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[博士论文] 吴成超
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:人类基因组计划发现,人类基因组中超过98%的区域是非编码区域。ENCODE、Roadmap epigenomics等后续计划进一步发现,非编码DNA中包含如DNA甲基化位点、启动子、增强子等众多DNA调控元件。DNA调控元件通过激活或抑制转录事件,精准地调控目标基因的表达量。一方面,这些DNA调控元件正是由于其环境序列的特异性才能够参与转录调控;另一方面,DNA序列在数学上可被视为有限字母表上的有限词,研究其复杂度特征可以挖掘DNA的序列特异性。这激发我们通过序列复杂度数学工具来量化识别DNA调控元件。本研究分为以下三部分:
  第一部分,我们详细描述两种序列复杂度的数学定义,重点研究其计算算法,并通过特征选择筛选出有效特征。首先根据不同序列长度确定因子复杂度的算法获取原始特征,随后根据二阶差分工具筛选拓扑熵特征,并最终确定因子复杂度的有效特征。同时,我们研究了abelian复杂度的数学定义和计算算法,并通过对abelian复杂度特征进行特征筛选确定出其有效特征。
  第二部分,我们应用因子复杂度有效特征构建CpG甲基化水平预测模型。我们首先获取人类胚胎细胞的甲基化实验数据,并筛选其中的CpG甲基化位点。在将位点扩增至合适长度之后,我们提取序列因子复杂度特征和序列的基本组成特征,并构建了基于支持向量机算法的CpG甲基化水平预测模型,该模型在不同染色体上的平均分类准确率为94.7%。与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后我们利用已构建的预测模型预测全基因组水平不同功能元件中的CpG甲基化平均水平,通过与实验数据的对比,进一步验证了该模型的预测能力。
  第三部分,我们应用abelian复杂度特征构建增强子预测模型。我们从FANTOM5计划的数据库中获取人类基因组的增强子数据,通过提取序列abelian复杂度特征和序列基本组成特征,构建了基于随机森林算法的增强子预测模型,其中正负样本1∶1模型的分类准确率为93.1%,正负样本1∶10模型的分类准确率为96.0%。在与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后利用该模型在人类基因组22号染色体进行步长为100bp的扫描预测,成功预测到5,123条增强子区域。以不同细胞系和组织的组蛋白修饰信号为佐证,扫描预测准确率最高可达42.8%。
  综上所述,我们通过研究序列的因子复杂度特征和abelian复杂度特征,结合基本序列组成特征,成功构建了DNA甲基化、增强子等DNA调控元件的精准预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小和降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关研究工作提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 张蕾
计算机技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:DNA测序是生物信息学的一项重要内容。从一代测序到二代测序,测序技术历经了方法和效率的巨大改变。在二代测序中,一次测序就可以获得GB级别的大规模测序数据。高通量测序产生的海量RNA-seq对数据分析技术提出了更高的要求。在分析RNA-seq数据的流程中,读段定位是分析RNA-seq数据的第一步,也是最重要的一步;读段定位直接影响着下游一系列数据分析的结果;已有大数据分析和计算技术为读段定位在运行时间和定位灵敏度上进一步提升提供了可能。以Hadoop为计算平台,本文开展了以下三个方面的研究工作:RNA-seq读段定位算法的研究;RNA-seq可变剪接识别算法的研究;RNA-seq数据分析结果的可视化。
  Hadoop作为大数据分析的主流计算平台,其计算特点可用来分析RNA-seq数据,本文设计了一个基于Hadoop的RNA-seq读段定位算法,以期提高读段定位过程运行效率,并使用种子扩展算法保证定位的灵敏度。算法主要学习了SeqMap的空位种子索引算法和mrFAST/mrsFAST的FastHASH方法,同时本文提出一个新的使种子定位到参考序列上的方法,新方法利用种子会连续定位的特点对定位规则做出了改变。实验证明:与传统读段定位工具相比,本文的基于Hadoop的读段定位算法不但可以在提升时间效率的同时,还可以保证读段定位过程的灵敏度。
  可变剪接是读段定位的下游的分析工作之一,对于以RNA-seq数据作为输入的可变剪接识别工具,往往需要依赖读段定位的结果才能进行可变剪接的识别分析,并且这些可变剪接识别工具需要依赖多个工具的支持以及注释文件才能进行识别,安装使用过程比较繁琐,能在并行环境下工作的可变剪接工具也较少,所以本文在读段定位的基础上设计了基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法,算法是根据工具SpliceMap和Tophat的思想设计而成,并提出一个新的跨越剪接位点的读段定位方法,新方法利用GT-AG剪切信号与读段种子间的规律辨别出剪接位点,进而实现跨越剪接位点的读段定位。实验证明:与ASTD可变剪接数据库相比,本文提出的基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法识别准确率可以达到50%以上,具有一定的实际应用价值。此外,基于本文算法开发的可变剪接识别工具具有使用过程简单,不依赖注释文件的优势。
  为了更加直观地展示可变剪接的识别结果,本文利用Servlet和Tomcat技术实现了可变剪接识别结果的可视化,可变剪接的识别结果可直接以网页的形式展示,参考序列上可变剪接发生的具体位置可以清晰显示,一目了然。
  读段定位的实验中,在2G以上的数据条件下,本文的读段定位算法的时间效率经过与Bowtie对比,可以提高将近40%,并且能识别出更多的读段,证明了基于Hadoop的读段定位算法可以提高时间效率并保证灵敏度。可变剪接实验中,本文算法通过与标准数据库对比,可以识别出参考序列五个可变剪接事件中的四个,准确率达到50%以上,可以证明本算法具有一定的实际应用价值。
[硕士论文] 李永飞
应用化学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:DNA是一种携带遗传信息的生物大分子,也是一种具有超强组装能力的纳米基元。二十世纪八十年代,Nadrian C Seeman教授率先提出采用DNA分子作为组装基元构筑高级有序结构,发展了DNA纳米技术这一重要新兴领域。迄今为止已经发展了多种组装策略,主要包括DNA模块自组装(tile-base assembly)、DNA折纸术(DNA Origam(1))和单链瓦片自组装(single-strand tile)。DNA纳米自组装的发展不仅大大丰富了微纳米结构的多样性与复杂性,在分析检测、生物医学等应用领域也展现出了巨大的应用潜力。本论文主要围绕DNA自组装开展了以下两方面研究:
  1.发展基于乙二胺的“无金属离子”缓冲体系,应用于DNA自组装。DNA自组装采用缓冲溶液大多为TAE/Mg2+,即需要金属阳离子(如:Mg2+)以屏蔽来自负电荷磷酸骨架的DNA链间静电斥力。但是,在某些应用中,镁离子或者其他金属阳离子的存在可能会带来不利影响,比如:增大金属离子依赖酶对DNA自组装纳米结构的影响。为了拓展DNA自组装的应用,本章节基于乙二胺分子开发出一种新的“无金属离子”缓冲体系用于DNA自组装,具体如下:(1)在乙二胺缓冲体系中,分别基于DNA双交叉模块和三臂模块成功组装得到二维纳米阵列和三维纳米笼—DNA四面体,表明这一新的缓冲体系适用于DNA自组装;(2)研究DNA自组装结构在新缓冲体系中的生物稳定性。研究表明:在新缓冲体系中,由于缺失镁离子,DNase I对DNA自组装结构的酶降解减弱;(3)基于新缓冲体系发展通用型pH调控手段。乙二胺分子具有pH响应性质,因此,基于乙二胺,可以实现DNA四面体组装与解组装的动态可逆调控。这种不依赖于DNA序列的pH响应调控,为DNA动态体系的开发提供了新的手段与思路。
  2.开发平行交叉四臂DNA模块,并组装得到DNA一维纳米管状结构。DNA自组装模块通常采用反平行交叉结形式,为了增加设计手段以及丰富DNA自组装结构多样性,本章节基于平行交叉结形式设计出一种新型四臂DNA自组装模块,并成功组装得到一维纳米管状结构。进一步探索了模块刚性、相对翻转角度等对自组装的影响。
[硕士论文] 程爱民
结构生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:基因的表达调控是一个发生在多时空、多层次的精细调控过程,包括表观遗传水平和翻译水平。组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传调控方式之一,涉及写入器、阅读器、擦除器的相互作用。BAP1是一种重要的泛素擦除器,可以被ASXL1激活,对H2AK119ub1去泛素化,从而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的机制以及BAP1定位在染色质上的机理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一种识别H3K56ac的组蛋白乙酰化阅读器,其识别的机理、识别的环境、识别的功能也不明确。除了组蛋白翻译后修饰,核糖体RNA的加工、成熟直接关系到蛋白质翻译机器核糖体的装配,也是重要的基因表达调控方式。U3 snoRNP核心复合物对rRNA进行2'-O-methylation修饰,促进rRNA的加工和成熟。目前对真核生物的U3 snoRNP核心复合物的装配研究较少。本文从三个方面对基因表达调控过程进行探究。
  BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在细胞核的成员,自身具有较低的酶活。ASXL1的DEUBAD结构域能够激活BAP1,并与BAP1形成PreDUB复合物对H2AK 119ub1去泛素化。我们在大肠杆菌中尝试多种方法成功表达和纯化了BAP1与ASXL1 DEUBAD结构域的复合物,生长的晶体最高衍射分辨率为2.6埃。我们发现BAP1单独存在时趋向于寡聚状态,而被ASXL1DEUBAD结构域激活后会形成稳定的异源二聚体,与报道的胞内研究结果一致。此外,我们用GST pull-down实验发现BAP1通过CTE结合在完整的核小体上,但不能作用于核小体酸性区、核小体DNA及游离的组蛋白,解释了BAP1/ASXL1复合物定位在染色质的机制。
  U3 snoRNA属于box C/D snoRNA,起引导核糖体RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58组成,其中fibrillarin是RNA甲基转移酶。复合物装配起始于snu 13与U3的box B/C、boxC/D,然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我们克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58,并表达纯化了snu13和fibrillarin。通过体外转录U3、box B/C和box C/D,用EMSA实验证实了snu13与U3的相互作用。snu13结合在U3的box B/C,亲和力为2.2μM,暗示snu 13还需要结合boxC/D以提高亲和力。此前有研究报道boxB/C自身为环(loop)结构,与snu13结合才能形成扭结(Kink-turn,K-turn)结构。我们利用RNA imino氢特殊的化学位移,发现在溶液状态下U3 box B/C也能形成K-turn结构。结合以前的研究,我们认为snu13通过构象选择机制而不是构象变化来结合U3 box B/C。
  H3K56ac是一个位于核小体核心区的乙酰化修饰,在转录、DNA复制、DNA损伤修复等过程发挥重要作用,而根据报道,CREBBP bromodomain可能是H3K56ac的阅读器,但作用机理不清楚。与徐莉同学合作,我们解析了CREBBP bromodomain与H3K56ac复合物的晶体结构。晶体结构表明,CREBBP bromodomain识别H3K56ac的方式类似于其他bromodomain与乙酰化赖氨酸的相互作用,都是通过一个疏水口袋、水介导的氢键网络和保守的天冬酰胺结合赖氨酸乙酰化侧链。有意思的是,H3αN在核小体上形成α-helix,而在CREBBP bromodomain中为伸展状态。GST pull-down实验发现,CREBBP bromodomain不能结合H3K56乙酰化的重组核小体,但是能识别H3/H4 dimer上的H3K56ac,证明了伸展状态的H3αN的确存在,与之前报道的H3/H4 tetramer上H3αN构象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明显促进HAT结构域乙酰化H3K56。根据上述研究结果,我们提出,CREBBP bromodomain从HAT活性中心捕获H3K56乙酰化的H3/H4 dimer,促进HAT进行下一轮H3K56乙酰化,随后H3K56乙酰化的H3/H4在CAF1的帮助下参与核小体组装。
[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 胡双双
生物医学工程 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究江苏十个地区小家鼠的基因多样性和遗传进化关系,为国境口岸鼠形动物遗传进化规律和溯源的研究提供了确凿的技术支持,并为物种种内基因差异比较分析提供了重要的实验数据。通过生物信息学分析探索小家鼠种内差异与地理位置之间关系。
  方法:基于对江苏十个地区线粒体控制区基因和线粒体全基因组的研究,通过基因的扩增、测序和比对,研究小家鼠线粒体组成,结合GenBank的小家鼠线粒体基因组信息,对小家鼠进行遗传多态性分析和系统发育树研究。
  结果:获得小家鼠的线粒体控制区序列和线粒体全基因组序列,小家鼠线粒体基因组全长16,302 bp,由13种蛋白质编码基因、2种rRNA基因、22种tRNA基因、1个轻链复制起始区和1个控制区组成。经生物信息学分析发现小家鼠线粒体基因多态性丰富,其遗传进化规律域地理位置有一定的联系,不同地区小家鼠之间的分化程度大于同一地区小家鼠之间的分化程度。
  结论:小家鼠的种内差异程度与个体所处地理位置有很大的联系,我国的小家鼠大致可以长江为界限进行划分。江苏地区的小家鼠也显现出这种规律但并不明显。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 欧阳杉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究用含20%PEG6000的MS液体培养基模拟生理脱冰胁迫处理扁蓿豆幼苗,以上述胁迫处理6h的扁蓿豆幼苗叶片总RNA为模板进行反转录,运用RACE技术和RT-PCR方法,克隆得到扁蓿豆抗逆相关RNA剪切因子MrSKIP基因cDNA全长。序列分析结果显示,MrSKIP基因cDNA全长为2280bp,含有一个1833bp的完整开放阅读框,序列推测编码610个氨基酸含一条S-N-W-K-N的多肽,分子量为68.86145 KDa,等电点为8.95,生物信息学分析表明MrSKIP含有该家族的典型结构域SNW SKIP。进一步克隆得到了扁蓿豆基因组的MrSKIP基因,序列分析表明,该基因无内含子。
  利用tasiRNA技术和发根农杆菌转化法,在截形苜蓿108R根部干扰MrSKIP同源基因的表达,对转化外源基因的截型苜蓿根系进行干旱、高盐和低温胁迫处理,鉴定MrSKIP基因的功能,结果显示胁迫处理下干扰MrSKIP同源基因的的转基因根系样品,其根长和根鲜重均显著小于对照。研究结果初步表明MrSKIP基因表达量的降低影响植物对干旱、低温和高盐胁迫的耐受性,特别对干旱胁迫耐受性的降低尤为显著。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 袁亚洲
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:基因识别是对DNA序列进行分析,获取其中重要信息的第一步。目前测序技术的发展使得测序数据呈爆发式增涨,然而实验方法无法快速有效的从海量信息中获取知识,基于此运用计算机技术来识别基因的方法应运而生。在2015年,我们课题组研发了原核生物基因识别程序ZCURVE3.0,该算法是基于Z曲线理论,采用新的机器学习算法SVM,增加新的特征变量,并且对内部参数进行进一步的优化,使得该识别算法更加快速准确高效。在预测出基因后,还需要知道其相应编码的蛋白质,于是我们基于ZCURVE3.0算法,对其进行进一步的升级,添加相关的功能,使得其成为完善的可视化集成系统。
  在本基因识别可视化系统中,第一部分是对ZCUREV3.0的功能进行可视化(BAGA)实现,其保留了相应识别算法的所有功能。在通过对50个原核生物的全基因组进行测试,选取比对阈值,排除伪基因,同时使得删除的正确基因数尽可能少,那样基本保持正确的基因数不变。在与GenBank提供的总的基因数相比,BAGA的预测基因识别率为97.60%,预测结果的特异度为96.74%,与ZCURVE3.0的特异度94.21%相比有2%的提升。BAGA附加预测率为3.34%,比ZCURVE3.0(6.08%)下降接近3%。附加预测率的降低,表明其预测错误的基因数目相比ZCURVE3.0有更进一步的减少。第二部分是对于ZCURVE3.0和Prodigal两个基因预测软件联合方法(BAGA2.0)的实现,通过保留两者预测相同的基因,对不同的基因进行序列比对,调节合适的参数,保留比对得分较高的基因,将这两部分的基因作为最终联合预测的基因。BAGA2.0对应的识别率为98.73%,特异度为96.09%。这两者性能,都比ZCURVE3.0效果要好。另一方面,BAGA2.0的附加预测率为4.08%比ZCURVE3.0(6.08%)要低。综合来看,联合两者来识别细菌的基因性能要更优。此外,虽然BAGA2.0的特异度比BAGA要低,其附加预测率要大,但是其识别率和准确度却更佳。
  在本文中采用BLAST序列比对实现了对于预测的基因进行功能注释,对于系统中实现的两部分的预测结果都能够实现注释,而且能够选择快速注释和完全注释两者不同方式。同时,集成基因组岛预测程序。我们将此完善的集成软件编译成各种不同系统的版本,使用者能够访问http://cefg.cn/zcurve-visualization/下载,并免费使用。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
[硕士论文] 赵柯郁
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(the mechanistictarget of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex1(mTORC1)和mTOR complex2(mTORC2)。mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nMAZD8055处理12h,100nMAZD8055处理24h,200nMAZD8055处理12h和200nMAZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200nM处理24h组效果最显著(p<0.05); Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p<0.05); ELISA结果显示对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和258.75±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055处理24 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml和188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61 mmol/L、19.54±1.53 ng/ml和183.82±26.94 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑵利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为5.42±0.08 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和403.3±11.17 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和297.82±20.8 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑶靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml和527.99±32.67 pg/ml,Raptor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46ng/ml和331.84±48.02 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑷靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14 ng/ml和109.47±7.46 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07mg/kg; Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24mmol/L、6.93±0.14 ng/ml和55.74±6.01 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑸三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2> mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA抑制率,对TG和DHA作用 mTORC2>mTORC1,对PA作用 mTORC1>mTORC2。
[博士论文] 付佳伦
劳动卫生与环境卫生学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  环境中抗生素耐药性细菌(简称耐药菌)的污染及抗生素耐药基因的扩散已成为全球危机。据世界卫生组织报道,耐药菌正蔓延至世界各地,到2050年,抗生素耐药每年将导致100万人早死。抗生素耐药基因的扩散情况日趋严峻,以至于其已被列为一项新型环境污染物,成为当今国际研究的重点和热点。抗生素耐药基因的水平转移是导致耐药基因扩散的重要原因。耐药基因大多编码在质粒上,通过质粒介导的接合转移将耐药基因在微生物间进行传播和扩散是基因转移最常见,也是最有效的方式。
  地表水是耐药菌和耐药基因的巨大储存库。它不仅汇聚和容纳了来自降水径流,医院污水、生活污水、养殖污水和实验室污水等各种来源的的耐药菌、耐药基因甚至多重耐药基因外,还承载着一部分内源性的污染,比如耐药基因在水环境中的随机耐药突变和自然转移。水生动物是生存在水环境中的重要生物,其摄食的环境中充满了耐药菌和耐药基因。水生动物肠道是细菌生长和繁殖的重要场所,同时,肠道中定植的大量固有菌群都可以作为潜在的受体菌。因此,耐药基因在水生动物体内的转移和扩散也可能是地表水耐药基因内源性污染的一部分。但是,耐药基因是否能在水生动物体内发生扩增,目前尚未见报道。
  基因发生抗性突变和自然转移的效率只有百万分之一。并且研究发现,即使在水中存在的各种物理、化学和生物因素尤其是丰富的DNA酶类的作用下,也无法使耐药基因变性和分解。水中耐药菌和耐药基因的污染依然严重。除此之外,还有研究报道了在水产养殖的水体及鱼的粪便和肠道中检出耐药菌和耐药质粒。基于以上全部事实,我们认为水环境中的耐药基因除了接纳各种水体中的耐药基因和在水环境中发生耐药突变和随机转移的少量耐药基因外,更主要的是其在水生动物体内转移与扩增的结果。综上所述,课题提出“水生动物肠道是地表水中耐药基因转移和扩增的重要场所”假说。
  研究目的和意义:
  本研究旨在通过建立耐药基因在水生动物体内定植和转移的模型,在采用细菌培养和分子生物学等技术方法的基础上,定性、定量地研究耐药菌及耐药基因在水体动物体内定植和转移的规律,阐明耐药基因在水生动物肠道内的转移和扩增机制,摸清耐药基因发生定植和转移的消化道部位与转移发生机理,以及明确肠道内接受耐药基因的接合子的种类和数量。课题研究成果为进一步丰富人们对耐药基因在动物体内转移和扩增的规律和机制的认知及提供了充分的理论依据,同时也为水产养殖用药,水源水保护以及生态环境的污染和管理提供了数据依据和技术支撑。
  研究内容和研究方法:
  ⑴采用RED重组技术构建供体菌K12Cm:RP4,并通过将供体菌饲喂给斑马鱼构建RP4质粒介导的耐药基因在斑马鱼肠道内接合转移模型。
  ⑵采用选择性平板筛选和qPCR技术研究斑马鱼粪便中耐药菌和耐药基因的体外排出量随时间的变化规律。
  ⑶利用选择性平板筛选和qPCR技术研究耐药菌和耐药基因在斑马鱼肠道内的时空分布规律。
  ⑷采用双荧光标记供体菌,流式细胞分选并联合16S rDNA高通量测序的方法肠道鉴定肠道和粪便中受体菌的细菌物种和丰度组成。
  ⑸利用qPCR法检测RP4质粒接合转移调控基因在斑马鱼肠道中的mRNA表达。
  研究结果:
  ⑴斑马鱼肠道和粪便的固有菌群都不含有RP4质粒,除了对氨苄青霉素耐药外,对四环素,卡那霉素和氯霉素均敏感。因此课题利用RED重组技术,在野生株大肠杆菌K12的基础上构建了基因组被氯霉素抗性基因cat标记,并携带RP4质粒的供体菌K12Cm:RP4。通过每日定时定量向饲料中掺入供体菌,持续喂食斑马鱼,建立耐药质粒在斑马鱼肠道内的接合转移模型。
  ⑵斑马鱼摄入的外源性耐药菌,大部分排出体外并沉积在粪便。12%的粪便固有细菌通过RP4质粒的接合作用获得了耐药基因。喂食斑马鱼供体菌90天后停止,粪便中耐药菌和耐药基因排出的规律曲线可以分为三个阶段:上升期,平台期和下降期。在摄入108 cfu/(dfish)供体菌的高剂量组,cat基因和traG基因在平台期的粪便排出相对数量分别为2.37%和15%,而摄入107 cfu/(dfish)供体菌的中剂量组,cat基因和traG基因在平台期的粪便排出相对数量都不到1%。与高剂量组相比,中剂量组的供体菌和接合子达到平台期所用的时间更短,产生的接合子数少大约一个数量级。在摄入106 cfu/(dfish)供体菌的低剂量组中没有观察到明显的供体菌和耐药基因的排出规律,也没有检测到接合子。接合子的产生数量和到达平台期的时间与供体菌的喂食浓度相关。
  ⑶外源性耐药菌和耐药基因在整个消化道内的分布是极不均匀的。前肠和中肠中耐药菌和耐药基因存在的数量较少,并且它们的分布没有显著性差异。后肠是外源性耐药菌和接合子定植,以及耐药基因分布的最主要的消化道场所,其中接合子的数量是其它肠段中的将近25倍。在喂食供体菌的过程中,耐药菌可以在肠道内定植,同时耐药基因在肠道内发生了大量的转移和扩散。但是外源性供体菌K12Cm:RP4在肠道内的定植具有暂时性,一旦斑马鱼不再摄入供体菌,肠道内的耐药菌和接合子数量会迅速下降,这可能是与肠道内缺乏抗生素选择压力有关。
  ⑷肠道和粪便的接合子中既包括可培养细菌,也包括非可培养细菌,后者占全部接合子的90.4%~97.2%。其中气单胞菌属(Aeromonas)丰度最高,占全部细菌的90%以上(均值为90.0%~96.7%),是肠道固有菌群中接合转移发生频率最高,最容易获得RK2质粒的物种。其它的接合子主要来自Proteobacteria,Firmicutes和Fusobacteria菌门(加起来占大约5%)。除Aeromonas外,来自Proteobacteria门的可培养细菌Shewanella以及Enterobacteriaceae也是肠道固有菌群中重要的接合子。
  ⑸耐药质粒在斑马鱼肠道内转移和大量扩增与调控基因在后肠的mRNA表达有关。在平台期,后肠中trbBp基因的mRNA表达量上调到7.16×10-3 copies/cell,是上升期mRNA表达量的24倍。TrbBp基因的明显上调促使了细胞间的交配配对,从而形成接合的通道,促进了接合转移的第一步过程。同时,平台期trfAp基因的mRNA表达也在后肠出现了明显的上调,均值达到2.42×10-2 copies/cell,促使了RP4质粒携带耐药基因的跨膜转运,以及质粒DNA的复制、转移和分配,从而促进了接合转移的第二个过程。然而在前肠和中肠,平台期trbBp和trfAp基因的mRNA表达则上调的不够显著。因此,后肠是耐药质粒接合转移频率最高并且最活跃的消化道肠段。
  研究结论:
  1、建立了稳定的RP4质粒介导的耐药基因在斑马鱼肠道内转移和扩散的水生动物模型。
  2、斑马鱼摄入的外源性耐药菌,大部分会排出体外并沉积在粪便。12%的粪便固有细菌通过接合转移携带了RP4质粒。喂食斑马鱼供体菌一段时间后停止,粪便中耐药菌和耐药基因排出的规律曲线可以分为上升,平台和下降三段。
  3、后肠是耐药菌和接合子定植,以及耐药基因分布的最主要的消化道场所。
  4、斑马鱼肠道受体菌中非可培养细菌占90.4%~97.2%,其中最重要的接合子是Aeromonas,占90%以上。可培养细菌只占不到10%,主要包括Enterobacteriaceae和Shewanella。
  5、耐药质粒在斑马鱼肠道内转移和大量扩增与调控基因在后肠的mRNA表达有关。后肠是耐药质粒接合转移频率最高,最活跃的肠段。
[硕士论文] 刘昭
营养与食品卫生学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌可以与肠道粘膜免疫系统相互作用,在抑制肠道致病菌、调节机体免疫功能、维持肠道微生态平衡等方面发挥重要作用。而乳酸菌发挥益生作用的前提是其与肠上皮细胞的粘附,粘附作用是菌株定植肠道的第一步。乳酸菌对肠道上皮细胞的粘附作用有助于其在肠道定植、增强乳酸菌与肠道细胞之间的交流、抑制病原菌在肠道的定植和提高机体免疫力。因而乳酸菌的粘附性是评价其作为益生菌的重要指标。最新研究发现,在乳酸乳球菌中,细胞外膜的丝氨酸蛋白酶lactocepin除了有水解蛋白质、抗炎等功能外,还能介导乳酸菌的粘附作用,主要是通过影响范德华力的改变。
  为了研究lactocepin是否介导乳酸菌的粘附,本文以副干酪乳杆菌为载体,用九-Red重组系统敲除lactocepin的编码基因prtP,构建副干酪乳杆菌lactocepin缺失突变株。并比较了突变株与亲本株在生物学特性、体内外粘附性以及对肠道免疫影响等的差异。主要的结果如下:
  比较副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株菌的生长曲线、表面疏水性、自凝聚能力、抑制致病菌的能力及药敏性。结果表明,lactocepin缺失,副干酪乳杆菌生长速度减慢,疏水性和自凝聚能力显著下降,抑菌能力无明显变化,对不同抗生素的敏感性有所改变。副干酪乳杆菌亲本株对诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、链霉素均具有耐药性;对四环素和青霉素G中度敏感;对利福平、头孢唑林和头孢拉定均敏感,而lactocepin缺失突变株菌突变株对诺氟沙星、多粘菌素B和链霉素均有耐药性;对环丙沙星、青霉素G和头孢拉定中度敏感;对利福平、四环素、头孢唑林均敏感。
  本研究还测定了副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞以及肠黏液的粘附能力,建立了四种体外粘附模型。实验采取了镜检法、涂板法测乳酸菌对细胞的粘附性,荧光标记法测乳酸菌的体内粘附数。结果显示,lactocepin影响乳酸菌对不同细胞粘附性。在巨噬细胞上,亲本株粘附的数量为27.7±2.52个,lactocepin缺失突变株粘附的数量是19.3±3.06个,明显高于脾脏细胞的19.3±2.08个、10.7±1.53个和小肠上皮细胞的14.7±1.53个、8.3±1.53个,且亲本株对三种细胞的粘附量均显著高于突变株。亲本株对小鼠小肠黏液的粘附率为20.07±0.18%,突变株的粘附率为16.96±0.82%,亲本株显著高于突变株(P<0.01)。
  本试验采用流式细胞仪分析了两株受试乳酸菌在小鼠肠道中的定植与分布。结果表明,亲本株与突变株在肠道中的定植情况不相同。突变株在肠道的定植主要发生在灌胃前期,回肠和结肠中都是在第1d定植量最多,十二指肠和空肠中都是在第3d定植得最多。亲本株在肠道的定植除在结肠是第一天定植量最多以外,都发生在灌胃后期。亲本株和突变株主要都是定植在结肠,十二指肠中最少。在不同肠段,亲本株的粘附量均显著高于突变株(P<0.01)。
  采用CBA技术通过体内、外实验研究了受试乳酸菌对免疫器官、免疫细胞和免疫分子的影响。结果表明,发现亲本株与突变株都能在灌胃的中期提高小鼠的免疫器官指数,后期不明显;均能提高脾脏淋巴细胞转化率,但亲本株比突变株更显著;亲本株能显著提高巨噬细胞能量水平和吞噬能力(P<0.05),突变株作用不显著。亲本株和突变株高剂量时均可以增加机体对IFN-α的表达量(P<0.01),亲本株的表达效果更显著,亲本株可以增加机体对IL-10的表达量(P<0.01),而突变株的作用效果不明显。亲本株可以增加机体对IFN-γ的表达量,且与剂量及时间有关,高剂量作用显著(P<0.05),突变株作用不明显。两种受试乳酸菌在喂养小鼠的整个阶段均可提高CD11c+ CD80+双阳性细胞的细胞的数量。
[硕士论文] 黄宏轶
营养与食品卫生学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属于乳杆菌属(Lactobacillus),是可用于保健食品的益生菌,能够耐受人体的防御机制,其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等。干酪乳杆菌具有促进细胞分裂,产生抗体免疫及预防癌症等生理功能。由于干酪乳杆菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效,现成为人们研究、开发、生产的焦点。
  最新研究发现,在乳酸乳球菌中,细胞外膜的丝氨酸蛋白酶lactocepin能介导乳酸菌的黏附作用,而且在某些乳酸菌中,lactocepin对肠道炎性具有良好的抑制作用。它能够降解部分炎性细胞因子。因此对这种细胞表面蛋白的深入研究不但可以提高益生菌的益生功能,且可为开发肠道免疫调节制剂提供理论基础。
  1干酪乳杆菌21858 prtP基因突变株构建及其生物学特征。
  根据GenBank信息,细胞外膜丝氨酸蛋白酶lactocepin由prtP基因编码,本文通过通过λ-Red重组技术,替换干酪乳杆菌prtP基因,构建干酪乳杆菌(21858)prtP基因突变株(21858△)。
  通过测定两株乳酸菌的基本生物学特性发现21858△和21858生长曲线类似,21858△自凝聚率在各个时间点都低于21858,且时间越长差距越明显。21858与四种致病菌的共凝聚率大于21858△。21858△的疏水率为为44.1±1.5%,大于21858疏水率23.9±0.62%,且具有显著差异(P<0.05)。对致病菌的抑制效果21858好于21858△,但都没明显差异(P>0.05)。提示prtP基因对干酪乳杆菌生长曲线无影响,敲除prtP基因会降低干酪乳杆菌的自凝聚率和与治病菌的共凝聚率,会提升疏水率,对致病菌抑制性有降低趋势。
  221858prtP基因突变株21858△粘附能力研究
  通过建立体内外粘附模型测定21858和21858△对肠粘液、细胞及小鼠肠道的粘附能力。结果显示21858小肠粘液粘附率4.638±2.3%,21858△小肠粘液粘附率3.665±4.5%,具有显著差异(P<0.05)。通过细胞粘附模型发现21858对三种细胞的粘附性都大于21858△。21858和21858△对脾脏细胞的粘附没有显著差异(P>0.05),对小肠上皮细胞和巨噬细胞的粘附性有显著差异(P<0.05)。采用流式细胞技术分析乳酸菌在体内粘附情况,发现在小鼠的十二指肠、空肠、回肠中21858的粘附率高于21858△,但是在结肠中21858△粘附率要高于21858,且在灌胃后21858在肠道各个部位粘附菌数都随时间存在一定上升趋势。但两株菌在空肠内随着时间有明显下降趋势。且发现回肠中总粘附菌数高于小肠其他部位。提示prtP基因编码的细胞外膜丝氨酸蛋白酶lactocepin,能够提高干酪乳杆菌对小肠粘液、细胞表面以及小鼠肠道的粘附。
  3.21858 prtP基因突变株21858△免疫效力研究
  研究发现21858能提升小鼠体重,且与对照组有显著差异(P<0.05),21858对体重的提升效果好于21858△,时间越长效果越明显。21858和21858△对免疫器官的指数有特异性影响。21858和21858△对胸腺指数在短期内(10d)没有显著影响(P>0.05),但在较长期(20 d),21858和21858△高剂量组相对于对照组都有显著差异(P<0.05),而其他各组相对于对照组无显著差异。且高剂量组胸腺指数相对中剂量组有显著差异,提示干酪乳杆菌对胸腺指数影响存在剂量依赖关系。对于脾脏指数,两种干酪乳杆菌在整个喂养阶段都有提高的作用,且提升效果具有浓度依赖性,浓度越高,提升越明显。21858提升效果优于21858△。说明21858对免疫器官的影响要优于21858△。
  对免疫细胞研究发现21858和21858△在饲喂的整个阶段均能提高小鼠淋巴细胞的转化率,且在相同时间和剂量下21858组的转化率高于21858△组。对巨噬细胞的活化研究提示21858能通过提高巨噬细胞的能量代谢水平或吞噬能力来活化巨噬细胞,增强其对抗原的处理能力。但21858△对巨噬细胞的活化没有明显提升作用,提示21858活化巨噬细胞能力要强于21858△。本研究通过流式细胞仪对小鼠CD11c+,CD80+双阳性脾淋巴细胞进行检测。结果表明,两种受试乳酸菌在喂养小鼠的整个阶段均可持续提高CD11c+CD80+双阳性细胞的数量,尤其在喂养后期,且21858组增强能力好于21858△组。提示干酪乳杆菌能提高小鼠免疫功能,prtP编码的细胞膜蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌菌提高免疫功能有重要作用。
[硕士论文] 金连丰
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。
  研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。
  本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用qPCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。
  研究结果如下:
  (1) RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:
  RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organdle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;
  (2) miR-139-5p靶基因的验证
  选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。
[硕士论文] 周向珍
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用避免了人工施用氮肥的种种弊端,在农业生产中有重要研究和利用价值。目前对共生固氮的研究仍聚焦在其具体分子机制。根瘤菌合成的结瘤因子(NF)是共生起始的关键信号分子,除此之外,根瘤菌中很多基因均参与共生过程,保证根瘤菌可以正常分化并行使固氮功能,包括nod基因,nif基因,fix基因及一些lps基因等。Mesorhizobium loti MAFF303099与模式豆科植物百脉根(Lotus japonicus)的共生在共生固氮体系中极具代表性,对揭示共生固氮机理有重要的研究价值。MAFF303099是中慢生根瘤菌属内最早完成全基因组测序的菌株。本课题以MAFF303099为研究对象,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10,000个MAFF303099的转座接合子,构建突变体库,旨在构建并筛选百脉根根瘤菌MAFF303099中共生相关基因的突变体,更好地阐明共生机制。主要研究结果如下:
  1.测定百脉根根瘤菌MAFF303099的生长曲线,确定了其在TY培养基中培养时,对数生长期在OD600为1.0左右;测定MAFF303099对Km的敏感性,确定Km筛选浓度为50μg/mL。
  2.利用三亲本杂交方法将含Tn5-sacB转座子的质粒pMH1701转入目的菌株MAFF303099,转化效率为3.75×10-5,并挑取复筛后的约10,000转座接合子用96孔板培养并保藏,构建MAFF303099的转座子随机插入突变体库。
  3.利用PCR、抗性筛选、蔗糖筛选验证了复筛后的转座接合子中均有转座子Tn5-sacB插入在其基因组中,进一步通过TAIL-PCR的方法在16个突变体中鉴定出了10个转座子插入基因编码框的突变体,并确定了其具体插入位点,证实了突变体库构建的可行性。
  4.探索并构建了一套能从MAFF303099突变体库中快速筛选目的突变体的方法,成功筛选到了结瘤因子相关合成基因nodB的突变体,命名为MAFF303099/nodB-1,且确定了Tn5-sacB在nodB基因中的具体插入位点。
  5.对MAFF303099/nodB-1进行共生相关表型的分析,发现MAFF303099/nodB-1不能使百脉根结瘤;通过组织化学染色对百脉根NINpro-GUS转基因植株根部进行GUS染色,发现MAFF303099 nodB-1仍可以少量诱导LjNIN的表达,并形成极少数的侵入线(IT)结构。
[硕士论文] 孙开福
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39T是一株可在15%的NaCl及pH10.0的碱性环境下生长的中度嗜盐菌(Moderately halophile)。本研究首先以构建基因文库的方法为基础结合基因功能互补法,利用大肠杆菌(Escherichia coli)Na+/H-逆向转运蛋白基因缺陷型株KNabc(△nhaA,△nhaB,△chaA),从松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39T中筛选到1个Group1 mrp操纵子,它是一个编码多亚基单价阳离子/氢逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter),并将其定名为Hs_mrp,其编码蛋白命名为Hs_Mrp。
  Hs_mrp操纵子全长6 Kb,包含6个完整的开放式阅读框和一个截短的ORF融合进LacZ的阅读框(与同源蛋白只缺少1个氨基酸)(ORF7-13),并且它们拥有一个共同的启动子。通过蛋白同源比对发现,Hs_Mrp与湛江盐单胞菌(H.zhanjiangensis)中推测的单价阳离子/氢逆向转运蛋白Hzj_Mrp的七个亚基具有最高同源性(88.7%-98.9%)。与已鉴定的Group1 Mrp比对,发现除了与来自H.zhaodongensis的Hz_Mrp同源性较高(83.5-97%)以外,与其他已鉴定的Mrp对应亚基均表现出较低同源性(最高为48.1%,最低28.9%)。同时,基于比对结果构建其系统进化发育树,结果显示Hs_Mrp与一个已鉴定的和几个推测的Group1型Mrp聚在一起且形成一个独立分支,这说明Hs_mrp的确编码一个GroupⅠ型Mrp系统。
  为了深入地揭示Hs_mrp的耐盐碱机制,我们分别在异源宿主大肠杆菌(E.coli) KNabc和在同源宿主NEAU-ST10-39T Hs_mrp基因敲除突变菌株中进行了相关功能鉴定实验。结果如下:
  (1)在异源宿主中,耐盐碱测定显示:Hs_mrp可使(E.coli) KNabc在0.8 M NaCl、一定浓度LiCl(5 mM)及pH8.0的碱性环境中恢复生长;阳离子/H+逆向蛋白活性测定显示,KN abc/pUC-mrp制备的反转膜在pH7.5-9.5的范围内表现出了较高的Na+(Li+,K+)/H+逆向转运活性,且在pH9.5下活性最高,表观K0.5值分析显示,Na+、Li+和K+的K0.5值分别是0.64、1.05和0.76。结果说明Hs_Mrp是pH依赖性的Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白且即Na+是最适底物,其次是K+和Li+。
  (2)首先成功构建了基因敲除质粒pK18-mrp-NcoI和携带庆大霉素抗性的pK18-mrp-Gm;其次,敲除质粒pK18-mrp-NcoI通过电转化方法顺利进入NEAU-ST10-39T;然后利用反向筛选成功地获得了两株Hs_mrp基因敲除菌株,我们将其命名为NEAU-ST10-39T-△mrp-7和NEAU-ST10-39T-△mrp-23;最后,我们成功将携带有完整Hs_mrp操纵子的重组穿梭质粒pMCS5-mrp转入到敲除突变株中,将其互补突变菌株命名为NEAU-ST10-39T-△mrp/pMCS5-mrp。
  (3)在同源宿主中,对Hs_mrp敲除突变株进行了相应生理测试。耐盐测试结果发现:NEAU-ST10-39T-△mrp/pMCS5-mrp(互补突变株)表现出与野生型菌株类似的耐盐能力,既Hs_mrp操纵子可以互补敲除菌株;处于pH7的中性条件下,存在2%和3%的NaCl浓度时,敲除菌株与野生型菌株和互补突变株的生长情况没有差异;然而,随着盐浓度的升高,敲除菌株的生长明显受到抑制。在pH8或pH9的碱性条件下,从2%或3%的NaCl浓度开始,敲除菌株生长就已经受到了明显的抑制。以上表明:在中性条件下,Hs_mrp对宿主菌在高盐下的生长具有重要作用;而在碱性条件下,Hs_mrp对宿主菌在较低盐浓度下的生长就已经起到作用。
  鉴于以上结果,我们认为Hs_Mrp是一个具有Na+(Li+,K+)/H+逆向转运活性的Group1型Mrp系统;并成功地构建了NEAU-ST10-39T的Hs_mrp基因敲除突变菌株。
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