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[硕士论文] 袁亚洲
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:基因识别是对DNA序列进行分析,获取其中重要信息的第一步。目前测序技术的发展使得测序数据呈爆发式增涨,然而实验方法无法快速有效的从海量信息中获取知识,基于此运用计算机技术来识别基因的方法应运而生。在2015年,我们课题组研发了原核生物基因识别程序ZCURVE3.0,该算法是基于Z曲线理论,采用新的机器学习算法SVM,增加新的特征变量,并且对内部参数进行进一步的优化,使得该识别算法更加快速准确高效。在预测出基因后,还需要知道其相应编码的蛋白质,于是我们基于ZCURVE3.0算法,对其进行进一步的升级,添加相关的功能,使得其成为完善的可视化集成系统。
  在本基因识别可视化系统中,第一部分是对ZCUREV3.0的功能进行可视化(BAGA)实现,其保留了相应识别算法的所有功能。在通过对50个原核生物的全基因组进行测试,选取比对阈值,排除伪基因,同时使得删除的正确基因数尽可能少,那样基本保持正确的基因数不变。在与GenBank提供的总的基因数相比,BAGA的预测基因识别率为97.60%,预测结果的特异度为96.74%,与ZCURVE3.0的特异度94.21%相比有2%的提升。BAGA附加预测率为3.34%,比ZCURVE3.0(6.08%)下降接近3%。附加预测率的降低,表明其预测错误的基因数目相比ZCURVE3.0有更进一步的减少。第二部分是对于ZCURVE3.0和Prodigal两个基因预测软件联合方法(BAGA2.0)的实现,通过保留两者预测相同的基因,对不同的基因进行序列比对,调节合适的参数,保留比对得分较高的基因,将这两部分的基因作为最终联合预测的基因。BAGA2.0对应的识别率为98.73%,特异度为96.09%。这两者性能,都比ZCURVE3.0效果要好。另一方面,BAGA2.0的附加预测率为4.08%比ZCURVE3.0(6.08%)要低。综合来看,联合两者来识别细菌的基因性能要更优。此外,虽然BAGA2.0的特异度比BAGA要低,其附加预测率要大,但是其识别率和准确度却更佳。
  在本文中采用BLAST序列比对实现了对于预测的基因进行功能注释,对于系统中实现的两部分的预测结果都能够实现注释,而且能够选择快速注释和完全注释两者不同方式。同时,集成基因组岛预测程序。我们将此完善的集成软件编译成各种不同系统的版本,使用者能够访问http://cefg.cn/zcurve-visualization/下载,并免费使用。
[博士论文] 高升华
蔬菜学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物表皮毛对抵御生物和非生物逆境具有重要作用,同时也是一种研究植物细胞命运调控的模式系统。拟南芥单细胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白复合体的调控,该复合体通过激活下游表皮毛起始关键基因的表达,导致表皮细胞膨大而异化成表皮毛。番茄、烟草等多细胞表皮毛的调控机制不同于单细胞表皮毛。到目前为止,番茄、烟草等多细胞表皮毛的形成机制尚未被揭示。表皮毛的形成离不开细胞周期的调控,细胞周期蛋白在不同细胞周期的转变过程中起到重要作用。花器官发育的研究具有重要的生物学意义,目前确定ABCDE模型可以用来揭示花器官形成调控机理。但是,本研究中的新型B型细胞周期蛋白是否参与花器官形成的调控还未可知。
  本研究主要对SlCycB2基因在番茄、烟草和拟南芥中的同源基因进行了鉴定,并在番茄和烟草中进行了功能分析。主要的结果如下:
  1.利用SlCycB2基因编码的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等数据库中筛选同源基因。在番茄中确定2个同源基因,命名为SlCycB3和SlCycB4;在烟草中确定3个同源基因,分别命名为NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在拟南芥中确定2个同源基因,命名为AtCycB2和AtCycB3。一级结构分析发现这类基因均只有一个外显子,编码100多个氨基酸,具有三个保守区。将该类基因与番茄、烟草和拟南芥中的功能已知的B型细胞周期蛋白进行系统进化树分析,结果显示它们是一类新型的B型细胞周期蛋白。
  2.利用番茄、烟草和拟南芥中SlCycB2的同源基因所编码氨基酸序列在NCBI中进行Protein Blast分析,确定不同物种均含有SlCycB2的同源基因,且功能未知。该结果表明SlCycB2基因以及在不同物种的同源基因可能具有重要的生物学功能。
  3.SlCycB2和SlCycB3的组织表达谱分析结果显示这两个基因在番茄各个组织中都有表达,在花和叶中的表达最高。亚细胞定位分析确定SlCycB2所编码蛋白定位于细胞核中。SlCycB2基因启动子序列分析发现其中有多个光响应元件。对栽培番茄Ailsa Craig进行光照和暗处理,测定SlCycB2和SlCycB3基因的表达量,结果显示二者均受到光的诱导,受到暗条件的抑制。构建SlCycB2基因启动子驱动GUS-YFP融合表达载体,转化番茄并分析该基因的表达特点,实验结果表明该基因在下胚轴、茎表皮毛、叶表皮毛、花中的柱头和未成熟的果实中都有表达,且在表皮毛的腺体中高表达。
  4.转基因功能分析确定SlCycB2基因参与调控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表达载体和RNAi抑制表达载体分别导入到栽培番茄AC获得转基因植株。qRT-PCR分析结果显示SlCycB2基因的表达水平在超量表达转基因植株中显著上调,而在抑制表达转基因植株中显著下调。SlCycB2超量表达植株中表皮毛密度显著减少,非腺体毛和Ⅰ型腺体毛几乎消失,Ⅵ和Ⅶ型腺体毛的密度显著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表达植株上表皮毛密度显著增加,且主要是Ⅲ型和Ⅴ型非腺体毛显著增加,而且茎上形成了Ⅲtype-like超长毛,其他类型的表皮毛没有明显变化。
  5.SlCycB2超量表达植株叶片萜类含量的测定结果显示与对照AC相比,SlCycB2超量表达植株叶片中萜类化合物(包括单萜和倍半萜)的含量极显著降低。萜类化合物对生物具有重要的防御作用。因此,分析了转基因材料对斜纹夜蛾的抗性实验,结果表明SlCycB2超量表达植株更易遭受斜纹夜蛾的啃食。综合这些结果,推测SlCycB2基因可能通过调控Ⅵ型表皮毛的形成,影响萜类物质的生物合成,进而影响其生物防御的效果。
  6.转基因功能分析还表明SlCycB2基因调控番茄花器官的发育。SlCycB2超量表达植株表现出花药开裂,花柱变短的表型,坐果率显著降低。SEM观察发现畸形花粉显著增加,花柱细胞变短和柱头乳突细胞畸形。实验结果表明SlCycB2参与调控番茄花柱和花粉的发育。
  7.RNA-seq分析结果表明,SlCycB2超量表达植株和对照AC植株之间具有241个差异表达基因(DEGs); SlCycB2-RNAi抑制表达植株和对照AC之间有84个差异表达的基因;SlCycB2超量表达植株和SlCycB2 RNAi植株之间有834个差异表达基因。对DEGs进行功能聚类分析,发现这些DEGs主要参与萜类代谢、角质蜡质合成和蛋白酶抑制因子的合成等途径。这暗示了SlCycB2超量表达植物中次生代谢物(如萜类化合物)的减少导致其对食草性昆虫的防御力减弱。
  8.转基因分析结果显示SlCycB2在不同物种的同源基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。利用pMV2载体构建了SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表达载体,利用pHELLSGATE2构建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表达载体,遗传转化获得转基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR检测目的基因的表达水平,确定这几个基因在超量表达植株中均上调表达;SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表达植株中均下调表达。表型分析发现SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2超量表达转基因植株的表皮毛密度显著减少;SlCycB3-RNAi抑制表达植株的表皮毛密度显著增加,说明这类基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。
  9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表达番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表达量进行测定,结果显示在NtCycB2和AtCycB2超量表达转基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下调表达;在SlCycB3超量表达番茄植株中SlCycB2基因亦下调表达;同样,在SlCycB2超量表达植株中SlCycB3也下调表达。推测这类基因可能受其同源基因的表达水平的影响。
  10.构建的SlCycB3、SlCycB4、tCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表达载体遗传转化烟草获得转基因植株。表型分析确定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2转基因植株的表皮毛密度显著降低,而SlCycB4、AtCycB2、NtCycB3和NtCycB4转基因植株的表型没有变化。SEM观察发现SlCycB2和AtCycB2转基因植株中长柄和短柄腺体毛密度都显著减少。因此推测茄科作物可能具有相似的多细胞表皮毛调控途经。
[硕士论文] 张香媛
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:细胞核是真核生物特有的,最大的细胞器。染色质是遗传和表观遗传信息的载体,并且是最大的生物大分子。大约2m长的染色质被折叠进直径小于10μm的细胞核。染色体构象捕获(3C)技术以及一系列它的衍生技术(4C、5C、Hi-C)的发展促进了核结构的研究。这些技术揭示了一些蛋白如CTCF,Cohesin等在染色质折叠和相互作用中发挥重要的作用。最近发现一些lncRNAs也参与了染色质的相互作用。lncRNAs通过与DNA、蛋白质,甚至与RNA本身相互作用,参与了染色质相互作用并调控了核结构的形成,比如XIST,Firre等。因为基因组的大部分编码为ncRNA,我们猜测也许很多lncRNA参与了核结构的调控。但是直到现在,也没有任何系统的关于lncRNA参与染色质相互作用的报道。
  为了在全基因组范围内筛选可能参与染色质相互作用的lncRNAs,我们建立了一种基于Hi-C技术的高通量筛选的方法,它是通过对比RNase处理前后基因组范围的染色质相互作用来实现的。建立高质量的Hi-C文库是整个课题的关键。Hi-C技术是一个多步骤、耗时较长的分子生物学技术,需要多种试剂和仪器。这个技术还不是很成熟,到现在为止它的重复性还不是很好很稳定。通过优化复杂的Hi-C实验中最核心的步骤如交联、酶切、限制性内切酶的失活和原位连接等,我们建立了一个成熟的、稳定的Hi-C建库流程。在初始Hi-C文库进行扩增之后,将GM12878细胞的RNase处理前后的两组生物学重复Hi-C文库进行了高通量测序。在初步的生物信息学分析之后,文库的质量及生物学重复的重复性得到检验。平均来说,原始数据中大概有90%的比对率,72%的配对率。
  此外,在去除自连片段和dangling-ends后,能够获得超过96%的有效相互作用对。相关性分析显示,两组生物学重复的bincoverage和allbinpairs的相关性都极强。所有这些结果进一步证明了优化了的Hi-C建库流程是可靠并且稳定的。在获得了高质量并且高度重复性的文库后,我们进一步对照分析了RNase处理前后样品文库的结果。对比分析显示,在RNase处理之后很多相互作用减弱甚至是消失了。
  在建库过程中也发现,和RNase处理组相比,同样细胞量的正常组得到了1.58倍的初始Hi-C文库(相互作用片段)。在两组生物学重复的正常组和RNase处理组扣减后,我们选择正值前10000对差异相互作用进行下一步的分析。最后发现在RNase处理后消失或减弱的染色质相互作用位点附近存在4081个lncRNAs编码基因。GO注释显示,这4081个lncRNAs编码基因附近的基因主要和细胞膜、Pleckstrinhomology-likedomain、铵离子转运、可变剪接等生物学结构或功能相关。筛选到的这4081个lncRNAs是潜在的可能参与染色质相互作用的,这为进一步研究它们的分子机制和功能提供了一个很好的基础。
[硕士论文] 胡文桥
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:染色质三维空间结构对基因转录调控具有重要的作用,一方面影响基因转录调控区域的活性,另一方面调节基因组上顺式调控元件与反式作用因子的结合。多外显子基因和单外显子基因具有不同的转录调控特点,它们的转录调控区域可能具有不同的染色质相互作用模式。因此,本课题重点研究染色质相互作用的全基因组分布,分析多外显子基因和单外显子基因在转录起始位点附近区域的染色质相互作用模式,并结合核小体定位、组蛋白修饰、拓扑关联结构域(TAD)、基因功能富集分析等研究染色质空间位点的相互作用对多外显子基因以及单外显子基因转录的调控作用。
  通过系统分析人类染色质相互作用数据,我们发现染色体内部的相互作用强度显著大于染色体间的相互作用强度,小染色体(chr16-22)之间的相互作用强度要明显高于较大染色体(chr1-9)之间的相互作用强度,而且染色体间的相互作用强度与基因密度有关。
  人类基因组多外显子基因和单外显子基因在转录起始位点(TSS)附近区域的染色质相互作用模式完全不同,多外显子基因在TSS上下游2000bp范围的作用趋势是一种“凹槽”模式,即在TSS区域染色质相互作用弱,上下游远端位点染色质相互作用都逐渐增强;而单外显子基因在TSS下游600bp位点左右形成一种“单峰”模式,即在TSS上游区域作用强度一般,在基因内部区域作用最强,然后作用强度缓慢降低。在TSS附近,多外显子基因和单外显子基因分别形成5种和4种不同的染色质相互作用模式图谱。单外显子基因位点的平均作用最大频度小于多外显子基因位点的平均作用最低频度,而且单外显子基因平均表达水平也明显低于多外显子基因。我们通过进一步分析发现,基因所在染色质片段相互作用越强,其基因表达水平越高,核小体周期性排布规律越明显,活性组蛋白修饰水平越高。染色质作用越强的基因更倾向位于TAD内部,并且离TAD边界越近。
[硕士论文] 龚杨杨
系统科学 南京信息工程大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,随着生物医学、生物信息学等领域研究的深入与应用,基因调控网络相关性能的研究受到科学工作者的高度关注。由于基因调控网络中的蛋白质、DNA、RNA等分子起着调控生物系统各种生命机理的作用,故上述分子浓度变化规律的分析与综合无疑成为研究的重点。从理论模型角度,研究较多的主要有由微分方程描述的基因调控网络,较为复杂的有,基于维纳过程驱动的基因调控网络与随机混杂基因调控网络。然而,已有实验证明,在某些特定因素的影响下,各分子浓度随时间连续地变化时,部分分子浓度会发生突变,此时,如果仍用基于维纳过程驱动的基因调控网络表述就不十分准确。为准确分析分子浓度的突变对基因调控网络性能的影响,本文考虑由Lévy噪声驱动的基因调控网络,研究当有分子浓度发生突变时,相应的基因调控网络性能的变化是否仍能在可控范围之内:
  1、研究了Lévy噪声驱动的变时滞基因调控网络的稳定性。通过构造Lyapunov函数,运用推广的Itó公式,结合Leibniz-Newton公式,以及利用Kunita估计方法和基本不等式等技巧,对跳变项进行估计,获得了Lévy噪声驱动的变时滞基因调控网络全局渐近稳定的充分条件,并通过仿真验证了充分条件的有效性。
  2、研究了Lévy噪声驱动的Markov调制的基因调控网络的有界性。考虑到Markov调制的基因调控网络有时会出现分子浓度爆炸的现象,通过选取适当的Lyapunov函数,利用推广的Itó公式以及复杂技巧的处理,反过来充分利用Lévy噪声抑制可能出现的分子浓度爆炸现象,给出了分子浓度增长具有上确界的条件,并通过数值仿真验证了所获条件的可实现性。
  3、研究了Lévy噪声驱动的具分布参数基因调控网络的指数稳定性。考虑到分布参数主要是刻画因分子浓度分布不均,导致分子扩散方向不同的基因调控网络,为了确保所获结论与扩散系数相关,通过构造关于空间变量平均的Lyapunov函数,利用Hardy-Poincare不等式,并设计反馈控制器,获得了Lévy噪声驱动的具分布参数的基因调控网络指数稳定性的充分条件,且条件与扩散系数相关,并通过数值仿真验证了所得结论的正确性。
[硕士论文] 张宇良
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物的细胞周期通过连续激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。在哺乳动物细胞周期中,周期蛋白A和周期蛋白B通过泛素化降解途径使靶蛋白去磷酸化,促进有丝分裂中期向后期转化;周期蛋白D通过磷酸化Rb蛋白终止G1期,促进细胞G1/S期转化。
  不同的生物体包含的周期蛋白类型不同,单细胞真核生物纤毛虫表现出周期蛋白多样性,表明单细胞生物体内存在精细的调控机制。嗜热四膜虫含有1个小核和1个大核,小核为二倍体,在营养生长期转录沉默,大核为多倍体,转录活跃,营养充足时细胞进行无性生殖,饥饿条件下进行有性生殖。有性生殖过程中,小核进行减数分裂,产生4个原核,其中3个降解,另外1个原核进行有丝分裂产生配子核,配子核交换,融合产生合子核。合子核通过有丝分裂产生新的大核和新小核,完成有性生殖。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜虫小核减数分裂期特异表达,Cyc2调控了小核减数分裂的起始,而Cyc17对减数分裂后期的起始和同源染色体的分离是必需的,但是Cyc28的功能目前并不清楚。
  本研究首次从嗜热四膜虫鉴定了有性生殖特异表达的周期蛋白基因CYC28,对其功能进行了分析,主要结果如下:
  1. CYC28生物信息学分析基于四膜虫大核基因组数据库(http//:www.ciliate.org)和功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn)分析表明嗜热四膜虫 CYC28(TTHERM_00082190)基因全长1174 bp,开放阅读框801 bp,预测编码266个氨基酸。RT-PCR产物测序分析表明CYC28序列正确。序列比对分析N端有一个由121个氨基酸组成的保守性周期蛋白框,周期蛋白框后有一个由9个氨基酸残基组成的破坏框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能属于周期蛋白B3亚家族。Microarray表达谱和实时荧光定量检测结果表明CYC28在营养生殖期和饥饿期不表达,在有性生殖期特异表达,4 h时表达量最高。
  2. HA-Cyc28的细胞定位及表达分析为研究Cyc28的功能,构建带有HA标签的表达载体 pXS75-CYC28,该表达载体由MTT1启动子调控,在Cd2+诱导下高效表达,经基因枪转化,巴龙霉素浓度梯度筛选,选择稳定的细胞株。免疫荧光定位表明,Cyc28在有性生殖早期定位于细胞质,在8 h定位在凋亡的旧大核上,表明Cyc28可能通过泛素化途径,在凋亡的亲本大核中降解或者直接参与了亲本大核的凋亡。蛋白免疫印迹结果表明,HA-Cyc28在四膜虫有性生殖0 h没有表达,2 h后表达上调,在4h和8h蛋白条带变弱,可能部分发生泛素化降解,在16h配对分开后蛋白质消失。
  3.敲减CYC28对有性生殖进程无显著影响 CYC28是有性生殖期特异表达的基因,为进一步分析Cyc28在嗜热四膜虫有性生殖过程中的功能,我们首先构建了CYC28的敲除载体pNeo4-Δ-CYC28,转化不同交配型的四膜虫细胞,通过同源重组,筛选得到CYC28敲减细胞株。同野生型细胞相比,敲减株在有性生殖过程中,细胞配对,小核拉伸,小核减数分裂以及原核选择,合子核的有丝分裂都未见异常。由于未能获得CYC28完全敲除的突变体细胞株,进一步构建了CYC28的干扰质粒pCYC28hpCYH,该质粒由Cd2+调控表达。干扰质粒通过基因枪转化四膜虫,经放线菌酮抗性梯度筛选,获得不同交配型的突变体细胞株。qRT-PCR检测得到稳定的干扰株。观察四膜虫在有性生殖过程中核发育,结果表明小核发育过程未受影响,细胞配对,小核拉伸,减数分裂,配子核交换,新大核形成以及结合后的个体均正常,表明Cyc28的敲减对有性生殖的进程无显著影响。
  4.过表达Cyc28影响有性生殖期原核的有丝分裂在突变体细胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配对后,CYC28基因的转录水平比野生型提高约10倍,观察有性生殖过程,过表达Cyc28引起原核有丝分裂进程的异常。同野生型相比,在有性生殖3.5h,45.5%细胞第一次减数分裂后期出现浓缩的染色体,未见染色体解聚后的小核;在4h,36.5%的细胞停留在第一次减数分裂后期,31.5%细胞进行的第二次减数分裂,小核松散;而在6h,大多数细胞选出的小核无法进行有丝分裂;在8h,45.3%细胞中未出现新大核,在12 h,未出现发育完成的两个大核一个小核的细胞。过量的外源Cyc28导致细胞核发育异常,原核有丝分裂受阻,有性生殖未能完成。
  本研究首次鉴定了嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC28,实时荧光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特异表达。敲减CYC28不影响细胞的发育,而过表达CYC28导致细胞有性生殖过程小核有丝分裂异常,暗示它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。进一步获得CYC28的敲除株,有望揭示Cyc28在嗜热四膜虫生殖过程中具体功能,完善周期蛋白在纤毛类原生动物中的复杂调控机制。
[博士论文] 唐友
农业工程;农业电气化与自动化 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:全基因组选择GS(Genomic Selection)也叫基因组预测GP(Genomic Prediction)是一种用于计算基因组育种值GEBV(Genomic Estimated Breeding Value)的方法,估算精准育种值需要检测覆盖所有全基因组水平遗传标记假设,然后对其个体进行评估。当前全基因组选择的方法非常多,如基于贝叶斯模型的方法(BayesianA、B、C、lasso等),还有基于最佳线性无偏预测BLUP(Best Linear Unbiased Prediction)模型的方法(gBLUP,rrBLUP等)。每种预测方法计算原理不同,对于表型性状预测效果有很大差别,所以预测选择适合的方法是提高最大精准值Accuracy最好的途径,其基因组育种值是作为育种家育种的重要参考。
  本文研发了一个新基因组选择方法mMAP(Mining the Maximum Accuracy ofPrediction)是将当前流行的基因组选择方法建立方法库,然后去预测运算大量不同的物种性状,采用交叉验证得到精准值,形成具有参考价值的知识库。新的物种性状根据知识库采用挖掘技术去选择最优GS方法在预测GEBV中指导育种分析。现在知识库里面有三百多种物种性状测得精准值,并不断有GS方法加入到方法库,再将预测新物种性状精准值累积到知识库中。mMAP方法具体研究实现过程及效果:
  (1)对于新物种性状预测,通过引入数据挖掘技术应用到基因组方法的选择上,将聚类分析处理知识库与多种流行的基因组预测方法相结合,目的是应用最少的基因组预测方法算出预测精准值最高。根据提供的三组知识库数据,真实预测累积数据、两组模拟知识库数据之间分别符合正态分布和随机分布,分别在92.27%、93.40%和90.2%以上找到该表型对应GS方法预测精准值的最高。
  (2)预测精准值运算采用统计学中交叉验证(Cross validation)提高验证精准值的效率。验证设计采用随机分5组,以80%已知表型数据作为训练群体,预测20%未知表型数据,然后重复100次以上验证去预测精准值基本上覆盖了所有假设,将其误差降到最低。也将交叉验证分组进行不同设置扩展实验,如3、5、10、20等,再重复100次以上其Accuracy接近稳定。
  (3)确定新表型性状选择GS方法的最佳时机,本研究设计了聚类中心最远、最近收敛方法去检验找到新预测表型最适合的GS方法。通过实验设置初始聚类分组重复100次以上使得初始知识库处理聚类核心比较稳定,然后在收敛时根据距离每组聚类核心最近位置值和最远边缘值查找,使得最新GS方法预测Accuracy将其临时组合到知识库,然后迭代收敛检验直到连续两次内没有新GS方法产生,避免了偶然性。通过真实数据检验对于新性状查找大概迭代3次左右即可找到最佳方法,迭代本身时间仅几秒钟。
  (4)每种GS方法都有独立的实现包,只需要将聚类产生的新GS方法和物种性状传到包里进行预测。而且各个包之间相对独立,通过主线程对聚类结果进行分别调用,其结果不会相互影响,经过比对结果,继续收敛。通过独立包的设计达到方法执行相对独立,保证数据安全和缩短运行时间。
  (5)采用面向对象技术实现mMAP研发,可以通过多线程实现独立包调用。通过引入操作系统底层封装技术Docker,直接调用Linux服务封装简化操作系统内核形成Docker容器,实现多线程应用。将容器封装到WEB环境,通过B/S操作访问模式,提供服务为育种家随时随地进行运算,结果会自动生成分析报告和育种值。该平台已经可以远程应用,并在2017年1月PAG(The Plant and Animal Genome)大会上进行了展示。
  (6)提供给mMAP运算的基因型数据可以是已发表公共的数据,也可以由原始测序数据转换得到。因此高通量测序数据转换基因型数据作为输入接口,整合到mMAP计算平台中构建一个完整体系,目的是可以降低原始数据存储空间、缩短转换时间以及高效服务育种业务。目前高通量测序原始数据(fastq格式)比对参考基因组序列(fasta格式),通过bowtie、samTool、GATK等工具进行数据转换、calling SNPs等操作,然后再变换成可用的基因型文件如Hapmap、Numeric Genotype等格式为后续分析服务。但是高通量测序原始数据太大,转换时间太长,整个处理过程占用大量资源。
  针对运行时间和占据空间问题,本研究设计了一个基因型数据处理管道,目的是提高效率,主要涉及算法技术和效果:HDF5数据格式替代fasta作为参考基因组,占空间小,比对速度较快;由于处理过程中大量的中间数据产生影响其效率,本研究设计一种高效双索引文件格式来存储差异基因位点数据,根据差异数量减少中间文件占用空间;由于生成SNP及基因文件都占据大量空间,引入gZIP压缩方法,能将大型基因数据文件压缩到50倍以上,而且编写方法直接调用压缩数据和还原的SNP数据,其操作与源数据效果相同。为了提高调用及转换基因型数据过程效率,对于变换基因型数据存储形式采用压缩格式,并提供很多灵活的操作接口,方便后续分析统计。整个管道采用面向对象技术研发,实现并行处理,并提供数据接口服务与mMAP整合在一起。
  通过mMAP方法预测很多物种性状,根据设置的条件可以找到最优合适的GS方法,并调用生成育种值,为育种家提供直接帮助。通过管道研究,能够完成大批高通量原始测序数据的转换,引入并行运算和相关技术可以完成基因大数据处理模式,并对遗传领域后期数据分析(如全基因组关联分析GWAS和GS)提供基础服务。
[硕士论文] 金连丰
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。
  研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。
  本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用qPCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。
  研究结果如下:
  (1) RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:
  RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organdle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;
  (2) miR-139-5p靶基因的验证
  选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。
[硕士论文] 张祎焜
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:生命系统存在于复杂的环境背景中。为适应环境的变化,生物需要通过感知和应答对已建立的稳态进行适当调整。温度是环境条件的一个重要方面,生物体对温度变化的适应机制一直是生命科学领域的研究热点之一,相关成果已广泛应用于基因工程、发酵工程、酶工程及新生物材料等众多领域。然而,生物体对热胁迫响应的内在分子机制目前仍不十分清楚。本工作中,利用RNA-Seq技术测定了大肠杆菌最适生长和热胁迫状态下的转录组数据,并通过基因表达谱和相关蛋白互作网络分析,研究了大肠杆菌的热胁迫响应过程。
  首先,基于已有的研究经验和预实验对培养基进行了优化,改进了大肠杆菌热胁迫实验方案,并结合生理实验结果确定了最适生长和热胁迫条件下大肠杆菌单批培养过程中RNA样本的采集时间点。然后,对RNA样本进行了链特异性测序,得到了两种实验条件下不同生长阶段的转录组数据。基于基因表达谱,鉴定和分析了最适生长和热胁迫条件下的差异表达基因;结果显示,与热激时期相比,热胁迫时期上调基因数量明显增加。对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的结果显示,热激时期,正常生理活动受到抑制,能量供给不足,热激响应活动活跃,错误折叠的蛋白质大量分解并用于合成热激蛋白,菌体处于典型的应激状态;热胁迫时期,热激响应活动减弱,热激时期受到抑制的部分生理功能得到恢复,一些最适生长温度下沉默的基因被激活,相关代谢通路运转,暗示与最适生长状态相比,热胁迫状态的菌体处于一个新的稳态。随后构建了差异表达基因的蛋白互作网络,并对网络中的枢纽蛋白进行了筛选和分析。基于MCL聚类算法对蛋白互作网络进行了模块划分,结果显示,热适应过程涉及的大部分生理活动都是由蛋白质的功能模块执行的,并且生理功能相似的蛋白质倾向于富集在相同的功能模块中。此外,蛋白互作网络枢纽蛋白功能分析和网络模块功能富集分析的结果支持转录组相关分析得到的结论。最后构建了最适生长和热胁迫状态下的蛋白互作网络,并对其拓扑属性进行了计算和比较。结果显示,两种生理状态下蛋白互作网络的拓扑属性差异很小,表明蛋白互作网络在不同环境条件下具有结构和功能的稳健性。基于此研究结果,借助物理学中的“势垒”概念,我们对热胁迫响应过程中适应策略的选择机制进行了推测。本工作为后续大肠杆菌热胁迫响应的研究提供了实验路线及研究方向,并为进一步揭示生物体适应策略的内在选择机制打下了基础。
[硕士论文] 乔菊霞
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在真核细胞中,染色质是由DNA,组蛋白,非组蛋白以及少量的RNA组成的。染色质的基本单位是核小体。核小体是由146 bp的左手超螺旋DNA缠绕着组蛋白八聚体组成的。组蛋白八聚体是由进化上比较保守的核心组蛋白H2A,H2B,H3, H4各两个单体构成。连接组蛋白则可以将DNA锁定在核小体上。在不同生物中,连接组蛋白在进化上不保守,在维持基因组的稳定性,特定基因的转录调控,染色质重塑,以及DNA损伤修复等方面发挥着重要的作用。
  嗜热四膜虫(Tetrahymean thermophila)具有传统纤毛虫特异的大核和小核的细胞双核体系。大核和小核中具有结构不同的组蛋白H1。小核特异组蛋白MLH1(micronuclear linker histone)在生长期表达量低,而在有性生殖时期表达水平显著提高,然而其具体的生物学功能并不清楚。本研究对Mlh1在四膜虫中的功能进行了系统分析研究,获得主要结果如下:
  1. MLH1基因的生物信息学分析 MLH1(TTHERM_00471820)在四膜虫大核基因组中无内含子序列,开放阅读框1902 bp,编码633个氨基酸。含有21.5%的赖氨酸和23.1%的丝氨酸。序列中含有一个较为保守的HMG-box结构域(93-158aa),该结构域属于 II/III类的 HMG-box超家族。与四膜虫高迁移率族蛋白 HmgB3(TTHERM_00155590)的HMG-box有35%的一致性。MLH1在营养生长期和饥饿前期有较低的表达,饥饿后期几乎不表达,而在有性生殖时期表达水平显著提高,有性生殖时期6h达到最高。
  2. Mlh1在不同发育阶段的定位 Mlh1在生长发育的不同时期会水解成不同的片段α,β,γ,δ。分别构建了含HA-tag和Flag-tag的pXS75-MLH1、pXS75-MLH1-α、pXS75-MLH1-β、pXS75-MLH1-γ、 pXS75-MLH1-δ载体,转化嗜热四膜虫细胞中,利用巴龙霉素抗性筛选出突变株。免疫荧光定位分析表明,在营养生长期 HA-Mlh1定位在小核上,而HA-α,HA-β,HA-γ,HA-δ定位在胞质中,表明全长Mlh1对于小核连接组蛋白的入核是必须的。营养生长期HA-Mlh1定位在小核上,而Mlh1-Flag没有定位在小核上,表明全长 Mlh1入核后很快发生了水解。在有性生殖早期, HA-Mlh1定位在小核上,且定位信号不断扩大,定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期,HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。在小核完成第二次减数分裂后,HA-Mlh1定位信号消失。结果表明,Mlh1参与减数分裂小核的拉伸。
  3. MLH1的过表达导致四膜虫异常的有性生殖0.15μg/ml的Cd2+诱导生长期突变株2 h,通过DAPI染细胞核DNA,显微镜下进行突变株有性生殖时期核发育观察,发现突变株在有性生殖期间出现无规则的小核和松散的染色质,突变株不能完成有性生殖。核发育概率统计显示,MLH1的过表达抑制了合子核的形成和发育,减数分裂后形成的配子大部分凋亡,少部分能发育到anlagen时期,之后配对细胞分开。
  4. MLH1的敲除影响四膜虫的有性生殖构建敲除载体pBsr-MLH1后,基因枪转化入四膜虫细胞内,通过杀稻温菌素梯度浓度筛选得到稳定突变株ΔMLH1。缺对PCR检测结果表明突变株存在小核染色体的丢失。核发育概率统计和γ-H2A.X定位信号结果显示,突变株在第二次减数分裂后,选择核不能完成DNA断裂修复,之后配子凋亡。结果暗示,MLH1的缺失会影响选择核的DNA断裂修复,进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。Mlh1可能和DNA损伤修复相关。
  5. MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿通过四膜虫功能基因组数据库分析,发现MLH1和高迁移率蛋白HMGB3有着相似的表达图谱。此外,Mlh1和HmgB3有着相似的一级氨基酸序列结构特性。RT-qPCR分析,发现在ΔMLH1细胞中,HMGB3的表达水平较野生型细胞有了明显的提高;在ΔHMGB3细胞中,MLH1的表达量也较野生型细胞有了明显的提升。 MLH1和HMGB3的双敲除突变株对MMS较为敏感,且有性生殖缺陷比 MLH1的单敲除细胞株表型严重。以上结果表明 MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿作用。
  本研究首次对MLH1在四膜虫有性生殖时期的定位和功能进行了系统分析;有性生殖早期,HA-Mlh1定位在小核上,且定位信号不断扩大,定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期,HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。MLH1的过表达不仅抑制了合子核的形成和发育,还形成了无规则的小核以及松散的染色质。MLH1的敲除会影响选择核的DNA断裂修复,进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。此外,组蛋白MLH1和高迁移率蛋白HMGB3可能存在功能冗余性。连接组蛋白Mlh1的正常表达对四膜虫细胞核的稳定性和有性生殖进程是必需的。
[硕士论文] 闫静
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在真核生物蛋白质翻译终止过程中,当三个终止密码子UAA、UAG和UGA中的一个到达核糖体A位点时,被第一类肽链释放因子eRF1识别,翻译过程终止,在第二类肽链释放因子eRF3的协同下完成新生肽链释放。在翻译终止过程中,第一类肽链释放因子eRF1利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Y×C×××F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。
  在本实验中,首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别三个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q/E367D)。同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显著提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显著,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别三个终止密码子,说明Loop结构显著的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。
  从以上实验结果推测,是否酿酒酵母第二类肽链释放因子与两种酵母的嵌合体eRF1相互作用的效率不同,导致两个嵌合体识别终止密码子的效率和功能发生了改变。因此,在本实验中,将克隆得到的四膜虫eRF1嵌合体和裂殖酵母Sp eRF1以及酿酒酵母两类肽链释放因子Sc eRF1和Sc eRF3的基因,分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,得到的重组质粒共转化到酵母菌株AH109。酵母双杂交结果证实四膜虫eRF1嵌合体(Tt/Sc eRF1/Tt/Sp eRF1)、功能Sp eRF1、Sc eRF1和Sc eRF3均存在相互作用关系,说明无论在何种细胞中,蛋白质翻译终止过程都需要两类肽链释放因子的协同作用来完成。排除了酿酒酵母细胞中嵌合体eRF1识别终止密码子的性质和活性的差异是由于Sc eRF3与嵌合体eRF1相互作用的效率不同而引起的。
  为了进一步验证N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,我们通过双荧光分子互补实验(BiFC)证实eRF1功能的主要调控因素是其N端结构域与C端结构域在分子内发生的相互作用引起的。通过克隆得到四膜虫eRF1的N结构域,C结构域、酿酒酵母eRF1的C结构域和裂殖酵母eRF1的C结构域及其突变体(Sp-C A364Q、Sp-C D364A/A364Q、Sp-C L357A/D364A/A364Q)的基因,分别连接到表达载体pQE-30和pET-28a中。结果表明四膜虫eRF1的N结构域与不同的C结构域以及突变体在体内都可发生相互作用,说明C端结构域通过与N端结构域的分子内相互作用,影响终止密码子的识别活性;也进一步证实了C端结构域参与了密码子的识别过程。
  综合以上结果表明,四膜虫eRF1的N端结构域不是其识别终止密码子的唯一因子,C端结构域在一定程度上影响并决定了eRF1对终止密码子是别的特异性。本研究结果,旨在为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供数据支持。
[硕士论文] 李想
软件工程;软件理论与技术 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着后基因组时代的到来以及对高级生命体的深入探究,针对人类生产生活、动植物性状表达的研究已经从功能性表现逐步迈入基因水平。在基因表达的过程中,基因的表达方式已成为当下又一热门话题,研究人员对此颇感兴趣。
  生物学领域的专家通过实验和高通量技术来识别或预测新的基因或物种,虽然其结果有一定的准确率但同时增加了实验人员的负担。在计算机科学的辅助下,应用生物信息学这一新兴学科来解决上述问题可以达到简化实验操作步骤以及更清晰直观的呈现实验结果的目的。
  在基因受诱导表达的过程中,转录是关键的一环。转录调控的过程中,针对转录因子结合位点(即顺式作用元件)的探索已经成为研究重点。对于顺式作用元件的提取及识别的方法也是多种多样的。当前学者大多以人工实验的方法以及应用国外的在线平台进行该领域的研究,但此类方式既耗费资源又不现实,因此本文提出一种基于真核生物顺式作用元件的提取与识别模型,并对其进行可视化,将识别后的转录因子结合位点进行整合,构建数据库。
  本文应用Blast工具对比序列文件,将对比后的结果进行内部重组及插入空位操作以实现多重序列对齐。应用无监督图聚类方法对同源基因簇进行查找,将5种禾本科植物的60个基因分为10个同源基因簇。本研究以五种实际生活中常用的真核生物作为实验物种,采用三阶马尔科夫模型生成背景序列,再使用搜索极大团的方式将显著性模体识别出来。该模型的识别正确率达到0.92,综合评价值达到0.91。
  通过将同源基因比对和模体识别模型融入真核生物顺式作用元件提取与识别的系统中,实现了模体查询、同源基因比对以及模体识别等基本功能。从运行速度上来讲,简单模式生物和复杂作物在处理时间上无较大差别,并且在数据量成倍增长的情况下,该系统保持相对良好的稳定性。
[硕士论文] 黄赟
生物化学与分子生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  利用siRNA干扰技术干扰胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)基因并构建细胞氧糖剥夺再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,探讨OGD/R和CBS基因干扰后SH-SY5Y细胞自噬和凋亡情况及相关信号通路变化。
  方法:
  构建OGD/R模型,体外模拟缺血再灌注过程,根据氧糖剥夺和再灌注时间不同共设9组,分别为正常对照组,氧糖剥夺4h/再灌注12h组(4h/12h组),氧糖剥夺4h/再灌注24h组(4h/24h组),氧糖剥夺8h/再灌注12h组(8h/12h组),氧糖剥夺8h/再灌注24h组(8h/24h组),氧糖剥夺12h/再灌注12h组(12h/12h组),氧糖剥夺12h/再灌注24h组(12h/24h组),氧糖剥夺24h/再灌注12h组(24h/12h组),氧糖剥夺24h/再灌注24h组(24h/24h组)。利用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察各组细胞OGD/R后细胞内自噬小体形成情况;脂质体转染法将靶向CBS基因的siRNA转入SH-SY5Y细胞内,同时构建OGD/R模型,氧糖剥夺4h/再灌注24h。将细胞分为3个组,分别为CBS干扰组,OGD/R组和CBS干扰+OGD/R组。CBS干扰组以阴性对照(与干扰组siRNA有相同的碱基组成但与靶mRNA无同源性的一段核苷酸序列)作为对照,OGD/R组以正常细胞作为对照,CBS干扰+OGD/R组以阴性对照+OGD/R组作为对照组。为观察转染试剂对正常细胞的毒性作用,特增加正常对照组作为参照。以上各组各设3个复孔并进行3次独立重复实验;蛋白印迹法鉴定 CBS基因干扰效率,并检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和信号通路中 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达水平,以及凋亡信号通路中NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。
  结果:
  1.透射电镜观察细胞内自噬小体:除正常对照组和氧糖剥夺4h/再灌注12h组未观察到自噬小体外,其余各组均在胞质内观察到了较多自噬小体;2. CBS基因干扰效率:蛋白印记法检测CBS蛋白表达,结果显示,干扰组与阴性对照组比较 CBS蛋白表达量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与正常对照组比较 CBS蛋白表达水平并无明显变化(P>0.05)。3.自噬相关蛋白及相关信号通路蛋白表达:3.1 CBS干扰组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR蛋白表达水平与阴性对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。3.2 OGD/R组与正常对照组比较,OGD/R组 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),Beclin-1蛋白表达无显著差异(P>0.05),p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.3 CBS干扰+OGD/R组与阴性对照+OGD/R组比较,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR均无显著差异(P>0.05)。4.细胞凋亡检测结果:4.1 CBS干扰组细胞凋亡率与阴性对照组比较无统计学差异(P>0.05)。4.2 OGD/R组与正常对照组比较,OGD/R组细胞凋亡率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3 CBS干扰+OGD/R组与阴性对照+OGD/R组比较,细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)。
  结论:
  OGD/R能够明显诱导 SH-SY5Y细胞发生自噬和凋亡,且可能与 Akt/mTOR及NF-κBp65/COX-2信号通路相关;CBS基因干扰对细胞自噬和凋亡均无明显影响。
[硕士论文] 任真奎
生物化学与分子生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨激活大鼠脑组织原代星形胶质细胞的α7尼古丁乙酰胆碱能受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)调控β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)聚集的研究。
  方法:
  分离新生大鼠大脑皮质,培养原代星形胶质细胞并纯化、传代,使用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞及纯度;体外制备Aβ1-42寡聚体;将培养细胞分为对照组、α7 nAChR激动剂组、α7 nAChR阻断剂组、PI3K/Akt信号通路抑制剂组以及Aβ组、激动剂+ Aβ组、阻断剂+ Aβ组。激动剂有尼古丁、PNU、s24795,阻断剂为甲基牛扁亭(methyllycaconitine,MLA)、LY294002。用蛋白印迹法(Western blotting)检测星形胶质细胞内源性 B-晶状体蛋白(αB-crystallin,Cryab)、磷酸化Akt、Aβ的表达。
  结果:
  采用免疫荧光法鉴定所培养的细胞,结果显示星形胶质细胞占所有细胞的95%以上。检测内源性Cryab蛋白表达结果显示:(1)尼古丁组与对照组比较,尼古丁组的内源性Cryab表达明显增高(P<0.05),MLA阻断剂组与尼古丁组比较,阻断剂组的内源性Cryab表达降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与尼古丁组比较,抑制剂组的内源性Cryab表达降低(P<0.01);(2)PNU组与对照组比较,PNU组的内源性Cryab的表达增加(P<0.05),MLA阻断剂组与PNU组相比,内源性Cryab表达降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与PNU组比较,抑制剂组的内源性Cryab表达降低(P<0.01);(3)s24795组与对照比较,s24795组的内源性Cryab表达明显升高(P<0.01),MLA阻断剂组与s24795组比较,阻断剂组的内源性Cryab表达明显降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与 s24795组比较,抑制剂组的内源性Cryab表达降低(P<0.01)。检测磷酸化Akt蛋白的表达结果为:(1)尼古丁组与对照组比较,尼古丁组的磷酸化Akt表达明显增高(P<0.05),MLA阻断剂组与尼古丁组比较,阻断剂组的磷酸化Akt表达降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与尼古丁组比较,抑制剂组的磷酸化Akt表达降低(P<0.01);(2)PNU组与对照组比较,PNU组的磷酸化 Akt的表达增加(P<0.05),MLA阻断剂组与PNU组相比,磷酸化Akt表达降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与PNU组比较,抑制剂组的磷酸化Akt表达降低(P<0.01);(3)s24795组与对照比较,s24795组的磷酸化Akt表达明显升高(P<0.05),MLA阻断剂组与s24795组比较,阻断剂组的磷酸化Akt表达明显降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与s24795组比较,抑制剂组的磷酸化Akt表达降低(P<0.01)。检测Aβ蛋白的表达结果为:(1)对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,尼古丁组与Aβ组相比,尼古丁组的Aβ蛋白表达均明显降低(P<0.01),LY294002抑制剂组尼古丁组比较,抑制剂组的Aβ蛋白的表达均明显升高(P<0.01);(2)对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,PNU组与Aβ组相比,PNU组的Aβ蛋白表达均明显降低(P<0.01),LY294002抑制剂组与PNU组比较,抑制剂组的Aβ蛋白的表达均升高(P<0.01);(3)对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,细胞总蛋白中,对照组Aβ蛋白无表达,s24795组与 Aβ组相比,s24795组的Aβ蛋白表达降低(P<0.05),LY294002抑制剂组与 s24795组比较,抑制剂组的Aβ蛋白的表达明显升高(P<0.01)。
  结论:
  尼古丁、PNU以及S24795通过激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚;PI3K/Akt信号通路很可能是这3种激动剂通过星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚过程的重要参与因素。为进一步研究Cryab蛋白可能是治疗AD的一个潜在靶点提供了一定的基础。
[博士论文] 李昊
生物信息学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:2003年,人类基因组计划的完成标志着生命科学进入了新的里程碑,人们开启了研究基因组序列的大门。近年来,随着测序技术的发展,海量的高通量数据涌现,包括ENCODE计划,ROADMAP计划,modENCODE计划在内的大型科学计划应运而生,诸如基因表达量,DNA甲基化,组蛋白修饰,DNA高敏位点等测序数据为人们提供了广泛的研究平台,但如何从这海量的数据中提取有用信息并作出生物学解释仍是一个困扰着大家的科学问题。
  越来越多的研究表明,谱系形成早期,即植入前胚胎的发育过程经历了一系列剧烈的染色质重编程事件,这种重编程现象不但介导了基因转录的重新启动,同时塑造了胚胎干细胞的全能性,为之后的胚胎发育奠定了基础。但重编程是如何进行的,又有哪些因素发挥了重要作用?为了探讨这一问题,我们讨论了植入前胚胎发育过程中染色质开放状态的分布情况并分析了开放区间中转录因子调控和表观遗传修饰的变化规律,进而对早期发育中细胞命运的影响因素展开了猜想。在本研究中,我们首先分析了植入前胚胎发育中染色质开放状态的全基因组基本性质以及其动态变化规律,发现,随胚胎发育,越来越多的开放区域来自于基因组编码区域,而且第一次细胞命运决定时期ICM中染色质性质最为活跃,其开放区间长度最短且离基因转录起始位点最近。进而,我们扫描并识别了开放区域中转录因子的结合位点,由聚类分析发现,开放区域中的转录因子表现出了发育阶段的特异性。最后我们结合表观遗传的组蛋白修饰数据讨论了发育过程中的组学信号变化情况,最终对细胞命运的决定模型进行了猜想。
  上述研究表明,在生命初期,转录因子调控和表观遗传修饰对胚胎植入前的重编程过程有着重要影响。我们接下来讨论了胚胎植入后,转录因子调控和表观遗传修饰是如何影响胚胎干细胞分化为各类细胞并形成组织行驶功能的。虽然转录因子作为重要的蛋白分子,调控基因的表达,但基因组中转录因子的结合位点仅为几bp到十几bp的小区间,然而,转录因子的结合位点却呈现出了区域富集的现象,基因组中不到2%的区域富集了超过90%的转录因子结合位点。已有研究在果蝇、线虫以及人类基因组中得到了这类转录因子高度富集的区间并定义为HOT region,如,通过22种转录因子的ChIP-seq数据在线虫中发现了304个含有超过15种转录因子的HOT region。虽然这些转录因子高度的聚集在基因组较小的区间内,但它们是如何相互作用行驶功能的,又是如何影响人类疾病及癌症的仍是一个未知的问题。为了探究这一问题,我们基于DHS数据开发了一种基因组HOT region的识别算法并在实验得到的HOT region中得到了验证,最终识别了154个代表性细胞系中的HOT region。进而,我们从多方面刻画了HOT region的发育分化相关功能并分析了胚胎干细胞到4个终端细胞的分化过程中HOT region及其表观遗传修饰的动态变化规律。
  在识别并注释了基因组热点区域HOT region的基础上,我们进一步探究了HOT region与人类疾病及癌症的关系。结合GWAS SNPs数据,我们发现,疾病及表型相关的变异位点倾向于在病理学相关的细胞及组织的HOT region中特异性富集;我们以造血细胞分化过程为例,详细讨论了疾病及表型的特异性变化规律,同时,我们对几种重要疾病及癌症展开分析,进一步说明了HOT region的重要意义。最后,我们探究了HOT region与部分致癌机理的关系,发现,肿瘤的形成过程可能需要有肿瘤细胞特异的HOT region以调控相关致病基因的表达。
  为了探究谱系形成过程中,转录因子调控和表观遗传修饰发挥了怎样的功能,我们首先基于已有数据分析了植入前胚胎发育过程中转录因子调控和表观遗传修饰的性质和变化规律,进而,我们识别并注释了基因组中转录因子结合位点聚集的热点区域,并分析了热点区域及染色质开放区间中转录因子调控和表观遗传修饰的性质及变化规律,最后,我们讨论了热点区域与人类疾病及癌症的关系。本研究着眼于细胞谱系的形成过程,重点关注于非编码区域的调控功能,既为基因组非编码区的研究增添了新的内容,同时也对细胞命运决定因素的展开了讨论和思考。
[硕士论文] 陈圳川
生物化学与分子生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:背景:
  DNA损伤可能来自机体的内在因素的作用,例如活性氧、细胞新陈代谢的副产物以及DNA在复制过程中由于拓扑异构酶失活而导致的错配;也可能来自电离辐射(IR)、紫外光照射(UV)以及自然界中其它致癌物等外在因素的影响。DNA损伤会导致基因突变和细胞衰老。细胞发生DNA损伤并对其进行精确、高效修复的机制被称为 DNA损伤应答机制(DDR),其作用是保护机体免受DNA损伤造成的不利影响。增殖细胞核抗原PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在DNA损伤修复机制中起着核心作用。PCNA作为一个稳定的“站台”,在损伤修复过程中招募一系列与复制相关的蛋白。类泛素蛋白(ubiquitin-like proteins,UBLs),是一类与泛素类似的小蛋白家族。据报道,类泛素蛋白含有与泛素同源的结构域,其同源性大约为15%-16%。UBLs可以分为两个亚家族:类泛素结构域家族UDP和类泛素家族修饰蛋白家族ΜLM。UDP可以与泛素以及泛素修饰蛋白发生非共价结合。ΜLM具有与泛素单体或二聚体同源的结构域,可以在E1-E2-E3酶联体系的催化作用下通过C末端的双甘氨酸基团与底物蛋白质共价结合,其代表成员有ISG15、FUB1、NEDD8、SΜMO、Urm1、UBL5、Ufm1和FAT10等。据文献报道,当复制过程中的细胞发生DNA损伤时,包括泛素化以及类泛素化在内的多种翻译后修饰通过修饰PCNA,对DNA损伤修复进行调控。当表皮细胞长时间暴露在紫外线(UV)辐射中,RAD6-RAD18复合体能够介导PCNA第164位赖氨酸残基发生高度的单泛素化,从而导致复制性DNA聚合酶发生变化。FAT10(HLA-F locus adjacent transcript10)是一种大小为18kD的蛋白,其N段和C端都含有与泛素相似的结构域,其中N端序列相似率为29%,C端序列则有36%与泛素相同,它的主要作用是编码人主要组织相容性复合体(MHC)I类基因座。人源FAT10除了在成熟树突细胞,B细胞以及在一些免疫器官,譬如胸腺和脾中表达,也可以在各种组织中通过促炎症因子(IFN-γ,TNF-α)刺激而表达,通过其C-末端结合共价修饰靶底物发挥作用。在前期工作中我们通过质谱鉴定确定增殖细胞核抗原(PCNA)是FAT10的共价修饰底物。
  目的:
  通过研究DNA损伤修复过程中类泛素蛋白FAT10与PCNA共价修饰作用机制,以及验证细胞中FAT10是否共价修饰ENO1,找到一种新的影响DNA损伤修复和癌症发生发展的调控方式,为衰老生理学研究提供新的思路。
  方法:
  (1)用UV/IR和VP-16处理细胞,通过western-blotting以及qRT-PCR实验分别检测DNA损伤对FAT10蛋白和基因水平表达的影响;通过免疫共沉淀实验检测当DNA发生损伤时FAT10蛋白是否共价修饰PCNA;通过类泛素化降解实验以及siRNA敲低FAT10实验检测PCNA能否被FAT10通过26S蛋白酶体降解;通过细胞免疫荧光实验探究FAT10和PCNA之间相互作用的亚细胞定位情况以及 PCNA被FATylation对细胞形成细胞核聚集点的影响。
  (2)构建pFlag-CMV-eno1和pCMV-Myc-fat10两种真核表达质粒,并将这两种质粒共转入HEK293细胞内,通过免疫共沉淀的方法,探究AT10是否在细胞中共价修饰ENO1。
  结果:
  首先,我们用UV/IR和VP-16处理细胞,western-blotting以及qRT-PCR实验检测发生DNA损伤的细胞,结果显示,DNA损伤能从基因和蛋白水平诱导FAT10表达的上调,FAT10表达量随着DNA损伤程度加重而增加。在本次实验中,当UV辐射剂量达到20J/m2、IR辐射剂量达到20Gy或VP-16剂量达到200μM时,FAT10表达量最高。通过免疫共沉淀实验检测以10J/m2和20J/m2的UV辐照强度处理后的HeLa细胞,发现FAT10能够共价修饰PCNA。同样,我们观察到用IR辐照以及用VP-16处理细胞时,FAT10也都能够共价修饰PCNA。通过PCNA降解实验,我们发现随着细胞因子TNF-α和IFN-γ浓度升高,诱导产生的FAT10蛋白表达量逐渐增加,而PCNA的表达水平却逐渐降低;在加入26S蛋白酶体抑制剂—MG132处理的细胞中,PCNA的表达水平不变。同样,在VP-16处理后的细胞中,PCNA和FAT10的降解也可以被MG132抑制。将FAT10 siRNA转染到被VP-16处理后的细胞中,敲低内源性FAT10,发现PCNA的降解现象明显消失,这些结果表明当DNA损伤时,FAT10可以通过26S蛋白酶体介导PCNA降解。其次,我们分离出样品的细胞质和细胞核,并通过western-blotting检测PCNA和FAT10的表达情况,发现大部分PCNA在细胞核中积累,当添加26S蛋白酶体抑制剂后,细胞质中PCNA的积累显著增加,同时,FAT10在细胞核和细胞质中都显著积累。这些数据表明在VP-16处理后的细胞中,FAT10可能在细胞质中通过26S蛋白酶体介导PCNA降解。最后,我们通过激光共聚焦显微镜检测细胞核聚集点(nuclear foci),观察到FAT10和PCNA共定位在损伤位点,并且当使用VP-16处理细胞后,细胞核聚集点的数量增加,同时,细胞质中PCNA的表达水平降低。当添加MG132后,细胞核聚集点的数量减少,并且PCNA的表达水平恢复正常。这些实验结果表明在DNA损伤修复中,FAT10在胞质中介导PCNA降解从而影响细胞核聚集点数量增多。另外,我们通过构建pFlag-CMV-eno1和pCMV-Myc-fat10两种表达质粒,并将这两种质粒共转入HEK293细胞内,利用免疫共沉淀的方法,发现在细胞中FAT10能共价修饰ENO1。
  结论:
  我们推测细胞发生DNA损伤时能够诱导FAT10表达上调并能够共价修饰PCNA蛋白使之在细胞质中被26S蛋白酶体降解,从而使细胞核损伤位点数量增加。此外,我们还发现,类泛素蛋白FAT10在细胞中能共价修饰ENO1。以上结果提示,细胞发生癌变时,FAT10可能通过共价修饰PCNA和ENO1影响和调控肿瘤的发生和转移。
[博士论文] 周作琼
遗传学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:一、hprg1b基因的功能研究及其干细胞系建立
  脊椎动物hprg1基因编码两种同源的蛋白异构体,分别是Hprg1a和Hprg1b。在酵母中,Hprg1b蛋白的同源蛋白作为一种E3泛素连接酶组分而参与调控糖代谢过程。早前在人类基因组范围内大规模筛选E3泛素连接酶的研究中,发现人的Hprg1b蛋白可通过其R型锌指结构域与E2泛素结合酶相互作用,形成一种新的泛素酶蛋白复合体。最近,Hprg1蛋白在爪蟾中的研究表明,蛙的Hprg1可能通过其E3泛素连接酶的作用而调控胚胎的头部发育。另外,含有hprg1b基因的染色体片段缺失的人类胚胎,出现严重的畸形发育。但是,目前hprg1b基因在胚胎发育中的具体作用仍不清楚。
  斑马鱼基因组只编码一种Hprg1蛋白,即Hprg1b蛋白。本文将斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列,同人、小鼠、龟、鸡和爪蟾的Hprg1a和Hprg1b的蛋白质序列进行比对分析,发现斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列与这些物种中的Hprg1蛋白质序列相似度超过了68%。而且,本文分析了人、小鼠、龟、鸡、爪蟾和斑马鱼的hprg1a和hprg1b的基因结构,发现这些基因间具有非常保守的剪切位点和基因结构。在进化过程中,hprg1基因高度保守的蛋白序列和基因结构,说明了该基因的功能是高度保守的。另外,我们进一步研究了人、小鼠和斑马鱼hprg1b基因及其附近基因的染色体同线性关系,发现hprg1b基因及其附近基因在人、小鼠和斑马鱼中具有染色体同线性,说明了斑马鱼hprg1b基因是人和小鼠hprg1b基因的直系同源基因。因此,本文在斑马鱼中研究hprg1b基因的作用,有利于揭示该基因在高等脊椎动物中的作用。
  通过ddPCR技术,精确定量了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达。实验结果显示,在斑马鱼的胚胎发育过程中,hprg1b基因具有很强的母源性表达,并且在斑马鱼胚胎发育的整个过程中,hprg1b基因一直持续高表达。同时,本文利用原位杂交技术分析了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,发现在斑马鱼的胚胎发育中,hprg1b基因表达的区域与斑马鱼脑部和心脏的形态建成区域完全重合。hprg1b基因在斑马鱼胚胎中的表达模式,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼的胚胎发育,特别是脑和心脏的发育。
  为了研究hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育中的作用,我们设计了斑马鱼hprg1b基因的翻译阻断型morpholino。并且通过蛋白质印迹实验,发现注射该morpholino的斑马鱼,Hprg1b蛋白的表达量明显减少。在合子期阻断hprg1b基因的表达后,发现斑马鱼出现大量死亡,致死率高达80%。并且存活下来的斑马鱼大部分出现脑部和心脏发育异常等畸形,畸形率高达93%。在观察hprg1b基因敲低斑马鱼的脑部发育中,发现在24 hpf,hprg1b基因敲低斑马鱼的前脑区域极度变小;中脑、后脑原基和后脑区域的结构不明显。hprg1b基因敲低斑马鱼发育到72 hpf,与对照组斑马鱼相比,其头部畸形愈加明显,整个头部区域变小,无明显的前脑、中脑和后脑的形态构造。同时,仔细分析hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏在胚胎发育过程中出现的畸形,发现其心脏畸形主要表现为心脏环化异常、心房和心室腔室变少。而且,统计72 hpf的斑马鱼离体心脏的细胞数量发现与对照组斑马鱼比较,hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏细胞明显减少。
  并且,通过原位杂交技术和ddPCR技术分析了早期心肌细胞分化标志基因cmlc2在心盘、心管、心房和心室等结构中的表达。与对照组斑马鱼相比,hprg1b基因敲低斑马鱼的cmlc2表达量和表达区域明显变小,说明了hprg1b基因可以通过调控心肌细胞的发育,来影响斑马鱼胚胎的心脏发育。其次,通过原位杂交技术检测了房室通道结构发育重要调控因子bmp4在72 hpf斑马鱼心房和心室交接处中的表达。实验结果显示,hprg1b基因敲低斑马鱼的bmp4的表达量明显低于正常水平,说明了hprg1b基因可能影响斑马鱼房室通道内部结构的发育。同样,在72 hpf hprg1b基因敲低斑马鱼心脏中,心内膜标记因子has2表达下调,说明hprg1b基因敲低斑马鱼房室心内膜发育异常。另外,本文通过免疫组化分析发现了心肌肌球蛋白重链在hprg1b基因敲低斑马鱼的心肌细胞中表达降低,而且其排列异常,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼心脏收缩功能。
  针对hprg1b基因敲低斑马鱼出现大规模死亡和畸形的现象,本文通过ddPCR技术,检测了斑马鱼胚胎发育重要的调控因子的表达。实验结果表明,hprg1b基因敲低斑马鱼的外胚层标记因子(fgf8和otx2),中胚层标记因子(gata4,gata5,和nt1),和内胚层标记因子(sox17)等基因的表达量明显低于对照组斑马鱼,提示hprg1b基因可能通过调控斑马鱼胚胎基因的表达,来影响斑马鱼的胚胎发育。
  另外,本文构建了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系。该胚胎干细胞系具有繁殖快、转染效率高、表达多种核心多能基因的特点。随后,将hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞移植进入了野生型斑马鱼中,追踪了Hprg1b阳性细胞的发育命运。在嵌合体斑马鱼发育到24 hpf,观察到在前脑、中脑、后脑原基、后脑和心管中,具有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞出现。在48 hpf嵌合体斑马鱼中,我们发现脑部、心室和心房中也均有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞。hpr1gb-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞的细胞移植实验,说明在斑马鱼的胚胎发育过程中Hprg1b阳性细胞可以发育成为脑和心脏细胞。
  因此,本文利用斑马鱼模型研究hprg1b基因的功能,首次证明了hprg1b基因在脑部和心脏的发育中起作用;并建立了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系,为hprg1b基因的深入研究和揭示早期心脏发育的分子机制提供了很好的细胞模型。
  二、斑马鱼磁力蛋白和隐花色素同源基因鉴定
  许多动物可以通过磁场来进行定位或导航。最近在果蝇中研究发现,磁受体蛋白(MagR)和隐花色素(Cry)形成的复合体是磁力感应的分子基础。MagR和Cry蛋白广泛表达于各种动物中,但是它们在不同动物中的功能是否保守仍不清楚。为了探究MagR和Cry在低等脊椎动物中的功能,我们分别鉴定并分析了它们在斑马鱼中对应的同源基因的表达情况。人基因组含有一个MAGR基因和2个CRY基因。斑马鱼也只有一个magr基因,却含有7个cry基因。通过蛋白序列比对、基因结构和染色体同线性分析,我们发现magr基因在进化过程中高度保守,并且斑马鱼magr基因是人MAGR基因的直系同源基因。并且,斑马鱼有4个cry1基因(cry1aa,ry1ab,ry1ba,cry1bb)是人类CRY1基因的同源基因,1个人CRY2直系同源的基因,以及2个斑马鱼cry相似基因(cry4和cry5)。RT-PCR分析发现,在斑马鱼胚胎和成体组织中magr基因泛表达,而所有cry基因只在脑和眼睛中显著表达;在斑马鱼胚胎发育中斑马鱼magr基因和除了cry1aa外的其余cry基因都具有母源性表达。此外,我们利用翻译阻断型morpholino敲低magr基因的表达,斑马鱼没有出现明显的死亡变化和发育异常,并且胚胎发育调控因子fgf8、otx2、 gata4、gata5、has2、nt1和sa114的表达也无明显变化。因此,我们的结果表明,在斑马鱼基因组中magr基因和cry2基因为单拷贝基因,cry1为多拷贝基因。而magr基因在斑马鱼器官形成中未见明显作用,提示可能需要建立magr敲除品系以进一步探究其功能。
  三、tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析
  最近几年,二代测序技术迅猛发展,极大的缩减了测序费用和测序时间,使基因组转录本测序(RNAseq)分析成为研究信号通路和靶基因筛选的最佳选择。本文将tmp3基因敲除斑马鱼囊胚期的胚胎进行了转录组测序。利用tophat软件将测序序列比对到斑马鱼参考基因组上,再通过htseq-count软件分析映射结果来鉴别外显子之间的剪接点,共得到了24102个基因的表达数据。在R语言中通过DESeq2软件包,得到了tmp3基因敲除斑马鱼和野生型斑马鱼差异表达的2194个基因,其中表达上调基因为1231个,表达下调基因为963个。然后,使用goseq软件包对差异表达基因进行了基因本体(GO)富集分析。对表达下调基因的GO富集类型分析后,我们发现下调基因的GO富集类型主要与斑马鱼中胚层发育和细胞增殖相关。结合tmp3基因敲除斑马鱼心脏异常的表型,我们从表达下调的基因中挑选出与中胚层发育相关的基因dharma、foxa2、 lefty1、k1f2a、mespaa、noto、t111、ape1a、tbx16和tdgf1,以及与细胞增殖相关的基因rrm2、gmnn、po1d1、map2k2b、ccnk、ccn11b、cdca8、aurka和cdk4,作为tmp3的候选靶基因。总之,本文关于tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析,为tmp3基因的深入研究提供了思路。
[博士论文] 许艳
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  信号转导和转录活化因子(Signal Transducers and Activators ofTranscription,STAT)家族蛋白表达于多类机体组织和细胞内,参与调控细胞生长、分化、凋亡、DNA损伤修复等多种生理途径。STAT3是STAT家族的重要成员,最早被发现为癌基因[1]。STAT3可接受外界各类生长因子和细胞因子等刺激信号,调控下游目的基因表达,进而调节细胞的各项生理过程。近期研究发现STAT3也是一种多功能转录调节因子,其在乳腺癌、白血病及头颈部鳞癌等多种肿瘤组织及细胞系中表现持续性活化[2],说明STAT3信号转导通路的激活密切关联于多类肿瘤的发生发展[3-5]。STAT3调节下游靶基因的转录,可通过与其他调节因子形成复合物的方式,也可以通过酪氨酸位点(如Y705)的磷酸化[6],分子间酪氨酸磷酸化位点与SH2结构域的相互作用,在细胞浆部位形成同源或者异源二聚体,移位至胞核内进而调控下游靶基因的表达水平[7]。被激活的STAT3可调节下游基因的表达活性及细胞生理功能[8],例如凋亡抑制基因(Bcl-xl、Survivin、Mc-Ⅰ等),细胞周期凋亡基因(Cyclin D1/D2、cMyc等),肿瘤转移相关基因(金属蛋白酶MMPs等)和血管内皮生成因子(VEGF等)。
  经细胞因子处理后,细胞浆内的信号转导与转录激活因子(STAT)家族蛋白羧基末端(C末端)结构域的氨基酸残基发生一系列翻译后修饰变化[9],例如705位酪氨酸残基和727位丝氨酸残基发生磷酸化,685位赖氨酸残基发生乙酰化[7,10,11]。组蛋白乙酰基转移酶CBP可介导STAT3的Lys685位点的乙酰化,该乙酰化过程是可逆的,可在Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和(或)Sirtuins家族特定成员的催化下发生去乙酰化反应。C末端结构域Tyr705/ Ser727磷酸化的STAT3在细胞核与目的基因启动子结合在转录激活进程中起着至关重要的作用[12,13]。STAT3磷酸化激活的基因参与不同的生理进程,包括干细胞的自我更新、T细胞的分化、细胞周期和增殖等[14-17]。Lys685位点的乙酰化对于STAT3形成稳定的二聚体、细胞生长相关基因的转录增强以及促进反映抑瘤素M治疗的细胞循环进程具有决定性的功能,而这种二聚体对细胞因子刺激的DNA结合和转录调控也是必需的[7]。
  STAT3 Ser727位点磷酸化的发生促使细胞浆内的STAT3向线粒体转移[18]。采用STAT3表达缺陷型PC3细胞进行检测,表达S727A突变型STAT3的PC3细胞的生理状态与表达野生型STAT3的PC3细胞及表达N端连接线粒体定位序列的MLS-STAT3的PC3细胞相比较,表现出电子运输链(ETC)中复合物Ⅰ的活动性降低,缺氧条件下活性氧簇量(ROS)的增加。STAT3可能通过增强细胞呼吸电子传递链的活性来参与Ras(原癌基因产物)依赖性的细胞转化[19]。推测线粒体内的STAT3可能通过与细胞呼吸链复合物Ⅰ和Ⅱ相互影响并最终提高NADH,从而增加电子呼吸链的活性和ATP的产生量。然而,活体实验内最佳的ATP的产生量或氧化磷酸化作用并不需要STAT3和蛋白复合物Ⅰ/Ⅱ之间的直接相互作用[20]。故而,我们推测STAT3在线粒体代谢过程中发挥功能可能存在其他的途径,我们以此为出发点进一步探讨。
  磷酸化修饰主导STAT3从细胞质移位至细胞核,与DNA结合、启动核内催化作用,去磷酸化作用终止上述信号转导过程[21-24]。然而,STAT3在细胞质和线粒体之间通过何种方式传导及其在线粒体中活性逆转的机制仍然未知。有趣的是,参与去除翻译后修饰的线粒体酶可显著促进去乙酰化[25],从而表明乙酰化修饰在线粒体活动中是一个重要角色。已有报道指出在线粒体内可检测到三个去乙酰化酶SIRTs家庭成员SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在[26-28]。蛋白的乙酰化修饰在细胞处于血清饥饿/释放状态中往往起着至关重要的作用,因此我们推测乙酰化修饰可能在线粒体内参与调控能量代谢过程。
  研究目的:
  1.研究胰岛素与血清生长因子诱导的STAT3乙酰化修饰对线粒体内物质能量代谢途径的调控及其作用机制。
  2.研究乙酰化的STAT3在线粒体内能量代谢的调控对癌细胞发生发展的影响。
  研究方法:
  1.质粒和截短体的构建构建STAT3 K87R,K685R,K707R,K709R,K685/707/709R点突变质粒,STAT3(28-770),(1-738),(28-738),(1-320),(1-585),(465-770),(685-770)等截短体,确定STAT3作用功能域及位点;将酵母菌氧化酶复合物Ⅳ(Cox4)的核酸序列构建到STAT3羧基端,提高STAT3的线粒体定位。
  2.免疫共沉淀检测线粒体内与STAT3相互结合相互作用的蛋白。
  3.转染SiRNA分别干扰细胞内乙酰基转移酶CBP和去乙酰化酶SIRT5的表达。
  4.蛋白Western Blot分析比较不同处理条件下,不同蛋白在细胞各组分内的表达水平及相应乙酰化修饰程度。
  5.免疫组化检测STAT3 K685乙酰化在癌组织及正常癌旁组织细胞内的定位。
  6.质谱分析分析STAT3 C末端乙酰化位点的序列特征;检测细胞因子诱导的STAT3乙酰化位点;检测体外反应中SIRT3或SIRT5对包含K685乙酰化的肽段的去乙酰化水平。
  7.检测丙酮酸脱氢酶复合物Ⅰ(PDC E1)活性 PDC E1活性检测试剂盒(YoYongBio)采用分光光度法检测不同处理条件下细胞的PDC E1活性。
  8.检测线粒体膜电势(MMP)水平采用碧云天(Beyotime)线粒体膜电势检测试剂盒(JC-1探针)(C2006)。
  9.胞内葡萄糖消耗水平检测采用胞内葡萄糖检测试剂盒(Sigma,GAGO-20)。
  10.油红染色(Oil Red O Staining)着染胞内脂滴,胰岛素或者血清刺激后,光学显微镜下直接观测胞内脂滴的聚集状况。
  11.Seahorse分析检测不同处理条件下,胞内酸化率(Extracellularacidification rate,ECAR)和氧消耗率(Oxygen consumption rate,OCR)水平。
  12.α-酮戊二酸(α-KG)水平检测采用α-KG检测试剂盒(Sigma,MAK054)。
  13.检测胞内乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)水平
  (1)荧光定量法:采用α-KG检测试剂盒(Sigma,MAK039)。
  (2) ELISA方法:ELISA试剂盒来源于上海信帆生物科技有限公司。
  14.乳酸检测采用乳酸水平检测试剂盒(Sigma,MAK064)。
  15.ATP水平检测采用ATP检测试剂盒(Beyotime,S2006)。
  16.数据统计学处理 one-way ANOVA分析不同样品结果数据,p<0.05(*),p<0.01(**)认为有统计学意义。
  实验结果:
  1.STAT3经胰岛素刺激发生乙酰化修饰,转移进入线粒体
  细胞因子IL6刺激STAT3多个位点发生乙酰化修饰[7,29,30],相似地,在血清饥饿的成纤维细胞中,经血清饥饿和释放处理或胰岛素刺激后,同样检测到了STAT3乙酰化的诱导。PC3细胞蛋白的质谱分析结果显示STATs家族中STAT1、STAT3和STAT5的C末端氨基酸序列中K685、K707和K709赖氨酸残基与重要的磷酸化位点705位酪氨酸残基相临[31],为C末端区域乙酰化位点特有的序列特征。在小鼠成纤维细胞(MEFs)内,经血清饥饿释放激活的STAT3在Y705和S727位点都发生适度的磷酸化,但胰岛素处理后却没有明显检测到磷酸化的存在,但两种处理方式都可以诱导STAT3 C末端乙酰化修饰的发生。293T细胞内,乙酰基转移酶CBP的过表达,尼克酰胺(Nicotinamide,NAM)和曲古抑菌素A(Tricostatin,TSA)均可以诱导STAT3乙酰化。SiRNA敲除小鼠成纤维细胞内的CBP,胰岛素刺激后,却没有明显的STAT3乙酰化现象的发生,而且胰岛素刺激可以增强CBP与胰岛素受体的关联。我们分离出MEF细胞的细胞浆,细胞核和线粒体三部分,只在细胞浆和细胞核两部分检测到了CBP的存在。
  在蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理的前提下,我们再用胰岛素对MEFs进行处理,实验结果表明胰岛素对于STAT3的表达及稳定性没有明显影响。对小鼠成纤维细胞内经血清饥饿释放处理和胰岛素刺激后各细胞组份内STAT3修饰及定位的变化进行比较,前者可以诱导STAT3同时进入线粒体和细胞核内,后者只表现出诱导STAT3线粒体的移位;只有血清饥饿释放处理诱导S727的磷酸化,但两者都可以诱导STAT3 K685位点乙酰化的发生。STAT3乙酰化可以发生在C末端位点,亦可发生在N端[7,32]。从胰岛素处理的293T细胞内分离提纯STAT3,质谱分析结果显示胰岛素诱导的STAT3乙酰化位点包括N末端结构域的K87位及C末端结构域内的K685、K707和K709。在线粒体外部, HDACs家族的HDAC6使得STAT3 K87去乙酰化[33],降低STAT3线粒体定位。血清饥饿释放处理诱导的STAT3 Y705和S727位点的磷酸化对STAT3线粒体定位的影响不显著。STAT3(1-738),(28-770)及(28-738)截短体都不会影响STAT3向线粒体内的移位。STAT3及各结构域截短体分别与CBP共转染293T细胞,CBP的过表达明显提高了STAT3 WT、STAT3(1-320)和STAT3(1-585)在线粒体内的定位,但是截去N端结构域的STAT3(321-770)变化不明显,而且STAT3 K87R与STAT3 WT相比,线粒体定位明显降低,即使在血清刺激或者胰岛素处理的条件下也没有改观。
  2.线粒体内乙酰化的STAT3与PDC E1相结合而激活PDC E1,促进丙酮酸向乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的转化
  已有报道称,线粒体内STAT3是呼吸链的一个组份,可与电子传递链复合物Ⅰ/Ⅱ和GRIM-19相结合[18,19]。从HeLa细胞线粒体蛋白裂解液内分离纯化STAT3,质谱分析与STAT3相关联的组份。我们的质谱分析没有发现上述已被报道的组份,却惊喜地发现了新的与STAT3结合的线粒体蛋白,包括丙酮酸脱氢酶复合物Ⅰ(PDCE1)、细胞色素C(CytC)和SIRT5。在野生型MEFs细胞内,胰岛素刺激加强了STAT3与PDC E1的结合, PDC E1及其余两种丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酸转乙酰酶(PDC E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(PDC E3)的表达水平没有明显的改变。转染293T细胞,STAT3 C末端结构域参与与PDC E1的结合。在野生型MEFs细胞内胰岛素刺激增强了STAT3与PDC E1的结合,从而提高PDC E1的生物活性,促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A,但是在STAT3-/-MEF细胞内胰岛素刺激对于丙酮酸脱氢酶活性没有明显影响。丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒检测到高表达Cox4-STAT3的细胞的PDC E1比高表达野生型STAT3的细胞表现出更高的生物活性。STAT33KR突变体抑制STAT3与PDC E1的结合,高表达3KR(K685,K707,K709)的STAT3-/-MEFs的PDC E1的活性比高表达WT、Y705和S727A突变体的细胞明显受到抑制。PDC E1负责丙酮酸向乙酰辅酶A的转化,胰岛素刺激后,STAT3 WT MEFs细胞内乙酰辅酶A的水平急剧增高;相反,STAT3-/-MEFs细胞内却没有明显的变化。
  3.存在于线粒体内的多种去乙酰化酶催化STAT3去乙酰化
  已有报道称SIRT5是线粒体内的去琥珀酰酶,亦是去乙酰化酶[9,28,34-36]。SiRNA敲除HeLa细胞内Sirtuin家族成员,筛选出针对STAT3的去乙酰化酶。线粒体内可检测到SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在,SIRT5的缺失明显增强STAT3的乙酰化程度,SIRT3的缺失也可较小程度发挥STAT3去乙酰化功能。敲除A549细胞内的SIRT5,细胞浆、线粒体和细胞核三部分内STAT3乙酰化水平都相应地增强。为了进一步研究STAT3与SIRT5的结合区域,将全长STAT3、STAT3(1-130)、STAT3(465-770)分别与SIRT5共转染293T细胞,相对于N端截短体(1-130)的微弱结合,C端截断体(465-770)与SIRT5强烈结合。SIRT5 H158Y突变体抑制了SIRT5对STAT3的去乙酰化功能。体外实验显示,SIRT3和SIRT5针对STAT3 K685位点均有去乙酰化的功能,但是SIRT5具有更广泛的去乙酰化功能,SIRT3对于K707和K709位乙酰化没有明显抑制,故而SIRT5是我们研究的重点。线粒体内的去乙酰化酶SIRT3和SIRT5皆可以发挥去乙酰化功能,即使已经有报道称两者在线粒体能量代谢中功能相反[37-40]。
  4.STAT3的乙酰化调控线粒体内三羧酸-电子传递链(TCA-ETC)的生物功能
  胰岛素刺激和NAM处理都能较小幅度地提高MEFs细胞的线粒体膜电位,在STAT3-/-MEF细胞内,线粒体基础膜电势和胰岛素刺激后的膜电势相对于野生型MEF都明显降低。我们选择了在17号染色体上STAT3整个基因缺失的前列腺癌细胞株PC3作为研究对象[41]。PC3细胞内,相对于STAT3的突变体Y705F、S727A,STAT33KR对线粒体膜电势的抑制作用更为显著,说明STAT3的乙酰化修饰对线粒体膜电势的影响比磷酸化修饰更为重要[20]。过表达SIRT5可明显抑制因CBP的过表达引起的线粒体膜电势的提升和PDC E1活性的增强。胰岛素刺激条件下,比较野生型和STAT3-/-MEF两种细胞内ATP的合成水平,后者基础水平ATP的合成量比较高,但是在胰岛素刺激前后却没有明显的变化。高表达STAT3各突变体的STAT3-/-MEF细胞的ATP合成量进行比较分析,Y705F对ATP的生成没有明显影响,S727A表现出较小程度的影响,但3KR明显抑制了ATP合成的提高。与STAT3-/-MEF相比较,胰岛素处理后野生型MEFs细胞内葡萄糖的水平迅速下降。Seahorse XF96胞外流量分析仪检测胰岛素处理的MEF细胞的胞外酸化率(Extracellularacidification rate,ECAR)的变化,STAT3的缺失并不影响胞内糖酵解水平,相同的实验过程中,野生型MEF细胞经胰岛素处理后氧消耗率(Oxygenconsumption rate,OCR)明显高于STAT3-/-MEF细胞。检测胰岛素处理后野生型MEF和STAT3-/-MEF细胞内α-KG的水平,我们发现STAT3对于胰岛素引起的TCA循环的上调是必不可少的。分离MEF细胞内细胞浆和线粒体组份,我们发现经胰岛素处理后,两组份内的乙酰辅酶A含量都显著增加。油红燃料对胞内脂滴进行染色,胰岛素促进野生型MEF细胞内脂滴的大量聚集,但是对STAT3-/-MEF细胞作用不明显。与转入STAT3 WT的STAT3-/-MEF细胞相比,转入3KR突变体的细胞没有表现出明显的脂滴堆积。不表达STAT3的前列腺癌PC3细胞表现出很低的PDCE1活性、线粒体膜电势及ATP合成水平,而转染Cox4-STAT3的PC3细胞中PDC E1活性、线粒体膜电势及ATP合成水平都明显升高[42]。肺腺癌细胞A549内表现出连续性高水平STAT3乙酰化,从而在大量表达STAT3的线粒体内,表现出较高水平的PDC E1活性。转入STAT3的PC3细胞大大降低了Warburg效应,乳酸的产生量明显降低,葡萄糖转化成脂肪酸量明显升高。对从非小细胞癌和鳞状细胞癌肺癌患者处获取的肿瘤切片进行免疫组织化学分析,结果显示K685位点的乙酰化广泛分布于细胞质区域,而在正常癌旁组织中只检测到少量K685的乙酰化。为进一步确认细胞质内K685乙酰化主要定位于线粒体,分离肺癌患者癌组织和癌旁组织细胞质和线粒体两组份,免疫印迹实验显示肿瘤组织线粒体内K685乙酰化明显高于癌旁组织,相反,SIRT5的表达水平明显低于癌旁组织,癌组织内ATP的产量也高于正常组织。
  结论及意义:
  综上所述,细胞浆内的STAT3,经过胰岛素或血清内的生长因子作用激活后,可以转移进入不同的亚细胞结构内行使不同的生物功能,包括细胞核和线粒体。然而,对于STAT3的线粒体移位及对随后的三羧酸(TCA)循环和电子传递链(ETC)调控的精确机制仍然知之甚少。在血清饥饿的细胞内验证并观察到了经血清释放处理或胰岛素刺激后的STAT3乙酰化过程。血清释放处理或者胰岛素刺激调动CBP乙酰化的STAT3向线粒体移位。在线粒体中,STAT3与丙酮酸脱氢酶E1(PDC-E1)结合而增强PDC E1的生物活性,随后加速丙酮酸转化为乙酰辅酶A,促进TCA循环,提高线粒体膜电势,促进ATP的合成。不同的去乙酰化酶可抑制上述STAT3乙酰化促进线粒体内丙酮酸代谢的过程。HDAC家族成员HDAC6使细胞浆内的STAT3 K87去乙酰化,抑制STAT3向线粒体内的移位。Sirtuin家族成员SIRT5可去乙酰化STAT3,抑制线粒体内丙酮酸代谢的途径。STAT3乙酰化在线粒体内促进丙酮酸代谢从而提高ATP合成的途径,同样适用于分析癌细胞内超常能量的产生。在肺癌A549细胞株中,线粒体内的STAT3表现出连续性的乙酰化,可以在持续性的活性状态中维持癌细胞线粒体膜电位和ATP合成[43-45],从而为癌细胞的大量增殖提供了能量基础。发现癌细胞的能量供给来源有助于从根本上切断癌细胞发生发展,对于阻遏癌细胞的增殖有极其重要的理论指导意义。
[硕士论文] 朱伟伟
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:细菌sRNA(small noncoding RNA)广泛参与细菌生命活动,包括基因表达、代谢以及应激反应,但仍未见sRNA对DNA复制起始影响的系统研究。经过敲除11种sRNA并分析所得突变体,发现大肠杆菌DsrA-sRNA影响DNA复制起始,是个复制起始负调控因子。DsrA-sRNA与dnaA-mRNA可能有相互作用,但这种相互作用并未影响DnaA的表达。然而,qPCR实验说明DsrA-sRNA过表达提升rpoS、dps、hchA、cbpA和yiaG基因的表达,敲除dsrA降低dps基因的表达,而Dps的表达会阻止DNA复制起始。另外,细菌双杂交实验证实HchA与Dps蛋白有相互作用,而HchA与DnaA蛋白没有相互作用。有趣的是,△dps细胞中过表达DsrA-sRNA促进DNA复制起始,与在野生型细胞中过表达DsrA-sRNA的效果相反。△hchA细胞中过表达DsrA-sRNA仍然抑制复制起始。综上所述,DsrA-sRNA对复制起始的抑制作用是通过Dps来实现的,然而,缺失Dps时,DsrA-sRNA以别的途径影响复制起始。
  复制原点附近基因穿越oriC的转录是复制起始必须的。为了探讨oriC转录对复制起始的作用机制,把PBAD启动子插入在染色体oriC右侧,其转录能够穿越oriC,构建了WT-PBAD、△dksA-PBAD和△mfd-PBAD菌株。经流式细胞仪分析发现阿拉伯糖的加入并不影响WT-PBAD细胞的复制起始;阿拉伯糖诱导对△dksA-PBAD细胞的复制起始的影响依赖于营养,在LB培养基中△dksA-PBAD细胞的复制起始频率明显高于△dksA细胞,阿拉伯糖的加入进一步提高其复制起始频率。因此,oriC转录的确促进染色体复制起始,但其作用由DksA活性来调节。
[硕士论文] 邹发贵
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:人类Sirtuins蛋白家族是一类依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,与酵母的Sir2基因同源,它们含有共同的保守催化结构域:去乙酰化结构域。在人类基因组中存在7种Sirtuins蛋白(SIRT1-7),参与了多种细胞生命活动,如热量限制,细胞衰老,代谢,染色体稳定,转录沉默等。SIRT7蛋白目前研究相对较少,在多种癌症中表达上调,很可能参与了癌症的发生发展过程。
  人类Sirt7基因位于染色体17q25.3上,基因组含有10个外显子,mRNA全长1203bp,由400个氨基酸残基编码而成,蛋白分子量约为44.9KDa。Sirt7主要分布于细胞核当中,HDAC酶活性较低,既可以使组蛋白去乙酰化,也可以催化非组蛋白发生去乙酰化。SIRT7蛋白调节Pol I聚合酶亚基PAF53的去乙酰化,增强Pol I结合rDNA启动子的能力,上调rDNA的转录发生,促进细胞增殖和抑制凋亡的发生。SIRT7靶向结合特定基因启动子,介导H3K18Ac去乙酰化,稳定染色质构象,抑制特定抑癌基因的转录,维持癌细胞的侵袭形态。
  泛素-蛋白酶体途径是负责调节体内蛋白水平和功能的重要机制。在这个过程中,泛素连接酶E3负责底物的选择性识别和特异性降解,是蛋白酶体降解途径的决定性因子。TRIM蛋白家族成员均含有RING结构域,普遍具有E3连接酶活性。在这里我们为寻找SIRT7的特异性E3展开了一系列实验,并通过CRISPR/Cas9技术构建了一株MCF-7敲除细胞系,以便后续深入研究SIRT7在乳腺癌的功能。主要的实验内容和结论如下所述:
  ①MCF7细胞敲除Sirt7后,影响p53的mRNA和蛋白水平:
  MCF7敲除Sirt7基因后,发现其克隆形成能力并没有发生变化,而细胞周期受到影响。RT-qPCR和WB结果显示,Sirt7基因敲除后,p53的蛋白表达水平和mRNA表达水平均有上调。
  ②在293FT细胞内,TRIM25蛋白与SIRT7蛋白发生相互作用:
  通过蛋白组学的实验数据,我们筛查出SIRT7的相互作用蛋白,其中泛素连接酶E3 TRIM25也在其中,是我们特别感兴趣的基因。为证实结果的可靠性,我们应用免疫共沉淀和免疫印迹的实验方法加以验证,并确认TRIM25和SIRT7蛋白两者之间确实存在相互作用的关系。
  ③TRIM25下调SIRT7蛋白稳定性并使其发生泛素化降解:
  TRIM25质粒或空载体转染MCF7细胞和293FT细胞后,CHX药物处理细胞,分别检测内源性和外源性SIRT7蛋白表达水平,免疫印迹结果显示:TRIM25蛋白能使SIRT7蛋白的半衰期显著降低。体内泛素化实验结果进一步表明,TRIM25能使SIRT7蛋白发生特异性泛素化作用。
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