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[硕士论文] 周玉宝
化学工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:富马酸沃诺拉赞为钾离子竞争性酸阻滞剂,是一种新型的可逆性质子泵抑制剂,用于治疗和预防胃酸相关疾病。但是该化合物的水溶性差,动物口服生物利用度仅10%,限制了其抑酸和治疗胃酸相关性疾病的作用,因此,研究富马酸沃诺拉赞晶型性质以及新盐型晶型,对改善其生物利用度有重要的意义。
  本文参考多篇文献资料,设计了一条以5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛为起始原料,经过对接、还原氨化、乙酸成盐、富马酸成盐及解离等步骤制备高纯度游离态沃诺拉赞的合成路线,并对每个步骤进行了系统的研究和优化。工艺中,将沃诺拉赞游离态与乙酸成盐,提高了稳定性,在后续形成富马酸盐的过程中还能达到除杂的效果,从而可以得到纯度高,杂质含量低的富马酸沃诺拉赞;同时成功实现了沃诺拉赞游离碱的合成,并对游离碱的晶型进行了多方位的表征,不仅创新性地得到沃诺拉赞游离态产物,而且对于课题后续研究奠定良好基础。该路线具有起始原料和反应试剂易得、反应步骤较短、合成工艺相对简易、成本较低、具有工业化价值等优点。
  本文获得了沃诺拉赞8种盐型,分别为:琥珀酸盐Form1、磷酸二氢盐Form1、L-苹果酸Form1、甲磺酸盐Form1、盐酸盐Form1、半L-酒石酸盐Form1、硫酸氢盐Form1、硫酸盐Form1,并分别进行了多方位的晶型表征;完成了代表性L-苹果酸Form1的制备工艺优化,并对这些盐型的水中溶解度和晶型稳定性进行了探究和对比,为后续的生物利用度研究提供了理论支撑。
[硕士论文] 刘帅
药剂学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:依巴斯汀(Ebastine)是生物碱类抗过敏药物,属第二代H1受体拮抗剂,临床上用于治疗过敏性鼻炎、荨麻疹、支气管哮喘、湿疹、皮肤瘙痒等疾病。目前上市剂型为常释片,每次口服10mg,每日1~2次。依巴斯汀属于难溶性药物,片剂药物溶出受限,而过敏性疾病发病急,需要迅速缓解症状。将依巴斯汀制成速效制剂,可满足起效快的用药要求。本实验采用水溶性基质制备依巴斯汀滴丸剂,并进行质量考察和药动学实验,主要研究内容和结果如下:
  1.处方前研究
  建立UV和HPLC两种依巴斯汀含量分析方法,定量方法学考察结果表明:紫外分析依巴斯汀在考察的1.68~15.12μg/mL范围,浓度与吸光度呈良好线性关系,回归方程为Y=0.0499X+0.0041,R2=0.9993;高效液相分析依巴斯汀在1.68~33.60μg/mL范围,浓度与峰面积呈良好线性关系,Y=8584.1X+2376.2,R2=0.9994。UV、HPLC两种方法的专属性好,精密度和稳定性的RSD均小于2%,加样回收率均大于97%,RSD值均小于2%,符合定量要求。对原料药进行高温、高湿试验,含量测定结果表明:依巴斯汀在60℃条件下热稳定性良好,在RH80%、25℃条件下吸湿量小于0.2%,稳定性良好;主药及基质混合进行热稳定性考察,结果表明主药与基质在60℃条件下无相互作用。以滴丸圆整度、溶散时限为评价指标,在单因素影响试验基础上,选择药物与基质比例1∶7、1∶5、1∶3,PEG4000∶PEG6000比例1∶3、1∶1、3∶1,熔融温度75℃、80℃、85℃进行优化试验。
  2.处方工艺优化
  在单因素考察基础上,采用Box-Behnken响应面优化方法,以5min及30min时的累计溶出度综合计算指标Q,考察药物与基质比例,基质PEG4000∶PEG6000比例,熔融温度对溶出度影响,进行滴丸处方和工艺优化,得出最优处方为药物与基质比例为1∶3.4,基质PEG4000∶PEG6000比例为1∶0.41,熔融温度为84℃。
  3.滴丸成型表征及质量评价
  对以优化的处方和工艺制备的滴丸进行X射线粉末衍射(XRD)、差示扫描量热法(DSC)、红外光谱分析(IR)和扫描电镜(SEM)表征,结果表明:XRD谱中依巴斯汀衍射峰明显减弱;DSC图谱中主药结晶峰消失;IR图谱中主药特征峰强度明显减弱;SEM图中主药与基质充分融合,证明依巴斯汀滴丸固定分散体形成;同时进行重量差异、圆整度实验,结果显示:滴丸呈乳白色,圆整度为0.90±0.03,重量限度差异在±15%以内;与市售依巴斯汀片剂相比,依巴斯汀滴丸剂溶出速度较快,溶出完全;稳定性试验显示:滴丸在温度40℃、相对湿度RH55%±5%密封条件下贮存6个月,外形、含量均无明显变化,最优处方制备的滴丸稳定性良好。
  4.药动学初步研究
  依巴斯汀给药后迅速代谢为卡瑞斯汀,目前主要通过测定卡瑞斯汀的血药浓度来进行药代动力学研究。建立了卡瑞斯汀在生物样品中的HPLC测定方法,色谱条件为:色谱柱:Symmetry C18(5μm,4.6×250mm);流动相:甲醇∶水=30∶70;柱温:25±5℃;流速:0.9mL/min;检测波长:210nm;进样量:20μL。该测定方法专属性良好,其他成分无干扰;大鼠血浆中卡瑞斯汀在0.05~10μg/mL浓度范围与峰面积呈良好线性关系,Y=26198X+8392.4,R2为0.9993;精密度RSD值均小于7%,室温和冻融稳定性RSD值均小于7%,平均回收率大于95%,RSD值均小于6%,最低检测限为12.5ng/mL。以上方法学考察表明可用于生物样品中卡瑞斯汀的含量测定。
  分别采用1.8mg/kg、2.7mg/kg、3.6mg/kg3个给药剂量进行大鼠灌胃给药,通过DAS2.0软件进行数据处理,得到对应的药动学主要参数:大鼠血浆中药物吸收半衰期t1/2kα分别为0.678±0.361h、1.031±0.25h、0.924±0.147h;分布半衰期t1/2α分别为1.025±0.716h、1.950±0.927h、1.806±1.569h;消除半衰期t1/2β分别11.178±4.364h、11.178±3.368h、11.585±2.346h;血药浓度达峰时间分别为2.333±0.516h、2.500±0.548h、2.167±0.408h;达峰时卡瑞斯汀的血药浓度分别为0.639±0.027μg/mL、0.940±0.025μg/mL、1.259±0.033μg/mL;消除率CL/F分别为2.072±0.217L/h/kg、2.302±0.397L/h/kg、2.099±0.170L/h/kg;时间-血药浓度曲线下面积AUC0-24分别为6.987±0.360μg·h/mL、10.245±1.187μg·h/mL、13.800±0.517μg·h/mL。以上实验结果显示:依巴斯汀滴丸药动学符合二室模型特征,给药后药物在大鼠体内分布速度快、消除速度缓慢、清除率低、平均滞留时间长。
  对自制依巴斯汀滴丸及市售片剂进行生物等效性评价,采用方差分析、双单侧t检验及(1-2α)%置信区间的方法,分别对主要药动学参数Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞进行等效性统计学分析。结果显示:两种不同剂型间存在着显著性差异(P<0.01);以AUC0-∞为计算参数,得到的相对生物利用度F为(106.2%~140.9%)%,说明两种制剂在大鼠体内不具有生物等效性。自制依巴斯汀滴丸与市售片剂相比,具有主药释放速度快、分布迅速、消除缓慢、达峰浓度高等的特点。
[硕士论文] 姜磊
临床兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)存在半衰期短,容易失活,内出血风险等问题,而我们进行相应改造的重组人组织纤溶酶原激活剂(rhPA)则具有半衰期延长、产量提高、与人体相容性高等优点。本实验室构建的重组PCL25/rhPA表达载体内含有CMV增强子调控元件以及获得的转基因纯合子兔整合拷贝数2倍于半合子,导致了其高效表达的能力,表达产量及活性的提高,有助于表达水平较高的转基因兔进行纯合子培育及传代扩系。现阶段目前临床上应用的t-PA及其突变体大多是在原核大肠杆菌中表达,少部分由动物或昆虫细胞表达,从乳汁中分离纯化rhPA尚未见报道。我利用多种纯化手段,研究从转基因兔乳中将rhPA分离出来的方法,从而确保从转基因兔乳中纯化的rhPA的纯度、生物活性及稳定性。
  乳腺特异性表达rhPA转基因兔的筛选与繁育将山羊BLG信号肽编码区和人t-PA的K2和P结构域的编码序列克隆到含有山羊β-酪蛋白基因的5'基因组片段和CMV启动子/增强子的PCL25载体中作为嵌合启动子/增强子,构建了PCL25/rhPA乳腺特异性表达载体。经原核显微注射PCL25/rhPA表达载体线性片段后,共获得存活仔兔48只,经PCR检测整合阳性兔27只。对F0代转基因兔乳清进行ELISA检测并测定OD450值,结果获得11只能在乳腺中表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔。通过对F2代转基因兔测交后代的检测,筛选出4只转rhPA基因纯合子兔(编号C1-C4)。将纯合子兔与半合子兔乳清样品进行ELISA检测并测定OD450值,发现转基因纯合子兔乳清中rhPA的表达量明显高于半合子转基因兔乳清中的表达量。通过FAPA法将获得的转基因兔乳清稀释后与注射用阿替普酶药物比较,结果显示表达rhPA的转基因纯合子兔与半合子兔乳清均在纤维蛋白平板上产生了明显的溶栓透明圈,均具有溶栓活性功能,但纯合子转基因兔溶栓活性强于半合子转基因兔。对转基因兔乳清进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析,检测发现rhPA转基因兔乳清中含41KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。
  表达产物rhPA的纯化与分析经20000g离心、35%饱和硫酸铵沉淀、酸碱沉淀及超滤等乳样前处理后,除去了如酪蛋白、脂肪等不溶性物质及大部分的盐离子和小分子物质,再利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法进一步分离纯化rhPA。发现采用0.5mol/L L-Arg+0.5mol/L Nacl的25mmol/L PB缓冲液(pH5.5)洗脱液进行Lysine HyperD亲和层析时能将大部分目标蛋白洗脱下来;Blue Sepharose6FF亲合层析时,通过阶段梯度洗脱后发现采用0.4mol/L NaCl的25mmol/L PB缓冲液(pH8.0)淋洗再用1mol/L NaCl的25mmol/L PB缓冲液(pH8.0)洗脱时能将杂蛋白去除的同时洗脱下目标蛋白。SP BestaroseTM FF离子交换时,通过线性梯度洗脱后发现采用0.3mol/L NaCl的20mmol/L PB缓冲液(pH5.0)淋洗再用1mol/L NaCl的20mmol/L PB缓冲液(pH5.0)能分离出目标蛋白。最后应用Surpdex G75凝胶过滤预装柱进一步精细分离纯化目标rhPA。各层析方法洗脱产物经FAPA法检测均具有生物活性且未失活;同时各层析方法洗脱产物经平衡液置换后进行SDS-PAGE检测均出现约41KDa大小的rhPA目标蛋白条带。转基因兔乳汁经多种纯化方法提纯后的纯化产物,经ELISA半定量与原乳清比较计算回收率为30%。运用Quantity One1-D分析软件进行SDS-PAGE纯度分析,纯化后纯度达96%以上。Western Blot检测纯化产物中含有41KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。获得的最终纯化产物通过FAPA法比较其与注射用阿替普酶药物在体外的溶栓生物活性的比活性,结果发现纯化产物在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行相对分子质量分析测定,结果显示该纯化产物与提供的理论序列比对结果相符,分子量大小为41713Da。rhPA的N-和C-末端蛋白质序列测定表明纯化的蛋白质是完整的,进一步确定该纯化产物为重组人纤溶酶原激活剂。
  本研究筛选出了能在乳腺中高表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔,并以此为基础培育的该品系转基因纯合子兔rhPA的表达量及体外溶栓活性均高于半合子转基因兔。本试验通过多种纯化技术相结合的方法,最终获得在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右的纯化产物rhPA,为之后的纯化研究提供了新的思路。
[硕士论文] 张海霞
生理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:神经菌毛素1(Neuropilin1,NRP1)作为一种跨膜糖蛋白在轴突导向,血管生成和肿瘤免疫等多种反应过程中发挥着重要的作用。研究发现,NRP1是血管内皮生长因子(VEGF)的非酪氨酸激酶受体,促进VEGF与其受体(VEGFR)的结合,对血管生成具有极大的促进作用,其中b1b2结构域是其与VEGF165的主要结合位点。研究发现,NRP1高表达于多种肿瘤细胞表面,尤其是上皮细胞肿瘤。阻断NRP1不仅能直接对肿瘤细胞的迁移及肿瘤的发生发展产生抑制作用,而且能够阻断其与VEGF165的结合,间接抑制肿瘤局部血管的生成与发展,继而影响肿瘤的生长发展。因此,NRP1有望成为抗肿瘤治疗的新突破点。本研究首先通过PCR技术得到人NRP1b结构域(HuNRP1b)的编码序列,并将其克隆入原核表达载体,经表达、纯化后,获得重组HuNRP1b蛋白;将重组HuNRP1b蛋白免疫小鼠,制备出抗HuNRP1b单克隆抗体(McAb)。随后,采用体内、体外实验分析McAbs结合肿瘤细胞的能力及抑制血管生成的活性,为其后续的抗肿瘤研究提供基础。
  一.重组HuNRP1b结构域蛋白的获得
  利用PCR方法得到HuNRP1b的编码基因,构建重组质粒pET30a-HuNRP1b,经双酶切和测序验证后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组表达菌BL21(pET30a-HuNRP1b)。经0.6mM/L IPTG进行低温诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白His-HuNRP1b的表达。经变性、复性、纯化等步骤制备可溶的重组蛋白。经SDS-PAGE分析,融合蛋白His-HuNRP1b成功获得表达、纯化,浓度约为3.0mg/ml。
  二.制备抗HuNRP1b结构域单克隆抗体并分析其生物学特性
  选取8wk Balb/c鼠,将上述获得的纯化蛋白His-HuNRP1b进行小鼠腹部皮下免疫,100μg/只,免疫3次,间隔2wk。第一次免疫,将纯化His-HuNRP1b与等体积完全弗氏佐剂混合,充分乳化后在小鼠腹部皮下进行多点注射。再次免疫,佐剂更换为不完全弗氏佐剂,抗原、剂量、免疫途径均同上。1wk后,取小鼠眼眶下静脉丛血,检测其血清效价,取效价高者进行加强免疫。加强免疫时,采用尾静脉直接注射不加任何佐剂的His-HuNRP1b。3d后取免疫鼠脾脏,制备单细胞悬液,与sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将阳性杂交瘤细胞株经过2-3次亚克隆后得到稳定的单克隆细胞株,小鼠腹腔注射法制备腹水McAbs。采用Western-Blot、间接免疫荧光法(IFA)、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学法(IHC)研究McAbs的生物学特性。本研究共获得4株腹水McAbs,分别为1H4、2G7、3H4、8G9,它们的ELISA效价依次为1∶256000、1∶64000、1∶256000、1:128000,亚类分别为:IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b。
  Western-Blot鉴定结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)只与融合蛋白HuNRP1b结合而不与空载体表达菌结合,在36kDa的位置出现特异性条带;且该McAbs可以与高表达天然HuNRP1的乳腺癌细胞株(MCF-7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231)结合,在大小约120kDa的位置有特异性条带。表明本研究所获得的McAbs不仅可以识别重组HuNRP1b结构域蛋白而且可以识别全长的HuNRP1。IFA结果表明,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)可以与人脐静脉内皮细胞(HUVEC),人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)及人白血病细胞株(k562)结合,观察到亮绿色荧光,表明所获得的McAbs均能够特异性识别天然的HuNRP1。ICC结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)作用于HUVEC细胞及MDA-MB-231细胞时,在胞膜及胞浆内可见棕褐色信号,其中McAbs:2G7、3H4、8G9结合能力较强。4株McAbs采用IHC实验分析临床样本的结果表明,在9例乳腺癌样本中McAbs分析发现有6例呈HuNRP1阳性;7例肺癌样本中有3例呈阳性;3例食管癌及3例肾癌均呈阳性,这与商品化的抗用HuNRP1抗体检测结果一致。
  表明获得的McAbs可以特异性识别肿瘤细胞及肿瘤组织中的HuNRP1。
  三.抗HuNRP1b结构域单克隆抗体抑制血管生成活性的研究
  运用Transwe11小室迁移实验,分析McAbs对HUVEC细胞的迁移的影响。在小室的下室加入10ng/ml VEGF165,上室分别加入终浓度为50ng/孔的McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)阻止细胞向下迁移,每组设三个复孔,同时设PBS组作为对照。实验结果显示,McAbs(1H4、2G7、8G9)相对于PBS组细胞迁移抑制率约为15%,3H4组未表现出抑制作用。运用Matrigel体外成管实验分析McAbs对HUVEC细胞体外成管的影响,细胞接种后,每孔加入10ng/ml VEGF165刺激细胞成管,实验孔加入McAbs(1H4、2G7、8G9),50ng/孔,设PBS孔作对照,继续培养6h,镜下观察细胞成管情况,发现PBS组的HUVEC细胞可以形成明显管状结构,而McAbs组大部分细胞仍附于Matrigel表面生长,抑制率约为10%,体外实验表明McAbs(1H4、2G7、8G9)对于局部血管生成具有一定的抑制作用。
  利用鸡胚尿囊膜血管生成实验,进一步分析McAbs对新生血管发生发展的影响。以硅胶环作为载体在健康发育的鸡胚内血管生长相对不丰富位置分别放入McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9),保持终浓度为100ng/枚,同时设终浓度为100μg/枚的地塞米松组作为阳性对照,设PBS100μL/枚作为阴性对照。结果显示,McAbs(1H4、8G9)组及地塞米松组鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长受到了明显的抑制,但McAbs(2G7、3H4)组抑制效果较不明显。最后,采用SCID小鼠体内种植Matrigel小体实验研究McAb对动物体内血管的生成的抑制作用。将100μg McAb1H4、5×106MCF-7细胞与500μl Matrigel混匀,于SCID小鼠腹部皮下注射。6天后取出小鼠体内种植的Matrigel小体,观察小体内血管的发育情况,并对其进行包埋、制成切片,通过苏木素-伊红(HE)染色及IHC方法进一步分析Matrigel小体内血管的发育。HE染色和IHC实验发现McAb1H4可以干扰Matrigel小体内MCF-7细胞对小体内血管生成的吸引作用。
  综上所述,本研究成功制备出4株抗HuNRP1b McAb,且具有识别天然HuNRP1的能力。其中,McAbs1H4、2G7、8G9具有一定的体外抑制HUVEC迁移及成管能力,其中McAb1H4具有体内抑制肿瘤血管生成的能力。该特异性McAb的获得为研究靶向抑制肿瘤部位血管生成及肿瘤的发生、发展提供了生物材料。
[博士论文] 范娟
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:小鹅瘟是导致雏鹅死亡的常见疾病之一,可造成巨大经济损失,严重危害养鹅业的发展。现有弱毒活疫苗和小鹅瘟抗体的广泛应用,在我国小鹅瘟疫病防控过程中发挥了巨大的作用。但活毒疫苗存在毒力返强的潜在危害,从而限制了其生产应用,因此研究小鹅瘟灭活疫苗显得尤为重要。本研究对小鹅瘟分离毒株的生物学特性进行了系统研究,筛选出免疫原性好、繁殖滴度高的小鹅瘟野毒株作为灭活疫苗候选株,并开展了生产工艺、乳化工艺和免疫效力研究工作,以期制备出安全、高效的小鹅瘟灭活疫苗,为我国小鹅瘟疫病的防控和净化提供有力工具。
  1、小鹅瘟病毒疫苗候选株的筛选
  为了研制与当前小鹅瘟流行株匹配的疫苗,本研究对从2009~2011年江苏省养鹅地区疑似小鹅瘟的临床样品中共分离了5株鹅细小病毒(GPV),同时对分离株进行VP3基因测序并绘制遗传进化树,序列分析结果表明GPV分离株与国内大部分分离株属于同一分支,明显不同于国内疫苗株SY61和台湾主要分支。对获得的毒株经有限稀释法纯化,并对纯化后的病毒进行繁殖性能、毒力、特异性及免疫原性等进行了测定,5株病毒均属于强毒株,其中Gosling plague virus/taizhou/10(TZ10)株病毒含量最高(F10代:1050ELD50/0.2ml以上),且其灭活抗原免疫鹅4周后的抗体水平最高,因此确定以TZ10株作为小鹅瘟疫苗候选株。
  按照农业部颁发的《兽用生物制品(毒、虫)种种子批建立实验技术指导原则》各项要求,对纯化后的TZ10株F0代毒在鹅胚中连续传至30代,并分别对不同代次种毒进行了AGP、鹅胚半数致死量(ELD50)测定、免疫原性、特异性实验及纯净性检验,建立了符合规定的小鹅瘟病毒TZ10株的基础种子批(F16~F20种毒)、规定了生产用最高限制代次(F25)。
  2、小鹅瘟灭活疫苗生产工艺研究
  疫苗生产过程中,抗原的生产工艺决定了疫苗质量及生产成本,抗原的完全灭活和疫苗的乳化工艺分别是关系到疫苗安全、有效性和疫苗质量的关键步骤。本研究选取前期种子批F25代次GPV尿囊液,进行最佳鹅胚接种剂量与最佳鹅胚接种日龄的试验,从鹅胚死亡数统计、抗原收获量统计、病毒含量测定三方面进行比较,分别确定生产过程中最佳病毒稀释比例、接毒剂量、鹅胚日龄为:种毒用灭菌生理盐水进行1∶100倍稀释,0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚最佳。根据接种后不同时间鹅胚死亡数、抗原收获量、死亡鹅胚情况和病毒含量测定数据确定种毒最佳培养时间为接毒后48~120小时,收获死亡鹅胚尿囊液;抗原最佳培养时间为接毒后48~144小时,收获死亡鹅胚尿囊液及鹅胚。为了确定抗原灭活的最佳方法,对甲醛溶液的浓度、灭活时间进行了研究,结果表明:采用甲醛溶液作为灭活剂,灭活剂终浓度为0.2%,37℃灭活48小时,可以完全灭活小鹅瘟病毒TZ10株。乳化工艺研究证实:取小鹅瘟病毒TZ10株灭活抗原,按每96份抗原加4份灭菌吐温-80比例加吐温-80,充分溶解混匀,制成水相;94份注射用白油加6份司盘-80及1份硬脂酸铝,加热溶解至透明灭菌,制成油相;水相与油相的最佳配比为1∶3,二次乳化的剪切速率在3000~4000r/min,乳化过程温度控制在25℃以下,可获得最佳乳化效果。
  3、小鹅瘟灭活疫苗的安全性评价
  按照确定的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)生产工艺,在实验室试制了3批灭活疫苗。将试制的3批小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)通过疫苗单剂量、单剂量重复及双倍剂量免疫3~5日龄、1月龄鹅、7月龄开产种鹅、9月龄产蛋种鹅进行安全性评价,结果表明:所有免疫鹅精神状态、采食、饮水正常,无全身不良反应。接种部位无肿胀,免疫21日后,单剂量重复和双倍剂量接种的实验组中,有少量疫苗颗粒未吸收现象;除双倍剂量接种组个别鹅注射部位肌肉有轻微潮红外,其余各免疫组免疫鹅注射部位无异常变化。免疫21日后,免疫组与对照组鹅平均增重无显著差异。疫苗注射后1周内产蛋鹅产蛋数较对照组少2~3枚,之后恢复正常,且种蛋孵化率无差异。表明研制的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)对产蛋鹅安全,雏鹅接种后未出现任何临床症状。
  4、小鹅瘟灭活疫苗的效力评价
  通过对3批试制疫苗的免疫效力试验,发现小鹅瘟疫苗免疫种鹅产生的GPV血清琼扩抗体水平与雏鹅被动免疫GPV琼扩抗体水平、攻毒保护率呈正相关;对种鹅血清GPV琼扩抗体效价与对应雏鹅攻毒保护结果相关性分析表明,当种鹅血清抗体效价为1∶2时,雏鹅血清被动免疫保护率为92.3%;当种鹅血清抗体效价不低于1∶4时,雏鹅被动免疫保护率达到100%。考虑到临床饲养环境及鹅群健康状况的不确定性,规定疫苗的效力检验标准为:7~8月龄健康阴性鹅,胸部肌肉注射疫苗,1.0ml/只,4周后其血清GPV琼扩抗体效价几何平均值应不低于1∶8。
  最小免疫剂量实验结果表明,试制的3批疫苗以不低于0.5ml/只剂量免疫7~8月龄产蛋种鹅,免疫后种蛋孵化的雏鹅90%以上可以抵抗GPV强毒的攻击。根据3批试制疫苗制苗抗原灭活前的病毒含量及最小免疫剂量试验结果,考虑到临床实际情况的复杂性,为保证雏鹅获得确实的被动保护,规定制苗用半成品抗原的病毒含量应≥1055ELD50/0.2ml、推荐免疫剂量为1.0ml/只。
  根据3批试制疫苗免疫持续期的种鹅和雏鹅的血清AGP抗体效价及所产种蛋孵化雏鹅的攻毒保护试验结果,确定种鹅开产前免疫2次,1ml/次,其免疫持续期为5个月;推荐免疫程序为:种鹅开产前5周首免,胸部肌肉注射,1.0ml/只,3周后以相同剂量、途径加强免疫1次。该免疫程序可基本保证种鹅在6个月产蛋期内,雏鹅获得有效母源抗体抵抗GPV感染。
  因健康阴性产蛋种鹅的来源和质量不够稳定,其作为效检用动物时,难以保证检验结果的稳定性及可重复性。为此本研究对疫苗免疫SPF鸡后血清抗体效价及特异性进行了分析,以探讨其作为小鹅瘟疫苗效检替代动物的可行性。3批小鹅瘟灭活疫苗以不同剂量免疫21日龄SPF鸡,抗体检测结果显示同一剂量不同时间点检测的SPF鸡血清AGP抗体效价基本一致,表明SPF鸡对疫苗可产生稳定的免疫抗体反应。将SPF鸡免疫后阳性血清与小鹅瘟病毒进行中和反应结果表明,SPF鸡免疫小鹅瘟灭活疫苗后产生的抗体具有特异性;抗体效价随免疫剂量和时间的变化规律与7~8月龄健康阴性种鹅免疫后血清AGP抗体效价的变化规律一致,证明免疫SPF鸡后测定血清AGP抗体效价方法作为小鹅瘟灭活疫苗的效检方法是可行的。
  根据疫苗免疫SPF鸡和种鹅的中和抗体效价与AGP抗体效价相关性分析,当种鹅AGP抗体效价在1∶8时,中和抗体效价为2.87log10,对应的SPF鸡血清AGP抗体效价为1∶16;根据免疫剂量与抗体产生的正相关关系,及实验动物对疫苗的吸收情况,确定21日龄SPF鸡作为小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)效力检验替代动物的检验标准为:21日龄SPF鸡,颈部皮下注射,0.25ml/只,免后4周小鹅瘟AGP抗体效价的几何平均值应不低于1∶18。
[硕士论文] 顾彩虹
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:马来酸氟吡汀(FM,Flupirtine Maleate)是一种新型中枢性非阿片类止痛药,它的作用点位于脑干,属于选择性神经原钾通道开放剂,主要具有止痛,肌肉松弛和神经保护三重功效,且不会产生耐受性和依赖性。目前,FM的国内上市剂型为常释胶囊。但是对疼痛急症的治疗,理想的药物应既起效迅速又较长时间维持平稳有效血药浓度,为达此目的,本实验以聚乙二醇(PEG)6000和单硬脂酸甘油酯(GMS)为载体制备FM缓释固体分散体制剂。实验主要内容及结果如下:
  1.马来酸氟吡汀固体分散体制剂的制备
  (1)本实验对FM的性质、引湿性和原辅料的熔点进行考察,采用紫外分光光度法测定马来酸氟比汀缓释固体分散体(FMSSD)制剂中药物含量,并进行方法学考察。结果表明:FM呈白色絮针状结晶,熔点171℃~175℃;易溶于甲醇、乙醇、水和0.1mol/L盐酸溶液;FM引湿性考察中,在室温RH80%条件下放置24小时后增重小于0.2%,无引湿性。选定345nm为定量波长,FM在0.1M HCl中,在考察的1.9μg/mL~16.2μg/mL浓度范围内线性关系良好,测定的专属性、精密度、日内稳定性及回收率均符合要求。
  (2)本实验以累积释放度为考察指标,选择对固体分散体累积释放度影响较大的因子:药物FM与载体质量比、辅料比(PEG6000∶GMS分别为1∶1、1∶2、1∶4)及制备固体分散体的熔融温度(三个水平80℃、90℃、100℃)三因素,采用响应面试验来优化工艺。确定工艺参数为:药物与载体质量比为1.5∶1,PEG6000和GMS比为1∶2,制备固体分散体的熔融温度为90℃。
  (3)采用相似因子法比较自制FM固体分散体制剂与国外上市FM缓释片剂的体外溶出特性。结果显示f2=43.2,不在50~100之间,表明两种制剂的体外溶出不具有相似性。但自制FM固体分散体制剂在0.75h的累积释放率为33%,没有突释现象;释药60%的时间为3h左右;释药90%的时间为10h左右,释药缓慢。相较于FM缓释片剂,从累积释放曲线可以看出自制FM固体分散体制剂到达平顶的时间较晚,缓释的效果更好,提示自制制剂能够较长时间的保持有效浓度。
  (4)对自制缓释固体分散体制剂按零级释药模型、一级释药模型及Higuchi模型进行体外释药数学模型的拟合,结果表明,自制缓释固体分散体制剂更符合一级释药模型。
  2.FM固体分散体制剂的物相表征及稳定性考察
  (1)采用扫描电镜法、红外光谱法及X-射线衍射法对FMSSD进行物相表征,考察FM在固体分散体中的存在状态。结果表明:扫描电镜下原料FM晶体清晰可见,FM与基质材料的物理混合物中也可以看到其晶体颗粒,但是在FM的固体分散体中几乎观察不到它的晶体颗粒,由此显示FM大多以非晶态分散于载体中;红外扫描图谱显示FM有1700cm-1附近的C=O伸缩振动,3000cm-1附近的N-H伸缩振动,这两个特征峰在FM固休分散休中强度显著减弱,可能是FM与载体材料有氢键结合等,提示FM已经较好的分布于载体材料中。在X-射线衍射图谱中,FM原料药在8.8°、17.44°和18.18°处有三个特征衍射峰,FM与基质材料的物理混合物的谱图中FM的特征峰依然存在,而在FM的缓释固体分散体的谱图中,原有的各个衍射峰强度大大减弱,推断FM在缓释固体分散体中少量以微晶形式存在。
  (2)采用加速实验和长期试验对FMSSD制剂进行稳定性考察,结果表明:在加速实验中,在40℃±2℃,RH75±5%条件下,缓释固体分散体外观性状、药物的含量以及药物释放情况均未见明显变化;在长期试验中,室温条件下,缓释固体分散体制剂外观性状、药物的含量以及药物释放均未见明显变化,提示FMSSD制剂在密封条件下稳定性良好。
  3.自制FMSSD制剂与国外市售FM缓释片剂的生物等效性研究
  本人参与并完成前期建立大鼠血浆中FM的HPLC检测方法。色谱条件:色谱柱:Symmetry C18(5μm,4.6×250mm);流动相:甲醇∶水=50∶50(V/V),用1mol/L的甲酸调pH值至6.70;柱温:25℃;流速:0.5mL/min;检测波长:320nm;进样量:20μL。FM在大鼠血浆中0.015~5.00μg/mL浓度范围内,呈现良好的线性关系(R2>0.9991)。该方法具有良好的专属性,精密度、稳定性RSD均小于6%、回收率大于90%,均符合相关检测要求,可用于血浆样品中FM的测定。采用该方法对自制FMSSD制剂及国外FM缓释片剂进行生物等效性评价,分别对主要药动学参数Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞采用方差分析、双单侧t检验及(1-2α)%置信区间的方法进行生物等效性统计学分析,结果表明:两种FM不同剂型间存在着显著性差异(P<0.01)。以AUC0-∞计,国外市售FM缓释片剂为(30.897±1.387)μg·h/mL较自制FMSSD制剂的(76.079±3.906)μg·h/mL低出1倍多;相对生物利用度为(246.811±19.884)%,不在参比制剂的80.0%~125.0%范围内,因自制FMSSD制剂的生物利用度远大于国外市售FM缓释片剂而使两种制剂在大鼠体内不具有生物等效性。
  本实验制备的FM固体分散体制剂具有较好的贮存稳定性和良好的溶出特性,可以达到良好的释药和长效要求。且自制FMSSD制剂能迅速达到有效血药浓度,迅速发挥镇痛作用的同时还能够持续缓慢释放药物保持持久的有效血药浓度,达到了更好的缓释效果,延长了镇痛时间。本实验为FM固体分散体制剂的体内外药效学研究及临床应用奠定了基础出。
[硕士论文] 王亚杰
微生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:猪圆环病毒2型(PCV2)是猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪病的主要病原。PCV2在世界范围内流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前PCV2防控主要依靠疫苗免疫,上市的疫苗有全病毒灭活苗、重组嵌合苗和亚单位疫苗,其中制备全病毒灭活苗所用病毒滴度较低,制备成本较高;大肠杆菌和昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的亚单位疫苗工艺复杂、价格高昂,因此研制安全、高效的新型PCV2亚单位疫苗很有必要。
  自聚肽ELK16能在大肠杆菌内形成活性包涵体,其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。结核杆菌热应激蛋白70(Hsp70)是重要的病原相关分子模式,通过Toll样受体2(TLR-2)刺激先天性免疫细胞,释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和IL-12等细胞因子具有免疫佐剂作用。本研究以自聚肽ELK16为纯化标签,用于PCV2Cap蛋白和结核分枝杆菌Hsp70的融合表达和纯化,旨在简化PCV2亚单位疫苗和Hsp70分子佐剂的制备工艺。进而以小鼠为动物模型,评价分子佐剂对候选亚单位疫苗的免疫佐剂作用,为PCV2新型亚单位疫苗研制奠定基础。
  以自聚肽ELK16为纯化标签,分别与结核分枝杆菌Hsp70和PCV2Cap基因融合,在重组大肠杆菌中进行诱导表达。在优化条件下,利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70,其纯度高达95%、96%和85%,产量分别为92mg/L、84mg/L和83mg/L细菌培养。分别用ELK16-Cap、ELK16-Cap+弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap+ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70免疫小鼠,设PBS对照组。初免后7、14、21和28天采血分离血清,用间接ELISA进行抗体检测,结果显示:在初免后7天,IFA+ELK16-Cap和ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组即为ELISA抗体检测阳性,其他三组为特异抗体阴性;从初免后14天开始,四个免疫组的抗体水平呈逐渐上升趋势,其中ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组抗体水平最高,IFA+ELK16-Cap免疫组次之,ELK16-Cap免疫组抗体水平最低;从初免后21天开始,四个免疫组的抗体水平进一步上升,ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平最高,ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组抗体水平次之,ELK16-Cap免疫组抗体水平最低。在二免后两周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞,用试剂盒检测细胞因子表达。结果显示:PBS对照组、ELK16-Cap免疫组、ELK16-Cap+IFA免疫组、ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组和ELK16-Cap-Hsp70免疫组的TNF-α浓度分别为588.55、802.55、995.55、1382.55和1719.55pg/mL,IFN-γ浓度分别为46.30、92.22、155.56、470.37和518.15pg/mL,IL-12浓度分别为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72pg/mL。这些研究结果表明,分子Hsp70对刺激PCV2Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA,但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强,而ELK16-Hsp70+ELK16-Cap对三种细胞因子产生的刺激作用次之。
  为了优化PCV2重组抗原的抗原性,将His标签与PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和表位和PCV-2b Cap基因进行融合表达,并将结核分枝杆菌Hsp70基因与4Cap-His进行融合表达,利用亲和层析法纯化得4Cap-His、Hsp70-His和4Cap-hsp70-His融合蛋白。将30只小鼠分为5组,分别为PBS对照组、4Cap-His免疫组、4Cap-His+Hsp70-His免疫组、4Cap-hsp70-His组和4Cap-His+IFA免疫组。初免后7和14天采血,用间接ELISA测定Cap蛋白特异抗体;在二免后14天取免疫小鼠脾淋巴细胞,用试剂盒测定细胞因子浓度。每组三只免疫小鼠用2×103TCID50PCV2b攻毒,第3和7天采血分离血清,用定量PCR检测病毒血症。结果显示:在初免后第七天,4Cap-His+Hsp70-His和4Cap-hsp70-His即为ELISA抗体检测阳性,其他三组为抗体检测阴性;初免后14天,对照组和4Cap-His免疫组仍为抗体检测阴性,4Cap-His+IFA免疫组为抗体检测阳性,但低于4Cap-hsp70-His免疫组;从初免后21天,四个免疫组的抗体水平明显上升,其中4Cap-hsp70-His免疫组的抗体水平最高。与对照组相比,四个免疫组的TNF-α、IFN-γ和IL-12表达水平明显上升,并高于刀豆蛋白A刺激组。与对照组相比,所有含4Cap重组蛋白的免疫组血清中病毒载量均呈降低趋势,攻毒后7天比3天明显下降,4Cap-hsp70-His免疫组病毒载量下降最多,4Cap-His+Hsp70-His免疫组次之,4Cap-His免疫组病毒载量下降最低。这些研究结果表明,ELK16标签对Hsp70刺激PCV2Cap蛋白ELISA抗体产生无明显影响,两种方式融合Hsp70的体液免疫刺激作用优于IFA,均能刺激小鼠产生TNF-α、IFN-γ和IL-12表达,并且Hsp70融合PCV2Cap蛋白的刺激作用较强。
[硕士论文] 尹克全
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鸡白痢沙门菌是宿主特异性致病菌,多侵害21日龄以内的雏鸡,引起白色痢疾,发病率和致死率极高;成年鸡感染后一般无临床症状,但使其处于持续带菌状态,导致体重减轻,产蛋量下降。鸡白痢沙门菌含有很多致病基因,其中ipaJ基因是在鸡白痢沙门菌中新发现的与毒力相关的基因,其编码的IpaJ蛋白参与细菌对机体的早期感染过程。研究表明ipaJ基因广泛存在于鸡白痢沙门菌中,且为鸡白痢沙门菌血清型所特有的基因,与其亲缘关系较近的其他血清型沙门菌则不含有该基因,如鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌等。本研究克隆表达了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,制备了IpaJ蛋白的单克隆抗体并建立了相应的检测技术,为鸡白痢沙门菌致病机制的研究和疾病诊断提供了重要的生物学材料。
  1鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆及表达
  以鸡白痢沙门菌C79-13和福氏志贺菌SNI基因组为模板分别PCR扩增ipaJ基因。将ipaJ基因分别与原核表达载体pColdI和pMAL-c5X相连接构建重组原核表达质粒,通过双酶切以及测序鉴定,结果表明ipaJ基因成功克隆至原核表达载体上,且没有任何碱基突变。将构建成功的重组质粒分别命名为pColdI-SP-ipaJ(Salmonella Pullorum)、pMAL-c5X-SP-ipaJ(Salmonella Pullorum)和pMAL-c5X-SF-ipaJ(Shigella flexneri)。将重组原核表达质粒通过热激法转入原核表达宿主菌BL21(DE3)和ER2523,分别经0.5mM和0.3mM IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western Blot验证,结果表明重组蛋白条带大小分别为31.8kDa、73.5kDa和71.3kDa。将诱导表达的蛋白产物通过割胶纯化法和免疫亲和层析柱方法纯化目的蛋白,Western Blot结果表明所纯化的目的蛋白具有良好的免疫反应性,表明成功获得了重组蛋白rHis-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)、rMBP-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)和rMBP-SF-IpaJ(Shigella flexneri)。
  2鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的制备
  将割胶纯化的重组蛋白rHis-SP-IpaJ免疫6-8周龄BALB/c小鼠,经3次免疫后,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以纯化获得的重组蛋白rMBP-SP-IpaJ作为检测原蛋白,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,经过3次检测,最终确定获得8株稳定分泌特异性IpaJ单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1C3、1F3、2D9、3B5、3D8、4D5、4G6和5D1。亚型鉴定结果显示1C3、2D9、4G6和5D1为IgG1型,3B5和4D5为IgM型,1F3和3D8为IgG2b型。以间接ELISA方法测定其细胞上清效价,结果显示1C3、2D9和3B5为200,1F3和3D8为1600,4D5、4G6和5D1为6400;制备上述8株杂交瘤细胞腹水并以间接ELISA方法测定其腹水效价,结果显示1C3为2000,1F3为256000,2D9为1000,3B5为4000,3D8和4D5均为128000,4G6为2048000,5D1为4096000。ELISA和Western Blot结果显示所获得8株单抗均与相应的融合蛋白rHis-SP-IpaJ、rMBP-SP-IpaJ和rMBP-SF-IpaJ有良好的反应性,而与对照组BL21(DE3)-pColdI和ER2523-pMAL-c5X空载体细菌不发生反应。特异性鉴定结果显示8株单抗只与相应的重组融合蛋白有反应,与其他重组融合蛋白均无交叉反应。
  3鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的初步应用
  应用HRP酶标记4G6单克隆抗体检测鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白的体外表达情况,并以重组蛋白rMBP-SP-IpaJ作为检测抗原建立针对鸡白痢病的竞争ELISA检测方法。①Western Blot结果表明鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白能够在体外LB培养条件下正常表达。②当血清工作浓度为1∶10时,利用竞争ELISA方阵实验确定重组抗原蛋白rMBP-SP-IpaJ包被浓度为0.5μg/mL,酶标竞争抗体4G6工作浓度为1∶16000;以梯度实验确定血清最佳工作浓度为1∶2。基于实验数据绘制ROC曲线并确定其灵敏度为0.906,特异度为0.762,Cut-off值为40.5,统计分析p<0.05,鸡白痢阳性血清对酶标抗体4G6有显著的抑制作用。应用建立的竞争ELISA检测技术对某养鸡场的200份临床血清样本进行检测,阳性检出率为2%。表明基于鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白单克隆抗体建立的竞争ELISA检测技术对鸡白痢病诊断有良好的应用前景。
[硕士论文] 徐祥东
化学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:癌症,俗称恶性肿瘤,是人体内的细胞不受控制,过度增殖而引起的疾病。虽然现代的医疗技术已经十分先进,但是癌症的治疗仍是困扰人类的巨大难题之一。传统治疗癌症的方法不仅治疗难度大还会对人体正常组织造成一定程度的损伤,因此寻找创伤小且具有针对性地治疗方法显得尤为迫切。目前,新兴的光热疗法(Photothermal Therapy,PTT)可以通过纳米材料将照射的近红外光转化为热能,通过局部升温的方式杀死肿瘤细胞且不会对正常组织产生损伤,引起了人们的广泛关注。纳米酶通过发挥过氧化物酶和氧化物酶等活性可催化双氧水及氧气产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),过量的活性氧也可以杀死癌细胞。因此本论文的研究目标在于寻找一种既具有良好光热转化性能又可以产生活性氧的纳米酶材料,并探究其光热-ROS对肿瘤协同治疗的效果。
  本论文设计制备了同时具有过氧化物、氧化物模拟酶活性和光热治疗功能的金/碳复合材料,系统地研究了金纳米粒子(AuNPs)与碳层复合方式、金纳米粒子含量等因素对过氧化物及氧化物模拟酶活性、稳定性、细胞毒性、肿瘤光热及ROS协同治疗效果的影响,论文主要包括以下三个部分:
  (1)以SiO2纳米球为模板,聚多巴胺为碳源,经氢氧化钠刻蚀除去SiO2模板后得到氮掺杂空心碳纳米球(N-HCNs)。通过负载不同粒径AuNPs制得多种N-HCNs@AuNPs复合材料。采用TEM、XRD、Raman、XPS以及BET等实验方法对所得材料进行形貌及结构的表征。N-HCNs@AuNPs复合材料的模拟酶活性通过催化底物TMB所产生的紫外吸收值(652nm)的大小进行评估,采用Michaelis-Menten方程来测定所的材料与底物的亲和能力。N-HCNs@AuNPs复合材料的光热转化性能通过给与一定的近红外(NIR)辐照计量后,体系的升温情况进行测定,同时考察NIR辐照对N-HCNs@AuNPs复合材料模拟酶活性的影响。
  (2)为了进一步考察金纳米粒子在金/碳复合材料发挥模拟酶活性及光热转化性能中的作用,我们又制备了具有蛋黄蛋壳结构的金纳米粒子负载氮掺杂空心碳纳米球(Au@N-HCNs)。通过TEM、HRTEM、XRD、Raman、XPS以及BET等实验方法对材料独特的形貌及结构进行一系列的表征。随后对Au@N-HCNs材料的模拟酶活性以及光热转化效率做了进行了详细的研究:同样通过催化TMB显色的方法判断其模拟酶活性的大小。采用Michaelis-Menten方程计算其与底物亲和能力的强弱,并利用ESR波谱验证催化过程中ROS的产生;材料的光热转化能力通过计算其光热转换效率(η)进行比较。构建小鼠结肠癌细胞(CT26)小鼠皮下植瘤模型探讨Au@N-HCNs复合材料对肿瘤光热-活性氧协同治疗的效果,并对其生物应用安全进行初步检测:主要包括细胞毒性试验,肿瘤细胞对材料的摄取,细胞内ROS的水平,生物相容性及体内分布分析。与上一章相比,虽然光热转化效率有所降低,但是在降低金含量的情况下金/碳纳米酶的活性得到了显著的提升。
  (3)在上述两章研究的基础上,通过在氮掺杂的空心碳壳内负载多个金纳米粒子,构建金/碳纳米酶。期望通过提高壳层内金纳米粒子的量来提升材料的光热转化效率及产生ROS的能力,最终提高肿瘤光热-活性氧协同治疗的效果。通过St(o)ber法制备SiO2纳米球,并以SiO2纳米球为模板,在其表面负载15nm金纳米粒子,利用聚多巴胺的粘附性在其表面负载一层聚多巴胺,经800℃煅烧以及氢氧化钠浸泡后除去SiO2模板,得到金纳米粒子负载氮掺杂空心碳纳米球(15nm AuNPs@N-HCNs)。另外,以2nm AuNPs@N-HCNs的材料作为对照样。通过TEM、HRTEM、XRD、Raman、XPS以及BET等手段对其形貌和结构进行详细表征。相比于N-HCNs@AuNPs材料与Au@N-HCNs材料,AuNPs@N-HCNs材料的光热转化效率以及纳米酶活性均得到了显著提高,动物实验也验证了上述规律。
  综上所述,通过控制金纳米粒子(AuNPs)与碳层的复合方式、金纳米粒子大小及含量,本论文构建并优化了同时具有优异的模拟酶活性以及光热转换性能的金/碳复合材料并将其用于肿瘤光热-活性氧协同治疗。
[硕士论文] 吴红萍
生物工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:2,3,5-三甲基氢醌(TMHQ)是人工合成维生素E的重要前体,维生素E作为目前市场容量最大的维生素产品之一,在医药、饲料、化妆品等方面有着广泛的应用。2,3,6-三甲基苯酚(TMP)氧化还原法和异佛尔酮法是工业合成2,3,5-三甲基氢醌的主要方法,但是化学法普遍存在反应步骤多,反应条件苛刻,催化剂及溶剂的使用对环境造成污染等问题,而生物催化法具有反应条件温和、绿色清洁等优点。为此,本课题通过构建氧化还原酶库,从中筛选出能够一步催化TMP生成TMHQ的生物催化剂,并在此基础上通过优化反应条件和定向进化的方法提高其催化活性。
  通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行基因挖掘,克隆了来源于不同物种的氧化还原酶并构建E.coli BL21(DE3)重组菌进行诱导表达,通过调整诱导温度、诱导时间和分子伴侣等进行表达优化,最终获得6个可溶性表达的蛋白,成功构建了氧化还原酶库;在此基础上,以2,3,6-三甲基苯酚(TMP)为底物,NADH为氢供体,筛选能够合成2,3,5-三甲基氢醌(TMHQ)的目标蛋白,最终获得4个具有目标催化活性的重组酶,即来自于大肠杆菌的HapC和UbiH-K、来自枯草芽孢杆菌的yjiB和来自巨大芽孢杆菌的P450BM3,其中以P450BM3的催化活性最佳。
  在确认P450BM3对2,3,6-三甲基苯酚的催化活性后,从辅酶特异性、温度、pH、底物浓度、助溶剂及助溶剂浓度和金属离子等七个方面对反应体系进行了优化。结果表明,底物浓度为0.5 mM时,P450BM3能利用NADH和NADPH两种辅酶进行催化反应,反应最佳温度为25℃,最适pH为7.0,最适助溶剂为丙酮,助溶剂溶度为5%,金属离子Fe2+能促进反应进行;经过一系列反应条件的优化,P450BM3催化TMP生成TMHQ的产物得率由最初的0.4%提高到3.19%,提高了近7倍。
  为了进一步提高P450BM3一步催化TMP生成TMHQ的催化活性,采用定向进化的手段对酶进行改造。结合P450BM3晶体结构和文献报道催化非天然底物的分子改造经验,运用定点饱和突变的方法构建突变体文库,利用咪唑蓝/吩嗪硫酸甲酯(MTT/PMS)显色的高通量筛选方法,获得活性分别提高57.5%和71.9%的两株突变体I259P和L181Q。动力学参数分析表明,两个突变体的Km值相比野生型均有所下降,对底物更具亲和力,总催化活性(kcat/Km)也均高于野生型。分子对接结果表明,L181Q的突变有利于关键氨基酸间氢键的形成从而稳定催化中心,促进反应进行,I259P位点突变则改变了底物通道内氨基酸残基与底物的相互作用,使底物分子更接近催化中心Fe原子。
  研究结果表明,生物催化剂代替化学法合成药物中间体具有一定的可行性,本研究中成功筛选到能够一步催化TMP合成TMHQ的生物催化剂,为生物合成TMHQ奠定了基础。
[硕士论文] 吴伟鹏
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体,其生物活性构型为(E,E,E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E,E,E)-GGOH产量,在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶(BTS1-DPP1)和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg/L GGOH)的基础上,进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面,过表达了来源于红法夫酵母的GGPP合酶突变体(CrtE03M),增加了前体物质GGPP的供应,从而将GGOH产量提高了1.6倍,达到56.04mg/L;另一方面,利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调,从而使GGOH产量提高4.5倍,达到156mg/L。同时,通过敲除GAL80构建了葡萄糖调控的GAL体系,用以控制GGOH合成,与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起,构成了顺序表达体系,最终,以十二烷为有机相,在摇瓶中进行两相发酵,培养72小时后获得GGOH产量183.07mg/L,与初始菌株相比提高了5倍。随后本实验对菌株YWWP11-12DEE03(+)分批补料发酵。经过120 h发酵,最终发酵液OD600达到了310,最终产量为1.86 g/L。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。
  除了香叶基香叶醇,本论文还以酿酒酵母作为底盘细胞对另一种萜类物质β-紫罗兰酮的生物合成进行了初步探索。β-紫罗兰酮在工业上是非常重要的香精香料。目前,β-紫罗兰酮主要来源于以柠檬醛为原料的化学合成。由于受健康生活观念的影响,消费者日益倾向于选择天然食用香料,因此对天然香料的市场需求不断增长,而微生物发酵生产得到的香料被视为“天然香料”。以课题组前期构建的高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株YXPW74为起始菌株,表达了来源于玫瑰的外源基因RdCCD1后,成功地检测到4.2 mg/Lβ-紫罗兰酮。对RdCCD1基因进行过表达后,β-紫罗兰酮仅略有提高(4.9 mg/L)。为了进一步促进β-胡萝卜素向β-紫罗兰酮转化,引入了来源于拟南芥的AtCCD7蛋白。为了检验RdCCD1蛋白和AtCCD7蛋白能否产生协同催化作用,分别构建了单独表达AtCCD7基因的菌株以及共表达RdCCD1和AtCCD7基因的菌株。结果表明单独表达AtCCD7基因的菌株产量仅仅为0.6 mg/L,并且过表达AtCCD7基因也不能显著提高产量;而共表达RdCCD1和AtCCD7基因的菌株产量达到了6.1 mg/L,与单独表达RdCCD1菌株相比,得到了明显的提高。结果表明,在酿酒酵母中CCD1蛋白和CCD7蛋白的确存在协同催化作用。由于两个酶的酶活均很低,在后续实验中还基于β-胡萝卜素和β-紫罗兰酮的颜色差异建立高通量筛选方法,对它们分别进行了定向进化,遗憾的是,并没有筛选到阳性突变体。本实验通过对CCD1和CCD7酶学性质分析,共表达RdCCD1和AtCCD7基因产生协同催化作用对合成生物学人工设计构建代谢途径有重要借鉴意义。
[硕士论文] 文魁山
化学工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:原花青素(Proanthocyanidin,PC)是由黄烷-3-醇单体连接成不同聚合度的黄酮类物质,具备抗氧化、清除自由基等生物活性,可应用于抗肿瘤、抗炎抗毒、保护心血管等药物的制备。松树皮、蔓越桔、葡萄籽等植物源材料中原花青素含量丰富,其中葡萄籽提取物已成为工业制备原花青素的最主要来源。原花青素由单体(没食子酸、儿茶素、表儿茶素)、低聚体(OPC,聚合度2-4)和高聚体(PPC,聚合度5以上)组成,随聚合度增加生物利用度降低。将高聚体解聚为B-型二聚体,对提高其生物利用度和经济效益具有重要意义。本文以市售葡萄籽提取物(GSPE)为研究对象,建立原花青素质量含量与聚合度的盐酸-香草醛法测定法、单体和二聚体UPLC定性定量方法体系;用乙酸乙酯-水两相萃取获得原花青素高聚体,探讨了盐酸解聚、EC/HCL(C/HCL)解聚的反应历程;以二聚体含量为响应值,设计了四因素(物料比、HCl浓度、时间、温度)五水平的中心组合(CCD)的响应面实验,优化解聚反应的条件。本文的研究结果如下:
  1、市售GSPE中原花青素质量含量为95%,平均聚合度3.56; UPLC法定性与定量分析了GSPE的成分,其中没食子酸(0.3%,M/M)、儿茶素(1.74%)、表儿茶素(1.29%)、原花青素B1(0.19%)、B2(0.72%)、B3(0.08%)、B4(0.04%)、ECG(0.15%),各标准品的标准曲线RSD%小于0.5%,R2大于0.999;三聚体以上的高聚体(88.7%)难以分离。
  2、GSPE萃取收率为99.2%,其中萃取相产物占19.3%,平均聚合度2.21;萃余相产物占80.6%,平均聚合度5.65,且萃余相中不含单体和二聚体。
  3、EC/HCL解聚反应,当反应条件为:物料比1、HCL0.1 mol/L、时间20 min、温度40℃时,产物聚合度降至1.74,其中B2与B4含量分别为1.96和0.23 mg/mL,两者比例约为8.5∶1;在相同的反应条件下,C/HCL解聚反应产物的聚合度降至1.68,B1与B3含量分别为2.18和0.253 mg/mL,两者比例约为8.6∶1;盐酸解聚效果不明显,产物聚合度为4.56,单体二聚体含量少。
  4、响应面法优化EC/HCL解聚最佳反应条件为:物料比2.8,HCl浓度0.06 mol/L,时间16 min,温度36℃,产物B2理论值3.35 mg/mL,实际值为3.314 mg/mL,相对误差1.19%;C/HCL解聚最佳条件为:物料比2.78,HCl浓度0.07 mol/L,时间17 min,温度34℃,产物B1理论值3.64 mg/mL,实际值为3.75 mg/mL,相对误差3.02%。两种实验方法的模型拟合度R2分别为0.981和0.975,P值均小于0.001,表明模型拟合度高,影响显著。
  开发的EC/HCL(C/HCL)解聚法能在温和条件下有效解聚原花青素高聚体。通过优化反应条件,选择性提高目标二聚体含量,是一种简单高效的方法,具有极大的推广潜力。
[硕士论文] 刘晓利
制药工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:血栓性疾病是严重危害人类健康的重大疾病之一,临床上采取抗凝治疗是治疗血栓性疾病的重要措施。阿加曲班是日本三菱化学研究所研制出的一个小分子直接抗凝血酶抑制剂,是精氨酸的衍生物。阿加曲班可直接与凝血酶催化活性位点可逆结合,对凝血酶有较强的选择性抑制作用。阿加曲班在临床上有着广泛的应用,现在主要用于外周动脉闭塞性疾病、肝素诱导的血小板减少症、急性缺血性脑卒中、急性心梗、血液净化、经皮冠状动脉介入术及外科手术的抗凝等。
  本课题以专利EP0008746、US4258192、US4201863、EP0823430为主体对阿加曲班生产工艺进行优化开发,按照《中国药典》2015版要求对其质量标准进行研究,获得了以下成果:(1)根据查到的专利文献,对文献进行重现,并从时间、经济、安全等方面对文献工艺进行优化,最终生产工艺路线以4步完成,并顺利通过小试、中试、放大生产,建立稳定、可控、质量有保证的生产工艺流程。(2)通过对比研究国产药品注册标准及日本16版药典所载标准,建立有关物质、异构体、含量及其他常规项目检测方法,并进行必要的方法学研究。(3)通过影响因素试验、加速试验及长期稳定性试验考察产品在放置过程中哪些因素会随着时间的推移影响产品质量,另外通过长期稳定性试验确定产品的有效期。
[硕士论文] 阳凯
制药工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:抗生素是临床上用于治疗细菌感染的主要药物,本文简述了抗生素的主要分类和作用机制,重点研究了新型抗生素索托霉素的合成。
  索托霉素(Surotomycin)是环脂肽类抗生素,由美国Cubist公司研制,目前已完成两个临床Ⅲ期研究,适应症为艰难梭菌相关性腹泻(CDAD),于2012年12月获得美国FDA的QIDP资格,2013年10月获得美国FDA授予的快速通道地位。
  我们采用新的缩合试剂HBTU,将母核与侧链直接缩合制得产品,替代文献中将侧链做成活化酯再与母核缩合的方法。此方法缩短了工艺步骤,且避免了昂贵脱水剂EDCI的使用,降低了成本。
  在制备BOC-保护的达托霉素、BOC-保护的索托霉素母核的过程中,创新性的运用纳滤技术直接处理料液,代替文献中使用填料吸附、洗涤、洗脱、浓缩的方法,减少了工艺步骤及物料使用。
  另外在文献报道的基础上对整个工艺的可放大性进行了优化,确定了一条低成本、低污染、易操作、适用于工业化生产的工艺。即以达托霉素为原料,先用BOC基团保护裸露的鸟氨酸胺,再经酰化酶脱去正癸酰基后得到BOC-保护的索托霉素母核,然后与经多步反应制得的侧链缩合生成BOC-保护的索托霉素,再酸化脱保护、分离纯化制得纯度98.9%的样品。
  本文中所合成的关键中间体和成品都经过MS、1H-NMR和13C-NMR结构鉴定。
[硕士论文] 王玥
应用化学 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:水凝胶是以水为分散介质、具有三维网络结构的高分子聚合物,性质柔软富有弹性,形态类似于橡胶、果冻。水凝胶最主要的特点是在水中能够保持一定的形状,吸收大量的水却不溶解于水。微观形貌为孔洞的交联结构,因此具有较强的吸附能力。基于其独特的内部结构,在药物缓释材料领域受到了广泛研究者的青睐。
  根据水凝胶网络键合类型的不同,分为物理凝胶和化学凝胶两类。根据水凝胶对外界刺激的响应情况,分为传统型和环境响应型两类。传统型水凝胶对外界环境的刺激无变化,而环境响应型水凝胶根据外界环境(如温度、pH、光、电场、离子强度、光照等)的变化,自身发生溶胀或者收缩行为。基于环境响应型水凝胶显著的溶胀收缩性能,已经广泛应用于传感器、控释开关等领域。目前,除了传统的块状水凝胶,水凝胶微球以及纳米水凝胶等不同形态和尺寸的水凝胶也得到了极大地发展。相对而言,水凝胶微球体积小,方便植入人体达到药物定点释放的效果。而纳米水凝胶的尺寸在于纳米级的结构,容易穿透人体中的各种保护膜,在医学领域具有广泛的应用价值。
  设计和开发无毒、可降解以及具有生物相容性等特点的生物高分子材料是未来材料领域可持续发展的主要思路,而以生物高分子为原料是制备这类高分子材料的重要策略之一。本论文以大豆分离蛋白(SPI)为原料,丙烯酸(AA)为单体,采用不同的聚合方法控制水凝胶的形态,最终制备了块状水凝胶、水凝胶微球以及纳米水凝胶,进一步研究了水凝胶的吸水性和药物缓释性能。
  首先,通过溶液聚合(Solution Polymerization)制备了SPI/PAA复合水凝胶。该水凝胶宏观形态类似于透明的果冻。SEM微观结构显示出良好的三维空间结构,存在大量的孔洞。考察了SPI与AA的质量配比对SPI/PAA复合水凝胶宏观形态的影响,同时也考察了不同因素对其溶胀性能的影响。确定了最佳反应条件,在此条件下水凝胶的溶胀度最高达176g/g。溶胀行为表现出水凝胶的pH响应性。以牛血清白蛋白(BSA)为模拟药物,在pH=7.4、离子强度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中,水凝胶载药量最高达0.5g/g干凝胶,不同水凝胶样品的累积释放率达90%以上。
  其次,通过反相悬浮聚合(Inverse Suspension Polymerization)制备了SPI/PAA复合水凝胶微球。以溶有SPI的氢氧化钠(NaOH)溶液为水相,石油醚为油相,十二烷基硫酸钠(SDS)为乳化剂,span80为助乳化剂,APS为引发剂,BIS为交联剂。水凝胶微球的宏观形态为球形颗粒,控制AA的投入量可以控制直径大小,直径控制在0.8-4mm之间,成功实现了对水凝胶微球宏观形态的控制。SEM微观结构显示明显的球形轮廓以及孔洞结构。以苯扎氯铵为模拟药物,在pH=7.4、离子强度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中,水凝胶微球载药量最高达26.92mg/g,不同样品的累积释放率在60%-70%。
  最后,通过反相乳液聚合(Inverse Emulsion Polymerization)制备了SPI/PAA复合纳米水凝胶。同样以溶有SPI的NaOH溶液为水相,石油醚为油相,SDS为乳化剂,span80为助乳化剂,APS为引发剂,BIS为交联剂。通过原料投加控制,无需添加乳化剂也可制备得到纳米水凝胶。SEM微观结构显示出明显的、分散均匀的球形结构,直径大小在80nm-200nm之间。DLS数据显示纳米水凝胶粒径分布在200-800nm。Zeta电位结果显示纳米水凝胶带正电荷,说明制备的纳米水凝胶的pH值小于大豆分离蛋白的等电点。以苯扎氯铵为模拟药物,在pH=7.4、离子强度为0.01 mol/L的磷酸缓冲液中,纳米水凝胶载药量最高达26mg/g,不同样品的累积释放率在60%-80%。
  本论文采取相同原料、不同聚合方法得到三种新型复合水凝胶。通过聚合方法选择、控制原料配比成功实现了对产物宏观形态的控制,进一步实现了微观结构和尺寸的控制。复合水凝胶表现出较高吸水率,并对蛋白质、小分子药物等具有良好的负载效果,实现了有效地控制释放。为进一步探究这类复合水凝胶在环境领域以及生物医学领域的应用奠定了基础。
[硕士论文] 宗蕊
药剂学 河北北方学院 2018(学位年度)
摘要:聚合物胶束是两亲性嵌段共聚物在水溶液中自发形成的新型纳米递药系统,由疏水性内核以及亲水性外壳组成。内核作为载药容器,能够增溶脂溶性药物;外壳可保护胶束不被体内网状内皮系统识别和摄取,延长药物体内循环时间并保证其稳定。与低分子表面活性剂不同,嵌段共聚物毒性很低且更加安全,可以作为抗癌、抗炎、基因治疗药物的载体。
  本文以槲皮素标准品为原料药,Pluronic P123以及Pluronic F68为辅料,制备载槲皮素Pluronic P123/F68混合胶束,以改善槲皮素水溶性差的缺点,考察该混合胶束的理化性质及体外释放,并研究其在大鼠体内的药物代谢动力学。研究方法及结果如下:
  1.槲皮素Pluronic P123/F68混合胶束的制备
  紫外分光光度法测定药物含量,薄膜分散法制备聚合物胶束。以包封率、载药量为指标,单因素分别考察投药量、P123质量分数、旋转蒸发温度、水浴温度、水相用量对处方的影响。经(L9(34))正交实验优化处方。得到优化后处方为:投药量20 mg,P123质量分数50%,水化温度40℃,水相的用量5 mL。处方验证结果显示,槲皮素混合胶束包封率为(94.25±2.13)%,载药量为(8.61±0.18)%。
  2.槲皮素Pluronic P123/F68混合胶束理化性质以及体外释药评价
  透射电镜观察槲皮素混合胶束的外观;Malvem粒度分析仪测得胶束的粒径、电位;芘荧光探针法测定临界胶束浓度;差势扫描量热法考察胶束物化特性。优化后制备的胶束外观呈球形;粒径为(77.88±1.07)nm,电位为(-17.12±1.29)mV;临界胶束浓度值为0.338 mg·mL-1;差势扫描量热法验证胶束已形成。
  选择4%甘露醇为保护剂通过冷冻干燥技术制备胶束的冻干剂,考察其稳定性。常温保存胶束溶液4天后渗漏率为20.04%,4℃保存冻干制剂1个月后渗漏率为2.67%,初步显示冻干制剂稳定性良好。
  用体外透析法考察胶束释放行为:含1%吐温-80的生理盐水为释放介质,释放温度37℃,转速为100 r·min-1,游离槲皮素溶液为对照。结果表明槲皮素胶束释药行为符合Higuchi动力学,拟合方程为:F=6.735·t0.5(Rsqr_adj=0.9604,AIC=75.5840);游离槲皮素释药行为符合First-order方程,拟合方程为:F=100·[1-Exp(-0.379·t)](Rsqr_adj=0.9555,AIC=46.7969)。混合胶束能够使槲皮素释放缓慢。
  3.槲皮素Pluronic P123/F68混合胶束在大鼠体内药物代谢动力学研究
  本文在已建立的超高效液相色谱法基础之上,以槲皮素溶液(自制)为参照,考察并对比大鼠尾静脉注射槲皮素混合胶束后的体内药物代谢动力学,数据经PK Solver软件处理。大鼠尾静脉注射槲皮素溶液剂以及混合胶束的体内过程均符合二室模型,槲皮素混合胶束与溶液剂的消除半衰期为34.88 min与30.47 min,清除率为0.026 mLmin-1与0.037 mL·min-1,因此槲皮素胶束能够减少药物在体内的消除。统计矩结果显示,槲皮素混合胶束与溶液剂的药时曲线下面积AUC0-inf为289.52μg·mL-1·min与192.86μg·mL-1·min,平均滞留时间MRT为27.06min与11.22 min。两种制剂多数药代动力学参数均有统计学显著性(P<0.05)甚至极显著性(P<0.01)差异。
  经研究证实,Pluronic P123/F68混合胶束能够提高槲皮素水溶性,使药物释放缓慢;通过静脉注射能够降低槲皮素体内药物清除率,延长了消除半衰期,增加了药-时曲线下面积。因此,该剂型拥有良好的应用前景。
[硕士论文] 杨元国
兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:替米考星是一种半合成大环内酯类畜禽专用抗生素,结构与抗菌效果同其他大环内酯类药物相似,所有的革兰阳性菌、部分革兰阴性菌、支原体、螺旋体对其敏感。主要用于治疗牛、羊、鸡、猪等动物由敏感菌感染引起的感染性疾病。替米考星难溶于水,临床上主要使用其磷酸盐磷酸替米考星。磷酸替米考星的作用机理与抗菌效果与替米考星相似。
  温敏原位凝胶注射剂,是指高分子材料以溶液状态注射给药后,在用药部位对温度刺激产生响应,发生分散状态或构象的可逆转化,形成半固体状的药物储库。温敏原位凝胶注射剂已成为一种新型药物传递系统,可以延长药物的作用时间,在药剂学与生物技术领域得到了大量的研究。
  本研究通过冷溶法制备出磷酸替米考星温敏原位凝胶注射剂。结果显示,P407和P188对胶凝温度影响明显,亚硫酸钠、依地酸二钠对胶凝温度的影响不明显;磷酸替米考星会使原位凝胶的胶凝温度升高;配比为23%P407+6%P188+0.2%亚硫酸钠+0.01%依地酸二钠+10%磷酸替米考星(以替米考星计)的胶凝温度为36.8℃。
  为考察磷酸替米考星温敏原位凝胶的特性,建立了紫外分光光度法测定替米考星的含量的分析方法。结果显示:替米考星浓度在12~28μg/mL浓度时,替米考星吸光度与浓度线性关系良好,标准曲线方程为:A=0.0209C-0.0071,R2=0.9998,该方法精密度高、重复性和回收率好。
  考察了体内外胶凝特性和体外释放特性。结果显示:体内外胶凝效果明显,在37.5℃条件下和注射进体内,均能在1min内快速发生胶凝现象;体外释放时间延长至约2倍,在2h时,磷酸替米考星溶液累计释放率为55.3%,凝胶仅为31.2%;5h时,溶液累计释放率为91.1%,凝胶仅为53.4%。
  利用家兔考察了肌肉刺激性,采用改良寇氏法研究了磷酸替米考星温敏原位凝胶注射剂的急性毒性。结果显示:磷酸替米考星温敏原位凝胶注射剂对肌肉的刺激在1级至2级之间,刺激较小,可用于肌肉注射;对小鼠腹腔注射LD50=302.691mg/kg,95%可信限为269.421mg/kg~340.095mg/kg,急性毒性较小。
  本实验制备的磷酸替米考星温敏原位凝胶注射剂相较于磷酸替米考星水溶液体外释放时间延长,急性毒性较小,因此具有很好的发展前景和临床运用价值。
[硕士论文] 濮慧敏
食品科学与工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:通过接枝共聚反应将酚酸类化合物接枝到壳聚糖分子上,合成壳聚糖-酚酸接枝共聚物,对于改善壳聚糖的理化特性与生物活性具有重要的意义。在常用的壳聚糖-酚酸接枝共聚物的合成方法中,由抗坏血酸(AA)和过氧化氢(H2O2)氧化还原对诱导的接枝共聚法具有操作简便、成本低的优点,然而其确切的接枝机理尚不清楚;同时,壳聚糖-酚酸接枝共聚物的抗氧化活性评价通常采用体外试验,其体内抗氧化作用尚不明确。因此,本论文旨在揭示AA/H2O2氧化还原对引发的壳聚糖-酚酸接枝共聚物的合成机理与抗氧化活性。
  (1)采用电子顺磁共振技术分别对Fe2+/H2O2和AA/H2O2两种氧化还原体系中产生的自由基进行定性和定量分析;随后,研究两种氧化还原体系中产生的自由基与壳聚糖的反应机理。结果表明,Fe2+/H2O2氧化还原体系中仅产生羟基自由基(·OH),其最佳反应条件是:Fe2+浓度0.5mmol/L,H2O2浓度1.5mmol/L,溶液pH值5.0,反应时间5min。而AA/H2O2氧化还原体系中仅产生抗坏血酸自由基(Asc·-),而并不能产生·OH,其最佳反应条件是:AA浓度0.15mol/L,H2O2浓度0.075mol/L,溶液pH值6.0,反应时间5min。壳聚糖与·OH反应后未产生新的自由基,而壳聚糖与Asc·-反应后形成了新的碳自由基。此外,Asc·-对壳聚糖分子具有脱氨基作用,且在反应过程中形成大量的不饱和键,使得壳聚糖原有的空间结构和结晶性消失,热稳定性降低。相比之下,·OH主要断裂1,4-β-D-糖苷键,因而经·OH降解的壳聚糖在结构、结晶性和热稳定性方面均与壳聚糖类似。
  (2)利用AA/H2O2和Fe2+/H2O2氧化还原体系的最佳自由基产生条件,合成两种壳聚糖-咖啡酸接枝共聚物(分别命名为CA-g-CSⅠ和CA-g-CSⅡ),研究自由基介导的CA-g-CS的合成机理。结果显示,CA-g-CSⅠ的接枝量为68.5mg/g,而CA-g-CSⅡ的接枝量几乎为零。CA-g-CSⅠ的平均分子质量大于壳聚糖,在290nm和320nm处有两个紫外吸收峰,在1537cm-1处新出现的红外吸收峰(对应于咖啡酸C=C的伸缩振动),在核磁共振氢谱的6.3-7.6ppm范围内出现咖啡酸次甲基质子信号,均证明咖啡酸已成功通过Asc·-接枝到壳聚糖分子上;同时,CA-g-CSⅠ的热稳定性和结晶度均低于壳聚糖;表面相对光滑,呈片层状或棒状。相比之下,CA-g-CSⅡ的平均分子质量小于壳聚糖,热稳定性略高于壳聚糖,而结晶性稍低于壳聚糖,其仍维持着壳聚糖的空间立体结构,并在颗粒内部形成大量空穴。上述结果表明,咖啡酸能通过Asc·-接枝到壳聚糖分子,但不能通过·OH接枝到壳聚糖上。
  (3)对壳聚糖-咖啡酸接枝共聚物的体外抗氧化及体内护肝活性进行研究。体外抗氧化实验的结果表明,CA-g-CS有较好的体外抗氧化能力,且显著高于壳聚糖,说明将咖啡酸接枝到壳聚糖上能提高壳聚糖的抗氧化活性。体内实验的结果进一步表明,相比与四氯化碳模型组,CA-g-CS处理能显著降低血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶水平,增强肝细胞内抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶)活性,并提高肝细胞内非酶类抗氧化物(谷胱甘肽)水平和总抗氧化能力,从而发挥护肝活性。值得注意的是,CA-g-CS的护肝活性远高于壳聚糖,与阳性对照水飞蓟素接近。
[硕士论文] 邱辉
兽医 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:转移因子是一类无毒、无种属特异性的小分子复合物,增强免疫效果确实,是天然、安全的免疫增强药物,常用于免疫抑制性疾病的防治。壳聚糖为一种天然高分子材料,生物降解性好,可形成水凝胶较好地包裹小分子药物,达到缓释效果。本研究针对转移因子注射液、口服液等传统剂型作用时间短、给药次数多等缺陷,构建转移因子的壳聚糖新型缓释凝胶注射剂,以达到长效增免的目的。
  转移因子的主要成分是多肽和核糖,通过福林酚法和二羟基甲苯显示法建立标准曲线,对多肽和核糖含量进行定量。采用透析法提取猪脾脏转移因子,通过单因素试验和正交试验考察了冻融次数、匀浆pH、透析时间和透析比例等对转移因子多肽和核糖提取效率的影响,获得了转移因子的最佳提取工艺,以用于转移因子凝胶注射液的研究。
  以壳聚糖作为凝胶材料,优化壳聚糖-甘油-硼砂温敏凝胶的制备工艺,筛选出转移因子凝胶注射剂的最佳处方,并对其胶凝时间、黏度、稳定性、缓释特性等质量指标进行考察。结果采用2%壳聚糖,按照32∶10的比例添加甘油,用7.5%硼砂溶液调至pH6.7得到的转移因子凝胶注射剂质量较好,其胶凝温度36℃,胶凝时间20min,黏度195mPa·S,无菌检查合格,稳定性良好,体外累积释药95%长达12h。异常毒性研究表明,转移因子凝胶注射液对正常小鼠没有异常毒性,能提高主要免疫器官胸腺和脾脏的脏器指数。通过腹腔巨噬细胞吞噬实验可知,转移因子凝胶能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,效果优于转移因子溶液。
  转移因子凝胶注射剂制备方法简单,质量可控,天然安全,具有良好的稳定性,可以实现对转移因子的缓慢释放从而达到长效目的,具有较好的兽医应用前景。
[硕士论文] 凡国庆
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:氟苯尼考(FF)是一种新型的动物专用的酰胺醇类广谱抗生素。常温下,FF在水中的溶解度很低,这大大限制了它的广泛应用。环糊精包合技术是一项用于提高难溶性药物溶解度的技术,在药剂学中已得到广泛使用。为了改善FF的溶解性能,本实验通过溶液搅拌法结合冷冻干燥法制备了氟苯尼考/羟丙基-β-环糊精(FF/HPCD)包合物冻干粉针剂,并对其进行了表征和质量评价。以10%FF注射液为参比,研究了该制剂在比格犬体内的药代动力学特性。实验结果如下:
  1采用溶液搅拌法制备了FF/HPCD包合物,以载药量和包封率为考察指标,通过单因素筛选对主客体投料比、有机溶剂种类和用量、环糊精浓度、反应体系pH、包合温度、搅拌速率以及包合时间等指标进行考察,结合正交试验对FF/HPCD包合物的处方和包合工艺进行了优化,得到最优制备条件为:HPCD与FF摩尔比为2∶1,甲醇浓度为50%,HPCD质量浓度为20%,反应体系pH为5.0,搅拌温度30℃,搅拌速率为100r/min,搅拌时间为2h。采用冷冻干燥法对包合物进行干燥,通过单因素试验对冻干过程的主要因素进行优化,得到最终冻干工艺为:预冻过程为-30℃预冻4h,冻干程序为-50℃冷冻干燥16h,30℃升华干燥4h。通过以上工艺条件成功制备出了FF/HPCD包合物冻干粉针剂。
  2通过相溶解度法、扫描电镜、差示扫描量热、X射线粉末衍射、红外光谱扫描、核磁共振氢谱等技术对FF、HPCD、二者物理混合物以及FF/HPCD包合物冻干粉进行了表征。扫描电镜、差示扫描量热、X射线衍射和红外光谱的对比结果表明FF被包嵌入HPCD的内腔,且形成的包合物以无定型状态存在;相溶解度和核磁共振氢谱结果则表明二者以1∶1包合比反应,且FF主要从宽口端被包嵌入HPCD的分子内腔。
  3通过外观、澄明度、含量、pH值、溶解度、热原、溶血性、注射刺激性等指标对FF/HPCD包合物冻干粉针剂进行了质量评价,并通过影响因素试验对其进行了稳定性考察。所制备的FF/HPCD包合物冻干粉针剂外观检查为白色疏松、光滑平整的粉末状固体;冻干粉复溶后澄明度符合要求;药物含量为11.78%±0.04%;pH值检查结果为6.92±0.03;在水中37℃的饱和溶解度为78.93±0.42mg/mL,比FF原药的2.23±0.04mg/mL提高了约35.4倍;热原检查符合测定结果;溶血率<5%,可作为注射使用;与10%FF注射液相比,FF/HPCD包合物冻干粉针剂具有更小的肌肉注射刺激性。影响因素试验结果表明,FF/HPCD包合物冻干粉耐高温和强光环境,但具有很强的吸湿性,需在干燥条件下保存。
  4比较了10%FF注射液及FF/HPCD包合物冻干粉针剂在比格犬体内的药动学行为。用DAS2.0系统拟合给药后不同时间点的血药浓度,结果表明两种制剂的药动学数据符合一级吸收动力学二室模型,10%FF注射液在比格犬体内的主要药代动力学参数分别为:Cmax为11.559±1.544mg/L,Tmax为0.583±0.129h,V1/F为1.107±0.208L/kg,CL/F为0.871±0.140L/h/kg,AUC(0-t)为21.638±2.379mg/L*h,AUC(0-∞)为23.652±2.391mg/L*h;相应地,给予相同剂量FF的包合物组主要药代动力学参数分别为Cmax为15.896±3.147mg/L,Tmax为0.444±0.086h,V1/F为0.719±0.171L/kg,CL/F为0.808±0.082L/h/kg,AUC(0-t)为22.134±2.882mg/L*h,AUC(0-∞)为24.543±2.841mg/L*h。与普通注射液相比,包合物组的FF吸收速率较快,达峰时间(Tmax)显著减小(P<0.05),达峰浓度(Cmax)显著增大(P<0.05),药时曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(m-∞))没有显著性差异,两种制剂相对生物利用度为102.3%。上述结果表明,FF/HPCD包合物冻干粉针剂可以作为FF的一种有效注射制剂,具有广泛的应用前景。
  本实验采用溶液搅拌结合冷冻干燥法成功制备了FF/HPCD包合物冻干粉针剂,并对其进行了各项表征和质量评价。该制剂显著增加了FF在水中的溶解度,与FF注射液相比极大地减小了肌肉注射刺激性,明显改善了FF在比格犬体内的药代动力学特性。
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