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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[博士论文] 刘兵
血管病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原发性高血压病是一种人类常见的慢性病,它是以血压升高为主要特征,并伴有血管、心脏等重要脏器并发症的一种严重威胁人类健康的疾病,发病率长期居高不下。有调查显示,中国有23.3%的成年人约2.45亿患有高血压病,而根据2017年美国心脏病协会/美国心脏协会新修订的高血压标准(收缩压≥130mmHg,舒张压≥80mmHg),中国高血压的患病率高达46.4%,而中国高血压的控制率为17%。因此,对高血压发病机理的研究和寻找更高效的的治疗策略,仍是当前生物医学界研究的热点。高血压病除外周心血管系统的一系列特征表现外,中枢神经系统交感输出亢进是高血压病发生和发展的重要机制之一。在中枢神经系统的众多核团中,头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感输出和基础血压的关键中枢,RVLM神经元功能异常与高血压和交感兴奋性增高密切相关。
  研究证实中枢肾素血管紧张系统(Renin-angiotensin system,RAS)过度激活是高血压病中枢交感输出的重要机制之一,增多的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以降低中枢压力敏感反射,增强中枢交感缩血管紧张性,导致血压的异常增高。血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme2,ACE2)是肾素血管紧张系统家族中的新成员,ACE2将血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)和AngⅡ转化成血管紧张素-(1-7)[Angiotensin(1-7),Ang-(1-7)],并拮抗AngⅡ的升压效果而发挥作用,而RAS和ACE2相关轴之间的平衡对维持正常血压和自主神经功能的中枢调节非常重要。已有研究证实,原发性高血压状态下大鼠RVLM内ACE2的表达显著下降,而在该区域过表达ACE2可使血压和肾交感活性显著下降。因此,ACE2在中枢调控心血管功能中的作用十分显著,也是当前寻求新的高血压防治策略的研究靶点之一,但目前高血压中枢ACE2功能降低的机制尚不清楚。
  细胞中ACE2是Ⅰ型跨膜蛋白,由细胞外的N端结构域、跨膜结构和一个短的胞内C末端组成,细胞外液中可溶性ACE2的形式为缺乏其胞内和跨膜结构域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究较为广泛,而上游对其调控的机理目前尚不清晰,研究较少。有研究显示镶嵌在细胞膜表面的解聚素和金属蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases17,ADAM17)可以调节细胞ACE2活性,ADAM17可以剪切细胞表面的多种蛋白质,从而发挥其多样的生理功能。它在机体内很多个器官都有表达,参与了一些生理和病理进程。ADAM17在细胞膜表面可以通过蛋白水解作用,剪切细胞膜上的ACE2,使得ACE2胞外部分脱落,进入细胞外液,降低细胞膜上ACE2的活性功能,导致细胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠肾小管中,ADAM17表达增加,它通过剪切细胞膜上ACE2使得尿液中的游离ACE2片段(70KDa)增加,给予胰岛素可逆转这一状况。有研究证实AngⅡ灌注下,心脏ADAM17活性增加,ACE2表达减少且活性下降,最终引起心脏肥大和纤维化。组织基质金属蛋白酶抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP3)是ADAM17的内源性抑制剂,它可以抑制了ADAM17介导的底物胞外域脱落。有研究报道,AngⅡ诱导可以增加心肌TIMP3表达增加,而AngⅡ的灌流两周不能使TIMP3-/-小鼠的心脏肥大,可见TIMP3参与AngⅡ诱导心肌肥大的病理过程。研究证实中枢脑组织中存在ADAM17的表达,其是杏参与中枢特别是交感中枢RVLM内ACE2的调节,仍不清楚。有研究报道,白藜芦醇(resveratrol,RSV)在外周可以增加TIMP3表达,而果糖诱导的高血压大鼠口服RSV的1周后血压下降,那么RSV是否通过TIMP3/ADAM17作用,增加了中枢内ACE2的功能从而参与血压的调控呢,仍不清楚。
  RSV是一类多酚类化合物,具有多种的心血管调节保护功能。RSV在很多病理和生理条件下可以增加ACE2的表达和活性,改善疾病状态。如RSV通过上调腹主动脉和肾上主动脉的ACE2的表达和活性来抑制ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤的生长。此外,摄入RSV可以增加高脂饮食小鼠脂肪组织中ACE2的表达,而降低ACE的表达。此前,本课题组发现高血压大鼠中枢第四脑室灌流RSV产生抗高血压效应,且高血压大鼠RVLM内ACE2的变化直接影响血压和交感输出,而ACE2的活性受到ADAM17的调控,同时ACE2和ADAM17也受到AngⅡ的调节,那么RSV在中枢的抗高血压效应是否通过ADAM17蛋白介导调节RVLM内的ACE2活性来参与的呢?中枢RVLM内RAS系统异常是否通过ADAM17介导调节ACE2的活性并参与高血压的形成呢?
  因此,根据以上背景确立本课题的研究目标是(1)高血压大鼠中枢ACE2活性下降是否与TIMP3/ADAM17的异常相关,正常血压大鼠WKY中枢灌流AngⅡ能否在RVLM内通过TIMP3/ADAM17来降低ACE2活性;(2)RSV在交感中枢RVLM是能否来调节ACE2的表达和活性,能否对TIMP3/ADAM17通路产生调节作用;(3)在PC-12细胞中干扰TIMP3的表达,能否拮抗RSV对ADAM17和ACE2调节作用。
  方法:
  实验动物为雄性正常血压Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR),动物体重在250-330g之间,细胞模型为PC-12细胞系。通过第四脑室灌流RSV对大鼠中枢施行持续定量给药,使用无创尾动脉法动态监测实验大鼠血压,使用脑定位微透析法对RVLM的细胞外液进行收集,采用WKY第四脑室灌流AngⅡ来确定其对RVLM内ADAM17和ACE2的影响,使用免疫荧光共聚焦法检测RVLM神经元ADAM17的表达,使用淬灭荧光底物检测脑组织及脑脊液中的ACE2活性。
  结果:
  一、高血压大鼠RVLM前交感神经元ADAM17表达增加
  免疫荧光检测显示大鼠RVLM前交感神经元存在ADAM17的表达;通过Western Blot检测大鼠ADAM17蛋白表达显示:SHR组的RVLM内ADAM17表达显著高于对照组WKY组(P<0.05,n=5)。
  二、AngⅡ通过TIMP3/ADAM17途径下调RVLM内ACE2的功能
  (一)AngⅡ减弱RVLM细胞上ACE2功能而增强RVLM细胞外液ACE2活性。WKY第四脑室分别灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)和AngⅡ一周。相比灌流aCSF,灌流AngⅡ一周后平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)显著增高[MAP:113±4vs.151±4mmHg;HR:360±5vs.395±6beats/min(BPM),P<0.05,n=5],使用试剂盒检测实验标本ACE2活性发现:灌流AngⅡ的WKY组(WKY+AngⅡ)RVLM组织内ACE2活性低于对照组(WKY+aCSF)的活性(454±44.7vs.180±73.2AFU/μg/min,P<0.05,n=5),而RVLM的细胞外液(脑脊液)ACE2活性显著高于对照组(1370+470vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=5)。
  (二)AngⅡ减少RVLM组织内TIMP3表达并增加ADAM17表达。Western Blot检测显示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM内ADAM17表达水平高于对照组(WKY+aCSF),而TIMP3的表达水平则低于对照组。
  三、中枢白藜芦醇(RSV)通过TIMP3/ADAM17通路上调高血压大鼠RVLM内ACE2功能
  第四脑室灌流实验分成四组WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。
  (一)中枢RSV降低高血压大鼠的血压。SHR第四脑室灌流RSV(SHR+RSV)后,第5天血压开始下降,约在第7天下降至最低值后趋于平缓稳定,与对照组SHR+aCSF相比,SHR+RSV组血压显著下降(161±2vs.143±2mmHg,P<0.05,n=5)。而WKY的血压与灌药前相比无明显变化(P>0.05,n=5)。
  (二)RSV增加高血压大鼠RVLM组织ACE2活性,并减少RVLM细胞外液ACE2活性。使用试剂盒分别检测脑组织和透析液中的ACE2活性显示:SHR+aCSF组RVLM内细胞外液(脑脊液)的ACE2活性显著高于WKY+aCSF(1455+287vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=8)而RVLM组织内的活性则显著低于WKY+aCSF组(291±13.2vs.464.0±48.5AFU/μg/min,P<0.05,n=8)。
  结论:
  高血压大鼠RVLM内ACE2表达与活性的下降与增多的中枢AngⅡ诱导的ADAM17功能增强相关,而中枢RSV通过TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM内ACE2的表达和活性,改善心血管功能,本研究揭示高血压中枢ACE2调节的新机理,为高血压的防治策略提供了新的思路。
[博士论文] 鲍礼智
临床医学(内科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:慢性心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段,其中常见的原因是冠心病,特别是心肌梗死。慢性心衰预后较差,有统计表明整体生存率比恶性肿瘤更低。患者的生存质量逐年下降、医疗成本逐渐升高,引起社会的广泛关注。水潴留是心衰的重要病理生理机制,针对水潴留的利尿是心衰规范化治疗的基石。临床上最常用的袢利尿剂能选择性地阻断分布在髓袢升支管腔侧质膜上的Na+-K+-2CI-共转运子,抑制机体对氯化钠的重吸收,产生强大的利尿作用,但其应用也有一定的局限性。利钠治疗继发的低钠血症是影响心衰远期预后的危险因素,部分患者出现的利尿剂抵抗是临床常见的难题。因此,新的水代谢调控靶点和高效安全、特异性强的利尿药物研究一直是学术界关注的热点。
  水通道蛋白2(Aquaporin2,AQP2)分布于肾脏集合管主细胞的管腔顶质膜和胞浆的囊泡内,是调控集合管水通透性的关键通道蛋白,主要承担集合管腔水的重吸收和原尿浓缩的功能。AQP2在管腔顶质膜的分布及合成上调,进而增加水重吸收,是心力衰竭水潴留的最重要病理生理机制之一。针对调控AQP2蛋白开发的新型利尿剂显示出众多优越性,具有广阔的临床应用前景。
  肥胖抑制素obestatin是2005年由斯坦福大学张键博士等人发现的一种由23个氨基酸构成的多肽,经酰胺化修饰成为生物活性形式,在调节消化系统功能、体重变化、糖脂代谢、血管内皮功能等方面有广泛作用。中枢侧脑室给予obestatin可直接影响口渴中枢,减少机体的水摄入,同时通过抑制下丘脑的精氨酸加压素(AVP)的合成和释放,下调肾脏对水的重吸收。心力衰竭时外周循环obestatin水平升高,由于循环中obestatin不能通过血脑屏障进入中枢,那么外周循环obestatin对肾脏水重吸收是否有调节作用值得进一步研究。
  目的:目前在慢性心力衰竭机制研究中,关于obestatin和AQP2的作用鲜有报道。本课题旨在通过在体和体外实验,观察obestatin对水代谢和肾脏内髓AQP2的长时调控作用,通过基因芯片筛选差异表达基因以及基因沉默技术来分析其可能的调控机制。
  方法:利用临床常用器材,设计自制经口气管插管的定位防逆流装置和尾静脉穿刺用途的四联固定器,并在预实验中进行测试评估。采用开胸结扎前降支的方法构建大鼠急性心肌梗死模型,6周后通过心脏超声来筛选EF值≤45%的大鼠作为心力衰竭模型,随机纳入造模空白组、dDAVP组、V2受体拮抗剂组、obestatin高剂量组、obestatin低剂量组、NA-obestatin组、obestatin抗血清组等7组,加上假手术组共8组。分别尾静脉注射生理盐水、dDAVP、OPC31260、obestatin(200ug/kg)、obestatin(100ug/kg)、NA-obestatin、obestatin抗血清,连续注射14天。第15天(造模后第8周末)为实验终点并取大鼠肾脏内髓。实验全程定期测量尿量、体重,干预前后分别行心脏彩超检查及留取血尿样本。使用ELISA方法检测血BNP和血AVP水平,使用荧光定量PCR检测Aqp2基因表达,免疫组化和western blotting相对定量AQP2蛋白在肾脏内髓的表达情况。体外培养mIMCD3细胞,待细胞长至70%融合状态,无血清培养基空白12h后,分别给予不同时间节点(6h、12h、24h、36h、48h,10-7mmol/L的obestain)和不同干预措施(PBS、10-7mmol/L的obestatin、0.5×10-7mmol/L的obestatin、NA-obestatin、dDAVP、OPC31260、obestatin抗血清)的刺激,24h后分别提取RNA和蛋白,通过定量PCR和western blotting来检测AQP2基因和蛋白的表达水平。通过基因芯片对obestatin和PBS分别干预后的mIMCD3细胞mRNA进行差异表达基因筛查,通过生物信息学分析推测可能的调控机制并选取73个感兴趣的基因进行real-time qPCR验证。从验证后的基因中选取与水代谢密切相关的Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因进行特异性敲减,观察obestatin调控AQP2表达的变化。
  结果:成功构建大鼠心梗后慢性心衰模型,成模率为51.16%。造模后8周,心衰模型各组间LVIDd、LVIDs、LVVold、LVVols、EF%、FS%等心功能指标以及血尿电解质组间比较无明显差异。Obestatin高剂量组与干预前相比24h尿量明显增加(75.18±8.51vs.40.77±5.49mL/kg,P<0.001)。Obestatin高剂量组与造模空白组相比,血浆BNP浓度明显下降(1152.61±99.31vs.1504.54±85.62pg/mL,P<0.001),血浆AVP无明显变化(12.13±0.74vs.12.41±1.04pg/mL,P>0.05)。Real-time qPCR及免疫组化、western blotting显示肾内髓AQP2基因和蛋白表达与造模空白组比较均下降。体外培养的IMCD3细胞经obestatin在不同时间点刺激后,AQP2基因和蛋白的表达量水平波动基本一致,与对照组(0h)相比,6h、12h、24h、36h和48h时间点AQP2的表达量显著降低(P<0.05),在6h-24h区间内,随着刺激时间的延长,其下降趋势越明显;但是36h后,其下降趋势呈现回升现象。体外培养的mIMCD3细胞分别给予不同措施刺激24h后,与假手术组相比,obestatin高剂量组、obestatin低剂量组以及OPC组AQP2基因和蛋白的表达量显著降低(P<0.05),与obestatin高剂量组相比,抗血清组AQP2基因和蛋白的表达量显著升高。在obestatin刺激后的mIMCD3细胞中表达差异有统计学意义的基因主要有Pparg、Aqp2、V2r、Fgf23、Myo1f、Slc8a1,可能参与长时调控的信号通路有FGF信号通路。敲减Pparg、V2r基因能使mIMCD3细胞的AQP2表达下调,同时给予obestatin刺激24h后,下调幅度更为显著。敲减Gpr39基因对mIMCD3细胞的AQP2表达无明显影响,但同时给予obestatin刺激后,能显著削弱obestatin对V2R、PPARG、AQP2的下调效应。
  结论:在体实验和体外实验证实了obestatin能下调肾脏内髓AQP2表达,在体实验还观察到利尿作用及心衰的生化指标好转。基因芯片筛查结果的生物信息学分析及定量PCR验证发现obestatin通过V2R与PPARG两条信号通路来下调IMCD3细胞的Aqp2基因表达,Myo1f、Slc8a1基因可能参与钙调蛋白结合和细胞骨架蛋白结合等分子生物学功能的调控。利用shRNA技术特异性敲减Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因,在基因及蛋白水平证实了obestatin通过与GPR39受体相互作用来下调V2R、PPARG和AQP2的表达。
[博士论文] 童文文
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止点炎、渐进发展的骶髂关节炎以及脊柱关节强直。该病好发于青壮年男性并且发病率较高,由于缺乏典型的早期症状和明确的早期生物标记物,AS通常在第一次临床症状出现后的8-10年时间才能得到明确的诊断。晚期患者脊柱的骨性强直及髋关节的骨性融合将导致患者完全丧失生活和工作的能力,对家庭和社会产生极大负担。脊柱及关节部分的骨化作为AS主要病理特征,目前关于它的发生、发展机制也尚不清楚。因此寻找AS的早期诊断标志物以及探索骨化发生的生物学机制一直是AS研究的热点。
  自身抗体是多种自身免疫性疾病的免疫标记物,可作为早期诊断,疾病活动度的观测,治疗预后评估等的标志物。由于缺乏类风湿因子,强直性脊柱炎一直被认为是血清阴性脊柱关节病,血清抗体较少被考虑作为生物标记物进行研究。然而,近年来越来越多的证据表明B细胞和相应的体液免疫反应可能通过抗原提呈,抗体产生等方式参与AS的发病过程。因此,本课题试图通过蛋白芯片在AS血液样本中筛选到合适的可以作为AS早期诊断的标志物,并研究自身抗体相应的抗原蛋白在疾病发生发展中的作用及机制,从而为强直性脊柱炎寻找合适的标志物及可能的治疗靶点。
  目的:
  第一部分:筛选强直性脊柱炎患者血浆内的自身抗体并扩大样本验证Kaiso蛋白自身抗体在强直性脊柱炎血浆内的表达情况。
  第二部分:探究Kaiso分子在体内外实验中对成骨分化进程的影响。
  第三部分:探索Kaiso分子调节成骨分化进程的具体机制。
  方法:
  第一部分:(1)HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎患者及正常人血浆:经过芯片封闭,芯片杂交,芯片检测,数据提取与分析等步骤筛选出强直性脊柱炎患者血浆内特异性的自身抗体。(2)血浆自身抗体表达水平的验证:基于Meso Scale Discovery(MSD)技术,利用夹心法,即将重组蛋白包被在板底,然后加入含有待测抗体的血浆样本或阳性对照抗体进行孵育,再加入带有sulfo标签的抗待测抗体的二抗,最终利用电化学发光原理检测,从而得出不同血浆样本中的抗体表达水平。
  第二部分:(1)Kaiso分子过表达、敲减稳转细胞株的建立:通过病毒载体的构建,慢病毒包装,慢病毒感染细胞及嘌呤霉素筛选等实验步骤完成慢病毒感染稳转细胞株的构建。荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验验证过表达及敲减效率。(2)成骨分化的诱导及检测:在培养基中添加50μg/ml抗坏血酸,10mMβ-甘油磷酸钠,50ng/ml BMP2重组蛋白进行成骨诱导。在不同时间点使用PCR技术检测骨化相关分子的变化、使用BCIP/NBT法进行染色检测碱性磷酸酶的表达情况、使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性、使用茜素红S染色法观察钙结节形成,从而评价不同细胞株成骨分化能力。(3)裸鼠体内异位成骨实验:将Kaiso过表达、敲减及相应对照的稳转株细胞株接种到β-TCP材料支架上,细胞-材料复合物植入裸鼠肌肉内部模拟活体环境,最后通过μCT扫描骨密度值及HE染色观察材料上细胞的成骨情况来评价不同稳转细胞株的成骨能力。
  第三部分:(1)RNA测序了解Kaiso过表达及敲减后基因表达的变化情况:通过提取RNA,RNA质量检测,建立cDNA文库,上机检测,测序结果分析等步骤检测Kaiso过表达及敲减后差异表达的基因。并进一步进行GO、KEGG分析探究差异基因富集到的生物过程及信号通路。(2)使用PI3K-Akt信号通路抑制剂并加入成骨诱导液进行诱导,探究该信号通路是否参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)Kaiso分子结合的目的基因预测及验证:根据生物信息学分析预测转录因子Kaiso可能结合的目的基因,ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验验证Kaiso与Itga10启动子区域的结合及对Itga10的表达调控。(4)Itga10敲减实验进一步验证Itga10与PI3K-Akt信号通路及成骨分化的关系。
  结果:
  第一部分:(1)通过HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎及正常人血浆,结果在强直性脊柱炎病人血浆中特异性筛选出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗体。(2)扩大相应样本量利用MSD技术对其中感兴趣的Kaiso蛋白抗体进行验证,结果显示早期AS患者体内Kaiso抗体表达水平显著高于正常人,晚期AS患者血浆内表达水平与正常人无显著差异。
  第二部分:(1)通过慢病毒感染技术成功构建Kaiso基因过表达和敲减MC3T3-E1稳转细胞株。使用成骨诱导液分别对Kaiso过表达及敲减稳转细胞株进行成骨诱导,结果发现骨化相关分子、碱性磷酸酶的表达量及活性、钙结节形成等反映成骨分化能力的指标在Kaiso过表达后被显著抑制,而在Kaiso敲减后明显增强。(2)裸鼠体内异位成骨实验证实Kaiso过表达稳转细胞株体内成骨能力低于对照,而Kaiso敲减稳转细胞株体内成骨能力与对照组相比显著增强。
  第三部分:(1)对RNA测序所得的差异基因进行GO分析发现,Kaiso过表达后下调的基因和Kaiso敲减后上调的基因均能够富集到骨化相关生物过程。KEGG分析发现PI3K-Akt信号通路在Kaiso过表达时被抑制,Kaiso敲减时被激活。其中Itga10的表达变化与PI3K-Akt信号通路变化一致。(2)PI3K-Akt信号通路抑制剂证实该通路参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验发现Kaiso可以通过结合存在于Itga10启动子区域的特异序列从而抑制Itga10的表达。(4)Itga10敲减实验证实Itga10的表达与PI3K-Akt信号通路成正相关,敲减Itga10能够抑制细胞的成骨分化。裸鼠体内异位成骨实验进一步证实敲减Itga10对细胞成骨分化的抑制作用。
  结论:
  本课题通过三个部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗体在早期强直性脊柱炎患者血浆内高表达,进一步探究Kaiso分子与骨化这一强直性脊柱炎病理过程的关系,结果显示Kaiso分子可通过结合Itga10来调控PI3K-Akt信号通路从而抑制成骨分化过程。这为强直性脊柱炎的早期诊断及骨化的干预治疗提供了一个新的可能。
[硕士论文] 彭巍
医学心理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着社会的进步和科技的发展,应激成为了人们生活中不可避免的事件,而且应激的复杂性和强度也不断增加。按应激持续的长短,可分为急性应激和慢性应激,慢性应激指机体长期而持久的紧张状态。长期慢性应激会导致人体内环境的紊乱,引起包括肝脏脂肪变性在内的各种病理变化,但应激导致肝脏脂质沉积的具体机制并不清楚。长期以来,肝脏脂质沉积被认为是肥胖者的“专利”,是长期不良的生活习惯和生活方式所致,但是越来越多的“瘦子”被查出患有脂肪肝,特别是在长期慢性应激状态的人群中比率更高。因此,阐明慢性应激致肝脏脂质沉积的作用及其机制,从而寻求行之有效的防治方法,具有着显著的现实意义。FoxO1是叉头蛋白O家族的一员,是调节细胞生长、分化和代谢的关键分子,在糖代谢调控中起重要作用。越来越多的研究表明,FoxO1在脂代谢中也起关键作用。本实验室前期研究表明慢性应激可导致肝脏脂质沉积和FoxO1激活,但FoxO1在应激致肝脏脂质沉积中的作用及其机制仍不清楚,且国内外研究鲜有报道。
  研究目的:明确FoxO1在应激致肝脏脂质沉积的关键性作用,探讨FoxO1在肝脏脂质沉积中的作用机制。
  研究方法:1、将雄性C57BL/6小鼠分为四组:对照组、慢性应激组、慢性应激+FoxO1抑制剂组、FoxO1抑制剂组,6周后通过肝脏脂质检测和油红O染色评定小鼠肝脏脂质沉积情况;通过Western blot检测小鼠肝脏FoxO1蛋白及其磷酸化水平,用实时荧光定量PCR检测FoxO1基因及经典下游调控基因的转录水平,明确慢性应激及抑制剂对FoxO1的影响。
  2、用实时荧光定量PCR检测脂质代谢相关基因的转录水平,并分别检测四组小鼠摄食量、体重、糖代谢变化情况,探究FoxO1致应激小鼠肝脏脂质沉积的机制。
  3、将Hepa1-6细胞分为四组:对照组、皮质酮处理组、皮质酮+FoxO1抑制剂处理组、FoxO1抑制剂处理组,48h后通过油红O染色评定细胞脂质沉积情况;通过Western blot检测四组细胞FoxO1蛋白及其磷酸化水平,用实时荧光定量PCR检测FoxO1基因及经典下游调控基因、脂质代谢相关基因的转录水平。
  研究结果:1、慢性应激可致小鼠肝脏甘油三脂沉积,血清甘油三脂、游离脂肪酸含量显著增加,同时肝脏FoxO1激活;而FoxO1抑制剂可以抑制FoxO1活性,改善小鼠肝脏甘油三脂沉积,降低血清甘油三脂、游离脂肪酸含量;四组小鼠肝脏和血清胆固醇含量无明显差异。
  2、慢性应激使小鼠摄食量和体重增长减少,肝脏甘油三脂合成基因Fasn、脂肪酸摄取基因FATP和FABP、胆固醇合成基因HMG-CoAR、胆固醇氧化基因CYP7A1转录增加,FoxO1抑制剂降低这些基因转录水平,但对摄食量和体重增长无明显作用;四组小鼠空腹血糖、餐后血糖、胰岛素、葡萄糖耐量和胰岛素耐量以及肝脏ACC1、SCD1、CD36、PPARα、Acox1、Lcad、Mcad、Pdk4、Cpt1a、Ucp2、ABCG1基因转录无明显差异。
  3、皮质酮可致Hepa1-6细胞脂质沉积、FoxO1激活、甘油三脂合成基因Fasn转录显著增加,FoxO1抑制剂抑制FoxO1活性、减轻细胞脂质沉积、降低Fasn转录水平。
  研究结论:慢性应激可致小鼠肝脏脂质沉积,这一作用是通过应激激素皮质酮激活FoxO1从而促进肝脏甘油三脂合成及游离脂肪酸的摄取所介导。
  全文小结:本工作通过研究FoxO1在应激小鼠肝脏脂质沉积中的作用,发现慢性应激可以通过皮质酮激活FoxO1,而FoxO1作为转录因子通过调控肝脏甘油三脂合成和游离脂肪酸摄取相关基因的表达,导致肝脏脂质沉积和高甘油三脂血症,表明FoxO1在脂代谢紊乱中起重要的调节作用,并提示FoxO1抑制剂可作为脂代谢紊乱防治新的途径。
[硕士论文] 于金
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:便秘是一组临床常见的复杂症状,表现为排便次数减少、排便困难、粪便干硬。排便次数减少指每周排便少于3次。排便困难包括排出困难、排便费力、排便不尽感、排便费事以及需要手法辅助排便。由于缺乏有效的治疗方法,它给病人带来了巨大的经济负担,极大地影响了患者的生活质量,促使人们寻找新的、有效的方法来治疗便秘。2015年,Ron等人10进行了一项验证振动胶囊安全性和通过其来治疗便秘的潜在功效的研究。该胶囊是利用电磁信号和固定的振动档位(A或B,由医师推荐)预定延迟6-8h使胶囊到达结肠后开始振动。
  结果报告没有发生严重的不良反应,有暂时的轻微的副作用。26例患者中有23例肠蠕动平均数显著增加。但是该振动胶囊只有一种振动模式,且无法在体外对服用的胶囊进行监测和调试。
  目的:
  我们和上海安翰医疗技术有限公司合作,研制出一种经智能手机体外调控的、多档位的创新型振动胶囊系统(Vibrating Capsule,VC),该系统由振动胶囊本身和通常称为适配器的外部配置装置(external configuration device,ECD)组成。VC有各自的半导体芯片,每个芯片都有自己独自的序列号,以利于被ECD识别和控制。我们利用该系统先后对8条比格犬和便秘患者应用来验证其安全性,并探索其可能对排便的影响和便秘的治疗作用。
  方法:
  在第一部分实验中,8条比格犬均先后依次喂服低、中、高3个档位的VC并运用常规方法和设备测其相应的一般生理指标(包括体温、心率、呼吸、体重、行为活动状态,每日摄食量、每日饮水量等)、血液指标(血白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白,血小板计数,丙氨酸氨基转移酶,天冬氨酸氨基转移酶,总胆红素,直接胆红,总蛋白,白蛋白,尿素氮,血肌酐,钾,钠)、粪便指标(排便量、排便次数,排便的布里斯托大便性状评分,粪便常规及粪便潜血检查)等;之后对8条犬喂服超高档位的VC,并行腹部CT及安乐死后解剖取样行病理检查。
  在第二部分试验中,我们设计了一项计划45例功能性便秘患者的双盲、安慰剂对照研究,以评价振动胶囊对于缓解和治疗功能性便秘的有效性及对肠道传输的作用。包括2周不服用胶囊的基础期,6周双盲、安慰剂对照治疗阶段,及最后一次使用胶囊后14天随访阶段(随访至胶囊排出停止)。受试者参与这个试验的总持续时间约10至14周,包括基础期阶段、治疗阶段及试验后随访阶段。
  结果:
  在动物试验中(1)应用VC前后犬的一般生理指标和血液指标并无明显差异(P>0.05)。腹部CT及病理检查均未见明显异常。(2)应用VC后犬的排便次数增加(P<0.05或<0.01),但不同档位之间的VC没有显著差异(P>0.05)。(3)随着胶囊档位的不同,排出VC的时间呈缩短趋势,但统计学没有显著差异(P>0.05)。(4)VC对犬排便的性状未产生明显影响(P>0.05)。(5),能够顺利通过智能手机检测到犬体内的VC信号,并进行参数调试。
  在临床试验中的初步结果显示(1)已完成振动胶囊治疗的患者,无明显与试验器械有关的不良事件发生。(2)胶囊自服用到自发排出时间未发生超过14天的情况。(3)第6周达到≥3SCBM的受试者百分比:假胶囊组为33.3%,而振动胶囊组为60%。(4)临床试验目前仍在进行中。
  结论:
  在动物实验中,VC是安全的,应用VC能使犬的排便次数增加,随着胶囊档位的不同,排出VC的时间的均值呈现缩短趋势;VC对犬排便的性状无明显影响;体外通过智能手机调控VC是可行的。
  在临床试验中,初步认为振动胶囊是安全的,对受试者生活质量具有改善作用。
[硕士论文] 潘云
内科学(内分泌与代谢病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、探索在空腹血糖及糖化血红蛋白水平均正常的慢性胰腺炎(CP)患者中通过口服葡萄糖耐量试验(O GTT)早期发现糖尿病和糖耐量减低的情况,提高CP相关性糖尿病的早期诊断率,以便尽早开展干预措施。2、比较慢性胰腺炎患者OGTT-胰岛素/C肽释放试验的血糖、胰岛素、C肽的曲线特点,分析与临床特征及其他检验指标的相关性,分析CP相关性糖耐量异常发生的危险因素。
  方法:
  根据纳入和排除标准,纳入2017年6月至2018年2月在长海医院消化内科就诊并收治入院的慢性胰腺炎患者,通过基本病史和本次入院OGTT试验结果,将所有慢性胰腺炎患者分为慢性胰腺炎合并糖耐量正常组、慢性胰腺炎合并糖耐量减低组、慢性胰腺炎合并新诊断的糖尿病组及慢性胰腺炎合并既往糖尿病组。分析比较四组间糖代谢的特点,描绘OGTT血糖、胰岛素、C肽释放曲线,分析曲线的特点,及其与临床特征及其他检验资料的相关性,分析发生糖耐量异常的危险因素。根据基本病史资料,按是否酗酒,是否抽烟,性别将慢性胰腺炎分组,比较不同组间的代谢特点及临床特征差异。
  结果:
  共纳入慢性胰腺炎患者60例,其中糖耐量正常组13例,糖耐量减低组15例,新诊断的糖尿病组15例,既往糖尿病组17例。1、在慢性胰腺炎患者中发现仅通过空腹或糖化血红蛋白水平筛查新发现糖尿病4例,空腹血糖受损2例,糖耐量异常的检出率为14.0%,而通过OGTT试验发现糖耐量减低15例,新诊断的糖尿病组15例,糖耐量异常的检出率高达69.8%。2、四组间糖代谢特点比较:慢性胰腺炎合并既往糖尿病组的OGTT0min、30min、60min、120minC肽水平均较其他三组低,胰岛素曲线下面积、C肽曲线下面积(C-PAUC)、胰岛素分泌指数(HOMA-β)也小于其他三组;慢性胰腺炎合并新诊断的糖尿病组的胰岛素早期分泌指数(ΔI30/ΔG30)和胰岛素分泌敏感性指数(ISSI-2)低于慢性胰腺炎合并糖耐量正常组;四组间胰岛素敏感性指数(ISIcomp)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)差异没有统计学意义。3、OGTT-胰岛素/C肽释放试验的血糖、胰岛素、C肽分泌曲线特点:慢性胰腺炎合并既往糖尿病组血糖、胰岛素、C肽的分泌高峰均在120min,C肽的变化(峰值-基线,峰值/基线)在四组间存在显著差异(p<0.001),慢性胰腺炎合并既往糖尿病组C肽升高的幅度和倍数较其余三组均低;慢性胰腺炎合并新诊断的糖尿病组血糖高峰在60min,而胰岛素、C肽分泌高峰在120min;慢性胰腺炎合并糖耐量减低组血糖、胰岛素分泌高峰在60min,而C肽分泌高峰在120min;慢性胰腺炎合并糖耐量正常组血糖、胰岛素、C肽分泌高峰均在60min。4、酒精性慢性胰腺炎和非酒精性慢性胰腺炎患者OGTT-胰岛素/C肽释放试验不同时间点的血糖、胰岛素、C肽水平及HOMA-β、HOMA-IR、ISIcomp、ΔI30/ΔG30差异均无统计学意义。酒精性慢性胰腺炎组患者男性患者比例、吸烟患者比例、胆总管狭窄比例大于非酒精性CP组患者。
  结论:
  1、本研究提示在慢性胰腺炎患者中常规行OGTT试验可以提高糖代谢异常的检出率(55.8%),具有较好的糖尿病早期诊断价值。
  2、慢性胰腺炎合并既往糖尿病组OGTT-胰岛素/C肽释放试验的血糖、胰岛素、C肽的分泌高峰均在120min,C肽的变化(峰值-基线,峰值/基线)较其余3组均低,存在胰岛素/C肽分泌不足。
  3、慢性胰腺炎合并新诊断的糖尿病组、糖耐量减低组血糖高峰在60min,而C肽高峰在120min,早期胰岛素分泌指数(ΔI30/ΔG30)也较慢性胰腺炎合并糖代谢正常组偏低,提示CP相关性糖尿病病程早期即存在胰岛素/C肽早期时相的分泌不足。
[硕士论文] 刘健
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)在全球范围内均具有较高的发病率及病死率,且随着年龄的增加而升高。为加强对CAP诊断和治疗的规范化管理,2006年中华医学会呼吸病学分会感染学组制定了社区获得性肺炎诊断和治疗指南。历经10年,国内CAP的病原谱分布及其耐药特点发生了变化,同时出现了新的抗菌药物及诊疗技术手段。中华医学会呼吸病学分会感染学组结合国内外最新研究成果,对CAP指南进行修订,发布了“中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)”(简称新版指南)。为配合我国成人CAP新版指南推广,了解上海地区各级医院医师以及呼吸与非呼吸专科医师对CAP诊断和治疗的认知现况并与指南推荐意见相比较,为指南的深度推广提供方向和依据。
  方法:
  根据CAP诊断和治疗过程中的常见问题设计问卷,问题主要涉及被调查者的人口特征和对CAP诊断和治疗的认知,包括病原的分布特点与耐药性、诊断标准与病原学诊断方法、严重程度的判断及收入院或重症监护病房的标准、经验性抗菌药物的选择和治疗后评价、对新版指南的认识与运用等。在新指南推广培训前告知参会医师通过微信二维码扫描进入电子问卷进行网上作答并对结果进行汇总分析。
  结果:
  共收到有效问卷1254份,其中三级、二级和一级医院的医师分别占46.1%(578人)、26.4%(331人)和27.5%(345人);呼吸专科医师占31.4%(394人),其他相关专业(含急诊科、ICU、感染科、全科、其他内科、外科)占68.6%(860人)。在诊断时78.1%(979/1254人)的医师对超过半数的CAP患者行胸部CT检查,二三级医院的医师及呼吸专科医师进行胸部CT检查的比例更高;60.3%(756/1254人)的被调查者采用CURB-65评分评估CAP患者病情的严重程度,“呼吸衰竭、需要机械通气”及“感染性休克”是收入重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)最常用的标准。CAP前5位的病原微生物依次为肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌和肺炎衣原体;重症肺炎血培养送检率普遍较低,且各级医院送检率比较差异无统计学意义(x2=1.211,P>0.05)。针对非重症CAP的抗菌药物治疗多选择单药,重症CAP中最常用的单药方案是三/四代头孢菌素;联合用药时三级医院最多选用“碳青酶烯类和万古霉素”,一二级医院为“β-内酰胺类和大环内酯类”,专科医师最多为“β-内酰胺类和喹酮诺类”,非专科医师最多为“β-内酰胺类和大环内酯类”;在更换抗菌药物的标准中,有76.6%(961/1254人)的医师认同影像学出现新的阴影时需调整抗菌药物,一级医院及非专科医师更多将“影像学肺部阴影完全吸收”作为停用抗菌药物和出院的指征,将“体温大于39℃,一般退热药物无效”、“大片实变影”、“多叶段肺炎”等作为糖皮质激素应用的指征;建议患者接种肺炎链球菌或流感疫苗的比例在二三级医院中为59.8%(198/331人),58.1%(336/578人)和61.6%(204/331人),58.3%(337/578人),均明显低于一级医院的74.8%(258/345人)和75.1%(259/345人),差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  目前在CAP诊治过程中存在胸部CT检查使用过度,重症肺炎血培养送检率低,糖皮质激素应用指征过于宽泛等问题。尽管我国已于2006年出版了首部成人CAP诊断和治疗指南,但目前上海地区医师对CAP诊治的认知与指南推荐尚有不少差距,中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)的推广尤显重要,需要在各级医院尤其是广大基层医院中加大普及力度,进一步规范CAP的诊断和治疗。
[硕士论文] 焦培磊
生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原发性高血压是一种人类常见的慢性疾病,约占高血压患者总数的90-95%。尽管目前绝大部分高血压患者经过药物治疗可以将血压控制在正常水平,但高血压的严重并发症如脑卒中和心力衰竭等疾病的发病率仍旧居高不下,因此对高血压的发病机理进行深入研究仍然具有重要意义。除了体液调节,在高血压的形成过程中神经调控扮演了重要的角色,交感神经活动亢进是高血压病的主要特征和病理基础,并且与脑卒中和心力衰竭等疾病的发展预后密切相关。头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感神经活动的关键区域,有研究证实RVLM中的前交感神经元兴奋性增强是高血压状态下交感神经活动亢进的主要原因,因此,探究高血压病理状态下RVLM内前交感神经元兴奋性增强的作用机制并寻求有效降低其兴奋性的方法对探索高血压的预防和治疗具有重要作用和深远意义。
  氧化应激(oxidative stress)是指由于体内氧化和抗氧化系统的平衡被打破,更倾向于氧化,产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。有研究报道,与正常血压Wistar-Kyoto(WKY)大鼠相比自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)RVLM的氧化应激明显增强;在SHR的RVLM内过表达超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)基因可以使血压和心率下降,表明高血压状态下的交感神经亢进与氧化应激密切相关。近年来研究发现核转录因子Nrf2(nuclear factor-erythroid-2-related factor2)在体内的抗氧化应激防御以及维持氧化还原稳态中发挥了重要的作用。研究证实与WKY相比,自发性高血压脑卒中大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat,SHRSP)的血管平滑肌细胞中Nrf2的活化程度下降,而Nrf2激动剂莱菔硫烷(L-sulforaphane)可以改善SHRSP的血管功能紊乱。但目前关于高血压交感神经活动亢进下氧化应激水平增强的具体机制尚不明确。
  β-arrestin1是一种G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)的重要调节蛋白,它是最初在提纯β-肾上腺素受体激酶的过程中被发现的,它可以通过调节受体的脱敏、内吞和介导细胞信号转导等作用来发挥其负性调控G蛋白偶联受体的作用。近年来研究发现,在心脏β1AR中,β-arrestin可以通过反式激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)发挥心血管保护效应;在脑缺血模型中,β-arrestin1可以通过调节Beclin-1介导的自噬产生神经保护效应,由此可见,β-arrestin1在外周心血管系统和中枢神经系统中均可发挥生物学效应。然而目前RVLM内β-arrestin1在心血管生理和病理调控中的作用特点与意义尚不清楚。
  在外周心血管的研究,提示β-arrestin1与氧化应激关系紧密,但二者之间的关系在心血管调控中枢的作用与意义尚不明确,而且中枢β-arrestin1与Nrf2是否存在某些联系尚需验证。本课题的主要研究目的是明确中枢β-arrestin1在改善高血压心血管功能中的作用与机制,并探究其作用途径是否通过Nrf2途径改善高血压中枢的氧化应激水平,从而为β-arrestin1的作用机制提出了新的内容并且为高血压状态下中枢抗氧化应激提供了新的思路。
  方法:
  实验动物均为16周龄,体重在250-350g之间的雄性正常血压大鼠WKY和自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)。首先,利用免疫荧光确定RVLM内前交感神经元上存在β-arrestin1的表达,接着用Western blot的方法检测RVLM内β-arrestin1的蛋白表达含量。为了探究中枢β-arrestin1对高血压心血管功能的作用,我们向大鼠RVLM分别转染AAV-GFP(对照组)和AAV-Arrb1(β-arrestin1过表达组),并持续监测实验动物的血压。利用DHE检测RVLM内ROS含量,Western blot检测RVLM内Nrf2,p-Nrf2,Keap1(胞质中与Nrf2稳定结合),HO-1和NQO-1(Nrf2下游蛋白分子)的表达含量并用免疫荧光观察p-Nrf2进入细胞核的情况。
  为了进一步明确中枢β-arrestin1的作用机制,我们分别向SHR的RVLM分别转染AAV-GFP和AAV-Arrb1,转染病毒2周后,分别向RVLM注射Negative Control(NC)和Nrf2siRNA。在麻醉状态下监测大鼠的血压、心率和肾交感神经活动,并用DHE荧光探针检测RVLM内ROS含量,Western blot检测RVLM内Nrf2,p-Nrf2,Keap1,HO-1和NQO-1的表达含量。
  结果:
  一、中枢β-arrestin1对自发性高血压大鼠心血管功能的调节作用
  1.β-arrestin1在自发性高血压大鼠RVLM内的表达情况
  免疫荧光证实自发性高血压大鼠RVLM内前交感神经元上存在β-arrestin1的表达。Western blot结果显示,与WKY组相比,SHR组的RVLM内β-arrestin1表达含量明显降低(P<0.05,n=4)。
  2.RVLM过表达β-arrestin1明显降低SHR的血压水平
  清醒状态下监测血压结果显示:与SHR-GFP组相比,SHR-Arrb1组血压逐渐降低并在病毒转染2周后稳定于低水平(SHR-GFP组:165.4±2.0mmHg;SHR-Arrb1组:142.8±1.5mmHg;p<0.05,n=5),而WKY两组血压无明显差异。
  二、中枢β-arrestin1降低自发性高血压大鼠RVLM的氧化应激水平
  DHE荧光探针结果显示:与WKY-GFP组相比,SHR-GFP组RVLM内ROS含量明显增加;SHR-Arrb1组RVLM内ROS含量明显低于SHR-GFP组(p<0.05,n=5),结果提示:SHR的RVLM氧化应激水平明显高于WKY,过表达β-arrestin1明显降低SHR的RVLM氧化应激水平。
  三、中枢β-arrestin1通过促进Nrf2活化发挥抗氧化应激效应
  1.过表达β-arrestin1促进RVLM内Nrf2的活化
  Western blot结果显示:与WKY组相比,SHR组RVLM内p-Nrf2表达含量显著降低,同时,其下游HO-1和NQO-1表达含量显著降低(P<0.05,n=5)。RVLM过表达β-arrestin1后,与SHR-GFP组相比,SHR-Arrb1组RVLM内p-Nrf2表达含量显著增加,下游HO-1和NQO-1表达含量显著增加(P<0.05,n=5)。免疫荧光结果显示:p-Nrf2(红色荧光)在细胞核内分布增多,与蓝色细胞核混合呈淡紫色。
  2.干扰Nrf2可以逆转中枢β-arrestin1的抗氧化应激效应
  与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组血压和肾交感神经活动显著升高(P<0.05,n=4),而SHR-GFP两组则无明显变化。DHE荧光探针结果显示:与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组RVLM内ROS含量明显增加,而其与SHR-GFP-NC组相比无明显差异。Western blot结果显示:与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组RVLM内Nrf2和p-Nrf2表达含量均显著降低,同时,其下游HO-1和NQO-1表达含量显著降低(P<0.05,n=5)。
  结论:
  中枢β-arrestin1通过降低RVLM氧化应激水平改善SHR心血管功能异常,RVLM过表达β-arrestin1促进Nrf2活化,同时RVLM特异性干扰Nrf2逆转中枢β-arrestin1的抗氧化应激效应。本研究证实中枢β-arrestin1通过促进Nrf2活化发挥交感中枢抗氧化应激效应,从而改善高血压心血管功能。
[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
[博士论文] 邵柏棕
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:现今,炎症相关疾病的发病率逐年增加,严重危害人类的健康,其中,动脉粥样硬化和多发性硬化尤为显著。动脉粥样硬化已成为现代社会危害人类健康的杀手之一,可以继发心肌缺血、心肌梗死、血栓形成,甚至由于血栓脱落引起急性心血管事件的发生。动脉粥样硬化在病理上大体可分为四期,分别为脂质条纹期、纤维斑块期、粥样斑块期及晚期继发改变期,泡沫细胞的形成是粥样斑块形成的病理基础。现在普遍认为,泡沫细胞主要来源于聚集于动脉内膜下的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞,其中更多的泡沫细胞来源于巨噬细胞,其形成过程主要为血液中的单核细胞聚集于内膜受损动脉的内膜下转变为巨噬细胞,巨噬细胞吞噬异常聚集于血管壁内膜下层的氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoproteins,oxLDL)及其它修饰的脂蛋白,进而转变成为泡沫细胞。多发性硬化是一种炎症相关的神经退行性变,多发生在青少年,是致畸致残的主要疾病。目前认为,多发性硬化的主要病因是中枢神经系统的慢性炎症,其中,小胶质细胞作为中枢神经系统中的巨噬细胞发挥着重要的作用。因此,抑制小胶质细胞介导的炎症免疫反应在多发性硬化的防治工作中尤为关键。尽管已有很多研究探讨动脉粥样硬化和多发性硬化的防治,然而,两者发生发展的机制尚未阐明,有效的疾病防治手段仍需探索。β-arrestin-1蛋白属于β-arrestins蛋白家族,是一种多功能的胞浆调节蛋白。传统认为,其主要功能是参与G蛋白偶联受体的调节作用,主要使G蛋白偶联受体发生内吞或脱敏;然而,近年来的研究表明,β-arrestin-1可以作为支架蛋白参与多种G蛋白偶联受体依赖或非依赖的信号通路。已有报道指出,β-arrestin-1在多种疾病中发挥重要作用。在动脉粥样硬化中,已有研究表明,血管平滑肌中的β-arrestin-1可以通过抑制内皮下平滑肌的增殖、迁移进而降低斑块的新生内膜增生,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而,巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚无文献报道。此外,在多发性硬化中,敲除β-arrestin-1的小鼠其发生多发性硬化(EAE)的疾病严重程度显著降低,说明了β-arrestin-1在多发性硬化中的作用,然而,巨噬细胞(小胶质细胞)中的β-arrestin-1作用及其具体机制尚未明确。本课题对巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化和多发性硬化中的作用及其机制进行研究,主要分为三个部分:第一部分实验中,探究了巨噬细胞β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的保护作用,这种保护作用的实现有自噬过程的参与;第二部分实验中,发现巨噬细胞β-arrestin-1参与了α7nAChR介导的抗动脉粥样硬化作用;第三部分实验中,探讨巨噬细胞β-arrestin-1参与调控了α7nAChR的抗多发性硬化作用。
  (一)巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬发挥抗动脉粥样硬化作用
  自噬是机体重要的代谢机制,主要降解细胞内的长程蛋白、折叠错误的蛋白和受损细胞器,其功能的实现依赖于溶酶体。已有报道,自噬在多种疾病的发生发展中发挥重要的作用。在动脉粥样硬化中,诱导自噬有利于缓解粥样斑块巨噬细胞的炎症及免疫反应,并通过抗凋亡、增加胆固醇流出发挥抗动脉粥样硬化的作用。对于β-arrestin-1与自噬的关系,教研室的前期研究表明,神经元中β-arrestin-1可以诱导自噬水平的增加,从而保护神经元。然而,在动脉粥样硬化中尚无相关报道。在这一部分中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1抗动脉粥样硬化的自噬机制。该部分实验的具体结果简述如下:
  (1)检测发生动脉粥样硬化时斑块巨噬细胞β-arrestin-1的表达
  通过Western blot检测正常小鼠与动脉粥样硬化疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestins表达,发现与正常小鼠相比,疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestin-1水平显著增高。进一步通过组织免疫荧光技术检测发现斑块巨噬细胞中有β-arrestin-1蛋白的高表达。
  (2)构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除的动脉粥样硬化小鼠模型
  通过Cre-LoxP系统构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,并通过骨髓移植的方法构建ApoE-/-背景下的髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,继以喂以高脂饮食4个月造成动脉粥样硬化小鼠模型。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,与野生型小鼠相比,髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的主动脉斑块面积显著增加,主动脉斑块的稳定性下降,进一步检测血脂水平,发现髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的总胆固醇及低密度脂蛋白水平增加,高密度脂蛋白水平下降。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬机制的参与发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (二)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  α7n型乙酰胆碱能受体(α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)是一种n型乙酰胆碱能受体亚型。近年来研究表明,α7nAChR通过胆碱能抗炎通路发挥抗炎作用。α7nAChR在多种疾病中发挥作用,其中在动脉粥样硬化中,广泛认为,激动α7nAChR具有抗动脉粥样硬化的作用,然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1是否参与介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,激动α7nAChR可以显著降低小鼠的主动脉斑块面积,增加主动脉斑块的稳定性,而髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除很大程度上降低这种效果;进一步检测血脂水平,发现激动α7nAChR可以显著降低总胆固醇及低密度脂蛋白水平,而巨噬细胞特异性β-arrestin-1敲除很大程度上抑制这一效果。
  (2)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗泡沫细胞形成作用
  在小鼠巨噬细胞上通过油红O染色及细胞水平胆固醇检测,发现激动α7nAChR可以显著降低泡沫细胞的形成比例,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。进一步通过Real-time PCR检测发现,激动α7nAChR可以显著提高与胆固醇流出呈正相关的ABCA1及ABCG1载体的表达水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抑制巨噬细胞迁移作用
  通过Transwell细胞迁移实验检测巨噬细胞的迁移水平,发现激动α7nAChR显著降低巨噬细胞的迁移水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过介导α7nAChR的保护作用发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (三)巨噬细胞β-arrestin-1调控α7nAChR的抗多发性硬化作用
  激动α7nAChR在多发性硬化中发挥重要的抑制作用,主要是通过其介导的胆碱能抗炎通路抑制中枢神经系统中小胶质细胞引起的炎症反应。然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞(小胶质细胞)β-arrestin-1是否参与调控α7nAChR的抗多发性硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)检测发生多发性硬化时脊髓中小胶质细胞β-arrestin-1的表达变化
  通过Real-time PCR技术、Western blot技术和免疫组织荧光技术检测发现,发生EAE时,脊髓和脊髓小胶质细胞中β-arrestin-1蛋白水平显著提高。
  (2)LPS/ATP刺激的BV2细胞中β-arrestin-1蛋白调节激动α7nAChR的抗炎作用
  通过Western blot技术检测发现,在LPS/ATP刺激下的BV2细胞中,应用PNU282987激动α7nAChR显著抑制了NLRP3炎性小体的激活,而过表达β-arrestin-1蛋白极大地抑制了激动α7nAChR的这一作用。
  (3)LPS/ATP刺激的BV2细胞中激动α7nAChR抑制β-arrestin-1蛋白与NLRP3蛋白的结合
  通过细胞免疫荧光技术和免疫共沉淀技术检测发现,在BV2细胞中,LPS/ATP刺激显著增加了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合,而应用PNU282987激动α7nAChR显著降低了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合水平。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1负向调控α7nAChR介导的抗多发性硬化作用。
[硕士论文] 林文婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是预后十分凶险的深部真菌感染,它好发于免疫缺陷人群,若不积极治疗,死亡率高。两性霉素B(简称AMB)是国内外治疗指南中治疗隐球菌性脑膜的首选用药,但因为其副作用多且严重,难以透过血脑屏障,使隐脑治疗效果下降。鞘内给药能提高脑脊液中AMB的浓度,但神经毒性较大,而且需要反复腰穿,难以达到理想的药代动力学水平,对疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一种可注射性智能型水凝胶,生物兼容性良好,在低于体温时是液态,能够包载药物,达到体温时变为凝胶状态,能够缓慢控制释放药物。本实验用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物来负载AMB,并进行鞘内注射,使AMB在脑脊液中得到缓慢释放,减少给药次数,减轻AMB的毒副作用,解决隐球菌脑膜炎目前的治疗困境。
  方法:
  第一部分,AMB凝胶的获取和相关性质检测。首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝胶渗透色谱仪确定该聚合物的分子结构和并对其性能进行表征。用生理盐水将聚合物溶解成不同浓度的聚合物水溶液,测定其凝胶化温度,根据结果选择合适的浓度的聚合物水溶液进行后续研究;用物理载药方法将聚合物AMB负载于聚合物水溶液中(简称AMB凝胶),并对载药前后的聚合物水溶液进行流体力学检测,以判断AMB对该水凝胶是否有影响。
  第二部分,AMB凝胶的体外实验。配制2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶,置于缓释液中,定时更换缓释液,测定AMB凝胶体外缓释度,绘制体外释放曲线,计算累计释放度,用药物缓释曲线中的一阶方程对缓释数据进行拟合。
  第三部分,AMB凝胶的体内实验。在毒理学研究方面,选取健康大鼠为实验对象,将AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶、生理盐水分别进行鞘内注射,每天观察每组大鼠给药后的情况,用Tavlor's评分评估四肢活动能力,记录大鼠死亡或存活情况,在给药后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色观察脊髓损伤程度,与以上三个指标比较各组药物对脊髓的神经毒性。在药效学研究方面,建立大鼠隐球菌脑膜炎模型,在建模后的第7天开始用AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶进行鞘内注射,在造模后的第14天和第21天取脑脊液做脑脊液培养计数和乳胶凝集试验,进行治疗效果的评价。
  结果:
  第一部分,通过对三嵌段聚合物的结构和性能表征,结果显示该聚合物分平均分子量为1790-1500-1790,聚合物的结构分布控制非常好,是理想的产物。其液体-凝胶转变相温度为34℃,25wt%聚合物水溶液课用于医用。载药前后聚合物水溶液的流体力学行为不发生变化,说明AMB对该聚合物水溶液没有影响。
  第二部分,体外缓释结果表明AMB凝胶可以缓慢释放AMB长达36天,2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶累积释放度分别为89.0%、77.1%、65.6%,AMB缓释数据符合药物缓释的一阶方程(R2>0.95)。
  第三部分,在毒理学实验中,AMB凝胶组大鼠四肢的Tavlor's评分高于普通AMB(P<0.05),AMB凝胶组大鼠的生存率明显高于普通AMB(P<0.05),HE染色结果显示AMB凝胶的脊髓损伤程度较普通AMB轻,以上结果表明AMB凝胶的神经毒性明显低于普通AMB。在药效学实验中,脑脊液培养结果显示AMB凝胶组大鼠脑脊液中菌体数量低于普通AMB组(P<0.05),乳胶凝集试验结果表明AMB凝胶组脑脊液隐球菌抗原滴度数低于普通AMB组(P<0.05),这都说明AMB凝胶的治疗效果优于普通AMB。
  结论:
  PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液负载AMB所得到的AMB凝胶较普通AMB有较多优势。它能缓慢释放AMB超过30天,体内的抗菌效果优于普通AMB制剂,此外它还能减轻鞘内注射AMB的神经毒性,减少鞘内给药次数,是比较理想的治疗隐球菌脑膜炎的药物,同时也是一种很好的鞘内缓控给药的手段。隐球菌性脑膜炎作为模式疾病,为其它疾病的鞘内缓控给药提供借鉴意义。
[博士论文] 刘德芳
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性风湿免疫疾病,主要表现为反复的滑膜炎,导致多关节肿痛、变形、活动受限,往往演变成残疾,是致残率最高的关节疾病,严重影响了生活质量,是一种终身性疾病。目前RA的具体病因尚不明确。本课题根据湿性重浊粘滞,久湿形成毒,湿毒郁久化热致瘀,阻滞经脉筋肉,结合西方病因学说“体液论”,提出“湿毒入络”可能导致RA的病因学理论。湿毒入络,体液的流动或迁移可能刺激水通道蛋白(AQPs)的异常表达;RA的活动期炎性渗出,滑膜充血水肿,也可能伴随水的异常代谢。已有报道,AQPs在RA的发展过程中发挥着一定的作用,可介导其病理变化过程中的细胞迁移。另外,临床上尚无根治RA的办法,大多只停留在对症治疗,缺乏对因治疗。本课题针对RA的病因病机“湿毒入络”,拟方三黄一龙汤(SYD)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA湿热痹阻证,从临床和动物实验两方面对RA发病机制和三黄一龙汤或联合MTX的作用机理进行了研究。
  方法:
  本课题的第一部分以RA湿热痹阻证患者的外周血和滑膜液作为研究对象,从细胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信号因子等的表达及调控方面进行了初步研究,主要采用ELISA法检测相关指标。第二部分复制出RA湿毒入络动物模型,以大鼠的外周血、骨关节、肺、脾、肾脏等作为研究对象,从炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK-STAT通路的信号因子及关节病理组织学的变化及调控进行了深入研究,采用了ELISA法、RT-PCR法及病理组织学等检测方法。
  结果:
  一、RA湿热痹阻证患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿热痹阻证患者炎性因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者活动期关节肿胀指数、压痛指数以及ESR、CRP、DAS28明显升高;采用SYD联合MTX治疗,其关节肿胀指数、压痛指数及ESR、CRP、DAS28能较快较好地改善。(2)RA湿热痹阻证患者外周血TNF-α、IFN-γ较健康对照组显著升高,滑膜液TNF-α、IFN-γ较外周血明显升高。(3)采用SYD联合MTX治疗后TNF-α、IFN-γ显著下降。
  2、RA湿热痹阻证患者AQPs的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表达水平较健康者明显降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表达略高于滑膜液,以AQP1表达最多,AQP3次之,AQP2表达最少。(3)SYD联合MTX可以使RA湿热痹阻证患者低表达的AQP1、AQP2和AQP3上调。
  3、RA湿热痹阻证患者JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表达水平较健康者都降低,其中STAT1表达高于STAT3,PIAS1表达高于PIAS3,SOCS-1与SOCS-3表达相当。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表达高于滑膜液,而外周血中STAT3、SOCS-3与滑膜液中基本相当。(3)经SYD联合MTX治疗,RA湿热痹阻证患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下调,SOCS-3无明显变化。
  二、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATPase、JAK-STAT通路信号因子及关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠显示血小板数、中性粒细胞比率和单核细胞比率较正常组明显升高,淋巴细胞比率较正常组明显降低。SYD及SYD联合MTX能较好地降低中性粒细胞和单核细胞比率,上调淋巴细胞比率。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表达水平较正常组都明显降低;骨关节中IL-6和TNF-α表达较正常组都明显升高。SYD及SYD联合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上调,使骨关节中升高的IL-6和TNF-α下调。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血中VEGF表达较正常组无差异,而其骨关节中VEGF表达较正常组明显增多。SYD及SYD联合MTX均能使骨关节中增多的VEGF减少。(4)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组无差异;而其炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组明显减少。SYD联合MTX可促进炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的表达。
  2、RA湿毒入络模型大鼠AQPs、Na+,K+-ATP酶的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3表达较正常组均明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中以AQP2表达最高,其次是AQP3;骨关节中以AQP3表达水平最高,其次是AQP2。(3)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中AQP1mRNA的含量较正常组明显减少,其肾组织AQP1mRNA的含量较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性较正常组明显减退。(5)SYD及SYD联合MTX都能较好地促进RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3的表达,SYD联合MTX还能显著地增强肺组织AQP1mRNA的表达。(6)SYD及SYD联合MTX能显著地提高RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性。
  3、RA湿毒入络模型大鼠JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表达较正常组明显降低;骨关节中JAK1、JAK3表达较正常组明显升高;JAK2表达较正常组明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中JAK3mRNA的含量较正常组无差异;肾组织中JAK3mRNA的含量较正常组明显增多。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中STAT1表达较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠外周血中STAT3表达较正常组明显降低;骨关节中STAT3表达较正常组无差异。(5)SYD及SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨关节中JAK2的表达上调。(6)SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠骨关节中升高的JAK1、JAK3表达下调。(7)SYD及SYD联合MTX能上调外周血STAT3的表达。(8)SYD及SYD联合MTX能抑制肾组织中JAK3mRNA的表达。
  4、RA湿毒入络模型大鼠关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络证模型大鼠关节组织病理学表现为巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。(2)SYD联合MTX能抑制RA湿毒入络模型大鼠关节纤维组织的增生和淋巴细胞的浸润。
  结论:
  本研究证实了湿毒入络是RA的基本病机。湿毒入络诱导RA发病与AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK等密切相关,表现出外周血、骨关节及肺脾肾脏等组织器官中AQP的亚型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表达减少,Na+,K+-ATP酶活性减退,骨关节促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)产生增多,软组织TGF-β1mRNA减少,信号因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA异常表达,关节巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。印证了肺主通调水道、脾主运化功能参与了RA湿毒入络的发生发展过程。证明了三黄一龙汤及三黄一龙汤联合MTX能较好地降低RA的关节肿胀、压痛指数,降低ESR、CRP、DAS28等炎症指标,抑制外周血和骨关节炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管内皮生长因子(VEGF)产生,促进TGF-β1mRNA分泌,增强外周血和骨关节AQP1、AQP2、AQP3及肺脏AQP1mRNA的表达,提高脾脏Na+,K+-ATP酶的活性,调控信号因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表达。可作用于多组织器官,多靶点进行调节,增强组织细胞的代谢,缓解关节滑膜炎症,抑制滑膜组织血管新生。这为临床推广应用提供了理论依据。
[博士论文] 方文捷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  侵袭性酵母感染占所有真菌感染的90%以上,引起包括念珠菌病、隐球菌病和毛孢子菌病在内的多种严重真菌病。一方面,临床对于高发、新发致病酵母感染的流行病学和临床特征缺乏认识。侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,以往不致病或者较少致病的酵母感染病例逐年增多,同时传统高发病的酵母感染逐渐累及新的的基础病群体。比如,念珠菌属的多种非致病菌(如Candida auris,Candida fabianii)近年来逐渐成为致病菌,有些甚至发生了暴发流行,但是其流行病学、临床特征和干预策略的相关研究仍然较为滞后。又如,虽然国际上对于隐球菌脑膜炎的临床研究日益增多,但是目前对于隐球菌病的临床流行病学研究主要集中于HIV阳性人群。临床研究工作者较少从其他免疫状态人群入手,对该类患者的临床特征和诊疗策略进行系统的、分类的分析;由于缺乏临床证据,国际指南暂缺乏对不同免疫状态人群的特异性临床干预策略。据此,本研究的第一、二、三、四、五、六部分旨在填补新发、高发侵袭性真菌感染临床流行病学方面相应的空白。另一方面,由于侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,将微生物鉴定到菌种水平显得愈发重要,故传统诊断技术的局限性日益显现。本研究第七、八、九、十部分利用分子诊断的方法,重点针对以下三个方面开发诊断新技术:1、开发一套诊断策略,可以精准、低成本实现95%以上酵母感染的诊断;2、开发一套针对9个最常见医学相关念珠菌隐匿种的鉴别方法,用于解释90%左右的念珠菌感染;3、针对耳道念珠菌及其近缘种,实现通量高、敏感度高、特异性好、低成本分子诊断方案。
  方法:
  本系列研究第一、二、三、四、五、六部分的临床数据来源于上海长征医院、上海长海医院、伊朗设拉子大学医学科学院及9个国内外医学文献数据库。使用预先设计的表单,使用EPIDATA等软件抽取临床数据。在统计分析上,我们运用卡方检验分析分类变量;多重回归分析用于确定患者预后的独立预测因子;单个率合并分析用于确定全球患病率。
  本系列研究第七、八、九、十部分属于分子诊断体系研发。所用参考菌株来自全球最大的菌种保藏和医学真菌研究中心Westerdijk Fungal Biodiversity Institute,临床菌株来自中国、伊朗,科威特和奥地利多家医院。靶标序列来自本研究所内部数据库以及Genbank。序列分析和引物设计使用Geneious(@)10.1.2软件。体系以参考菌株优化并完成特异性试验后,进一步利用临床菌株体系扩大验证,并同MALDI-TOF MS和一代测序鉴定结果平行比较。
  结果:
  第一部分研究发现:目前全球62.9%的结核/隐球菌共感染病例发表于我国(n=197),56.3%的我国病例发表于2010年之后;99.5%的病例分布于我国季风区。在临床表现上,HIV阳性患者伴发结核/隐球菌共感染的症状比HIV阴性患者更加严重。在诊断方面,几乎所有的结核性脑膜炎合并隐球菌脑膜炎病例均经历误诊或者漏诊(95.2%)。为了解决这一诊断难题,本研究首次提出“联合应用颅内压和脑脊液糖、蛋白、氯”的联合诊断策略,该策略可有效区分结核性脑膜炎单独感染、隐球菌性脑膜炎单独感染以及结核/隐球菌脑膜炎共感染(AUC=0.89),同时不增加患者经济负担。
  第二部分研究发现:在SLE人群中,隐球菌脑膜炎的患病率为0.5%。患者主要以成人女性为主。感染前激素治疗剂量大于30mg/day泼尼松当量同高死亡率相关(OR=9.69(1.54,60.73))。36.8-38.9%患者在隐球菌脑膜炎发病过程中,狼疮活动呈现较低水平,感染发生较为隐匿。该疾病总误诊率为38.2%,死亡率为23.6%。
  第三部分研究发现:在SLE病程中,狼疮脑病发生时间早于隐球菌脑膜炎(p=0.03)。除发热,头痛和颈部僵硬外,大多数临床表现无法区分两个疾病状态(p<0.05)。狼疮脑病患者C反应蛋白值通常正常,而其在隐球菌脑膜炎患者中通常升高(p=0.08)。脑脊液压力和生化检查具有较高的诊断价值(AUC>0.7)。
  第四部分研究发现:Ⅱ型糖尿病隐球菌患病率为0.21%。此类患者平均年龄为56.1岁(95%CI:51.5,60.6),93%的患者年龄大于40岁。感染前62%的患者未经糖尿病管理或血糖控制不良。MLST分型示所有临床菌株属于ST5型,抗真菌药敏试验未发现耐药菌株。69%肺隐球菌病患者经历误诊误治,60%隐球菌脑膜炎患者接受不标准的抗真菌治疗。总体死亡率为33%。
  第五部分研究发现:肾病综合征患者中隐球菌病的患病率为0.3%。从肾病综合征确诊到隐球菌病确诊的中位时间间隔为16个月。46%隐球菌病发生于肾病综合征确诊第一年内。皮肤隐球菌病占所有类型隐球菌病的比例较高(35%)。58%患者经历了误诊误治,误诊病例中90%被初诊为细菌感染。总体死亡率为35%。
  第六部分研究发现:大部分Cyberlindnera fabianii感染病例分布于西欧和波斯湾沿岸。新生儿发病占比较高。中心静脉置管、感染前接受过抗生素治疗、新近接受过外科手术、肿瘤患者以及化疗、激素暴露、透析、低白细胞血症、机械通气和营养不良等可能为其患病的危险因素。Cy.fabianii最常被误诊为Candida utilis,其次为Candida pelliculosa,H.anomala,Pichia jadinii和Candida boidinii。抗真菌药敏试验显示对于氟康唑、伏立康唑、两性霉素b的耐药率分别为16.7%,12.5%,8.3%和12.5%,而对于卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净和氟胞嘧啶,均未见耐药菌株。总体病例死亡率为33.3%(8/24)。本研究进一步研发的多重PCR鉴别诊断体系可以准确鉴别Cy.fabianii及其近缘种,特异性100%,可作为临床API等检测试剂盒的补充。
  第七部分首次报道了一项称为“YEAST PANEL”新型临床致病酵母诊断策略,该诊断方法通过最多三次共21重PCR,鉴定并准确区分念珠菌属、毛孢子菌属、红酵母属、隐球菌属以及白地霉属在内的95%以上酵母感染。体系的优化和首轮验证使用了400株CBS参考菌株,并证实可以在不提去DNA的前提下以单菌落作为模板扩增。进一步通过2次共计800株临床菌的第二轮盲法试验证实,在上述菌株的鉴定上,该技术同MALDI-TOF MS以及ITS/LSU测序具有较为等同的准确性。
  第八部分首次实现无需DNA提取的一步法9重PCR,在单管检测并区分C.albicans,C.dubliniensis,C.africana,C.glabrata,C.nivariensis,C.bracarensis,C.parapsilosis,C.orthopsilosis,和C.metapsilosis。且同系统发育学上关系由近及远的酵母菌、曲霉菌以及人类DNA不存在交叉反应。利用临床菌株同MALDI-TOF MS平行比较发现,本PCR准确鉴别了所有的菌株,而MALDI-TOF无法区分C.albicans和C.africana。
  第九部分建立和验证一种新型多重终点PCR,用于Candida auris,C.haemulonii,C.dubushaemulonii和C.pseudhaemulonii的临床筛查和诊断。使用该检测体系分别在中国和伊朗进行了前瞻性和回顾性临床菌种筛查,研究发现了中国第一株C.pseudhaemulonii临床分离株和伊朗第一株C.haemulonii临床分离株。本研究首次建立了C.auris和C.haemulonii两个菌种的动物模型,以供诊断体系验证。多重PCR对于感染小鼠的血液和组织的总体阳性率分别为28.6%和92.9%。
  第十部分建立和验证一项溶解曲线法四重实时荧光定量PCR,用于Candida auris,C.haemulonii,C.dubushaemulonii和C.pseudhaemulonii的临床筛查和诊断。使用177株真菌验证该体系,发现其特异性为100%,具有高度的可重复性(R2=0.99%),且检测极限值高达10CFU/PCR。以来自科威特的106株被MALDI-TOF MS鉴定为耳道念珠菌的临床菌株进行多技术比较性试验。结果发现,我们的检测体系同以往发表的一项单重探针PCR以及D1/D2测序的结果符合率为100%,且其准确性高于MALDI-TOF MS。
  结论:
  一方面本系列研究阐明高发感染隐球菌病不同免疫状态患者的流行病学、临床特征、影响发病和预后的危险因素等,并在此基础上针对上述诊疗难点,提出鉴别诊断策略。同时首次描述了新发感染C.fabianii的流行病学和临床特征,并提出新型鉴别诊断新策略。
  另一方面本系列研究基于目前致病酵母病原谱的变迁,尤其是针对包括中国在内的发展中国家,成功建立了四项廉价、特异、准确的多重早期诊断技术,并完成初步临床验证。上述体系均有望在临床得以推广应用,作为现有诊断工具的补充或替代技术。
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