绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 4941 条结果
[博士论文] 崔红凯
影像医学与核医学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景和目的:
  脑动脉瘤是临床上最常见的脑血管病之一,发病率位居第三位。目前,颅内动脉瘤的研究方向是血管重建术,以真正达到动脉瘤的解剖治愈,Pipeline低网隙支架和Willis覆膜支架是基于血管重建技术所取得的重大临床成果。但由于是金属支架,需要永久且易致管腔再狭窄,这已成为血管内治疗领域函待解决的世界性难题和限制支架植入术继续发展的“瓶颈”。可降解支架被认为是血管内治疗领域继球囊扩张血管成形、金属裸支架、药物洗脱支架后的第4次革新,镁合金支架是目前可降解支架的研发热点。可降解镁合金支架植入后可为血管重塑提供支撑作用,之后自行逐渐降解,对血管无长期刺激作用,患者也无需终身服用抗血小板药物,是理想的血管内支架,未来可能取代传统的金属支架。鉴于此,本研究将分为三个部分对镁合金支架进行研究:
  第一部分 兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进
  目的:
  对兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型进行改进,以评价其模型的成功率及术后颈总动脉的通畅率。
  方法:
  40只新西兰大白兔随机分为两组:左颈总动脉结扎组(A组,n=20)与不结扎组(B组,n=20)。初次与一月后颈部3.0T MRA检查时测量兔子体重、右颈总动脉及双侧椎动脉中段直径。采用间断式外翻缝合法用6-0显微缝线将静脉囊与颈总动脉吻合,建立侧壁型动脉瘤,血管造影检查在2周后进行。
  结果:
  A组中20只新西兰大白兔皆顺畅行左侧CCA结扎。17只兔右CCA一月后查MRA示增粗,而双侧椎动脉未见明显增粗;B组在一月后MRA检查示右侧颈总动脉及双侧椎动脉均略增粗。A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在初次MRA检查时与B组比较均无显著统计学差异(P>0.05),但A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在1月后的MRA检查时均大于B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。建立兔颈部囊状动脉瘤模型35只(A组17只,B组18只),术后均健康成活。术后2周血管造影示A组所有囊状动脉瘤均清晰显示,右颈总动脉畅通。4个动脉瘤腔内有少许血栓形成。B组有14只显示囊状侧壁动脉瘤,4只发生了自发性右颈总动脉彻底闭塞,10只有明显的血栓形成,且其中5只伴有动脉瘤远端的颈总动脉变细。A组中动脉瘤模型的成功率大于B组(P<0.05),且A组中动脉瘤中血栓的发生率及自发性右颈总动脉闭塞率均明显低于B组,也具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进能明显提高动脉瘤模型的成功率并降低自发性颈总动脉的闭塞率及动脉瘤内血栓的形成。
  第二部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的可行性和可降解性研究
  目的:
  活体评价可降解镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型的可行性和可降解性能。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至术后12月。可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁动脉瘤模型的可行性和长期疗效通过血管造影随访来观察;活体可降解镁合金覆膜支架的可降解性能通过MRA和钼靶来研究。右颈总动脉支架植入处血管直径通过放置的标尺或在Photoshop8.0上测量。支架植入处的右颈总动脉分为近段、中部和远段,各段直径由三人分别独立测量,最终取三人的平均值。
  结果:
  所有的支架均放植成功,没有与手术相关的并发症发生。随访结果显示所有的颈总动脉侧壁动脉瘤均完全闭塞,无内瘘产生。A组可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显大于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。B组Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显小于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。另外,A组支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访时比较均大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。
  磁共振下镁合金支架植入处的血管形态在支架植入后1天呈信号缺失,就像严重的血管狭窄,在支架植入后5-6周,随着镁合金支架表面的镍降解,血管的形态基本上恢复正常。在钼靶下镁合金支架随着时间的延长而逐渐降解。镁合金支架的形态结构从完整清晰到逐渐断裂、解体,最后变得模糊不清。而Willis支架始终保持植入时的原有形态。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁型动脉瘤模型是可行性的。可降解镁合金覆膜支架放置处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时增大,说明可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后不影响植入处血管的生长;而Willis覆膜支架恰恰相反,Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时变细,且时间越长植入处的血管直径越细。另外,在钼靶下是可以活体观察镁合金支架降解的。
  第三部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的血管内超声研究
  目的:
  利用血管内超声(Intravascular Ultrasound,IVUS)评价可降解解镁合覆膜支架植入后植入段血管及管腔的变化和血管重构情况。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至覆膜支架植入后12月。在可降解镁合金和Willis覆膜支架植入后即刻、6和12个月行血管内超声检查。用血管内超声来定量分析支架植入处的平均血管面积、支架面积、血管管腔面积,并计算血管管腔狭窄率。重构指数等于支架植入处的血管面积与近远端参考血管面积的平均值之比。
  结果:
  所有的兔子完成了即刻、6和12个月随访时的血管内超声检查。与即刻支架植入相比较,A组可降解镁合金覆膜支架植入处的平均血管面积、平均支架面积与平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性意义(P<0.05)。尽管,B组Willis覆膜支架植入处的颈总动脉平均血管面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性(P<0.05),但B组支架植入处的平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时与即刻支架植入时比较明显缩小,差异具有显著性意义(P<0.05)。另外,尽管A组的血管管腔面积在即刻植入时小于B组(P<0.05),但在6个月和12个月随访血管内超声上,A组支架植入段的血管管腔面积要明显大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。血管内超声显示A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为无重构,重构指数intermediate remodeling(IR)为1.024±0.018(范围:1.01-1.05,95%可信区间:0.994-1.053);而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为负重构,重构指数0.62±0.083(范围:0.58-0.74,95%可信区间:0.487-0.752)。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后植入处的血管管腔可以随着血管生长而生长;而Willis覆膜支架植入处的血管管腔由于支架的束缚而随着时间的延长而逐渐变小。A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为无重构,而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为负重构。
[博士论文] 张纬
病理与病理生理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分应用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型
  研究背景:
  补体系统是免疫系统中重要的组成部分,它包含了30多种可溶性蛋白和膜蛋白,其活化过程为一系列的级联酶解反应。补体系统参与机体的特异性和非特异性免疫机制,主要生理作用为:溶解细胞、细菌和病毒的细胞毒作用;调理作用;引起炎症反应;清除免疫复合物和凋亡细胞。它主要包含了三条途径:经典途径、旁路激活途径和甘露糖结合凝集素途径。补体蛋白C3是三条途径的交汇点,它主要由肝脏细胞合成,除此之外,还由巨噬细胞、树突细胞、白细胞、近端肾小管上皮细胞、成纤维细胞、子宫上皮细胞、肺细胞和激活的T细胞等合成,表明C3在机体中发挥着重要的作用。据文献报道,C3与很多疾病相关,如肾小球疾病、溶血性尿毒综合症、胃癌以及风湿性关节炎等。目前为止,C3基因缺失的小鼠、豚鼠等啮齿类动物模型已有报道,但是这些动物模型由于它们的生理学和表观遗传学与人类有很大差异而受限制,大动物C3基因缺失模型却没有报道过。而猪在解剖结构及生理、免疫特性上与人类比较相近,且用猪作为动物模型不存在伦理上的障碍。
  最近,CRISPR/Cas9基因编辑技术大大提高了基因编辑效率,并且广泛应用于小鼠、兔子、山羊和猪等动物身上。在本实验中,我们运用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术构建C3基因敲除猪模型。
  研究目的:
  构建C3基因敲除、补体缺失的免疫缺陷猪模型。
  研究方法:
  1.从基因库里找到猪的C3基因,根据CRISPR/Cas9的构建原则,在第26个外显子上设计两个CRISPR/Cas9打靶位点,然后进行质粒构建。选择一个效率高的质粒进行核转染,筛选单克隆细胞,并进行测序鉴定。
  2.用双等位基因敲除的C3单克隆细胞作为体细胞核移植的供体,以去核的卵母细胞作为受体,借助体细胞核移植的方法获得重构囊胚,在体外培养至桑椹胚期移植到同期发情的代孕母猪子宫内,最终获得C3基因敲除小猪。
  3.将获得的新生克隆小猪的耳部组织提取基因组进行靶点位置PCR扩增,然后用PCR产物连接T载体送测序的方式进行基因型鉴定;采用Western Blot、ELISA和免疫组织化学的方法检测C3蛋白表达情况;用脂质体免疫测定法检测血清中补体活性(CH50);用补体依赖性的毒性试验方法检测C3敲除小猪血清对人293T细胞的杀伤力。
  实验结果:
  1.根据猪的C3基因序列,设计并构建2个CRISPR/Cas9打靶质粒,然后进行转染猪原代成纤维细胞,最终得到C3双等位基因敲除的细胞系。借助体细胞核移植技术,进行两批克隆实验。第一批共移植受体猪6头,怀孕1头且自然生产6头新生小猪。第二批移植受体猪共3头,其中怀孕2头,一头自然生产10头新生猪仔,取耳部组织培养原代成纤维细胞;另外一头自然分娩出3头新生猪仔,两批克隆总共生产了19头克隆小猪。
  2.两批克隆出生的小猪基因型鉴定结果均为C3基因靶点位置双等位基因敲突变,且都与相应的供体细胞基因型相对应;Western Blot和ELISA试验结果显示,克隆小猪的血清中几乎没有C3蛋白的表达;免疫组织化学的试验结果显示,C3敲除小猪的肝脏、脾脏、肾脏和肺组织等均没有C3蛋白的表达;通过检测血清中CH50的值,结果显示克隆小猪体内没有检测出补体活性;补体依赖性细胞毒性试验结果表明,C3敲除小猪的血清对人293T细胞没有杀伤作用,相反,野生型小猪血清对人的293T细胞有很大的杀伤作用。
  结论:
  利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,结合体细胞核移植(SCNT)技术可以成功获得健康的C3双等位基因敲除、补体系统缺失的免疫缺陷猪模型。我们是世界首例C3基因敲除猪模型。我们的结果不仅再次证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效构建猪的基因缺陷模型,而且还为进一步研究补体系统在人机体的作用打下了基础。
  第二部分稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
  研究背景:
  人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是具有自我更新和多向分化潜能的多能性干细胞,它可在体外诱导分化形成多种细胞和组织。1998年,人胚胎干细胞的建立、研究和应用是干细胞研究领域的一项革命性进展。遗传修饰揭示了hESCs重要的生物学特性,对hESCs自我复制、定向分化、体内动态追踪具有重要的作用。但由于hESCs培养困难,缺乏有效的转染方法,外源基因表达困难等,制约了hESCs的遗传修饰研究。
  Nucleo fector技术直接将DNA转染到细胞核内,大大提高了转染效率。早在2005年,有人利用该技术转染hESCs效率高达20%-65%。转染细胞时因启动子的敏感性,转染后药物筛选过程中易使基因沉默,Jennifer等使用EF1a启动子驱动胚胎干细胞表达红色荧光蛋白,成功获得了能够稳定表达红色荧光蛋白连续传10代的胚胎干细胞。
  胚胎干细胞被分为原始态多能性(na(i)ve)和始发态多能性(primed),来源于小鼠内细胞团(inner cell mass,ICM)的干细胞被认为是na(i)ve状态,来源于上胚层的干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)被认为是primed状态。研究发现,人胚胎干细胞与上胚层干细胞比较相似,因此也被认为是primed状态。始发态多能性是一种更易进行分化的状态,它不具有发育的全能性。胚胎干细胞的研究可以使人们更好的理解胚胎发育过程及其分子机制,更重要的是胚胎干细胞的临床应用将成为器官再生、基因治疗等的有效工具。
  基于以上的研究,我们利用核转染技术将带有pEF1alpha启动子的红色荧光蛋白质粒转染进入胚胎干细胞内以获得稳定表达的细胞系。并对该细胞系进行多能性功能的分析,为再生医学和疾病模型提供重要的材料。
  研究目的:
  建立稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系,并对该细胞系进行诱导分化的研究。
  研究方法:
  1.用核转染的方法将红色荧光表达质粒pEF1α-DsRed-Express2转染进入胚胎干细胞内,并用G418药物筛选单克隆;
  2.用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和RT-PCR方法检测转染红色荧光蛋白的胚胎干细胞(RFP-hESCs)多能性基因的表达;
  3.在体外对RFP-hESCs进行诱导分化鉴定其分化潜能;
  4.Primed状态的RFP-hESCs向Na(i)ve状态逆转诱导。
  实验结果:
  1.成功获得了稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系;并且经过鉴定RFP-hESCs仍然具有干细胞的特性,并且Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达与hESCs为出现明显差异;
  2.将RFP-hESCs诱导分化生成类胚体,并且有三胚层特异性基因的表达;进一步诱导分化生成定型内胚层细胞,qRT-PCR结果显示,定型内胚层细胞特异性基因有表达,干细胞特异性因子几乎不表达;
  3.得到Na(i)ve-like的细胞,但是该细胞不能继续传代。
  结论:
  成功建立稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系,并且没有影响该细胞系的干细胞特性,能够继续诱导分化生成其他类型的细胞,可用于后续实验的研究。
[硕士论文] 邓兰
内科学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究紫外线照射对成人原代肝细胞活率及膜电位的影响,通过混合淋巴细胞-肝细胞培养,探讨紫外线照射降低成人原代肝细胞的免疫原性的可行性及稳定性。
  方法:收集我院肝胆外科切除肝组织手术标本,诊断为肝脏良性病变(肝血管瘤、肝内胆管结石等),采用灌注法获得肝细胞;将实验肝细胞分为5个组,1个对照组(0 J/m2)及4个不同照射强度组(分别为200、350、550和750J/m2)。紫外灯功率固定,照射强度由照射时间调控,5组照射强度所对应的照射时间分别为0、2、4、6和8分钟。各组分别于处理后培养的第1、3、5天进行相关检测:台盼蓝拒染法和CCK-8法检测细胞活率;荧光显微镜和多功能酶标仪检测细胞膜电位变化;通过混合淋巴细胞-肝细胞培养(MLHC)检测受体T细胞增值情况;收集实验组和处理组的培养上清液,离心后全自动生化分析仪检测白蛋白、LDH的分泌量。
  结果:⑴改良的两步胶原酶灌注获得的肝细胞透亮,呈圆形或球形,胞质均匀,肝细胞总数可达109个以上,活率大于90%。⑵UVB照射新鲜分离的肝细胞,在照射强度相同的条件下,随着照射后培养时间的延长,成人原代肝细胞活率呈现下降趋势。照射后第1天活率最好,随着培养时间的延长,活率下降,到第五天,活率下降1/2;在照射后培养时间相同的情况下,随着照射强度的增加,肝细胞活率呈先上升后降低。照射2min后的肝细胞活率最高,较未照射组高,但差异不明显,活率明显高于4min、6min组,是照射8min组的2倍。⑶不同的UVB照射强度和UVB照射后不同培养时间之间,成人原代肝细胞的膜电位均有明显差异。UVB照射2min组的膜电位在照射后的各个时间点均比UVB照射肝细胞0min、4min、6min、8min组的膜电位高。⑷肝细胞在接受不同强度紫外线照射后,与淋巴细胞混合培养,照射后的肝细胞免疫原性下降,表现为共培养的淋巴细胞增值能力下降。2min组与对照组无明显区别,但明显低于4min、6min、8min组。⑸检测不同照射强度、培养时间的白蛋白、LDH分泌量,接受2min紫外线照射的肝细胞分泌功能最好,随着照射强度的增大和培养时间的延长,肝细胞合成和分泌功能下降。
  结论:混合淋巴细胞-肝细胞培养可以用来检测受体淋巴细胞对供体肝细胞反应的指标,照射2min时共培养的T细胞增值能力最低,提示此时肝细胞的免疫原性最小。
[硕士论文] 刘博
内科学(消化系病) 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:乙型肝炎病毒(hepatitisB virus,HBV)感染是影响人类健康的重要问题,据WHO报道,全球约20亿人曾感染HBV,其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为乙肝的高流行区,2006年全国乙型肝炎流行病学调查显示我国一般人群HBsAg携带率为7.18%,乙肝病毒携带者约有9000万人。慢性HBV感染可伴有肝纤维化发生,进而可发展为肝硬化、肝癌。目前尚没有特异的药物可以根治乙肝,动物模型对于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制的相关机制以及该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化,药物疗效评价等有重要意义。肝纤维化的动物模型主要有化学法、胆总管结扎、免疫法、尾静脉注射转基因质粒等,但这些模型无法模拟HBV感染的自然史。HBV具有严格的宿主特异性,故目前尚缺乏合适的HBV动物模型。AAV8作为一种嗜肝性病毒,其本身不具有致病性,可作为病毒载体携带HBV进入大鼠肝脏,本研究通过对大鼠注射rAAV8-1.3HBV,观察HBV在大鼠体内的复制以及引起的肝脏病变,旨在探索建立一种新型HBV感染动物模型,为进一步研究HBV复制、致病机制、肝纤维化进展等提供可能。
  方法:本研究分别对0日龄乳鼠于0、2、4周腹腔注射rAAV8-1.3HBV以及对6周龄成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV建模。注射rAAV8-1.3HBV后于多个时间节点进行尾静脉采血100~200ul,分离血清,检测大鼠血清中HBsAg、HBeAg、ALT及HBVDNA。12周末处死大鼠,取肝脏。做病理切片,行HE染色及Masson染色,免疫组化检测HBsAg、HBcAg、TGF-β1、α-SMA表达情况,评估肝脏损伤及纤维化情况。
  结果:乳鼠腹腔注射rAAV8-1.3HBV2周后血中HBsAg和HBeAg均为强阳性,感染率100%,除1只大鼠偏低外,HBsAg平均2686.31±804.39 IU/ml,HBeAg平均63.60±31.60 NCU/ml,4周时HBsAg和HBeAg较前呈下降趋势,8周和12周时仍有部分大鼠HBsAg和HBeAg保持阳性。对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。4周时实验组血中HBVDNA为1.39×105~1.06×107 IU/ml,随时间延长,至12周时血中仍可检测到较高拷贝的HBVDNA,表现为4.79×102~3.31×105IU/ml。肝脏中HBVDNA高于血清中HBVDNA。成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV后3天血中即可检测出HBsAg阳性,1周时HBsAg较前明显上升,2周后开始下降,至12周基本变为阴性。HBeAg结果与HBsAg表现不同,在注射后3天,rAAV8-1.3HBV组大鼠血中均未检测到HBeAg,第2周时,HBeAg均为阳性,并保持稳定至12周。
  对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。注射rAAV8-1.3HBV8h后,血中可检测到极高拷贝数的HBVDNA,数值在3.47×1010~4.5×1010 IU/ml之间,24h时血中HBVDNA仍维持在1010数量级,从3天开始血中HBVDNA较前下降,但此时血中HBVDNA仍可保持很高的拷贝数,4周时血中HBVDNA为2.20×103~1.12×105 IU/ml,之后维持稳定至12周时。病理可见肝脏充血,部分肝细胞水肿,体积变大,排列紊乱,肝窦受压变窄,可见嗜酸性变及散在点状坏死,汇管区略增厚,可见淋巴细胞浸润。免疫组化可见HBsAg、HBcAg阳性肝细胞,α-SMA、TGF-β1明显阳性,提示肝星状细胞活化,纤维化发生。
  结论:通过注射rAAV8-1.3HBV,HBV可在大鼠肝脏中持续复制并表达,并可引起肝脏损伤及纤维化的发生,该模型有助于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制以及研究该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化的相关机制。
[硕士论文] 刘伟
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:在对胸腺的功能研究中,一直把胸腺当作一个免疫“特赦”器官看待,抗原和大分子不能进入胸腺从而避免了胸腺内发生免疫反应。根据中枢耐受理论,如果在胸腺内植入外界抗原,那么该抗原将会被发育中的T细胞识别并对阳性选择和阴性选择产生影响进而形成耐受。根据我们先前的研究发现,当把肿瘤细胞注射到胸腺后,并没有诱导形成肿瘤细胞的耐受,肿瘤细胞最终会被清除。并且流式分析显示,在注射人肺癌细胞A549后,胸腺内CD4+、CD8+T细胞的数量增加。那么这些增多的淋巴细胞会不会是来自于外周呢?在给免疫缺陷小鼠移植T细胞的实验中发现,异体的成熟T细胞可以进入胸腺,但正常小鼠的外周成熟T细胞是否也具有这种现象还不确定。
  因此针对以上问题,我们选用正常小鼠作为实验对象,首先在其脾脏中注射CFDA SE荧光染料,通过流式检测胸腺内是否含有表达CFDA SE荧光信号的细胞,检测外周T细胞能迁回胸腺;其次我们在外周免疫过人肺癌细胞A549抗原的小鼠和未免疫小鼠的胸腺中分别注射等量的A549细胞,通过石蜡切片和流式细胞术分析对比胸腺内发生的免疫反应、抗原细胞在胸腺内的状态以及T细胞亚群含量的变化,并对发生于胸腺的应答反应做进一步探究。
  通过以上实验,我们得到以下结果:
  1.胸腺内可以检测到CFDA SE阳性细胞,并且这些细胞绝大多数呈CD3阳性;
  2.石蜡切片结果显示,免疫小鼠的胸腺内发生的免疫反应较未免疫小鼠更加剧烈,胸腺在相对较短的时间内即可恢复正常;
  3.流式分析结果显示,与未免疫小鼠相比,A549细胞在免疫小鼠胸腺内的存活时间缩短;
  4.胸腺微创注射后第5天,外周免疫小鼠和未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠相比,胸腺中CD4+和CD8+T细胞的数量都明显增加,但免疫小鼠的胸腺中CD8+/CD4+的比值较未免疫小鼠显著升高,而未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠之间无明显差异。
  通过以上结果,我们得出以下结论:
  1.正常小鼠的胸腺内存在来自外周的T细胞。这种回迁现象不仅发生于免疫缺陷小鼠,也发生于正常小鼠。
  2.用抗原外周免疫后,当胸腺内再次出现相同抗原时,胸腺内会发生更加及时、剧烈的免疫反应。
  根据以上结论,我们推测外周免疫后一部分记忆T细胞进入胸腺,当再次遇到相应抗原时,记忆T细胞迅速增殖并对抗原产生记忆性杀伤。外周成熟T细胞回归胸腺可能是机体保护胸腺免于抗原感染的一种正常机制,防止机体形成对外来抗原的耐受。
[硕士论文] 刘超
重症医学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景:随着人口老龄化日趋严重,老年人群中脓毒症患者在逐年增加,发病率及死亡率也随着年龄的升高显著上升。尽管做了大量的临床试验和基础研究,但目前仍没有有效治疗老年严重脓毒症患者的方法。临床与基础研究的分歧主要在于用于基础研究的试验动物过于年轻不能真实反映老年脓毒症患者的特点。近年来,利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)制备的亚急性衰老模型已应用于多种老年性疾病的研究当中并且取得了良好的效果,但关于其相关的老年脓毒症模型研究较少。因此,利用D-gal诱导的衰老大鼠建立脓毒症模型将为老年脓毒症的基础与临床研究提供新的思路。
  目的:1、观察D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型死亡率、炎症细胞因子、器官功能及生命体征的变化;2、探讨在老年脓毒症研究中的应用价值。
  方法:本研究由两部分组成。第一部分采用D-gal皮下注射的方法建立大鼠衰老模型,将12周雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为低剂量(low-dose)诱导组(LD-galgroup,诱导剂量125mg/kg/d)、高剂量(high-dose)诱导组(H D-galgroup,诱导剂量500mg/kg/d)和对照组(controlgroup,皮下注射同等剂量0.9%NaCl),6周后测量血清丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量并观察肾功能及生命体征变化。第二部分采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法在已建立的大鼠衰老模型的基础上建立脓毒症模型。实验分组同前,观察各组间CLP术后12h及24h死亡率、炎症因子、肾功能、MicroRNA-155及生命体征的变化。
  结果:1、D-半乳糖皮下注射6周后,大鼠血清MDA含量升高SOD活性下降(HD-galvs.control, P<0.01 for MDA and SOD;L D-gal vs.control, P<0.01 for MDA and SOD;HD-gal vs.L D-gal,P=0.017 for MDA,P=0.034 for SOD);2、CLP术后1周的死亡率分别是73.3%(HD-gal)、40%(L D-gal)和33.3%(control);3、与对照组相比,高剂量诱导组在CLP术后的血清肌酐、尿素氮、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、白介素-6、白介素-10、肿瘤坏死因子-α以及MicroRNA-155水平明显升高(P<0.05);4、根据肾损伤RIFLE分级,CLP术后24小时发生严重急性肾损伤(RIFLE-F)的可能分别是80%(HD-gal)、43%(L D-gal)和43%(control);5、高剂量诱导组在CLP术后更易出现心率、收缩压和体温的降低。
  结论:与青年SD大鼠脓毒症模型相比,在高剂量D-gal诱导的衰老大鼠上建立的脓毒症模型死亡率高,这可能与炎症反应的增加和严重的急性肾损伤相关。并且高剂量诱导组更易出现严重的感染性休克和低体温。因此,使用高剂量D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型进行临床前研究可以为老年患者的脓毒症治疗提供更有价值的信息。
[硕士论文] 尹郭伟
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:干扰素(IFN)诱导蛋白在干扰素生物学功能的发挥中起着至关重要的作用,p204是干扰素诱导蛋白p200家族(IFI200)鼠类蛋白成员,该蛋白能与多种蛋白相互作用,并通过这些相互作用发挥抑制细胞增殖、阻断细胞周期、促进细胞分化及感应外源双链DNA入侵等重要作用。
  本论文用D-半乳糖注射法对遗传背景相同的全身性p204基因敲除型(K0)小鼠和野生型(WT)小鼠进行卵巢早衰模型的构建,观察小鼠造模过程中的健康状况。造模八周后组织切片染色观察卵巢卵泡的发育的状况。采用酶联免疫吸附法检测血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(HL)水平。采用real-timePCR技术对卵巢组织c-myc、Bc卜2、Bax、CYP17A1、CYP19A1等基因表达水平进行检测与分析。采用免疫组化法检测Bc卜2、CYP17A1、CYP19A1蛋白在小鼠卵巢组织的表达和分布情况。
  实验结果表明,在造模过程中,KO小鼠的体重及卵巢重量均显著下降(p<0.01),而WT小鼠变化不显著,说明p204敲除使小鼠对D-半乳糖代谢紊乱导致的生理功能变化的影响更大。通过对卵巢组织的切片及染色观察发现KO小鼠卵巢闭锁卵泡和黄体增多,颗粒细胞排列稀疏,说明p204敲除对小鼠卵巢卵泡的发育产生了一定影响。对小鼠血清激素水平检测发现KO小鼠睾酮(T)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)水平均显著升高(p<0.01)。说明p204基因敲除后使小鼠体内的激素水平发生改变,导致卵泡发育功能下降,致使卵巢损伤。对小鼠卵巢相关基因检测中,发现KO小鼠凋亡相关基因bax、原癌基因c-myc表达水平均显著升高(p<0.01),说明p204敲除对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡产生影响,加速了卵巢早衰。还发现KO小鼠中性激素合成相关基因CYP17A1表达水平显著升高(p<0.01),CYP19A1基因表达水平均显著降低(p<0.01),说明p204敲除使小鼠体内性激素尤其是雄激素表达水平发生改变,导致小鼠卵泡发育发生障碍,形成卵巢早衰。免疫组化结果显示缺失p204导致小鼠卵巢内Bcl-2、CYP17A1、CYP19A1蛋白的表达和分布发生改变,加速卵巢早衰形成。
  以上结果表明p204在小鼠卵巢卵泡发育中可能通过调控颗粒细胞增殖和凋亡的过程从而抵制卵巢早衰的形成。本论文为初步探究p204在小鼠POF卵泡发育中的作用,为进一步阐明卵巢早衰卵泡发育障碍的发病机制和预防早衰奠定基础,具有重要的理论意义和临床价值。
  本研究的创新点在于:1)使用D-半乳糖注射法对C57品系p204基因全身性敲除小鼠构建卵巢早衰模型。2)发现缺失p204对小鼠卵巢组织产生损伤加速卵巢早衰。
[博士论文] 吴仕峰
外科学(骨外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  急性脊髓损伤在临床上通常表现为发病急、危害大,具有治疗费用昂贵与转归预后不佳的特点,在脊柱外伤尤其是脊柱骨折患者中具有较高的发生率。自进入工业时代和交通业时代以来,脊髓损伤的发病率呈现出连续上升的势头。在医学发展的历史进程中,现代医学在诸多方面均取得了令人瞩目的成就,攻克了医学领域一系列的许多难题,但迄今为止,对脊髓损伤的治疗没有太多的临床手段和突破性的医疗技术,不论在脊髓损伤的治疗和并发症预防上都存在很大的短板,距离患者期望的完全治愈和彻底康复的良好愿景还相差甚远。脊髓损伤的病理过程是相当复杂的,涉及一系列的作用机理和基础理论。近几十年来,大量的实验研究者进行了无数的基础与临床实验研究,在基础研究和临床诊疗等方面做出了巨大的努力,目的就在于能够找到脊髓损伤发生后的明确机制,从而根据不同的原理分类采取针对性的措施进行治疗,最终来达到临床治愈的效果。
  脊髓损伤后的神经再生是目前生物医学领域研究的热点,同时也是临床一线医生所面临和被困扰的难点,脊髓损伤后必将出现原发性损伤和继发性损伤并存的现状。针对上述两种损伤的神经功能修复主要存在两大难点,第一,如何替代脊髓损伤区域变性坏死的神经元,恢复原有的神经元数量。第二,如何预防和抑制损伤区域疤痕的形成,提供一个适宜神经元再生的微环境。
  近二十年来,经过广大研究者的不懈努力,脊髓损伤的修复再生研究取得了较大的进展,目前研究最多的就是种子细胞移植,也是已经尝试应用于临床治疗的措施手段。嗅鞘细胞同时具有星形细胞和许旺氏细胞的特性,能够穿行于外周神经和中枢神经,具有促进神经元轴突再生和神经元再髓鞘化的作用。在大量的实验研究和部分临床治疗中均证实嗅鞘细胞具有一定程度修复脊髓损伤的作用,也是目前脊髓损伤实验研究最多的种子细胞之一。
  嗅鞘细胞之所以能够成为目前最佳的移植细胞是与其自身独特的生物学特性密不可分的。嗅鞘细胞可以生成和分泌脑源性神经生长因子、骨形态发生蛋白、神经细胞粘附因子、层粘连蛋白、血小板源性生长因子和低亲和力神经生长因子受体等。嗅鞘细胞通过上述生物学特性在修复脊髓时具有改善受损区域脊髓内部微环境,抑制有害因子产生,减少局部炎症反应的作用。同时嗅鞘细胞启动髓鞘形成和轴突再生的修复程序,引导受损神经轴突修复再生,重新建立神经联系,恢复原有的神经功能。此外,嗅鞘细胞还可以通过抑制胶质细胞的增生,减少损伤处瘢痕的形成,阻碍脊髓内部空洞的出现,为脊髓损伤的修复和重建提供基础,从而有利于新生轴突重新穿越损伤区域,建立神经传导的途径,恢复原有的神经功能。
  脊髓损伤的康复治疗与患者的康复效果和预后密切相关,早期临床康复介入治疗是提高脊髓损伤患者预后的一个重要临床治疗手段。合理的物理治疗措施会显著提高患者的脊髓功能恢复程度,是提升脊髓损伤临床功能分级水平的治疗方法,并且已经得到研究证实。物理治疗根据种类的不同,其各自的治疗效果和临床用途也各不相同,物理治疗的共同效果主要表现为加快局部血液循环,改善局部条件,减少炎症因子释放,起到减轻组织水肿,减轻炎症反应,缓解疼痛的效果。除此以外。每种物理治疗还具有自身各自独特的作用,比如可以引起肌肉收缩,体液电离和极化,局部温度升高等。在目前的物理治疗中电刺激具有改善局部微循环,促进神经营养因子表达和促进移植细胞存活等作用。因此,在损伤初期通过电刺激治疗可以实现减轻脊髓损伤的继发性损害,利于神经元的存活和神经轴突的生长,在后期则可以减少脊髓损伤并发症的发生,提高患者生存率和生活质量,降低临床的致残率与死亡率。借助物理治疗的手段来治疗脊髓损伤在康复医学领域是预防和治疗继发性损伤所采取的最早措施,通过电疗和电刺激来改善损伤局部微环境的变化,加速神经元的修复,改善中枢神经的功能恢复。
  脊髓损伤的修复机制是错综复杂的,修复所需的干预措施也涉及许多方面,单一的治疗手段肯定不是最佳的选择,采用适当的联合手段发挥协同作用来提高修复效果,对修复脊髓损伤来讲更具有必要性,因此本实验应用嗅鞘细胞移植联合物理治疗修复脊髓损伤,探讨不同治疗方式的修复效果,观察损伤区域神经元的凋亡情况。
  目的:
  1、探讨能够满足脊髓损伤实验研究所需动物模型的制备。
  2、选择合适的嗅鞘细胞制备方法,确保满足移植所需的嗅鞘细胞。
  3、探讨物理治疗对脊髓损伤的修复作用。
  4、探讨嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的修复作用。
  5、探讨嗅鞘细胞联合物理治疗对脊髓损伤的修复作用,观察嗅鞘细胞和物理治疗的在治疗过程中的协同效果。
  方法:
  1、应用虹膜刀予以彻底离断大鼠脊髓,离断水平在胸10部位,制备完全离断的脊髓损伤动物模型。
  2、对培养的嗅鞘细胞在移植前采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法联合纯化,观察细胞的纯度。
  3、对原代培养的嗅鞘细胞和传代培养的细胞固定后进行p75免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察对细胞进行鉴定。
  4、将60只成年S-D大鼠模型随机分为四组,分别为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、嗅鞘细胞联合物理治疗组和对照组。
  5、在动物造模后次日,每日给予低频直流电刺激,每次作用15分钟,每日进行两次,观察物理治疗的修复效果。
  6、在动物造模后1周,脊髓损伤处及其远近端分别用微量注射器注射移植细胞,观察细胞移植后的脊髓功能的改善情况。
  7、在细胞移植和物理治疗后分别通过BBB功能评分、H-E染色、嗜银染色、辣根过氧化物酶染色、体感诱发电位等方法观察脊髓损伤的修复程度。借助免疫荧光染色、Western-blot免疫印迹和Tunel染色来进一步观察损伤区域移植细胞存活和脊髓神经细胞凋亡的情况。
  结果:
  1、采用脊髓离断法造模既能保证实验动物的存活率,也能达到模拟临床的效果,符合脊髓完全离断的标准,可以作为脊髓损伤动物模型的制备方法。
  2、采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法纯化的细胞纯度可达95%,符合细胞移植的要求。
  3、原代培养和传代培养的嗅鞘细胞p75免疫荧光鉴定均为阳性,细胞的生物学性质没有变化。
  4、在细胞移植和物理治疗后,各组实验动物的BBB功能评分根据得分高低最高为嗅鞘细胞联合物理治疗组,其余依次为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、对照组,各组间数值均具有统计学意义(p<0.05)。H-E染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组脊髓结构较其余各组清晰,神经纤维更具有方向性,存在散在分布的大小不一的空洞,其余各组均显示脊髓黑白质界限不清,结构紊乱,神经纤维中断扭曲,走行没有方向性,损伤区域存在大量的脊髓空洞。嗜银染色结果表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经纤维数量最多,与其余各组相比具有统计学差异(p<0.05)。对照组神经纤维数量极少,走向毫无方向性,神经纤维全部中断,没有连续性。辣根过氧化物酶染色显示鞘细胞联合物理治疗组神经元的数目最多,多于其他各组,结果具有统计学意义(p<0.05),嗅鞘细胞组、物理治疗组和对照组组间也具有统计学差异(p<0.05)。诱发电位检测表明各组动物在细胞移植后1周时均可检测到波形,嗅鞘细胞联合物理治疗组的诱发电位潜伏期低于其他各组。在移植后2周时,各组检测的潜伏期无明显统计学差异。在移植后4周时,嗅鞘细胞联合物理治疗组的潜伏期最短,与其他各组相比结果具有统计学差异(p<0.05)。在细胞移植后6周和8周时,各组的潜伏期由短至长依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间比较均具有统计学意义(p<0.05)。各组动物在细胞移植后1周时开始出现波形,可以检测到波幅,在移植后2周时各组动物检测到的波幅均较小,各组间比较没有差异。在移植后4周时嗅鞘细胞联合物理治疗组动物波形的波幅最高,超出其余各组波幅,差异具有统计学意义(p<0.05),在移植后6周和8周时各组的波幅继续升高,由高到低依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间波幅差异具有统计学意义(p<0.05)。
  5、免疫荧光染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组和嗅鞘细胞移植组均有嗅鞘细胞在体内存活,但前者的细胞数量多于后者,二者相比具有统计学意义(p<0.05)。Western-blot免疫印迹检测显示Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9蛋白表达结果为:嗅鞘细胞联合物理治疗组Bcl-2蛋白明显升高(p<0.05),caspase-9和caspase-3的表达减少(p<0.05),而Bax均变化不大。Tunel染色表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经元细胞凋亡的数量最少,具有统计学意义(p<0.05)。
  结论:
  1、完全离断脊髓损伤动物模型制备简单,重复性高,效果可靠,适宜用来进行脊髓损伤动物实验研究。
  2、实验制备获取的嗅鞘细胞的纯度、数量及生物学特性能够满足移植需要,可以做为修复脊髓损伤的种子细胞。
  3、嗅鞘细胞移植和物理治疗均具有一定程度的脊髓损伤修复作用,并且嗅鞘细胞移植联合物理治疗的修复效果最好,功能改善程度最高,优于单一手段的修复作用,但是远未达到完全修复的程度。
  4、嗅鞘细胞移植联合物理治疗能够最大程度的减少神经元的凋亡,继而保留损伤区域的脊髓功能。
[硕士论文] 侯琨
耳鼻咽喉科学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4),中文名称细胞毒T淋巴细胞相关抗原4,作为白细胞分化抗原的一种,又名CD152,是T细胞表面上的一种跨膜受体,与CD28共同竞争享有B7分子配体,当CTLA-4与B7分子结合后,可以导致T细胞表达无反应性,进而表达免疫反应的负调节。CTLA-4Ig主要是由CTLA-4分子细胞外功能区域和人自身免疫球蛋白IgG1的恒定区进行结合的一种融合蛋白,是一种经典的、研究功能明确的免疫抑制分子,CTLA-4Ig可以导致T细胞正常免疫反应受限,从而导致免疫功能降低。为了研究CTLA-4Ig在内耳发育及表达情况,我们与第三军医大学合作,以体细胞核移植方法构建人源性hCTLA-4Ig转基因巴马香猪,角蛋白(K14)作为启动子,靶向表达,从而避免了因全身性表达CTLA-4Ig导致的动物在胚胎发育期死亡。本次研究通过对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群中个体的转基因鉴定、听力学功能表型的分析和多种内耳形态学方法的研究,对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳聋做了初步研究。本次研究包括如下三个部分。
  第一部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳聋动物模型基因型鉴定及蛋白分布表达
  首先,为了明确本研究的科学性,我们应首先确保我们通过体细胞移植获得的封闭家系种群后代的基因型,确保其基因稳定遗传,可靠。此外还还需明确CLTA-4基因是否在正常巴马香猪发育过程中表达,及CTLA-4Ig是否在内耳表达。我们采用了PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)方法进行阳性巴马香猪的鉴定以及用于种群繁衍的筛选。其中,在PCR结果中,因巴马香猪转基因猪个体表达了326bp的目的条带,而正常野生型巴马香猪未见明显目的条带表达,说明转基因克隆猪家系稳定。
  第二部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪听力学功能检测
  为了研究CTLA-4Ig在内耳表达中的作用,我们首先通过对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪的听力学功能情况进行研究,在本次研究中,我们对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪封闭种群20只转基因克隆猪进行了听力学筛查,采用了听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值检测,并在相同检测条件下测试了20只正常野生型巴马香猪ABR阈值,进行统计学配对分析,发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪组ABR阈值与野生型巴马香猪组ABR阈值之间具有明显的统计学差异(P<0.05)。通过听力学功能的检测,我们发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪出现了不同程度的感音神经性耳聋,从而说明hCTLA-4Ig转基因巴马香猪家系出现了听力损失。
  第三部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪内耳形态学观察
  在明确了解hCTLA-4Ig转基因巴马香猪听力学表型特征后,我们通过对内耳进行形态学变化研究,进一步从形态学和病理学角度判断hCTLA-4Ig转基因巴马香猪异常特征。首先我们通过取材后直接在显微镜下比较观察,hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳蜗大小体积、耳蜗回数、听小骨等发育未见与野生型巴马香猪无明显差异。
  耳蜗标本经过火棉胶包埋后,采用连续切片,经过HE染色后观察,发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳蜗形态存在异常,出现corti's器结构异常,前庭膜塌陷,中阶狭窄等。其中耳蜗标本制备后进行扫描电镜观察,纤毛多数成病理改变,毛细胞脱落。
  在免疫荧光结果中,我们可以发现,hCTLA-4Ig在转基因猪的耳蜗内有表达,多集中在血管纹、螺旋神经节部位,而在正常野生型巴马香猪耳蜗表达情况较低。
  通过对如上方法的形态学分析,我们可以看出,hCTLA-4Ig转基因巴马香猪的耳蜗具有病理改变,而这些病理改变是由于基因异常引起的,从而说明CTLA-4Ig突变与耳聋相关。
[硕士论文] 王剑锋
神经病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景和目的
  黑质致密部多巴胺能神经元变性死亡所导致的体内多巴胺(DA)及其代谢产物含量减少是导致帕金森病的主要原因,其减少程度与多巴胺能神经元丧失程度成正相关。络氨酸羟化酶(TH)为DA合成限速酶,研究证明PD患者及PD动物模型TH含量明显降低,因此,通过干预提高TH含量及活性已成为减缓PD进展的重要治疗策略。
  瞬时受体电位香草醛亚型1(TRPV1)是一种非选择性阳离子通道,可被辣椒素选择性激活。传统上,TRPV1被认为涉及广泛的疾病领域,包括疼痛(炎症,内脏,癌症和神经病),炎症性肠病,间质性膀胱炎,尿失禁,气道疾病,胰腺炎和偏头痛,其涉及到的机制包括炎症,免疫,凋亡,氧化应激等诸多方面。最新研究表明TRPV1不仅在感觉神经元高度表达,而且高表达于其他功能脑区,并参与神经元损伤的细胞过程。此外,深入研究发现TRPV1可降低氧化应激以及脑梗死的相关标志物,提高运动和认知功能。提示其可能在神经退行性疾病的发生发展中发挥作用。本研究通过使用6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病大鼠模型来探讨TRPV1的神经保护作用,为其可能作为新的药物治疗靶点提供理论依据。
  研究方法
  随机选取108只雄性健康Wistar大鼠,体重控制为220g-250g,由山东大学动物实验中心提供。将其随机分为正常对照组(20只)、假手术组(右侧脑前内侧束立体定向注射生理盐水,20只),6-OHDA组(右侧脑前内侧束立体定向注射6-OHDA,40只),6-OHDA+辣椒素组(即干预组,注射6-OHDA后每天每只给予辣椒素1mg/kg腹腔注射,连续注射7d,辣椒素剂量为1mg/kg,40只)。对大鼠分别进行行为学检测(包括旋转试验与旷场试验)、蛋白质印迹检测黑质及纹状体TH及TRPV1表达水平、免疫组织化学检测黑质TH+神经元、测定大鼠脑内CAT、SOD、MDA含量。
  所有实验数据均使用GraphPad Prism5.0软件处理。计量资料以均数±标准差(x±s)进行统计描述;采用t检验进行两组间均数比较,p<0.05为差异具有统计学意义。
  研究结果
  1.行为学结果示与6-OHDA组相比,干预组大鼠诱发旋转圈数明显减少(n=10,p<0.01),大鼠1分钟内行走距离明显增多,平均速度明显增快,中央格停留时间显著减少,且差别均具有统计学意义(n=10,p<0.05)。
  2.免疫印迹结果示干预组大鼠黑质及纹状体TRPV1及TH蛋白表达水平较其余三组明显增高,差异均具有统计学意义(n=6,p<0.01)。
  3.组化结果示与6-OHDA组相比,干预组黑质TH+神经元数目明显增多,此外干预组大鼠黑质致密部TH阳性神经元树突明显增多,轴突长度增加。
  4.与6-OHDA组相比,干预组右脑CAT、SOD水平均明显增高,MDA水平明显降低,差异均有统计学意义(t=2.977,p=0.0139; t=2.787,p=0.0192; t=2.563,p=0.0282),左脑6-OHDA组与干预组相比CAT、SOD、MDA水平差异无统计学意义(p>0.05)。
  结论
  辣椒素可激活TRPV1蛋白,调节氧化应激水平,对PD大鼠多巴胺能神经元起神经保护作用,改善其运动功能,缓解PD病情。
[硕士论文] 季一发
小儿外科学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  检测R-spondin1、DKK-1、β-catenin在幼兔激素性股骨头缺血坏死动物模型股骨头组织中的表达,比较不同剂量甲基泼尼松龙对人成骨细胞中R-spondin1的表达及人成骨细胞凋亡的影响,探讨糖皮质激素致幼兔股骨头缺血坏死的相关机制。
  方法:
  1.幼兔股骨头坏死组(n=12):激素性股骨头缺血坏死新西兰幼兔;对照组(n=12):正常新西兰幼兔。应用Western Blot、RT-qPCR检测方法检测R-spondin1、DKK-1、β-catenin在各组股骨头中的表达情况,比较各相关蛋白及基因在各组中的表达差异,皮尔逊(Pearson)相关性检验分析R-spondin1与DKK-1、β-catenin的相关性。
  2.培养人成骨细胞并传代,激素干预组:分别加入(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)甲基泼尼松龙后,继续培养72h;空白组:不加甲基泼尼松龙,继续培养72h。Western Blot、RT-qPCR检测各组R-spondin1的表达情况,同期检测各组的细胞凋亡率。
  结果:
  1.R-spondin1在幼兔股骨头坏死组与对照组中的蛋白表达量分别为0.179±0.028、0.471±0.104,差异具有统计学意义(t=9.38,P<0.01);β-catenin在幼兔股骨头坏死组与对照组中的蛋白表达量分别为0.195±0.041、0.632±0.129,差异具有统计学意义(t=11.15,P<0.01);Dkk1在幼兔股骨头坏死组与对照组中的蛋白表达量分别为0.713±0.161、0.181±0.029,差异具有统计学意义(t=-11.25,P<0.01);在幼兔股骨头坏死组与对照组中,R-spondin1与β-catenin的蛋白表达呈正相关关系(r=0.89,P<0.01),R-spondin1与Dkk1呈负相关关系(r=-0.945,P<0.05)。
  2.R-spondin1在幼兔股骨头坏死组与对照组中的mRNA表达量分别为0.255±0.039、0.995±0.093,差异具有统计学意义(t=25.33,P<0.01);β-catenin在幼兔股骨头坏死组与对照组中的mRNA表达量分别为0.216±0.036、1.055±0.083,差异具有统计学意义(t=32.49,P<0.01);Dkk1在幼兔股骨头坏死组与对照组中的mRNA表达量分别为3.275±0.073、0.986±0.084,差异具有统计学意义(t=-10.32,P<0.01);在幼兔股骨头坏死组与对照组中,R-spondin1与β-catenin的表达mRNA呈正相关关系(r=0.860,P<0.01),R-spondin1与Dkk1呈负相关关系(r=-0.945, P<0.01)。
  3.空白组与10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L三种不同剂量甲基泼尼松龙干预培养的细胞中R-spondin1蛋白表达量分别为0.622±0.105、0.441±0.125、0.194±0.038、0.112±0.019,R-spondin1蛋白表达量随甲基泼尼松龙剂量增大而降低,差异具有统计学意义(F=76.37,P<0.01);R-spondin1mRNA表达量分别为0.999±0.168,0.897±0.131,0.624±0.101,0.323±0.033,R-spondin1mRNA表达量随甲基泼尼松龙剂量增大而降低,差异具有统计学意义(F=64.79,P<0.01)。
  4.空白组与10-8mol/L组、10-7mol/L组、10-6mol/L组的细胞凋亡率(%)分别为7.41±1.11、13.14±1.92、25.01±5.21、31.99±9.48,细胞凋亡率随干预剂量增大而增大,差异具有统计学意义(F=40.80,P<0.01)。
  结论:
  1.糖皮质激素对人成骨细胞中R-spondin1的表达具有负调控作用,可能通过负调控R-spondin1表达促进人成骨细胞的凋亡。
  2.在糖皮质激素致幼兔股骨头缺血坏死模型中,R-spondin1与β-catenin表达正相关,与DKK-1表达负相关,R-spondin1可能负调控Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞的凋亡,导致幼兔激素性股骨头缺血坏死发生。
[硕士论文] 胡婧
流行病与卫生统计学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  提取2010-2014年湖南省结核病基本信息,运用一系列数学理论方法,构建湖南省结核病传播模型,获得湖南省结核病传播模型的基本再生数、无病平衡点和地方病平衡点,为湖南省结核病干预措施提供科学依据。
  方法:
  提取湖南省结核病数据信息,以传染病群体模型研究方法中的结核病基本传播模型为基础,结合湖南省结核病传播的特点,构建湖南省结核病传播模型。采用残差平方和最小二乘法对模型的单位时间内自然死亡率(μ)、单位时间内的易感者感染概率(β)、单位时间内的治愈者感染概率(β')、单位时间内的潜伏者发病概率(α)、患者采取治疗比率(p)、未采取治疗患者病死率(d2)、未采取治疗患者在单位时间内的自愈概率(δ)、潜伏者自愈率(r1)、治疗患者治愈率(r2)、采取治疗患者病死率(d1)等参数进行估计。采用卡方拟合优度检验对参数估计结果进行评价。采用第二代矩阵方法计算湖南省结核病基本传播模型的基本再生数。采用李雅普诺夫稳定性定理计算湖南省结核病基本传播模型的无病平衡点。采用李雅普诺夫稳定性定理以及劳斯-赫尔维茨判据计算湖南省结核病基本传播模型的地方病平衡点。
  结果:
  构建了湖南省结核病基本传播模型。模型的单位时间内自然死亡率(μ)的估计结果为0.000019、单位时间内的易感者感染概率(β)的估计结果为0.0027、单位时间内的治愈者感染概率(β')的估计结果为0.00075、单位时间内的潜伏者发病概率(α)的估计结果为0.00018、患者采取治疗比率(p)的估计结果为0.53、未采取治疗患者病死率(d2)的估计结果为0.000054、未采取治疗患者在单位时间内的自愈概率(δ)的估计结果为0.0000060、潜伏者自愈率(r1)的估计结果为0.00084、治疗患者治愈率(r2)的估计结果为0.00318、采取治疗患者病死率(d1)的估计结果为0.0000068。卡方拟合优度的检验认为参数估计结果准确有效。湖南省结核病基本传播模型的基本再生数、无病平衡点(易感者,潜伏者,未采取治疗的结核病发病者、采取治疗的结核病发病者、治愈者)、地方病平衡点(易感者,潜伏者,未采取治疗的结核病发病者、采取治疗的结核病发病者、治愈者)分别为9.87、(66909999,0,0,0,0)、(39496869,19119954,34076,45802,8198563)。
  结论:
  通过对湖南省结核病模型分析,发现当前湖南省结核病疫情稳定在地方病平衡点。本次研究发现当前湖南省结核病基本传播模型的基本再生数为9.87,理论上湖南省结核病不可能消失。根据湖南省结核病基本再生数模型,发现当结核病感染者就诊率提高到85.2%以上,湖南省结核病将逐步消失。
[硕士论文] 李文霞
动物学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  无菌动物(Germfree animals,GF)指无可检出一切生命体的动物,进一步说,是指用现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。无菌动物具备以下几大特点:首先无菌动物可彻底排除背景微生物的干扰,无菌动物背景清晰,不携带任何活的微生物及寄生虫,用于构建菌群、菌株移植模型,可以彻底排除背景微生物的干扰;其次人体是由自身细胞和微生物细胞共同构成的“超级生物体”,无菌动物对于解析菌群宏基因组功能不可或缺。利用无菌动物技术“转入”(菌群移植)或“敲除”(无菌化)菌群,对于解析特定菌群宏基因组对疾病的影响尤为重要,犹如利用基因工程动物技术转入或敲除某一基因,对于解析该基因对疾病的贡献一样重要。
  随着高通量测序技术的发展,越来越多的科学家发现肠道菌群与诸多疾病发生存在必要关联,利用无菌小鼠制备菌群移植模型、悉生动物模型等能够更好地解析菌与人的关系,所以各研究单位对无菌小鼠的需求量出现逐年上升趋势,但国内现有的商品化无菌小鼠远远满足不了市场的需求。目前影响无菌小鼠培育进度的技术难点在于获得原代小鼠难、繁殖率低、无菌小鼠营养需求不详等因素。无菌小鼠的培育主要采用生物净化法,即剖腹产手术全子宫摘除,将仔鼠通过人工喂养的方式获得。能否成功喂养出无菌小鼠的关键在于有无适合无菌小鼠生长发育的营养配方饲料,包括哺乳期生长发育所需的奶制品以及生长繁殖期所需的饲料。而目前关于无菌小鼠营养需求相关研究相对较少,国际上针对无菌小鼠哺乳期及离乳后生长繁殖阶段均没有标准饲料,这极大地影响了大规模发展无菌小鼠培育工作进度。同时无菌小鼠为适应无菌环境,其生物学特性发生了巨大变化。因不能发酵食物中的多糖,盲肠变得膨大;为摄取更多的营养物资,其肠壁更薄、绒毛更长;无菌小鼠的免疫系统因缺乏微生物抗原刺激处于低发育水平;同时无菌动物基础代谢率更高、不易积累脂肪;其应激反应、行为学特征等均有异于常规动物。正常小鼠肠道菌群能够合成身体新陈代谢所需的B族维生素和维生素K,一般不会缺乏,而无菌小鼠肠道没有细菌,普通小鼠饲料里B族维生素和维生素K的含量满足不了无菌小鼠正常的生长繁殖需要,加之无菌小鼠饲料经高剂量辐照灭菌之后,部分营养成分损失严重。所以依据其生物学特征及生活环境提示无菌小鼠的营养需求异于普通小鼠,普通小鼠的饲料不适用于无菌小鼠的喂养。
  为了解决上述问题,本课题结合正常仔鼠哺乳期及生长繁殖阶段的生理生化指标及营养需求,最终配制出适合无菌小鼠哺乳期生长的人工配方奶和适合繁殖阶段生长的强化饲料,同时接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型,通过16s rDNA高通量测序分析,进一步验证了强化饲料与菌群移植模型的关系。
  方法:
  (1)依据小鼠鼠奶营养成分,对比婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组哺乳期KM小鼠张耳、睁眼、长毛等生长特性,统计离乳率,同时持续采集哺乳期乳鼠体重、尾长生长情况,对比小肠组织切片,运用统计学分析软件GraphPad Prism6.0分析小鼠血常规结果及血气理化指标,从而评价婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组组间差异。
  (2)依据实验动物小鼠纯化饲料标准AIN-93G,参照对比辐照消毒前后饲料中营养成分的损失程度,结合无菌小鼠体内不能合成维生素B族及维生素K的特点,配制成强化饲料。运用统计学分析软件SPSS19.0分析普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组生长阶段体重变化情况,性成熟后连续交配3次,统计分析小鼠受孕率、产仔及离乳数,随机抽取各组5只小鼠,对比其凝血四项指标及心脏组织切片,从而评价普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组的组间差异。
  (3)接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型小鼠,分别饲喂与宿主相同的婴儿奶粉和强化饲料,对菌群定植14天及28天的小鼠粪便进行16s rDNA高通量测序分析菌群相似度。
  结果:
  (1)婴儿奶粉组人工喂养137只乳鼠,离乳0只,人工配方奶组人工喂养124只乳鼠,成功离乳72只,离乳率58%。婴儿奶粉组与正常对照组体重尾长差异明显(P<0.01),人工配方奶饲喂无菌KM仔鼠其体重、尾长增长与正常对照组基本一致(P>0.05),红细胞计数、白细胞计数、血小板计数均无显著性差异(P>0.05),血液酸碱度无显著性差异(P>0.05),氧分压有显著性差异(P<0.05)。由此可见,人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期的生长需求。
  (2)普通饲料组(实验1组)与正常对照组比较其3-6周龄体重增长存在显著性差异(P<0.05),而强化饲料组(实验2组)与正常对照组无明显差异(P>0.05)。到达性成熟后,普通饲料组(实验1组)受孕率、产仔离乳数存在显著性差异(P<0.05),强化饲料组(实验2组)与正常对照比其受孕率、产仔离乳数无统计学意义(P>0.05),强化饲料组(实验2组)凝血四项值无明显差异(P>0.05),普通饲料组(实验1组)小鼠心脏组织切片有少量出血点,提示该组小鼠出现病理性出血,普通饲料不能用于无菌KM小鼠喂养,而通过营养改良后的强化饲料能基本满足无菌KM小鼠生长繁殖需求。
  (3)菌群定植14天时,奶粉组婴儿肠道菌群模型小鼠在“目”水平,肠道菌梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)与婴儿粪便的梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)丰度相似。菌群定植28天时,婴儿肠道菌群模型小鼠饲料组与奶粉组肠道微生物菌落差异不明显,强化饲料适用于模型动物。
  结论:
  (1)人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期生长的营养需求。
  (3)强化饲料的营养成分能基本满足无菌小鼠生长繁殖的营养需求。
  (3)强化饲料能够维持菌群移植模型小鼠的菌群多样性结构,适用于菌群移植模型。
[硕士论文] 王谷洋
肿瘤学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨应用DNA条形码标准序列对广西和云南树鼩群体进行分类鉴定的可行性,为树鼩种群的分类鉴别提供一个标准化的分子分类模式,也为后续建立高感染率的树鼩肝炎模型和培育优良品系提供可靠的遗传背景信息。
  方法:提取广西隆安和云南昆明树鼩种群共43只动物的全血基因组DNA,采用CO1基因作为条形码标记基因进行PCR扩增、产物纯化测序,结合Genbank数据库中下载的树鼩序列片段(海南亚种和普通树鼩),并通过MEGA等多种生物学软件来统计这4个树鼩种群的遗传学指标,如序列的长度、碱基组成、单倍型、保守位点、变异位点、简约信息位点、碱基替换、转换数与颠换数等,计算树鼩种群的种内遗传距离和种群之间的遗传距离,构建树鼩种群系统发育树进一步验证树鼩群体间的遗传差异。
  结果:1、PCR扩增和测序获得长度为638bp的CO1基因序列,无碱基插入或缺失,A、T、C、G四种碱基的平均含量分别占比为25.1%、29.3%、27.1%、18.5%,碱基A+T的平均含量明显高于碱基C+G的平均含量,有明显的A+T碱基偏倚现象,符合脊椎动物mtDNA碱基组成的特点。
  2、本实验树鼩种群归属于10个单倍型,其中隆安种群、昆明种群及海南亚种占9个单倍型,所有序列检测到保守位点470个,变异位点共168个,简约信息位点97个,碱基对转换数为31,颠换数为7,表明我国树鼩种群分化较多,种群资源丰富,具有遗传多样性。
  3、本研究的3个树鼩种群(隆安树鼩、昆明树鼩和海南亚种)种内遗传距离范围为0.00%-0.79%,中缅树鼩3个种群间的遗传距离在9.71%-13.59%之间,而它们与普通树鼩之间的遗传距离范围为20.43%-24.11%,种内遗传距离与种间遗传距离没有重叠区,存在明显的条形码间隔,表明DNA条形码能很好的鉴别不同地理类群的树鼩。
  4、系统发育树显示树鼩种群个体聚集趋势明显,同种不同个体分支长度较短,不同种群之间分支较长,同种不同个体都是先聚集到本种群的分支中,再与其它树鼩种群的支系聚集,证实了广西隆安树鼩与云南昆明树鼩是中缅树鼩的两个不同亚种群。
  结论:基于线粒体CO1基因的DNA条形码技术能有效用于树鼩种群的分类鉴定,本研究通过分析条形码在广西隆安树鼩和云南昆明树鼩的遗传差异证实了这两个群体为中缅树鼩的两个不同亚种群。
[硕士论文] 石振庆
生物工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外部因素作用于头部导致的中枢神经系统缺损性疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率等特点,给社会和家庭带来沉重负担,寻找积极有效的治疗方法是目前亟待解决的问题。干细胞替代疗法给 TBI治疗提供了新的策略和希望,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)来源于人脐带沃顿胶组织,具有无伦理学争议,来源广泛,多向分化潜能、低免疫原性等特点,是组织工程良好的种子细胞。然而移植后成活率低、数量不足等问题仍然制约着干细胞移植的应用。因此,提供适合移植干细胞生长与存活的微环境对于提高干细胞生物学活性和治疗效果至关重要。
  藻酸盐(sodium alginate,SA)水凝胶组织工程支架具有三维网络结构,与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)具有天然相似性,可为细胞生长提供立体支撑,且为细胞的气体交换、营养输送及其新陈代谢产物的排出提供良好的传输通道。透明质酸(hyaluronan,HA)作为天然细胞外基质的主要成分之一,可与干细胞表面特异性受体结合,促进干细胞的增殖、粘附,帮助信号传导,调控细胞分化。因此,本课题通过构建SA/HA组织工程支架,联合hUC-MSCs研究对创伤性脑损伤模型鼠的治疗作用。
  目的
  本实验利用组织工程技术体外构建SA/HA复合功能支架,并对其物化性能等进行表征,对包载hUC-MSCs的SA/HA水凝胶支架进行生物学评价,以提供更适合hUC-MSCs生存的微环境;在体内实验中,探究hUC-MSCs联合SA/HA水凝胶支架对 TBI大鼠的神经修复作用及其可能的作用机制,以期为干细胞移植治疗TBI提供新的策略和方法。
  方法
  1体外实验研究SA/HA水凝胶支架与hUC-MSCs相容性评价
  通过内部凝胶法制备4组不同配比的藻酸盐水凝胶,分别为1%-0.8、1%-0.5、0.5%-0.5、0.5%-0.2;扫描电子显微镜(SEM)进行水凝胶形貌表征;试管倾斜法检测不同配比的凝胶时间;冷冻干燥及称重法测定不同配比的含水率及降解性能;流变仪检测不同配比的弹性模量;流式细胞仪检测 hUC-MSCs的表面标记物;通过添加一定比例的透明质酸,SA与HA浓度比分别为4:1(S4H1)、2:1(S2H1),构建不同配比SA/HA水凝胶支架,包载hUC-MSCs,共分三组,分别为单独 SA组、S4H1组、S2H1组;通过激光共聚焦显微镜观察 hUC-MSCs在水凝胶中三维分布;Live-Dead染色法检测干细胞在不同分组中的存活;CCK-8检测不同分组中干细胞的增殖情况。
  2体内实验研究SA/HA水凝胶支架联合hUC-MSCs对TBI大鼠的神经修复作用
  采用落体撞击法(Feeney's weight-drop)构建大鼠创伤性脑损伤模型,随机分为NaCl组、scaffold组、hUC-MSCs组和scaffold+ hUC-MSCs组。CV染色观察大鼠脑缺损情况;mNSS评分评估大鼠运动功能恢复;Morris水迷宫法检测大鼠的学习记忆能力;取出大鼠脑组织,做冰冻切片;免疫组化检测脑内hUC-MSCs的存活和迁移;免疫荧光检测神经元标记物β-III Tubulin和细胞增殖Ki67的阳性表达;提取损伤侧脑组织蛋白和RNA,Western Blot、qRT-PCR检测组织神经分化相关蛋白和基因(NSE、NEUN、MAP2)的表达,神经营养因子 BDNF、NGF、NT3的表达变化,细胞凋亡相关蛋白Bcl2的表达。
  结果
  1、通过内部凝胶法制备的藻酸盐水凝胶外观呈半透明状,外形可根据所用模具的不同任意塑性;通过SEM表征结果显示,水凝胶内部呈三维多孔网络结构。凝胶时间、含水率、降解率随着SA浓度、f值的减小而呈上升趋势,弹性模量随着 SA浓度、f值的减小而下降。通过添加适当比例透明质酸,检测hUC-MSCs在水凝胶中的活性发现,与SA组相比,S4H1、S2H1组中细胞存活率提高(P<0.05)、细胞增殖能力上升(P<0.05),且与HA浓度呈正相关。
  2、通过落体撞击法成功构建大鼠脑创伤模型;mNSS评分评估发现,治疗组运动功能恢复显著(P<0.05);hUC-MSCs组和scaffold+hUC-MSCs组均能改善大鼠学习记忆能力,且联合组效果更加显著(P<0.05);hUC-MSCs联合支架可减少干细胞于病灶部位的流失,显著增加损伤部位移植的细胞数目(P<0.05);治疗组中β-III Tubulin和Ki67表达增加;损伤侧脑组织中,NSE、NEUN、MAP2、BDNF、Bcl2蛋白表达上升(P<0.05),NEUN、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因表达水平提高(P<0.05),且联合组效果更加明显。
  结论
  1、内部凝胶法可制备任意塑形的可注射性藻酸盐水凝胶,通过调整海藻酸钠浓度、f值的配比,可调控水凝胶的理化性质。
  2、藻酸盐水凝胶支架可为hUC-MSCs生长提供三维立体支撑,添加透明质酸后,藻酸盐/透明质酸复合水凝胶可增加细胞活性,提高细胞增殖能力,为hUC-MSCs提供良好的生存微环境。
  3、与单独hUC-MSCs治疗组相比,SA/HA水凝胶联合hUC-MSCs移植可明显改善 TBI大鼠的运动功能和学习记忆能力,减少病灶部位干细胞的流失,提高损伤部位神经细胞的再生和神经营养因子的表达,从而改善 hUC-MSCs移殖对TBI大鼠的神经修复作用。
[博士论文] 崔益强
人体解剖与组织胚胎学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:当前医学及生命科学研究中,动物模型是不可或缺的组成部分。生命科学研究中每一种模式动物研究的突破,为遗传学、分子生物学、发育生物学等研究领域带来了突破式的进展。随着科学研究的不断深入,人类对复杂生命现象的不断探索,以及人类面临的重大疾病(癌症,艾滋病,心脑血管疾病,神经性疾病等)的威胁,低等的动物模型已无法满足复杂的科学研究以及模拟人类重大疾病的需求。非人灵长类动物作为人类的近亲,具有与人类相似的免疫系统、神经系统以及代谢系统,是最理想的甚至是唯一的模型动物。许多灵长类动物的研究成果可直接应用于人类疾病的预测、预防、诊断和治疗,而这些方面一直是人类健康领域关注的焦点。目前,非人灵长类动物模型构建一直受到编辑效率低、操作困难等限制,这些困难成为制约非人灵长类动物模型研究的瓶颈。
  近年来,基因编辑技术领域发展迅速,新型基因编辑工具不断被开发,尤其是CRISPR/Cas9基因编辑系统的出现,使基因编辑技术进入了新的时代。目前基因工程定点基因编辑工具中,可设计目标序列的定点核酸内切酶主要有三种,即:ZFN(锌指核酸酶),TALEN(转录激活子样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9)系统。其中CRISPR/Cas9系统,以其设计构建方便,敲除效率高,应用范围广等优势,被广泛应用于基因编辑研究中。因此,对CRISPR/Cas9技术的改造优化,并将其运用于构建非人灵长类动物基因编辑模型是生命科学所迫切需要的研究内容。
  本文综合运用CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对Nr0b1,Pparg-γ,Rag1三个基因共设计5个sgRNA,其中Nr0b1与早期性腺发育相关,Pparg-γ与脂肪代谢相关,Rag1与免疫系统相关。通过对食蟹猴受精卵一细胞时期显微注射Cas9 mRNA与sgRNA的混合体系,移植入代孕猴,成功构建定点基因敲除猴。通过对流产猴配子的基因鉴定,确认CRISPR/Cas9引入的基因编辑可以传递于配子,提示该基因编辑可以传递给子代。接着,针对食蟹猴Oct4(Pou5f1)基因3'UTR区设计sgRNA,并构建同源重组质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm,通过对食蟹猴受精卵显微注射Cas9 mRNA、sgRNA与供体质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合体系,移植入代孕猴,利用细胞同源重组修复机制,将外源hrGFP定点插入目的基因Oct4的3'UTR区,成功获得定点基因敲入食蟹猴。
  在研究基因缺陷导致的疾病中,除基因缺失而直接影响基因表达以外,大数据的筛查结果显示,许多单核苷酸改变的多态性或突变位点,或者短的碱基插入删除(Indel)也与多种疾病关联。为了很好地模拟人类疾病的这类遗传学改变,以及模拟该类致病突变位点的修复。本文利用单拷贝BFP基因的293T细胞系作为研究工具,优化ssODN的设计方法。针对BFP与GFP差异位点附近设计不同的ssODN和sgRNA,利用重组后细胞荧光的比例来判断重组效率。通过综合比较不同的设计的ssODN,以及ssODN与sgRNA的不同位置组合,发现利用互补链ssODN并且突变位点位于切口位置3'方向时,重组率相对较高。随后,利用CRISPR/Cas9系统,结合单链寡核苷酸供体(ssODN)进行小鼠胚胎共注射,利用ssODN作为同源重组模板,进行同源重组修复,成功构建了Usp42,Cep41,Fbxo47三个定点突变小鼠模型,为非人灵长类动物模型基于ssODN的基因编辑奠定了基础。
  本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类动物——食蟹猴,结合显微注射技术,成功构建出定点基因编辑食蟹猴。通过对阳性流产猴配子的基因鉴定,提示CRISPR/Cas9技术产生的基因编辑在食蟹猴中可以传递给子代。利用CRISPR/Cas9技术结合同源重组技术,获得了定点基因敲入食蟹猴。并利用细胞系和小鼠模型进一步优化了以ssODN作为同源重组模板进行点突变模型构建中的设计方案,根据ssODN与sgRNA相对位置的不同设计分组实验,发现ssODN的设计以及与sgRNA相对位置与重组效率有关,为进一步在灵长类模型的应用奠定了很好的基础。
[硕士论文] 许鑫鑫
妇产科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一章电热损伤法建立新西兰大白兔宫腔粘连模型
  目的:宫腔粘连(Intrauterine adhesions,IUAs)指因为各种因素造成子宫内膜基底层损伤,在创伤愈合过程中,子宫内膜表面出现局部瘢痕或形成粘连带粘连在一起,造成宫腔部分或完全闭塞,临床表现为月经失调、盆腔痛等,严重者可能导致闭经、不孕、自发性流产等结果,对女性生育功能有着重大的影响,是导致女性不孕的重要因素。然而目前其发病机制及治疗方法仍未明确和统一,因此建立一个稳定有效的宫腔粘连动物模型,则成为开展相关研究的前提和基础。本文旨在利用机械损伤和电热损伤法构建兔IUA模型,观察比较两种方法的建模效果。
  方法:42只成年雌性新西兰大白兔随机分为机械损伤组和电热损伤组,每组21只。两组分别以机械刮宫和医用多功能高频电刀电灼损伤兔一侧子宫内膜模拟宫腔粘连形成,以另一侧子宫作为自身对照,分别比较损伤侧和对照侧子宫病理变化、腺体数量、纤维化面积及胚胎个数,评估两种方法建模效果及造成的子宫内膜损伤对兔生育力的影响。其中机械损伤组兔的损伤侧子宫为M-A组,对照侧子宫为M-B组;电热损伤组兔的损伤侧子宫为E-A组,对照侧子宫为E-B组。分别在损伤后7d、14d和28d收集兔双侧子宫组织,行HE和Massoon染色观察两侧子宫内膜病理改变,并对两侧子宫内膜的腺体个数和内膜纤维化面积比进行统计学分析和比较。另外将损伤后7d的雌兔与成年雄兔合笼,14天后观察比较两侧子宫胚胎个数。
  结果:两种建模方法均未见明显纤维粘连带形成。病理组织学观察显示机械损伤组术后7d,M-A组损伤内膜腺体数量较B组减少,间质水肿、白细胞浸润,毛细血管充血、阻塞,可见少量新生毛细血管;术后14d和30d,M-A组和M-B组子宫内膜切片HE染色镜下显示并没有明显的差异,损伤后的子宫内膜已完全修复。电热损伤组建模术后7d,与E-B组相比,E-A组宫腔皱襞减少,表面稍平坦,基本被柱状上皮细胞覆盖,腺体数量明显减少,间质水肿、白细胞浸润,毛细血管充血、阻塞,可见少量新生毛细血管;术后14d,E-A组宫腔表面皱襞仍少,表面较平坦,上皮基本全部被柱状上皮细胞覆盖,腺体个数仍较少,间质水肿不再明显,可见少量白细胞浸润,新生毛细血管增多;术后28d,E-A组子宫内膜形态学基本恢复正常,可见较多新生腺体,未见间质充血和淋巴细胞浸润。
  机械组损伤后7d,M-A组子宫内膜腺体数量较M-B组减少,差异有统计学意义(P<0.05);机械损伤后14d、30d,M-A组子宫内膜腺体数量与M-B组相比差异无统计学意义。电热损伤后7d和14d,E-A组子宫内膜腺体数量较E-B组减少,差异均有统计学意义(P<0.05);而电热损伤后30d E-A组子宫内膜腺体数量与E-B组相比差异无统计学意义。
  机械损伤后7d,M-A组内膜纤维化面积比与M-B组相比差异无统计学意义;电热损伤后7d,E-A组内膜纤维化面积比较E-B组增大,差异有统计学意义(P<0.05)。
  M-A组子宫胚胎个数与M-B组相比差异无统计学意义;E-A组子宫胚胎个数较E-B组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:利用机械损伤法很难建立稳定有效的兔宫腔粘连模型。尽管未见明显纤维粘连带形成,电热损伤造成的胚胎个数的减少说明采用电热损伤法建立的兔宫腔粘连模型在损伤后7-14天是稳定有效的。
  第二章人离体子宫冷灌注及冷缺血保存的安全区间
  目的:离体子宫保存是子宫移植过程中需要解决的一项关键问题,良好科学的子宫灌注和保存方法是保证子宫移植成功的重要前提。本文旨在探讨人离体子宫利用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(Histidine-tryptophane-ketoglutarate,HTK)液冷灌注及冷缺血保存的安全区间,为子宫移植的相关研究及临床应用提供理论依据和参考。
  方法:样本为人离体子宫7例,来源于行子宫切除术的宫颈癌患者。其中3例用HTK液在低温条件下经子宫动脉灌注,测量并记录一定灌注压力所对应的灌注高度,建立灌注高度与灌注压之间的数学关系模型;4例在适当灌注高度下进行短时间冷灌注,然后立刻取子宫内膜及肌组织分别于HTK保存液和生理盐水(normal saline,NS)中保存,两组又根据保存时问(0、3、6、24h)的不同分为0h组、HTK3h组、HTK6h组、HTK24h组、NS3h组、NS6h组和NS24h组,利用光学和电子显微镜观察各组子宫组织细胞形态学改变,测定并比较各组子宫平滑肌收缩能力,分析离体子宫短时灌注后冷缺血保存的最佳时限。
  结果:灌注压90~140mmHg对应的灌注高度为62~122cm,理论灌注高度H与灌注压P关系公式为H(m)=(128μl1/πd14·n·Δv/60+128μl2/πd24·n·Δv/60+133·P)/(pg)-0.470。与0h组比较,HTK3h组和HTK6h组的子宫组织在光学和电子显微镜下形态学结构均未见明显改变,但HTK24h组及所有的NS组的子宫组织均出现不同程度的细胞水肿、细胞间失去联系、线粒体肿胀及染色质粗染等不可逆的退行性改变;HTK3h、HTK6h和HTK24h三组子宫肌组织的肌收缩力差异无统计学意义(P=0.772);而与相同时段HTK组标本相比,NS3h、6h和24h组子宫肌组织的肌收缩力均明显降低(P<0.05)。
  结论:人类离体子宫组织在低温环境下利用HTK液灌注的安全高度是62~122cm,理论灌注高度H与灌注压P关系模型公式为H(m)=(128μl1/πd14·n·Δv/60+128μl2/πd24·n·Δv/60+133·P)/(ρg)-0.470。人离体子宫短时灌注后于4℃ HTK液中保存可耐受冷缺血时间至少6h。
[博士论文] 袁静
神经病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及目的:
  创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI),是指一类由各种外伤导致脑组织严重损害的疾病,具有高发生率、高致残率等特点,它的致死率、致残率居创伤的首位[1]。仅在美国,每年大约有170万例新病例报告,导致约5%的人死亡,超过40%的人长期残疾,和有25%的成年人受到影响,无法在TBI后1年返回正常工作[2-4]。而在发展中国家,随着社会经济水平不断提高,交通工具的普及、建筑的大力发展、高刺激运动的引入等等,使TBI的发病率呈持续升高的趋势。在TBI后可以出现相关的临床症状,造成广泛的心理和身体的障碍,包括运动障碍、癫痫、人格改变、记忆障碍、感觉障碍等。所以,TBI是一个影响公众的主要的健康问题。然而,目前仍没有经过FDA批准的脑外伤的治疗,对它的研究迫在眉睫。
  血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)完整性的破坏参与了多种疾病的发生、发展,包括缺血、多发性硬化和神经退行性疾病比如AD、帕金森病等[5-8]。通过影像学研究发现人的血脑屏障完整性在TBI后被破坏[9]。Alluri等研究也发现脑外伤可引起BBB的完整性的损失,它可以不再是血管内皮和大脑之间完美的保护屏障,它的功能障碍导致液体、蛋白质和免疫细胞的渗出,从而形成血管源性脑水肿,继发一系列的神经损伤,甚至留下严重的神经功能障碍[10]。因此改善血脑屏障的破坏对于改善TBI的结局至关重要。
  生理状态下BBB对维持中枢神经系统内环境稳定具有重要意义。在血脑屏障的完整结构中,脑微血管内皮细胞由Occludin、Claudins和JAMS(junctionAdhesion molecules)三种跨膜蛋白连接形成,其与紧密连接蛋白中闭锁小带蛋白-1(Zonulaoccludens-1,ZO-1)直接或间接结合,连接到细胞骨架蛋白,稳定整体的连接结构。而liu等研究发现ZO-1和occludin对血脑屏障很关键[11]。有研究发现在一个大鼠的寒冷损伤模型中,皮层产生纯血管源性水肿,在caveolin-1的表达增加的同时,发现了occludin和claudin-5表达的减少[12]。
  此外,BBB的完整性,也为某些生理条件的影响,包括炎症和氧化应激。局部炎症反应可导致血脑屏障破坏。在这一过程中,促炎性细胞因子,包括IL-1、iNOS、MPO和MMP-9,均可由脑损伤引起,同时抗炎症相关因子arginase-1和IL-10因为保护作用被激活。研究还发现中风后过量的活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)导致血脑屏障完整性的破坏,而NOXs是ROS的主要来源。[13-20]
  综上所述,脑外伤后导致血脑屏障的破坏,而维系血脑屏障的紧密连接蛋白异常及炎症和氧化应激均会导致血脑屏障通透性增加,从而出现血管源性水肿、颅内压增高,出现相应的临床症状,而治疗上目前无FDA批准的脑外伤的治疗,既往研究发现格列本脲、柴胡皂甙、丁酸钠等药物对创伤性脑损伤后的血脑屏障的破坏有保护作用,且Yang等对既往中草药治疗TBI的文献进行meta分析,结果显示中药对TBI治疗有益,且有明显的统计学意义,但有局限性,表明更精心设计和报告的动物研究是必要的[21-24]。
  虫草素(cordycepin)又称虫草菌素,具有抗炎、清除体内自由基抗氧化、抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、降血糖、降血脂等作用[25],Tuli等研究发现虫草素能明显减弱促炎症因子的水平,包括NO、PGE2、TNF-α和IL-1,同时增加抗炎因子的表达,如IL-10[26]。此外,虫草素可减少与年龄相关的氧化应激,改善大鼠抗氧化能力[27]。虫草素通过抗氧化性能和抑制凋亡细胞死亡来发挥对海马细胞的神经保护作用[28]。因此,有必要探讨虫草素是否对脑外伤后血脑屏障受损有保护作用。
  本实验通过使用TBI大鼠作为体外模型,运用多种技术,包括神经缺损严重程度的评价、伊万思蓝评估、实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA等,来探讨虫草素是否通过抑制炎症、抗氧化应激和紧密连接蛋白的减少来改善脑外伤后的血脑屏障破坏,并为临床上找到一种治疗TBI的新办法。
  方法:
  1.使用SD大鼠随机分组并通过经典的控制皮层冲击伤装置制作TBI大鼠模型。
  2.损伤严重程度的评价。根据1996年chen[29]等进行神经损伤严重程度评分,采用10分量表,0分代表正常,10分代表最严重的神经功能缺损。
  3.脑含水量的测定:按照Hatashita等应用干湿重法测定伤后24小时脑组织含水量。
  4.伊文思蓝的评价:通过术后伊万思蓝渗漏评价BBB的通透性。
  5.实时荧光定量PCR:损伤24小时后,组织匀浆后应用RNA裂解缓冲液,根据试剂盒指示分别提取RNA、合成cDNA和其后的qPCR来测定ZO-1、occludin、IL-1β、iNOS、MMP-9、arginase-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4、GADPH作为内参对照。
  6.Western blotting:如上所述,收集24小时后损伤组织,应用Westernblotting来观察组成血脑屏障的ZO-1和Occludin的表达情况。
  7.ELISA:参照western blotting方法提取损伤24小时后总蛋白,根据试剂盒的指示来检测IL-10。最后结果是以pg/mg来显示.
  8.评估MPO和NOX的活性:应用MPO测试盒(比色法)和光泽精增强化学发光法来评估MPO和NOX的活性。
  9.统计:统计学处理所有数据采用GraphPad Prism软件统计分析(GraphPad软件、美国),用单因素方差分析和Tukey的事后检验法。P值小于0.05被视为统计学意义。每项实验至少重复三遍。
  结果:
  1.虫草素治疗能改善TBI诱导的损伤,但呈剂量依赖
  假手术组大鼠接受相同的手术,但均没有影响皮质。TBI大鼠分别用生理盐水(对照组)或虫草素(1、5、10和20mg/kg)。不同实验组动物的脑卒中严重程度以神经系统损伤严重程度评分、脑含水量为特征。我们的研究结果表明,比假手术组,TBI大鼠有较高的神经功能缺损程度评分和更多的脑水含量。此外,给予虫草素干预治疗后,比对照组表现出较低的神经功能缺损程度评分和较少的脑水含量,表明虫草素可以治疗脑外伤引起的损伤。此外,虫草素的治疗作用具有剂量依赖性,在我们的实验中,20mg/kg的虫草素改善TBI的效果最好。
  2.虫草素治疗可保护TBI后的BBB的完整性。
  伊万思蓝可以评定BBB的完整性,因为伊万思蓝渗漏与BBB完整性的损失呈正相关。我们的研究发现对照组血脑屏障完整性受损,而20mg/kg虫草素治疗组可部分挽救TBI诱导的BBB完整性的损失。伊万思蓝的含量分析进一步证实,虫草素可治疗TBI诱导的血脑屏障完整性受损。此外,假手术组大鼠,作为阴性对照组,在受损的对侧,伊万思蓝含量和虫草素处理组没有差异。
  3.虫草素能减轻TBI诱导的同侧皮层紧密连接蛋白的损失。
  假手术组和TBI组相比较,假手术组大鼠的ZO-1和occludin转录水平较低。此外,在假手术组大鼠和假手术组+虫草素组之间及TBI+对照组和TBI+虫草素组之间ZO-1和occludin的mRNA水平各自相似。其后通过免疫印迹法检测两者的蛋白表达水平,结果显示与mRNA结果一致,TBI大鼠组(TBI+对照组和TBI+虫草素组)ZO-1和occludin蛋白水平较低。然而,对ZO-1和occludin蛋白条带强度的统计分析证实TBI+虫草素组显著高于TBI+对照组,表明虫草素能减轻TBI诱导紧密连接蛋白的损失,但不影响基因。总之,虫草素可能在转录后水平发挥神经保护作用。
  4.虫草素能抑制脑损伤同侧大脑的局部炎症。
  我们分析了促炎因子和抗炎因子的水平,包括IL-1β、iNOS、MMP-9、MPO和arginase-1、IL-10,正如预期的那样,局部炎症在TBI后同侧大脑引起,但被虫草素抑制。同时,TBI诱导的脑损害刺激抗炎症因子产生,而虫草素可以进一步加强这种作用。
  5.虫草素能抑制NADPH oxidase(NOX)在TBI后同侧大脑的表达和活性。
  我们的研究结果证实,脑损伤大鼠组NOX活性比对照组高,而虫草素治疗TBI大鼠组比TBI对照组大鼠NOX活性低。NOX-1、NOX-2和NOX-4是中枢神经系统中存在NOXs的三种类型[31]。我们进一步研究三种NOXs的mRNA的表达水平,发现在TBI诱导的大鼠中只有NOX-1,它却在TBI大鼠中虫草素治疗后被抑制。但NOX-2和NOX-4不受TBI诱导的损伤影响,也不被虫草素治疗影响。
  结论:
  1.虫草素对脑外伤引起的脑损伤有保护作用,且呈剂量依赖性。
  2.虫草素可以改善脑外伤引起的血脑屏障的破坏。
  3.虫草素对血脑屏障的保护可能是通过恢复紧密连接蛋白ZO-1和occludin的转录后表达水平、抑制局部炎症反应和降低NOX-1的活性来实现。
  意义:
  1.我们对虫草素改善创伤性脑损伤后血脑屏障完整性损害的机制进行了探讨,首次提出虫草素对脑外伤后血脑屏障的保护作用,发现虫草素可以通过减少血脑屏障相关的紧密连接蛋白转录后表达的丢失和通过抑制NOX-1而不是NOX-2、NOX-4的活性来改善脑外伤后血脑屏障的损害。
  2.虫草素治疗创伤性脑损伤大鼠有效,为我们治疗创伤性脑损伤提供了一个新的治疗方法,具有广阔的前景。
[硕士论文] 李庆华
口腔医学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:本研究旨在阐明不同处理方式治疗髁状突囊内骨折与创伤性颞下颌关节强直发生的关系,初步探讨髁状突囊内骨折继发颞下颌关节强直的机理,为髁状突囊内骨折治疗方法的选择及预防创伤性颞下颌关节强直发生提供可靠的数据支持。
  方法:本研究采用手术方法模拟髁状突囊内骨折建立小型猪动物模型。在实验动物模型建立的基础上进行对照实验,根据不同的治疗方式将实验动物分为生理盐水组、地塞米松组、钛板固定组和自然愈合组。其中自然愈合组为对照组,其它三组为实验组。1.术后6个月,通过大体标本观察、影像学和组织学检查评价各组颞下颌关节强直的形成。2.利用免疫组织化学染色定性检测各组颞下颌关节中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein2,BMP2)的表达情况。3.利用RT-PCR和Western Blot技术相对定量检测各组颞下颌关节中VEGF、OCN、OPN和BMP2的mRNA和蛋白表达改变。
  结果:
  1.通过大体标本观察、影像学和组织学检查发现,各实验组颞下颌关节强直发生率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.免疫组织化学染色定性检测发现,各实验组颞下颌关节中VEGF、OCN、OPN和BMP2的平均光密度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。
  3.RT-PCR实时定量分析发现,实验组颞下颌关节中VEGF、OCN、OPN和BMP2的mRNA表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。
  4.Western Blot检测发现,VEGF、OCN、OPN和BMP2在实验组颞下颌关节中的蛋白表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  1.小型猪髁状突囊内骨折实验动物模型的建立具有可重复性,该动物模型能为探索创伤性颞下颌关节强直的发生机制提供研究平台。
  2.不同处理方式治疗髁状突囊内骨折与创伤性颞下颌关节强直的发生率密切相关。
  3.将骨折复位并采用微型钛板固定,且将移位的关节盘复位固定可以有效减少颞下颌关节强直的发生。
  4.地塞米松局部注射于关节腔内可有效预防颞下颌关节强直的发生。
  5.清理骨创间血肿、减少骨创面的暴露及抑制新骨过度修复是预防关节强直发生的关键因素。
[硕士论文] 毛越
针灸推拿学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  现观察针刺足少阳胆经是否对SD大鼠的脂代谢(体重、摄食量、Lee`s指数及血清瘦素、骨钙素、ACTH等指标)是否具有调节作用。为今后进一步探讨针刺足少阳胆经在大鼠体重控制中的机制积累资料。方法:清洁级雄性,雌性SD大鼠各20只,实验动物由重庆腾鑫实验动物中心提供,体重(180-250)g。首先将实验动物饲养一周以适应环境,饲养于温度22-26℃,相对湿度60-80%的清洁级动物实验室,采用普通饲料喂养,一周后选取雌、雄两组体重组内比较相差在±15g以内的大鼠纳入实验。依照随机对照实验原则,按随机数字随机选取5只雄性、5只雌性纳入电针胆经组,5只雄性、5只雌性纳入对照组。行连续四周电针干预。干预经穴:阳陵泉、环跳、悬钟;对照组:与电针组同时以相同方式进行绑扎,但不作针刺干预。实验前三周每两天检测记录大鼠的体重,饮食量,饮水量。第四周每天检测以上数据。实验前后分别测大鼠身长,用于计算Lee’s指数。干预28天后处死,处死前禁食12h,不禁水,用电子台秤称其重量,用2%戊巴比妥钠按0.2-0.3ml/100g体重腹腔注射麻醉;动物麻醉后开腹从腹主动脉取血10mL,置4℃冰箱24h,待血清分离后(2000转/分钟,10分钟),取血清置-80℃低温冰箱保存,待测各项生化指标。促肾上腺皮质激素(ACTH)的测定:用化学发光法测定(西南医科大学附属医院核医学科)。血清瘦素(leptin)的检测用ELISA法测定,采用市售试剂盒(R&D Systems)。骨标志物标血清骨钙素(BGP)测定:用ELISA法测定,采用市售试剂盒(见前主要试剂),按说明书进行稀释、加样、孵育、洗板等。
  结果:
  1.一般情况和行为学情况,实验开始前雌雄电针组分别与对应的雌雄对照组比较,体重,饮食量,饮水量,鼠毛色泽及活动量无明显差异。经统计学分析,雄性电针组较雄性对照组实验前体重,饮食量两者之间无统计学差异。雌性电针组较雌性对照组实验前体重,饮食量两者之间无统计学差异。
  2.体重变化:实验1周后,雄性电针组较雄性对照组体重降低,具有统计学意义(P<0.05);雌性电针组较雌性对照组体重有所降低,两者之间无统计学差异;从实验第2周至第4周,雄性电针组较雄性对照组体重降低,两者间具有统计学意义(P<0.05);雌性电针组较雌性对照组体重降低,两者间具有统计学意义(P<0.05)。实验4周后,雄性电针组体重较实验前有所增加,两者间具有统计学意义(P<0.05)。但是较雄性对照组体重明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。雌性电针组体重较实验前有所降低,两者之间无统计学意义。但是较雌性对照组体重明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。
  3.饮食量变化:实验第1、2周,雄性电针组较雄性对照组饮食量降低,两者间具有统计学意义(P<0.05),实验第3、4周,雄性电针组较雄性对照组饮食量,两者之间无统计学意义。整个实验过程中,雌性电针组较雌性对照组饮食量差异较小,无统计学意义。
  4.实验开始前,电针组与对照组大鼠Lee`s指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验前,雄性大鼠较雌性大鼠Lee`s指数大,差异有统计学意义(P<0.05)。经过4周的干预处理后,雄性电针组较雄性对照组Lee`s指数降低,两者差异有统计学意义(P<0.05)。雌性电针组较雌性对照组Lee`s指数讲低,两者差异有统计学意义(P<0.05)。雄性电针组实验后较自身实验前Lee’s指数降低,两者差异有统计学意义(P<0.05)。雌性电针组实验后较自身实验前Lee`s指数降低,两者差异有统计学意义(P<0.05)。雄性对照组实验后较自身实验前Lee`s指数无显著差异。雌性对照组实验后较自身实验前Lee`s指数无显著差异。
  5.促肾上腺皮质激素(ACTH)含量:雄性电针组较雄性对照组ACTH差异显著,两者间具有统计学意义(P<0.05)雌性电针组较雌性对照组ACTH差异显著,两者间具有统计学意义(P<0.05)。
  6.血清骨钙素(BGP)含量:雄性电针组较雄性对照组BGP含量无显著差异,无统计学意义。雌性电针组较雌性对照组BGP差异显著,两者间具有统计学意义(P<0.05)。雄性对照组与雌性对照组间BGP含量无显著差异,无统计学意义。雄性对照组与雌性对照组间BGP含量差异显著,两者间具有统计学意义(P<0.05)。
  7.血清瘦素(leptin)含量:针刺足少阳胆经对不同性别正常大鼠leptin含量影响,无统计学差异。
  结论:
  1.电针足少阳胆经穴可能具有降低正常SD大鼠体重,以及Lee`s指数的效应。
  2.针刺足少阳胆经穴导致的正常SD大鼠体重减轻与其调节血清骨钙素含量之间未发现确切关联。
  3.针刺足少阳胆经穴导致的正常SD大鼠体重减轻的机制可能与大鼠体内ACTH含量降低有关。
  4.针刺足少阳胆经穴对不同性别的大鼠减重机制可能不同。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部