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[硕士论文] 庞倩
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:东北黑蜂是我国优良的地方品种,具有产卵力强、抗寒等优点,但其品种来源尚不清楚,抗寒机制缺乏系统研究,而分类地位和遗传特征的不清晰给东北黑蜂的保护均会造成阻碍。本研究通过全基因组重测序技术、对自由水含量和游离脂肪含量的测定以及实时荧光定量PCR技术对东北黑蜂的系统起源及抗寒机制展开研究,以期明确东北黑蜂的分类地位和遗传特征,主要研究内容和结果如下:
  (1)本研究对东北黑蜂、远东黑蜂、珲春黑蜂、高加索蜂和中华蜜蜂5个蜂种共100只工蜂个体进行了全基因组重测序,并在公共数据库下载了卡尼鄂拉蜂、欧洲黑蜂、安纳托利亚蜂和意大利蜂4个蜂种共40个个体的重测序数据。测序共获得246.32G原始数据,东北黑蜂重测序共获得54.49G的数据量,其clean reads与参考基因组的平均比对率为97.32%,平均测序深度为18.0×,鉴定到东北黑蜂2114450个SNP,739093个InDel。
  (2)通过构建进化树、主成分分析和群体遗传结构分析,探究东北黑蜂的系统起源。结果表明东北黑蜂与远东黑蜂、珲春黑蜂亲缘关系最近,并且血统组成单一。证明东北黑蜂来可能源于远东黑蜂。
  (3)通过测定东北黑蜂和意大利蜂的自由水含量和游离脂肪含量分析东北黑蜂的抗寒能力。结果表明,二者自由水含量和游离脂肪含量差异均不显著(P>0.05),表明二者对低温环境均产生了适应性,都形成了一定的抗寒机制。
  (4)利用Fst&θπ选择消除分析,通过东北黑蜂和意大利蜂的比较,筛选东北黑蜂受选择区域,再结合GO富集分析和KEGG分析筛选抗寒相关的基因。结果筛选到2个与小分子抗寒物质积累相关的基因,即与葡萄糖积累有关的PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase2基因以及与磷脂代谢有关的adenylate cyclase type6基因。
  (5)利用荧光定量PCR技术分析东北黑蜂、东北地区意大利蜂和扬州地区意大利蜂抗寒相关基因的表达。结果表明,东北黑蜂Dachsous、HSP90和Hsc70-5基因的表达量显著高于扬州地区的意大利蜂和东北地区的意大利蜂(P<0.05),而扬州地区的意大利蜂和东北地区的意大利蜂之间差异不显著(P>0.05);东北黑蜂和东北地区的意大利蜂HSP60和Hsc70-4基因的表达量显著高于扬州地区的意大利蜂(P<0.05),东北黑蜂和东北地区的意大利蜂之间差异不显著(P>0.05)。表明东北黑蜂的抗寒性强于意大利蜂,东北地区的意大利蜂的抗寒性又强于扬州地区的意大利蜂,说明环境可能会够影响甚至改变蜂种的抗寒性。
  本研究明确了东北黑蜂的分类地位,并发现东北黑蜂的抗寒性可能是其对低温环境的适应性,该研究对东北黑蜂遗传资源保护和实际生产具有一定意义。
[硕士论文] 王雪庆
生物化学与分子生物学 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:白蜡虫Ericerus pela(Chavannes)二龄雄虫分泌的白蜡是用途广泛的天然蜡酯,是多种蜡单酯的混合物。研究表明,蜡酯的合成是由脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoAreductase,FAR)将脂肪酸还原成脂肪醇,脂肪酸和脂肪醇在蜡酯合酶(wax synthase,WS)作用下酯化形成蜡酯。前期工作鉴定到了白蜡虫泌蜡候选基因far和ws,但关于far基因的功能等方面还缺少进一步的研究。本研究在获得白蜡虫far2基因cDNA ORF的基础上,采用原核表达FAR2,为单克隆抗体制备提供蛋白;利用昆虫-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)在BmN家蚕细胞中表达FAR2,收集蛋白FAR2进行体外酶活反应分析,气相色谱(gas chromatography, GC)检测酶反应产物;对蜡酯合成的另一关键酶基因进行原核菌体表达,低成本获得大量ws基因的dsRNA(double-stranded RNA,dsRNA)。主要研究结果如下:
  (1)白蜡虫FAR2原核表达载体pET-30a-eGFP/EpelFAR2成功构建,Western blot鉴定FAR2表达成功,SDS-PAGE分析确定IPTG加入量0.8mmol·L-1、诱导时间8h为最佳诱导条件。
  (2) Bac-to-Bac表达系统的重组质粒pFast-iel-FAR2-eGFP成功构建,重组Bacmid获得后转染BmN家蚕细胞,可观察到大量荧光。Westem blot鉴定FAR2成功表达,P2代病毒菌株感染细胞后于不同时间收集蛋白,其Western blot结果表明,细胞感染重组Bacmid后48h是最佳收集蛋白时间。
  (3)利用收集的白蜡虫FAR2对不同碳链长度脂酰辅酶A进行酶活反应,酶反应产物经GC分析,其结果显示:白蜡虫FAR可将C28脂酰辅酶A还原为C28脂肪醇。
  (4)采用原核表达系统大量制备白蜡虫ws dsRNA。构建白蜡虫L4440/EpelWS干扰载体,转化后经IPTG诱导获得ws dsRNA的平均量1705ng·mL-1,电泳检测拖尾现象不明显、质量较好。
  以上研究成功进行FAR2原核表达、真核表达、酶活分析及ws dsRNA的获得,为单克隆抗体制备、生化特性研究奠定了基础,ws dsRNA的体外表达对介壳虫防治具有一定意义。
[硕士论文] 刘思宏
植物保护-农药学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:意大利蜜蜂Apis melliferaL.又称西方蜜蜂,是蜜蜂属中群势比较强的一种,属黄色蜂种,是重要的社会性经济昆虫,在中国也有很多地区饲养意大利蜜蜂。目前关于新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性研究十分热门,但是作为含用手性异构体的第三代新烟碱类杀虫剂呋虫胺,其对映体对蜜蜂的急性毒性以及亚致死效应鲜有研究。因此,本文通过呋虫胺对映异构体对蜜蜂急性毒性以及亚致死效应的研究,来阐述新烟碱类杀虫剂呋虫胺对蜜蜂的安全性以及呋虫胺的两个手性异构体对蜜蜂毒性的差异性,以期为化学农药呋虫胺对蜜蜂的安全性评价提供依据,有效的减少潜在危险,为保护社会性经济昆虫蜜蜂提供理论基础。主要研究结果如下:
  (1)呋虫胺的两个手性异构体以及外消旋体对蜜蜂急性经口都存在较高的毒性和风险。R-呋虫胺对蜜蜂的急性经口毒性大于S-呋虫胺以及rac-呋虫胺,rac-呋虫胺对蜜蜂的急性经口毒性大于S-呋虫胺。所以在急性经口毒性方面来看,R-呋虫胺的风险性比较大。
  (2)亚致死剂量的呋虫胺对映体对意大利蜜蜂生化指标的影响比较研究:在LC5与LC20的亚致死浓度下,呋虫胺对映体对蜜蜂体内羧酸酯酶活力的促进顺序为rac-呋虫胺>S-呋虫胺>R-呋虫胺,对蜜蜂体内谷胱甘肽S转移酶活力的促进顺序为S-呋虫胺>R-呋虫胺>rac-呋虫胺,对蜜蜂脑内乙酰胆碱酯酶的抑制作用顺序为S-呋虫胺>R-呋虫胺>rac-呋虫胺,对蜜蜂体内多酚氧化酶的抑制作用顺序为rac-呋虫胺>S-呋虫胺>R-呋虫胺。
  (3)亚致死剂量的呋虫胺对映体对意大利蜜蜂对蔗糖的喙伸反应比较研究:在LC5、LC20与LC30的亚致死浓度下,呋虫胺对映体在蜜蜂糖浓度(10%、30%、50%)敏感性的抑制作用由大到小的顺序为R-呋虫胺>S-呋虫胺>rac-呋虫胺。
  (4)亚致死剂量的呋虫胺对映体对意大利蜜蜂对学习记忆能力比较研究:在LC5和LC20的亚致死浓度下,呋虫胺对映体对蜜蜂学习记忆能力抑制的影响顺序为S-呋虫胺>R-呋虫胺>rac-呋虫胺。
  (5)亚致死剂量的呋虫胺对映体对意大利蜜蜂脑内章鱼胺含量的比较研究:在LC5和LC20的呋虫胺亚致死浓度下,蜜蜂脑内章鱼胺含量顺序为rac-呋虫胺>R-呋虫胺>S-呋虫胺。
  本论文研究发现呋虫胺两个对映体对蜜蜂毒性有显著的差异性,且蜜蜂急性毒性高的构型对蜜蜂的学习记忆的亚致死效应比较低。
[硕士论文] 黄伦
养殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:四川地区地形结构复杂多样,地域面积宽广,蜜源植物物种丰富,气候复杂,造就了丰富的蜜蜂种质资源。本研究利用形态特征标记和基于SLAF-seq技术的DNA标记两种方法对四川地区43个区县的129群中华蜜蜂种质资源进行系统地调查,通过对四川地区中华蜜蜂的遗传资源多样性进行分析,为四川地区中华蜜蜂种质资源的多样性的鉴定、保护和生产利用提供重要依据。主要结果如下:
  1.形态特征多样性分析
  试验以四川地区中华蜜蜂19项形态指标进行分析,发现部分地区中蜂形态特征值之间存在极显著性差异(P<0.01);19项形态指标相关分析发现肘脉指数、胫节长、股节长、基跗节宽和蜡镜长分别与其他部分指标没有相关性(P>0.05),其余形态指标相互之间存在显著相关(P<0.05);形态指标直接聚类和主成分聚类分析一致,结果显示四川地区中华蜜蜂分布明显聚为3大类,阿坝州地区中蜂、甘孜州地区中蜂和四川其他样点地区中蜂。判别分析结果与聚类分析结果一致,阿坝州地区中蜂类型分布较为集中且与四川省其他各地区分化较明显,甘孜州地区中蜂与阿坝地区中蜂差异较大,部分单独聚集在一起且与四川省其他各地区分化较远,四川盆地和凉山州(攀枝花)大部分地区中华蜜蜂样本种群聚在一起。结果表明不同地理环境能影响中蜂的形态特征。
  2.DNA多样性分析
  试验以四川省38个样点蜜蜂为主要研究对象,利用SLAF-seq简化基因组测序技术,经测序共获得74M读长数据,本试验共获得268631个SLAF标签,标签的平均测序深度为253.24x,其中,多态性SLAF标签有189234个,共获得1018013个SNP标记。群体遗传学分析发现,四川地区中蜂从分子水平上明显分为六个种群:阿坝种群、甘孜1种群、甘孜2种群、凉山攀枝花种群、四川盆地种群和合江种群。其中甘孜州地区中蜂多态性SNP位点和阿坝中蜂以及四川盆地其他地区的中蜂有显著的差异,具有分化的可能性;阿坝中蜂建立了保护区,其中蜂蜂种资源得到一定保护,与其他地区中蜂的基因交流较少,保持了其独特的种群特征。
[博士论文] 王超
森林保护学 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:角倍是由角倍蚜(Schlechtendalia chinensis Bell)取食盐肤木(Rhus chinensis Mill)叶翅部位,引起叶翅变态发育而形成的虫瘿,因富含单宁酸而被各个行业广泛应用。角倍是五倍子分布最广泛、产量最大的种类,对五倍子生产中起着决定性的作用,是我国传统的林特产品。角倍的发育是在瘿腔内角倍蚜与寄主植物盐肤木彼此自身的生长协同平衡中进行的,机理过程复杂。在角倍与寄主盐肤木营养源库关系上,本文以光合产物的分配和分割为切入点,将田间去源去库的环割、去叶处理调查统计与示踪标记、氨基酸营养测定及分子转录表达分析方法相结合来探寻角倍发育的源库关系。
  角倍是营养库,角倍发育主要由着生复叶上的小叶作为源叶提供营养,角倍与着生盐肤木复叶上的小叶构成源库单位。角倍快速发育初期分别对角倍着生复叶枝条上下方环割处理,后期不同方式环割后处理与对照角倍体积角倍体积分别增大16.53倍和14.02倍,对照角倍体积分别增大了13.64倍和16.39倍,角倍体积变化差异均不显著;角倍快速发育初期去除复叶上的小叶(源叶)处理后,后期处理与对照角倍体积分别增大了2.21倍和16.34倍,后期角倍体积发育变化明显减缓,两者体积变化有显著差异。
  角倍的形成可以促进寄主盐肤木叶片的叶面积增大并与角倍体积呈正相关,进而可以提升营养源的供给能力。自然迁飞和人工挂放虫袋是角倍生产上的两种重要致瘿方式,这两种致瘿方式下有倍盐肤木与无倍盐肤木的各生长参数调查统计分析得到无论自然迁飞还是人工挂放虫袋的致瘿盐肤木在侧枝数、梢头数、复叶数及小叶总面积均显著高于无倍盐肤木。同时,人工挂放虫袋与自然迁飞致瘿的有倍树的小叶总面积有显著差异。人工挂放虫袋致瘿可以有效激发盐肤木结倍潜力,提高产量。主成分分析显示梢头数和复叶数对角倍产量贡献率最大。有倍盐肤木相对无倍盐肤木多了角倍作为营养汇入的库,进而影响寄主盐肤木协调自身,通过提高光合能力提供并传输更多的同化物营养来满足其发育需要。
  角倍之间存在源库营养的竞争和协调机制,一定条件下角倍与盐肤木叶片的源库关系可以转换。在角倍复叶不同位置进行13CO2标记及注射13CO2和标记葡萄糖进入角倍示踪,结果显示光合碳反应的碳源分配上角倍蚜和角倍始终都是顶端小叶光合碳源的主要分配对象和方向;角倍是营养汇入的库,角倍蚜更是光合碳分配的最大获益者,是最优先供给特定的“库”,角倍蚜是驱动角倍发育成为营养库的操纵者。对注入13C葡萄糖溶液的邻近角倍测定结果显示未标记角倍及瘿腔内角倍蚜δ13C值均有富集,其中角倍蚜富集最大,其次是角倍。不同角倍之间存在着营养的协调流动,这种营养流动可能与角倍蚜的取食刺吸和角倍组织结构相关。角倍蚜代谢排出的蜜露成分可以被传输到邻近周围的角倍和叶片,表明营养传输不只是叶片到角倍的单向流动,在一定的条件下角倍与盐肤木叶片的源库关系可以转换。
  角倍通过影响盐肤木叶片氨基酸含量变化调配源库关系,并在一定的发育阶段存在源库关系转换。在角倍发育不同时期,测定试材氨基酸得到各试材氨基酸组分虽然相同,但寄主盐肤木氨基酸营养的含量发生了变化。角倍中的水解和游离氨基酸在角倍发育初期比叶片的含量要低,随着角倍发育到中、后期,角倍的水解和游离氨基酸水平超过了寄主盐肤木叶片,表明角蚜虫刺激寄主盐肤木后,寄主盐肤木叶片的氨基酸含量因生理代谢发生变化而增加,逐渐形成了营养源,可以将此营养传输分配给角倍,以满足角倍的发育需要,结果支持了致瘿昆虫适应寄主植物的源库假说,而后期随着角倍氨基酸营养的增大也可为邻近叶片传输营养。这种氨基酸含量的升高与瘿内蚜虫个体数量和虫瘿体积的增加趋势一致,角倍和邻近叶片的游离氨基酸含量快速增加反映了盐肤木的抗虫能力随蚜虫数量的增加而增强,进一步反映了角倍蚜取食与盐肤木防御之间的平衡。
  角倍在分子水平上具有高表达的同化物运输和蔗糖合成、转移活性酶,有很强的营养库能力。对角倍及盐肤木叶片进行Illumina技术深度测序,获得112543条Unigene,平均长度为1133bp,其中只有76949条Unigene被注释,占总共的68.37%。系统聚类发现角倍与叶片在淀粉和糖代谢、光合作用途径富集。角倍的光合系统相关基因及Rubisco转录表达不高,但角倍蚜在瘿腔内活动产生较多CO2可以弥补提升角倍的净光合速率。角倍内主要同化物的蔗糖合成酶焦磷酸:1,6-二磷酸果糖转移酶(PFP)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性高表达,表明角倍作为营养库吸收并协调分配运输各个来源同化产物的能力强大。
[硕士论文] 张彩凤
光学工程 中北大学 2018(学位年度)
摘要:在蜜蜂养殖中通常会遇到需要统计蜜蜂数量的问题,科学的统计出蜂箱中蜜蜂的进出数量,进而估算出该蜂群蜜蜂的出勤率,可以为养蜂者的管理提供依据和极大的便利。
  蜜蜂的出勤情况主要是指蜂群中工蜂采集花粉的次数。在实际生产实践中,可以通过实施一定的手段来控制蜜蜂的出勤数,因此需要探究蜜蜂的出勤与其影响因素的关系。蜜蜂出勤受多种因素的影响,如环境温度、气压等,因此在统计蜜蜂出勤数量的同时实时记录当时的环境温度和气压非常必要。本文针对现有蜜蜂出勤计数器的缺陷,设计了一个多通道蜜蜂出勤自动监测系统,该系统不仅可以自动地统计蜜蜂进出数据,还可以实时监测环境温度和气压对蜜蜂出勤的影响。
  首先,介绍了本课题的研究意义和背景,光电传感器的国内外研究现状,以及本课题的来源和实验内容,确定了本系统的整体方案。
  其次,对整个系统进行了分模块设计,该系统由多通道光电检测模块、数据处理与存储模块、数据交换模块、数据采集与处理模块、短程无线传输模块、供电模块、温度与气压采集模块组成,分别对以上模块进行分析和电路设计,并对硬件部分进行了相应的程序设计。
  然后,通过温度传感器和气压传感器来监测环境温度和气压对蜜蜂出勤的影响。
  最后,进行实地现场实验,将实验采集到的各时段蜜蜂进出数据绘制成曲线,直观反映蜜蜂在一天中的出勤情况,通过对实验数据进行分析,证明了该系统的可行性和实用性,总结和展望了该系统对养蜂业的应用价值。
[硕士论文] 刘妮
生物化学与分子生物学 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)是一类重要的资源昆虫,其雄性幼虫分泌的次生代谢物质白蜡,是一种天然高分子化合物,被广泛应用于医药、食品等行业。白蜡虫是典型的雌雄性两型发育昆虫,雌虫为不完全变态发育,雄虫为完全变态发育,在研究昆虫的变态和进化上具有重要意义。保幼激素和蜕皮激素是调控昆虫变态发育的两种重要激素,为了弄清它们在白蜡虫变态发育中的调控作用,本文对白蜡虫形态特征和雌雄虫不同虫态保幼激素和蜕皮激素滴度动态规律进行了研究,分析了白蜡虫转录组雌雄差异表达基因,并采用实时荧光定量技术对保幼激素和蜕皮激素信号通路相关基因在白蜡虫变态发育中表达情况进行了解析,同时探讨了施用外源激素对2龄雄幼虫发育及其对激素相关基因表达的影响。主要研究结果如下:
  1、白蜡虫体内激素滴度变化动态规律
  通过高效液相色谱和酶联免疫技术分别对雌雄白蜡虫不同虫态的保幼激素和蜕皮激素进行滴度测定。研究结果发现,雌虫保幼激素滴度高于雄虫(不完全变态发育高于完全变态发育),1龄幼虫中期可能是白蜡虫两型发育的起始点,高浓度保幼激素(91.640pg/mg)维持雌虫的形态发育,低浓度保幼激素(8.980pg/mg)诱导雄虫的形态发育;在发育的转型期,蜕皮激素与保幼激素滴度的差值达到一定范围值时,20E才能诱导白蜡虫向下一个龄期的发育,其中,JH与20E滴度差值在31.019~59.366pg/mg范围时雌雄虫均可正常发育;在白蜡虫成虫发育期,雌雄虫的蜕皮激素滴度相对高于保幼激素。
  2、内源激素信号通路相关重要基因表达模式研究
  采用qRT-PCR技术对雌雄白蜡虫不同虫态的内源激素信号通路相关重要基因表达模式进行分析,并与激素滴度变化对比。研究结果发现,FPS、FDS、PMVK、JHE和JHEH基因仅在雌虫2龄和成虫期高表达,JHAMT和FAMeT基因仅在雄虫2龄期高表达,以上7个基因可能是调控白蜡虫性两型发育的关键基因;白蜡虫从幼虫到成虫期,雌虫保幼激素合成和降解酶基因表达逐渐增高;蜕皮激素合成基因在雌成虫期的表达量高于幼虫期,在雄虫的真蛹期表达量最高;保幼激素受体蛋白MeT在雌虫中基因表达变化(成虫期的表达水平高于幼虫期)与保幼激素滴度变化趋势相反,在雄虫中与保幼激素滴度变化趋势基本一致(幼虫期高于成虫期),而雌雄虫蜕皮激素受体蛋白EcR基因表达变化趋势与蜕皮激素滴度变化具有一致性,雌虫的保幼激素负调控其受体蛋白MeT基因的表达,雄虫的保幼激素正调控其受体蛋白MeT基因的表达;而雌雄虫蜕皮激素均正调控其受体蛋白EcR基因的表达。
  3、外源激素对白蜡虫发育及激素信号通路相关基因表达的影响
  3种浓度外源激素JH1(1.25mg/ml)、JH2(2.5mg/ml)和JH3(25mg/ml)经喷射、涂干和注射进行处理2龄初期的雄幼虫,对其个体泌蜡量、羽化率、体长、体重进行测定,以及对内源激素信号通路相关重要基因表达模式进行分析。研究结果发现,白蜡虫2龄期雄幼虫经JH2浓度的外源保幼激素类似物喷施处理后,白蜡虫个体泌蜡量在昆明地区增产率最高达到41.50%,峨眉地区增产率最高达到25.56%;3种浓度在3种处理方法下均可促进蛹羽化,蛹羽化率达到62.70%~81.62%,其中相同浓度下,涂干处理促进效果明显;JH3在促进蛹羽化的同时显著抑制了其体长和体重的发育。JH2可以上调JH合成基因,以及MeT和EcR基因的表达。说明外源保幼激素可影响基因的表达,JH2可能缩短了2龄雄虫达到泌蜡高峰期的时间或延长了2龄雄虫的发育,引起白蜡虫个体泌蜡量增加。
[博士论文] 孟丽峰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:尽管蜜蜂大脑存在明显的解剖学和功能分区,但是对各分区行使功能的分子机理还不清楚。蛋白质是生命活动的体现者,最能反映特定器官的功能特性。磷酸化是大脑行使功能的重要调控方式。因此,我们选取两种具有代表性的、行为和生理差异较大的蜜蜂:中华蜜蜂(中蜂)和意大利蜜蜂(意蜂)的采集蜂,利用鸟枪法、非标定量蛋白质组学对大脑的主要功能区蘑菇体、触角神经叶和视神经叶的蛋白质组进行研究。利用Ti4+-IMAC法对磷酸化蛋白质进行富集,然后利用生物信息学的方法对三个主要分区的磷酸化蛋白质组的位点,功能和关键通路以及上游激酶进行分析,以期阐明蜜蜂大脑主要分区调控和行驶功能的分子机理,以及中蜂和意蜂行为差异的神经生物学机理。这将对深入研究蜜蜂大脑不同分区行使功能的神经生物学机理以及其它昆虫大脑分区神经生物学功能研究提供重要的参考依据。
  通过对两种蜜蜂大脑不同分区蛋白质组的比较发现蘑菇体、触角神经叶和视神经叶三个分区的功能特异性也体现在蛋白质组的差异上。两个蜂种的蘑菇体和视神经叶在蛋白质组水平上利用相似的生物学通路来实现各自的功能。蘑菇体中蛋白质的动态变化对突触的塑造和长期记忆的形成具有重要作用。视神经叶上核糖核酸作为受体和第二信使在视觉传导中起重要作用。然而,两种蜜蜂触角神经叶的蛋白质功能存在显著差异,意蜂触角神经叶中与神经传导相关的氢离子和氢离子跨膜转运功能加强,中蜂触角神经叶中与突触塑造和神经递质长距离传输的微管骨架蛋白功能加强,说明两种蜜蜂在长期的进化过程中形成了与特定生存环境相关的嗅觉机制。同时,蛋白质合成和信号转导等与学习记忆相关的功能在中蜂的触角神经叶中加强,说明中蜂在长期的进化过程中形成了更强的嗅觉功能,以适应山区复杂的地貌和采集零星蜜源。进一步研究发现中蜂触角神经叶和蘑菇体中PKA和PKC等与学习记忆相关的激酶活性,以及一些与学习记忆相关的蛋白在Westen-Blot和免疫组化等水平上较意蜂高,证明了中蜂具有较强的嗅觉学习和记忆的能力。
  蛋白质磷酸化对其功能调节至关重要,尤其在大脑信号转导过程中。中蜂和意蜂大脑的三个主要功能区磷酸化蛋白表达谱和位点已经发生了变化,甚至一些执行基本功能的蛋白质的磷酸化位点也发生了变化。意蜂大脑各分区上调的磷酸化位点和蛋白数目远大于中蜂。在蘑菇体中,磷酸化蛋白质的主要作用是调控胞内信号转导,主要参与的通路是磷脂酰肌醇信号途径。触角叶中,两个蜂种的磷酸化蛋白质功能存在显著差异,中蜂触角叶中磷酸化加强了mTOR信号通路、染色质重塑、剪接体等功能,可能与中蜂复杂的生存环境和善于采集零星蜜源有关。而意蜂触角神经叶中蛋白质的磷酸化作用加强了蛋白质的磷酸化,可能与意蜂个体大,代谢旺盛有关。在视神经叶,两种蜜蜂的磷酸化蛋白质的主要功能是参与物质转运和蛋白质运输,上游的激酶主要是STE/STE20。
[博士论文] Zewdu Ararso Hora
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂在进化中形成了一套由化学通讯组成的精准系统用以调节他们复杂的社会活动。触角是蜜蜂最重要的嗅觉器官,对于各类化学信号非常敏感,如信息素和各类气味,在调节蜜蜂哺育和采集行为中扮演重要角色。虽然蜜蜂的嗅觉系统对于哺育和采集行为至关重要,但其在蜜蜂随日龄变化的劳动分工职能转变中的分子机理,以及不同蜂种间的差异还不明确。在哺育过程中,蜜蜂的哺育行为能够促进蜜蜂对幼虫信息素的识别,增强蜜蜂的采粉行为,从而提高工蜂王浆的分泌。因此,为了深入探究触角在促进蜂王浆高产中的分子机理,我们对不同日龄意蜂(ITBs)和浆蜂(RJBs)触角蛋白质组进行了比较。浆蜂是从意蜂中选育出的高产王浆的一个品系。两个蜂种中共鉴定到了5692个触角蛋白,是目前在触角中鉴定到的最多的蛋白质。在成年工蜂中,两蜂工蜂的触角蛋白质组主要功能是支持促进与生理和日龄相关的行为发育的各项基础功能。然而,为了适应不同的生理行为,不同日龄的工蜂嗅觉蛋白质组已发生变化。在幼蜂中,触角蛋白质组主要功能是刺激触角神经细胞的发育和分化,以支持嗅觉系统发育成熟。在哺育蜂(NBs)中,触角蛋白质组加强了触角的敏感性,以利于幼虫信息素的识别并促进蜜蜂的哺育行为。在采集蜂(FBs)中,触角蛋白质组扮演着重要角色,主要包括促进各类信号刺激的集中响应和处理,采集期间提供合成蛋白和代谢的原料以调节细胞的动态平衡等。经过数十年的选育,浆蜂触角蛋白质组较意蜂同日龄的触角蛋白质组发生了显著的变化,浆蜂触角蛋白质组主要功能是促进哺育和采集行为,以支持蜂王浆高产的需求。在浆蜂哺育蜂中,主要富集到大量与能量代谢和细胞动态平衡相关的功能类别,上调蛋白均富集到与能量代谢相关的通路,表明浆蜂的触角蛋白质组经过选育已经形成不同的嗅觉系统,以适应大量分泌蜂王浆这一行为。在浆蜂采集蜂中,主要富集到与能量代谢相关的功能类别和代谢通路,例如脂肪酸降解、丙酮酸代谢和包含碱基的化合物代谢加工、吡啶核苷酸代谢加工和乙醛酸、二甲酸代谢,这表明其触角蛋白质组增强了嗅觉系统,为强化花粉等采集行为做准备。本研究为阐明嗅觉在日龄相关的社会劳动分工的分子机理研究方面提供实验数据,并为探究浆蜂蜂王浆高产的分子机理提供新视角。
[硕士论文] 李爽
养殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂工蜂上颚腺是位于头部的一对外分泌腺体,主要生物学功能是分泌脂肪酸作为蜂王浆的主要成分为蜂群提供营养和参与报警外激素的合成,其中上颚腺分泌的10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是蜂王浆的重要脂肪酸成分和质量指标。蜂王浆高产蜜蜂(简称浆蜂)是我国从意大利蜜蜂(意蜂)中培育的新品系,产量较意蜂提高10倍以上,随着产量提高,其中的10-HDA出现一定程度下降,然而浆蜂和意蜂上颚腺在磷酸化蛋白质组水平上如何调控它们上颚腺的发育和功能的机理尚未开展研究。
  本研究基于液相色谱与二级质谱连用的磷酸化蛋白质组学和生物信息学等方法,通过比较二者工蜂出房蜂、哺育蜂、采集蜂发育阶段上颚腺磷酸化蛋白质组的差异,揭示磷酸化蛋白质组调控上颚腺的发育机制。
  浆蜂3时期分别鉴定到509、554、460个磷酸化蛋白,意蜂分别鉴定到483、499、387个磷酸化蛋白,浆蜂的磷酸化蛋白数目显著高于意蜂,表明浆蜂上颚腺的磷酸化调控网络较意蜂复杂。结果显示浆蜂和意蜂幼蜂、哺育和采集3个时期的磷酸化蛋白表达谱均相似,说明浆蜂和意蜂3时期表达的磷酸化蛋白质执行类似的生物学功能来保障腺体的发育和分泌活动。对每个时期磷酸化蛋白质组比较发现,浆蜂和意蜂上颚腺3个发育时期的磷酸化蛋白质组均存在显著差异。在各时期,意蜂的磷酸化作用通过加强蛋白质合成和加工、糖代谢等过程为腺体各项生命活动提供支持和能量。出房蜂时期,浆蜂磷酸化蛋白主要通过以剪接体为主的RNA加工、细胞骨架蛋白等相关过程的调控用于支持腺体基础发育,为哺育蜂时期产浆行为提供物质基础;经过蜂王浆高产选育,浆蜂哺育蜂时期与意蜂上颚腺磷酸化蛋白质组差异最大,浆蜂磷酸化的调控作用更为复杂,主要参与丙酮酸脱氢酶相关的能量代谢途径、脂肪酸合成、细胞内各类信号转导等过程,浆蜂已具有不同于意蜂的磷酸化蛋白质组,以维持其蜂王浆高产时10-HDA含量的提高及能量供应,保证蜂王浆的营养功能及自身代谢所需;采集蜂时期,磷酸化作用主要通过参与包括应激蛋白等新蛋白的合成适应腺体功能的转变,有助于采集蜂腺体分泌功能及形态变化,加强转运蛋白的合成促进报警激素的释放,适应外界环境,加强泛素化相关蛋白的合成以调控细胞凋亡等适应机体的衰老过程。
  浆蜂和意蜂在3个时期均通过加强不同的磷酸化蛋白质组来支撑上颚腺的发育及功能,其中最显著的差异在哺育蜂时期,浆蜂哺育蜂显著提高了脂肪酸合成力,保障其蜂王浆的基本功能。这在蛋白质修饰的水平上深入探究了浆蜂蜂王浆高产的产浆生物学机理。
[硕士论文] 吴鹏杰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:囊状幼虫病(Sacbrood Disease,SBD)是中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称为中蜂)幼虫期最主要的病毒性病害,可导致幼虫死亡,进而蜂群数量急剧减少。中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sacbrood Virus,CSBV)是引起中华蜜蜂囊状幼虫病的病原,已成为近几年来在蜜蜂中分布最为广泛的病毒之一。本文在调查中华蜜蜂囊状幼虫病毒流行分布规律的基础上,对CSBV结构蛋白VP1的分子生物学特性进行了研究,并对响应CSBV感染的两个免疫相关基因SRP9和GABARAP进行了分子克隆、生物信息分析和原核表达研究。
  主要结果如下:
  1、中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测及流行规律调查。采用RT-PCR方法,病毒检测发现,CSBV感染率高达94.59%,其次为黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV),检出率达77.03%。说明CSBV是中华蜜蜂中发病率最高的病毒。在我国东北、华北、华中、华南、西南、东部均能检测到CSBV病毒,发生的地点与我国主要的流蜜期路线相吻合,且存在广泛的混合感染问题。全年发生情况一直较为严重,春繁时期最易感染,呈现1-4月份逐步升高的趋势,6-9月份有所缓和,但10-11月份后又开始上升。
  2、中华蜜蜂囊状幼虫病毒纯化及电镜观察。采用超高速离心和蔗糖密度梯度离心的方法,获得了CSBV-BJ和CSBV-SX两个纯化CSBV病毒。实验观察到CSBV-BJ和CSBV-SX病毒粒子,病毒粒子的形状接近圆形(直径约30nm),接近二十面体的球形。
  3、中华蜜蜂囊状幼虫病毒VP1蛋白单克隆抗体制备。对CSBV-BJ-VP1进行克隆,获得有效序列长945bp,编码315个氨基酸,Nbp/3。该基因的预测分子量和等电点分别约为35.59kDa和9.38。对VP1进行原核表达,构建pET-32a-CSBV-BJ-VP1质粒,优化原核表达条件,在37℃培养,菌株OD600=1.0,IPTG浓度为1.0mM时,获得重组蛋白。将该蛋白免疫小鼠,成功制备了2株VP1单克隆抗体腹水,单抗的亚类均为IgG2a,轻链为κ链。
  4、中华蜜蜂SRP9基因克隆、生物信息分析及原核表达。采用RT-PCR方法,扩增有效序列长为237bp,编码78个氨基酸,(Nbp-3)/3,相对分子量为9.36kDa,等电点为9.17。系统进化树分析表明,中华蜜蜂SRP9与西方蜜蜂Apis mellifera和小蜜蜂Apis florea的SRP9聚成一支。蛋白质二级结构预测发现其含有2个α-螺旋区和3个β-折叠区。同源建模获得蛋白质的三维结构。原核表达后发现该重组蛋白表达在包涵体中,经洗包涵体方法纯化,获得了带有GST标签的重组蛋白。采用荧光定量PCR方法,研究了SRP9基因的表达特性,结果表明,在接种CSBV后,中蜂幼虫体内SRP9基因表达量显著提高。
  5、中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息分析及原核表达。采用RT-PCR方法,扩增获得有效序列354bp,编码117个氨基酸,(Nbp-3)/3,预测分子量为13.99kDa,等电点为9.48。系统进化树分析表明,中华蜜蜂GABARAP与同西方蜜蜂Apis mellifera、小蜜蜂Apis florea、大蜜蜂Apis dorsata、欧洲熊蜂Bombus terrestris、东方熊蜂Bombus impatiens的GABARAP蛋白处于同一个簇中。蛋白质二级结构预测发现其含有3个α螺旋和4个β折叠结构。同源建模获得蛋白质的三维结构。原核表达后发现该重组蛋白表达在包涵体中,经His标签蛋白纯化试剂盒,获得了带有His标签的重组蛋白。采用荧光定量PCR方法,研究了GABARAP基因的表达特性,结果表明,在接种CSBV后,中蜂幼虫体内GABARAP基因表达量显著提高。
[硕士论文] 袁晓龙
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:熊蜂是设施作物重要的传粉昆虫。随着设施农业的快速发展,以欧洲地熊蜂Bombus terrestris为主的商品化熊蜂被推广至世界各地,在创造巨大经济价值的同时在很多地区也造成了生物入侵现象。中国是全球熊蜂资源最丰富的国家,但是本土商品化熊蜂的研究相对滞后,长期依赖进口欧洲地熊蜂以满足设施作物授粉需求。但是欧洲地熊蜂对中国的入侵风险尚缺乏研究。本文从交尾与花粉采集两个方面评估了欧洲地熊蜂对中国本土熊蜂的潜在威胁,取得主要结果如下:
  (1)欧洲地熊蜂与我国本土熊蜂的雄性蜂头部分泌物比较采用四级杆飞行时间-气质联用系统(gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry,GC-Q-TOF/MS)测定了欧洲地熊蜂和我国本土9种熊蜂的雄性蜂头部分泌物,并进行聚类分析。结果显示:雄性蜂头部分泌物的物质组成在同一熊蜂种内高度相似,但在不同熊蜂种间差异明显;红光熊蜂B.ignitus、兰州熊蜂B.lantschouensis与欧洲地熊蜂的雄性蜂头部分泌物相似度较高,分别为58.49%与49.23%。
  (2)欧洲地熊蜂雄性蜂对我国兰州熊蜂交尾的影响在人工控制环境下,按照蜂王和雄性蜂为1∶8的比例设置兰州熊蜂交尾组,在此基础上,分别增加与兰州熊蜂雄性蜂比为1/4、1/2和1/1的欧洲地熊蜂雄性蜂,统计分析欧洲地熊蜂雄性蜂对兰州熊蜂交尾的影响。结果显示:在人工条件下,欧洲地熊蜂雄性蜂可以与兰州熊蜂蜂王杂交,并且随着欧洲地熊蜂雄性蜂密度的增加,兰州熊蜂的交尾成功率极显著降低(P<0.01)。
  (3)欧洲地熊蜂与我国本土熊蜂采集花粉比较在我国红光熊蜂和兰州熊蜂等自然分布区放置欧洲地熊蜂蜂群与本土熊蜂蜂群,收集工蜂归巢时携带的花粉,通过双索引高通量条形码技术对花粉进行鉴定,分析欧洲地熊蜂和本土熊蜂采集的花粉种类与花粉构成的重叠率。结果显示:在相同的植被环境中,欧洲地熊蜂与本土熊蜂采集花粉的种类与构成重叠率都在50%~100%之间。欧洲地熊蜂采集的花粉是本土熊蜂采集花粉的关键组成成分。
  本研究结果表明,欧洲地熊蜂与我国兰州熊蜂、红光熊蜂的雄性蜂头部分泌物相似度较高,欧洲地熊蜂雄性蜂的头部分泌物中极可能包含吸引兰州熊蜂和红光熊蜂蜂王的性信息素物质;在人工条件下,欧洲地熊蜂可以和兰州熊蜂杂交并能显著降低后者的交尾成功率。在相同的植被环境中,欧洲地熊蜂与兰州熊蜂、红光熊蜂、密林熊蜂采集花粉的组成类似。说明,欧洲地熊蜂一旦在我国自然界营巢,极有可能对我国本土熊蜂造成生殖干扰,竞争食物资源。本研究从生殖干扰和食物竞争的角度分析了欧洲地熊蜂对我国本土熊蜂的潜在威胁,为外来物种管理及我国本土熊蜂资源保护政策的制定提供了重要的参考依据。
[硕士论文] 张元元
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜂蜜作为天然甜味食品,因具有良好营养价值和保健功能深受人们喜爱。但是近年来,在我国南方部分省市,陆续报道爆发了多起因食用蜂蜜而中毒的事件,使人们对蜂蜜的安全性产生了一定的担忧。本研究通过对疑似有毒蜂蜜样本的分析,发现这些样本含有一定浓度的雷公藤甲素。雷公藤甲素是雷公藤属植物中特有的成分,具有较强的生理活性及毒性,鉴于此,可以将雷公藤甲素作为有毒蜂蜜潜在的特征标志物之一,用于鉴别有毒蜂蜜并可作为快速诊断有毒蜂蜜中毒患者的依据。建立蜂蜜中雷公藤甲素的高灵敏度和特异性检测方法,是开展疑似有毒蜂蜜鉴别及其风险评估的技术保障。目前蜂蜜中雷公藤甲素检测方法相对匮乏,为此,本论文通过优化不同的样品前处理过程,利用超高效液相色谱串联质谱法进行测定,建立了两种不同蜂蜜中雷公藤甲素的检测方法,并基于建立的检测方法考察了蜂蜜中雷公藤甲素在不同贮藏温度下的降解情况。主要研究结果为以下三部分。
  1.通过优化仪器参数(如流动相、色谱柱等参数,以及质谱的碰撞电压、离子对等参数)建立雷公藤甲素的仪器条件。优化样品前处理过程(提取溶剂、净化剂等)建立蜂蜜中雷公藤甲素定量分析的前处理方法。最终选取乙酸乙酯为提取剂,采用两步提取合并提取液的提取方法从蜂蜜中提取出雷公藤甲素,利用自配的净化剂组合包(C18、PSA、中性氧化铝)进行净化,并上机分析测定。结果表明:雷公藤甲素在5.0~1000.0μg/L范围内的线性关系良好,相关系数大于0.999。在5.0,10.0,50.0,100.0μg/kg四个浓度水平下进行添加回收率试验,雷公藤甲素的基质回收率在80%~102%范围内,日内RSD小于8%,日间RSD不超过13%,方法的定量限为5.0μg/kg,检出限为2.0μg/kg。这表明本章所建立的方法可用于蜂蜜中雷公藤甲素的定性和定量分析,且方法具有定性和定量准确、稳定,操作简便的特点。
  2.建立柱前衍生/超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中雷公藤甲素的定量分析方法。本部分主要是基于改进QuEChERS的前处理方法,对雷公藤甲素的衍生化条件(衍生剂、衍生温度、衍生时间、衍生剂浓度等)进行优化,最终确定样品前处理过程。并对雷公藤甲素衍生物的仪器方法进行优化。结果表明:雷公藤甲素衍生物添加入蜂蜜空白基质中而绘制成的基质标准曲线在1.0-100.0μg/mL范围内线性关系良好。加标回收试验通过基质标准曲线定量发现,在三个浓度1.0,10.0,100.0μg/mL添加水平下,蜂蜜中雷公藤甲素的回收率范围在79%~94%之间,精密度为2.9%~5.8%,准确度为6.9%~10.3%,定量限1.0μg/kg,检出限0.3μg/kg。因此本方法不仅定量限低,而且稳定可靠,可用于准确定性和定量分析蜂蜜中的雷公藤甲素。
  3.研究了雷公藤甲素以及其在蜂蜜贮藏过程中的降解规律,试验表明不管是否有蜂蜜基质的存在,雷公藤甲素的降解规律和温度有密切关系,其降解速度随温度的升高而加快。在日常生活中,蜂蜜往往是放置于35℃、20℃、4℃这三种温度条件下的,通过试验,我们发现蜂蜜中的雷公藤甲素在35℃条件下放置了六个月,其浓度降解了约50%;20℃条件下浓度降解约10%;4℃条件下不发生降解。由此可知通过放置并不能在短期内完全降低蜂蜜中雷公藤甲素的含量。
[博士论文] 吴雨祺
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:上颚腺是蜜蜂重要的外分泌腺体,其分泌物是维系蜂群社会性结构的重要物质。蜂王和工蜂上颚腺分泌物合成均以硬脂酸为合成前体,但在合成过程中表现出级型差异性,导致分泌物的组分产生差异。蜂王上颚腺分泌物以9-羰基-2癸烯酸(9-ODA)为主,有吸引工蜂和雄蜂、抑制工蜂卵巢发育等作用;工蜂上颚腺分泌物以10-羟基-2癸烯酸(10-HDA)和10-羟基癸酸(10-HDAA)为主,是蜂王浆的重要组成部分。研究蜜蜂上颚腺中基因的表达与调控,对揭示上颚腺分泌物合成的分子机制和深入了解上颚腺分泌物级型差异形成的分子机制有着重要的意义。本研究采用高通量测序技术,比较了意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)成熟蜂王上颚腺、正常蜂群工蜂上颚腺和无王蜂群产卵工蜂上颚腺的基因表达谱,以寻找蜜蜂上颚腺分泌物合成相关的关键基因;在此基础上我们利用RNA干扰技术敲降基因表达,进一步验证了特定基因在工蜂上颚腺分泌物合成过程中的作用。
  工蜂上颚腺分泌的10-HDA是蜂王浆中重要的脂肪酸成分,是蜂王浆质量控制的主要技术指标,同时也是蜂王浆定价的决定性因素之一,因此研究工蜂上颚腺的分泌规律与调控,在养蜂生产上有着重要的作用。本研究分析了工蜂上颚腺分泌物合成相关基因在不同日龄工蜂上颚腺中的表达模式,同时比较了不同营养条件下笼养工蜂上颚腺的基因表达谱,以期从分子水平上说明日龄和营养条件对工蜂上颚腺分泌能力的影响。主要研究结果如下:
  (1)蜜蜂上颚腺分泌物生物合成分子机制研究
  上颚腺是蜜蜂重要的外分泌腺,其分泌物在组成和功能上有着明显的级型差异。本研究首次利用高通量测序技术对意大利蜜蜂成熟蜂王、有王群正常工蜂和无王群中卵巢发育工蜂的上颚腺基因表达谱进行了检测,以获取蜜蜂上颚腺分泌物合成相关的候选基因。在这3个样本之间共检测到5457个差异表达基因,其中2629个基因在蜂王和正常工蜂间差异表达,在两种工蜂样本间则有2761个差异表达基因,而在失王工蜂和蜂王样本间检测到4662个差异表达基因。在这些差异表达基因中我们发现了多个可能与上颚腺中脂肪酸类分泌物合成相关的基因,涉及脂肪酸的羟基化、降解代谢与末端羟基修饰等多个过程,初步揭示了西方蜜蜂上颚腺的基因表达谱和上颚腺分泌物生物合成的相关分子基础。
  (2)蜜蜂上颚腺分泌物合成相关细胞色素P450基因的筛选
  在上颚腺脂肪酸分泌合成的过程中,细胞色素P450氧化酶系催化的硬脂酸末端羟基化是整个反应的起始步骤。为了探明参与这一合成过程的细胞色素P450,本实验在上一章节研究的基础上,检测比较了6个细胞色素P450在蜜蜂不同级型、不同生活阶段和不同组织间的表达模式。结果显示CYP6AS8和CYP6AS11分别在工蜂和成熟蜂王的上颚腺中高丰度表达,并且在级型间有着显著的差异,证明这两个基因与上颚腺的功能有着密切的关系。进一步,我们使用RNA干扰技术敲降了CYP6AS8基因在工蜂上颚腺中的表达,以明确CYP6AS8在工蜂上颚腺中的功能。实验结果显示,敲降CYP6AS8基因的表达后,工蜂上颚腺中10-HDA的合成水平也随之显著降低,证明CYP6AS8与工蜂上颚腺分泌物合成有着密切的联系。
  (3)不同日龄工蜂上颚腺中10-HDA合成相关基因表达模式研究
  工蜂上颚腺是蜂王浆中重要功能活性物质10-HDA的主要分泌器官,研究工蜂上颚腺分泌能力的变化规律在养蜂生产上有着重要的意义和价值。我们使用荧光定量PCR技术检测比较了与10-HDA合成相关关键基因:CYP6AS8、CPTI、ACOX1和ACOX3,以及在上颚腺中高丰度表达基因:CSP3和mrjp1在不同日龄工蜂上颚腺中的表达规律。结果显示,随着工蜂日龄的增长,除mrjp1外,CYP6AS8、CPTI、ACOX1、ACOX3和CSP3在工蜂上颚腺中的表达基本保持稳定,显示工蜂上颚腺的分泌物合成分泌能力不会随工蜂日龄的变化发生明显的改变。
  (4)不同营养条件对工蜂上颚腺合成能力及其相关基因表达研究
  蜜蜂的营养水平对蜜蜂腺体的发育和分泌能力有着显著的影响。通过人为控制工蜂日粮营养条件,我们探索了工蜂日粮营养水平对上颚腺分泌能力的影响。使用气相色谱测定了不同营养条件下工蜂上颚腺中10-HDA的分泌情况,同时利用高通量测序技术测定正常饲养工蜂和限制营养工蜂上颚腺的转录组,比较了不同营养条件下工蜂上颚腺基因的表达情况。在缺乏营养的条件下,工蜂上颚腺的10-HDA合成有着显著地下降;而转录组数据显示,与10-HDA合成相关的基因却表现出了上调的趋势。
  综上所述,本论文系统研究了上颚腺分泌物合成的分子机制,确定了参与工蜂上颚腺分泌物合成的细胞色素P450,有助于进一步深入研究上颚腺功能级型差异的分子基础;通过研究日龄和营养条件对工蜂上颚腺基因表达的影响,为研究西方蜜蜂工蜂上颚腺分泌能力的调控提供了线索。
[硕士论文] 秦瑶
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂(Apis spp.)是主要的授粉昆虫,对于食品安全、植物多样性、生态系统平衡至关重要。然而近年来全球各地区西方蜜蜂(Apis mellifera)常发生越冬蜂群损失现象,引起科学界和公众对蜜蜂健康的广泛关注。研究发现蜜蜂病毒是造成蜂群损失的主要因子之一。蜜蜂病毒可以通过水平传播和垂直传播两种方式在蜂群扩散,使蜜蜂隐性感染或者产生显性症状死亡。有些蜜蜂病毒已被证明可与狄斯瓦螨(Varroa dustructor)或蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)协同危害西方蜜蜂蜂群健康。而在东方蜜蜂蜂群中,除了囊状幼虫病毒(Sacbrood Virus)外,其他蜜蜂病毒较为少见。西方蜜蜂和东方蜜蜂(Apis cerana)在抗病毒能力上存在明显差异。
  本课题通过研究越冬期间意大利蜜蜂(Apis mellifera lingustic,简称意蜂)病毒感染情况、中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意蜂对病毒混合液的易感性、蜂螨寄生率对意蜂抗病毒能力影响,比较研究了中蜂和意蜂的抗病毒能力。具体研究内容和结果如下。
  1.越冬期间意蜂蜂群病毒感染情况分析
  通过比较分析3个蜂场共48群意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)越冬前与越冬后病毒感染情况,及其中1个蜂场8群蜜蜂越冬期间病毒感染情况的变化,探究与越冬期蜜蜂健康紧密相关的病毒种类。研究表明,残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)和以色列蜜蜂麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)在越冬意蜂群中感染率很高。与越冬后正常蜂群相比,濒临死亡的蜂群IAPV病毒量极显著更高,拷贝数达到了109左右;出现蜂群死亡的蜂场在越冬期间,蜂群DWV病毒量呈下降趋势,IAPV病毒量呈上升趋势。这些结果表明,IAPV是影响越冬期意蜂健康的最主要病毒。
  2.DWV和IAPV病毒混合液对中蜂和意蜂致病性比较
  本实验开展3个意蜂群和3个中蜂群的重复。除M3蜂群对照组的DWV在72h时扩增到108copies外,其余蜂群的对照组中各病毒随着时间变化均未出现病毒扩增趋势。饲喂病毒液的实验组在12h和72h时,3群意蜂和中蜂群C2的DWV和IAPV病毒滴度均极显著高于只饲喂糖浆的对照组(p<0.01),3群意蜂的实验组在72h内死亡率有高有低,最严重者在72h内死亡率达到54%,中蜂蜂群则呈现较一致趋势,72h内死亡率均处在10%-20%之间。并且无论中蜂还是意蜂,72h内死亡的蜜蜂体内IAPV病毒量均在108copies以上,DWV的病毒量则相对较低,均未超过108copies,因此我们推测造成72h内蜜蜂急性死亡的原因是IAPV病毒的迅速扩增。
  3.狄斯瓦螨寄生率与蜜蜂接种病毒后死亡率之间相关性
  瓦螨寄生率不同的6个意蜂群的蜜蜂接种病毒后,实验组72h内的死亡率与蜂群瓦螨寄生率相关系数达到0.955,瓦螨寄生率高,蜜蜂死亡率就高。以M2蜂群为研究对象探究不同瓦螨寄生率情况下饲喂病毒液后蜜蜂的死亡率,结果表明,对照组和实验组的蜜蜂死亡率均与瓦螨寄生率高度相关,相关系数分别为0.999和0.947。M2蜂群瓦螨寄生率较高时(40%和70%),新出房蜂的各病毒初始病毒量也较高,且瓦螨寄生率特别高时(70%),对照组蜜蜂DWV会随着时间扩增。因此,我们推测,病毒混合液对中蜂和意蜂致病性存在差异的原因,关键在于狄斯瓦螨的寄生影响了意蜂的抗病毒能力。
  综上所述,本研究表明IAPV是影响越冬意蜂群健康的关键蜜蜂病毒,DWV和IAPV病毒混合液对中蜂和意蜂的致病性都有一定的致病性,同时在不同意蜂群间差异较大,而且这一差异与蜂群狄斯瓦螨寄生率密切相关。本研究结果对于理解越冬蜂群损失现象有所帮助,对生产上蜜蜂病毒病的防控也有指导意义。
[硕士论文] 许瑛瑛
养殖 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂是一类重要的经济昆虫,通过生产蜂产品和为农作物授粉带来巨大经济效益。蜜蜂孢子虫病(Nosemosis)是由微孢子虫寄生成年蜂中肠等组织引起的慢性传染性疾病,病原体包括蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema cerenae)。由N.ceranae引起的西方蜜蜂的孢子虫病是影响当前世界养蜂业的主要病害之一。N.ceranae孢子能够通过蜜蜂排泄物、受污染的蜂机具以及蜜蜂交哺行为等途径在蜂群中传播,造成蜂群生产力降低,给养蜂业带来巨大经济损失。烟曲霉素是一种能够有效防治蜜蜂孢子虫病的抗生素药物,然而会对蜂产品造成污染,因此,亟需寻找其他防治孢子虫病的安全药物。本课题结合国内外利用植物制剂防治蜜蜂孢子虫病的经验,筛选有效抑制孢子增殖的植物提取物及单体,并进行穿心莲水煎剂防治蜜蜂病毒病的初步研究。主要研究内容和结果包括:
  1.对刚出房的西方蜜蜂(Apis mellifera)分别进行N.ceranae的接种后,将穿心莲水煎剂、黄柏水煎剂和葡萄皮醇提物3种中药提取物按不同组合溶于50%糖浆溶液中,饲喂给蜜蜂,记录死亡数并于第13d进行孢子计数。结果表明,7%穿心莲水煎剂、2%黄柏水煎剂及0.5%葡萄皮醇提物3种中药提取物相互组合或单独使用均能有效抑制孢子的增殖(p<0.05);穿心莲水煎剂与黄柏水煎剂的组合使受N.ceranae感染的蜜蜂寿命缩短(p<0.01)。综合孢子数和存活率结果可知,7%穿心莲水煎剂、7%穿心莲水煎剂与0.5%葡萄皮醇提物原浓度或原浓度的二分之一组合、2%黄柏水煎剂与0.5%葡萄皮醇提物原浓度或原浓度的二分之一组合更适合用于防治蜜蜂孢子虫病。
  2.对3种植物单体和2种有机酸防治蜜蜂孢子虫病的效果进行研究。结果表明,7%穿心莲水煎剂、0.1484mg/mL脱水穿心莲内酯、3种浓度的两种穿心莲单体组合[(0.0105+0.0371)mg/mL、(0.021+0.0742)mg/mL、(0.042+0.1484)mg/mL]、2.8125mg/mL草酸、1mg/mL柠檬酸、0.01mg/mL和0.02mg/mL白藜芦醇均能有效抑制N.ceranae孢子的增殖,(p<0.01),其中7%穿心莲水煎剂,(0.042+0.1484)mg/mL的两种穿心莲单体组合、2.8125mg/mL草酸和1mg/mL柠檬酸效果更好;但2.8125mg/mL的草酸表现出较高毒性,实验蜜蜂在13d内全部死亡。最终得出,(0.042+0.1484)mg/mL的两种穿心莲单体组合、1mg/mL柠檬酸更适合用于防治蜜蜂孢子虫病。
  3.给蜜蜂接种病毒液(含DWV、IAPV两种病毒),将7%穿心莲水煎剂以不同方式饲喂给蜜蜂,记录死亡数并于接种病毒液后的第3d和第8d对DWV、IAPV两种病毒进行病毒拷贝数的定量。结果表明,对于已感染大量病毒的新出房蜜蜂,穿心莲水煎剂并无治疗效果,相反,饲喂穿心莲水煎剂还会加速蜜蜂死亡;提前饲喂穿心莲水煎剂对出房48h后接种病毒的蜜蜂可能有一定的预防作用。这一预防作用可表现于减缓病毒拷贝数的上升。
  本研究为养蜂生产上蜜蜂孢子虫病的防治提供了一些可选方法,而且结果表明,利用穿心莲防治蜜蜂孢子虫病可同时起到对病毒病的一定预防作用。
[硕士论文] 陈佳玮
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:蜂胶(Propolis)是蜜蜂采集植物树脂并与自身上颚腺、蜡腺等分泌物混合加工而成的胶状粘性物质。蜂胶作为一种天然产物,其化学组成十分复杂,同时已有大量研究表明其具有抑菌、抗氧化、保肝护肝、抗炎等多种生物学活性,目前已广泛用于保健品、化妆品等行业。
  巴西绿蜂胶(Brazilian Green Propolis,BGP)产于巴西中南部,其植物来源是酒神菊属(Baccharis)植物,因其特有的化学成分与良好的保健功效而得到了世界各国广泛的关注。蜂胶的化学成分受植物来源、采胶季节以及蜂种等多种因素的影响,存在显著的差异,具有高度的可变性,这就给蜂胶的质量控制造成了巨大的困难。同时,大量研究表明,BGP具有抑菌、抗氧化以及抗炎等多种生物学活性,若能将化学成分与生物学活性结合,对BGP进行质量控制,是一种全面有效的评价方法。
  基于以上背景,本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立BGP的化学指纹图谱,确定共有成分峰,同时对共有特征成分进行定量测定;同时测定BGP和共有特征成分的DPPH自由基清除活性以及抑菌活性;最后利用多元线性回归分析,将BGP的HPLC指纹图谱分别与DPPH自由基清除活性和抑菌活性结合,建立谱效关系,筛选具有抗氧化活性与抑菌活性的成分。主要的研究内容与结果如下:
  1.首先对巴西蜂胶样进行样本的筛选。采用分光光度法测定了23个不同来源的巴西蜂胶样的总黄酮和总酚酸含量,同时利用HPLC对阿替匹林C进行定量测定。结果表明,样8与样11的总黄酮、总酚酸及阿替匹林C含量均明显低于其他样品,不适合作为BGP样本。
  2.利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),优化建立了BGP的HPLC化学指纹图谱,确定共有成分峰,并对共有特征成分进行定量测定。利用文献资料与标准品对比的方法确定了10种共有特征成分,分别为咖啡酸、绿原酸、p-香豆酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸、山奈素、山奈酚和阿替匹林C。
  3.对BGP及共有特征成分单体进行DPPH自由基清除活性的测定,利用多元线性回归分析建立了BGP的HPLC指纹图谱与DPPH自由基清除活性的谱效关系。结果表明,9种共有特征成分对BGP样的抗氧化活性贡献率为咖啡酸>3,4,5-三咖啡酰奎宁酸>异绿原酸C>异绿原酸B>山奈素>阿替匹林C>绿原酸>异绿原酸A>山奈酚。
  4.对BGP进行抑菌活性的测定,利用多元线性回归分析建立了BGP的HPLC指纹图谱与抑菌活性的谱效关系。结果表明,10种共有特征成分对蜂胶样的抑菌活性贡献率为异绿原酸A>山奈酚>异绿原酸B>阿替匹林C>异绿原酸C>p-香豆酸>山奈素>绿原酸>咖啡酸>3,4,5-三咖啡酰奎宁酸。
[硕士论文] 秦汉祥
养殖 广西大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本研究旨在探索以猪粪和厚垫料发酵牛粪为主要基料,榕树叶药渣、松树木屑、海鲜菇菌糠等废料为辅料养殖蚯蚓的可行性。
  方法:
  将猪粪和牛粪与榕树叶药渣、松树木屑、海鲜菇菌糠按不同配比混合,组成多种方案进行发酵,发酵成熟后调节好C/N比,再按不同C/N比进行分组开展蚯蚓养殖研究。
  结论:
  1、采用松树木屑做配料的蚯蚓料,用于养殖蚯蚓的效果不佳,蚯蚓不仅生长缓慢,而且容易生病,同时还有逃逸的现象;采用榕树叶药渣做配料的蚯蚓料,饲养蚯蚓的效果较好,且以C/N为25的蚯蚓料最好,获得的经济效益也最佳。用榕树叶药渣和猪粪混合做成的蚯蚓料,不仅使榕树叶药渣获得了再利用,而且能够有效解决猪粪污染环境的问题,让猪粪能够变废为宝,同时生产出的蚯蚓可作为畜牧业的饲料原料。
  2、以厚垫料法养牛的发酵牛粪饲养蚯蚓,蚯蚓生长良好,获得的经济效益也最高。这不仅实现了对牛粪的有效降解,降低了牛粪对环境的污染,而且可以产出高蛋白的蚯蚓和高品质的蚯蚓肥,既为养殖业提供了高蛋白原料,也为种植业提供了优质的有机肥料,使牛粪获得了更高的利用价值,还实现了牛粪的资源化利用。说明厚垫料法养牛的发酵牛粪直接养殖蚯蚓的方法是可行的。
  3、猪粪与配料发酵成熟后的基料养殖蚯蚓效果和效益虽然比厚垫料法养牛的发酵牛粪差,但是从经济和环保的角度来衡量还是可行的。
[硕士论文] 钱艳
食品工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:中国是养蜂大国,蜂产品作为人们日常极为重要的食药两用保健品,内需和外销量与日俱增。随之而来的蜂产品安全问题受到了关注,尤其是抗生素和激素等兽药残留已经成为影响蜂产品质量安全的最重要因素之一。兽药残留不但危害着人类的健康,还会破坏生态环境。因此,中国政府十分重视对蜂产品中兽药残留实施严格的计划监控。目前,有不少关于蜂产品中兽药残留检测方法的研究报道,但关于糖皮质激素残留检测的方法研究较少,因此建立一种简便、快速、准确的方法具有重要意义。本研究选取了蜂蜜和蜂王浆为研究对象,建立了相应的液相色谱-串联质谱的检测方法。主要内容如下:
  1.采用液相色谱-串联质谱在多反应监测模式下测定蜂蜜中7种糖皮质激素残留。试样中加入pH5.2的乙酸铵缓冲盐溶液和β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶,37℃恒温箱中放置16h。乙酸乙酯提取,经HLB柱净化,液相色谱-串联质谱仪检测。方法在0μg/kg~20μg/kg范围内具有良好的线性关系。实验中添加水平为2.5、5和10μg/kg时,回收率范围为78.2%~92.3%;相对标准偏差小于12.8%;方法检出限(LOQ)均为2.5μg/kg。
  2.采用液相色谱-串联质谱在多反应监测模式下测定蜂王浆中7种糖皮质激素残留。试样中加入pH5.2的乙酸铵缓冲盐溶液和β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶,37℃恒温箱中放置16h。甲醇超声提取,去除部分蛋白质,依次经HLB柱和氨基柱净化,液相色谱-串联质谱仪检测。方法在0μg/kg~80μg/kg范围内具有良好的线性关系。实验中添加水平为10、20和40μg/kg时,回收率范围为84.7%~100%;相对标准偏差小于9.9%;方法检出限(LOQ)均为10μg/kg。
[博士论文] 韩宾
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂具有丰富的社会行为,大脑作为信息处理的最高中枢在蜜蜂行为的调控中发挥至关重要的作用。神经肽是在大脑神经信息传递过程中具有作用的活性生物多肽,通过在神经元、神经回路、组织器官水平上整合神经系统和其他系统的功能,最终在生长发育、代谢、生殖、求偶、觅食行为等方面发挥重要的调节功能。与此同时,大脑主要利用电信号和化学信号传输信息,多种类型的膜蛋白,如受体蛋白、通道蛋白、转运蛋白等在信号传导中发挥不可或缺的作用,而膜蛋白的磷酸化修饰在蛋白功能和信号传导中发挥广泛而且精细的调控作用。然而,关于大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组在工蜂行为调控中的研究还未见报道。本研究针对蜜蜂成年工蜂中存在的与日龄相关的劳动分工现象,以工蜂不同发育时期的大脑为研究对象并选取了意大利蜜蜂(原意)和蜂王浆高产蜜蜂(浆蜂)两个品系,利用非标记蛋白质组学定量、膜蛋白提取、磷酸化富集、生物信息学分析等手段开展了工蜂大脑神经肽和膜蛋白在行为调控中的研究。
  在工蜂大脑发现的22种神经肽前体蛋白中鉴定到158条非冗余的神经肽,其中77条为首次鉴定,显著提高了蜜蜂神经肽组的覆盖率。在工蜂不同发育时期,14类神经肽家族动态调节工蜂生理以适应不同阶段劳动分工的需要,尤其是在采集蜂时期加强了代谢、运动、生物节律等方面生理调控以适应巢外采集工作。对原意和浆蜂大脑神经肽组的定量比较发现,浆蜂的神经肽组发生了重构,以适应蜂王浆高产的需要,其中利尿激素(DH)和外周神经激肽(PVK)通过加强浆蜂哺育蜂水分和离子平衡的调控为蜂王浆分泌量提高提供了有力的支撑;速激肽(TK)在嗅觉识别调控中发挥重要的负调控作用,其在浆蜂中的低表达有利于浆蜂对幼虫的识别,同时加强了对花粉的采集,保障了蜂王浆分泌对蛋白质的需求,从而促进了蜂王浆分泌量提高。
  膜蛋白作为信号传递的受体在蜜蜂大脑调控行为中具有重要功能,我们在不同发育阶段的蜜蜂大脑中鉴定到1079种膜蛋白,它们主要参与氧化磷酸化、内质网蛋白质加工、溶酶体等十个重要通路,其中氧化磷酸化途径主要为大脑神经元功能提供能量保障,而内质网蛋白质加工通路能够为各种酶、神经肽、突触以及囊泡的膜蛋白组件的合成和加工提供分子基础。为了满足工蜂不同发育阶段大脑生理功能的需要,大脑膜蛋白质组处于动态变化之中。在成年工蜂发育早期,碳水化合物、核甘酸和脂类代谢相关的膜蛋白上调表达为神经元的增殖、迁移等提供物质和能量支持,促进大脑结构和功能的完善;采集蜂在巢外从事采集工作面对多变的外部环境,其大脑需要处理复杂的视觉、嗅觉、以及触觉信息,此时上调表达的膜蛋白种类最多,且主要是通过增强神经元之间的信号传导加强行为调控并帮助采集蜂更高效的处理信息。通过对原意和浆蜂膜蛋质组的比较发现,浆蜂大脑膜蛋白加强了对哺育和采集行为的调控,进而支持蜂王浆高产的需要。在哺育蜂阶段,浆蜂大脑中的磷脂酰肌醇信号通路和花生四烯酸信号通路的功能得到加强,有利于提高对幼虫信息素的识别,进而提高台基接受率,这是蜂王浆高产的前提;在采集蜂阶段,浆蜂大脑中与神经信号传导相关的通路功能得到加强,如:SNARE在囊泡运输中的互作,wnt信号通路,TGF-beta信号通路等,增强了采集蜂对花粉的采集力,为蜂群提供充足的蛋白质食物以满足哺育蜂分泌蜂王浆对蛋白质的需求。
  通过对工蜂大脑膜蛋白磷酸化修饰的鉴定和分析发现,其磷酸化修饰主要在MAPKs,CDKs和CK2这几类激酶的催化下完成。在工蜂大脑发育不同时期,磷酸化参与调控的重点也有所不同,幼蜂期主要促进神经元的发育和突触功能的成熟,成蜂期主要加强哺育蜂和采集蜂大脑神经元离子传输和信号传导。原意和浆蜂大脑的膜磷酸化蛋白质组的比较发现,浆蜂中上调表达的磷酸化蛋白数目更多说明磷酸化在浆蜂大脑功能中的调控作用更加活跃。尤其是在哺育蜂和采集蜂时期,转运蛋白磷酸化水平显著提升表明神经元信号传导能力在浆蜂中得到加强,从而更有利于对哺育和采集行为的调控,为蜂王浆分泌量的提升提供保障。
  本研究通过对工蜂大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组的分析,深入解析了蜜蜂行为的神经调控和蜂王浆高产分子基础。在多维组学水平上全面阐释了神经肽、膜蛋白、膜磷酸化蛋白调节蜜蜂劳动分工行为和浆蜂蜂王浆高产的神经生物学机理。这不仅是对蜜蜂神经生物学的理论创新,同时也为其它昆虫在该领域的研究提供了借鉴。
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