绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 5324 条结果
[硕士论文] 汪沛
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  牙周炎是影响口腔健康导致失牙的主要原因,传统的治疗方案仅能改善牙周环境难以修复牙周炎引起的牙槽骨缺损。牙周组织工程通过构建细胞和多种材料的复合体并移植于牙槽骨缺损处,起到重建牙周组织、治疗疾病的作用。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周膜中具有自我增殖与多向分化潜能的干细胞,运用于牙周组织工程可显著增强牙周组织的形成和修复能力。骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins-9,BMP9)是优秀的成骨生长因子,已证实其具有较好的促干细胞成骨分化的能力,但对其作用机制尚不明确。有学者提出BMP9的作用机制包含Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins,Smads)传递信号为主的BMPs-Smad经典通路,以及通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)传递信号的BMPs-MAPK非经典途径,其中BMPs-Smad经典通路已获得学术界普遍认可,但对于BMPs-MAPK途径尚处于探索和初级研究阶段。MAPK通路下游底物与骨生长发育并没有直接关系,但有研究报道部分MAPK家族成员参与BMPs促成骨分化,因此猜测MAPK是通过串话其他通路参与BMPs诱导成骨的过程。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)作为MAPK家族重要成员,尚没有在BMP9促进成骨分化的作用和机制中有研究报道。此前有学者证实JNK与Smad2/3蛋白可以发生相互作用,这为两条通路的串话提供了前提,但是目前为止,尚未有JNK通路和Smad2/3通路在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中是否发生串话以及如何发生串话的文献报道。为了明确JNK通路是否在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用,以及JNK通路是否串话Smad信号通路,如何进行串话等问题,本项课题将深入研究讨论。
  研究方法:
  1.从牙周膜组织中通过改良组织块贴壁法获取离体细胞,通过CD146免疫磁珠分选获取PDLSCs,之后进行细胞表面标志物鉴定、组织来源鉴定、成骨分化和成脂分化能力鉴定。
  2.构建过表达Ad-BMP9载体,检测其对PDLSCs合适的感染剂量(multiplicities of infection,MOI)后诱导PDLSCs成骨分化,检测BMP9、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙蛋白(osteoclain,OCN)等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性等指标,分析BMP9促进PDLSCs成骨分化的能力。
  3.通过SP600125和AdR-si-JNK抑制或干扰JNK通路,验证干扰效果后,检测Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标,判断JNK通路是否参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化。通过抑制或干扰JNK通路,检测Smad2/3和p-Samd2/3的蛋白表达,判断JNK通路是否与Smad通路有密切关系,最后通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测p-JNK是否与Smad2/3发生反应。综合分析后,判断JNK通路是否串话Smad通路并在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用。
  4.向裸鼠肌肉内移植过表达BMP9的PDLSCs,使用腺病毒干扰JNK通路,通过影像学和HE染色对比未干扰JNK通路裸鼠异位成骨状态,鉴定分析JNK通路对BMP9诱导PDLSCs体内成骨的影响。
  研究结果和结论:
  1.经磁珠分选所得的细胞同时表达CD146阳性和STRO-1阳性比例约占27.9%;免疫荧光染色显示角蛋白阴性、波形蛋白阳性,表示细胞为中胚层来源的间充质细胞,且无外胚层来源细胞的污染;茜素红S染色和油红O检测表明分选后细胞具有成骨和成脂的多向分化潜能。
  2.荧光表达显示Ad-BMP9感染PDLSCs的MOI值为30-60,感染之后BMP9基因蛋白明显增高,表明构建的腺病毒有效;此外Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白和ALP活性均较对照组明显增高,结果具有统计学意义,证明BMP9具有诱导PDLSCs成骨分化的作用。
  3.分别抑制或干扰JNK通路后,p-JNK蛋白表达下降,证实JNK通路受到影响;干扰之后Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标均有不同程度下降,结果具有统计学意义,表明JNK通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化;此外p-Smad的蛋白也随着JNK通路被干扰而表达下降,证实JNK通路与Smad通路关系密切,最后通过Co-IP检测证实p-JNK和Smad2/3存在相互作用,结果表明JNK通路是通过串话Smad通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化的过程。
  4.影像学结果显示,添加干扰JNK通路的BMP9诱导PDLSCs体内成骨模型,所形成的异位骨或骨样组织的体积和骨密度均小于未经干扰的裸鼠;HE染色显示干扰组成骨进程处于早期,并落后于未经干扰的组,结果与体外结论类似,这表明JNK通路是BMP9诱导PDLSCs体内成骨分化的重要途径,但不是唯一途径。
[博士论文] 江浩
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  龋病是一种危害人类健康的的全球性疾病。自从病因学研究证实龋病为一种细菌感染性疾病以来,人们就有关龋病的相关微生物及免疫学方面的课题做了深入的研究。大量的证据表明变异链球菌(Streptococcus mutans,变链菌)与龋病的发生、发展密切相关,是目前公认的主要致龋菌,而与其致病相关的抗原成分已被用于免疫防龋的开发和研究。
  变链菌在牙面的粘附和聚集是其在口腔定植和致病的前提和基础。与此相关的毒力因子,如表面粘附分子AgⅠ/Ⅱ(PAc)和葡糖基转移酶(GTF)在此过程中起到了关键性的作用。首先,变链菌在牙面的附着有赖于PAc的功能结构域一唾液结合区段(Saliva-binding region,SBR);而在牙面的聚集和菌斑的形成有赖于GTF合成的不溶性葡聚糖(变聚糖)。实验表明针对PAc和GTF功能域(即唾液结合区域SBR和葡聚糖结合区域GBR)的抗体能有效阻止变链菌在牙面的定植。
  在前期的研究中我们已经成功地克隆出了编码SBR和GBR的基因片段sbr和gbr,并构建了包含有sbr或/和gbr的多种DNA质粒,本实验为探求提高免疫效能的免疫方法,采用了含有CMV和nirB的双启动子表达质粒pCMVnir,并利用减毒沙门氏菌SL3261作为载体进行肠道粘膜免疫,以期获得满意的免疫效果。本研究中我们首先通过DNA疫苗的体外表达我们验证了双启动子CMV和nirB在原核载体SL3261和真核细胞中调控抗原表达的功效。然后通过胃肠粘膜免疫我们在BALB/c小鼠身上探索了双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG的免疫原性,和其诱导的免疫反应,并且通过动物实验评价了其作为防龋疫苗对变链菌的抗定植作用。
  方法:
  第一部分:沙门菌运载的粘膜疫苗pCN-SS/SG在小鼠体内诱导的免疫反应
  1.使用前期构建的pTriEx-4-SBR和pTriEx-4-GBR质粒在JM109(DE3)大肠杆菌表达体系中诱导表达SBR和GBR,并用HisTrapTM试剂盒加以纯化来免疫BALB/c小鼠以制备抗SBR和GBR的多克隆抗体。
  2.利用前期研究中构建的质粒pCN-SS/SG和pCN-SSIE分别转化减毒沙门氏菌SL3261,和转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,并培养其转化株。
  3.将转染后的CHO细胞培养48小时,SL3261转化株在无氧条件下过夜培养,利用荧光显微镜和Western blot检测目的基因的表达情况。
  4.将pCN-SS/SG转化的SL3261于体外无抗生素的培养基中连续培养5天;并用SL3261/pCN-SS/SG口服免疫小鼠,于免疫后的不同时间点检测小鼠肝脏、脾脏、小肠PP结中沙门菌的定植情况,以及质粒pCN-SS/SG体内、外的稳定性。
  5.分别用携带质粒pCN-SS/SG或pNir-SS/SG的减毒沙门氏菌于第1和第16周通过胃肠途径免疫BALB/c小鼠,并于初次和再次免疫后动态监测小鼠血清和唾液中抗原特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgA的产生情况,以及小鼠脾细胞的Th1/Th2因子分泌情况。
  第二部分:DNA疫苗pCN-SS/SG抗变链菌定植的小鼠实验
  1.用pCN-SS/SG转化的减毒沙门氏菌SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠,同时用SL3261/pNir-SS/SG免疫组作为阳性对照,用SL3261/pCMVnir免疫组作为阴性对照。
  2.第二次免疫两周后,用S.mutans UA159分别口腔接种三组BALB/c小鼠,接种前后用棉签取样检测变链菌的情况。
  3.然后从接种后的不同时间点,即第一周至第八周检测小鼠口腔中变链菌的定植情况。
  结果:
  1.克隆抗原SBR和GBR在原核启动子nirB和真核启动子CMV的调控下,能在沙门氏菌载体SL3261和真核细胞中各自稳定地表达,在信号肽的协助下,并能可溶性地分泌至细胞外。
  2.质粒持续性测试表明,pCN-SS/SG能稳定地存在于生长的SL3261中,而SL3261/pCN-SS/SG能在宿主内生存4周以上。
  3.SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠后,诱发了血清IgG和唾液分泌性IgA的产生,再次免疫后抗体反应获得显著增强,并维持在较高水平且明显强于SL3261/pNir-SS/SG诱导的抗体反应。
  4.IgG亚类及细胞因子分析表明,SL3261/pCN-SS/SG免疫后的小鼠血清中不仅诱导出抗原特异性IgG2a而且有IgG1;同时脾细胞经SBR和GBR刺激后产生了Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-10)细胞因子,且SL3261/pCN-SS/SG免疫组水平明显高于SL3261/pCMVnir对照组。
  5.在接种后的第一至八周,pCN-SS/SG和pNir-SS/SG免疫组中的变链菌水平显著低于阴性对照和空白对照组,而在第三至八周,pCN-SS/SG免疫组中的变链菌又显著低于pNir-SS/SG免疫组,且持续维持在低于空白对照组99%的水平。
  结论:
  1.双启动子CMV-nirB在载体菌SL3261和真核细胞中能很好地控制克隆抗原的表达;且表达质粒pCN-SS/SG与载体菌SL3261有很好的相容性,在宿主体内可存在较长时间。同时免疫结果表明,以减毒沙门氏菌SL3261作载体,双启动子(CMV-nirB)防龋疫苗的粘膜免疫效果,无论是在免疫强度还是持续时间上,都要优于单启动子nirB。
  2.以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG表现出更强的抗变链菌定植的作用,而优于单启动子。
  综上所述,本实验以构建的pCN-SS/SG质粒作为抗龋DNA疫苗,以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,成功诱导出针对变链菌PAc和GTF抗原的粘膜免疫反应。与nirB启动子单独使用相比,CMV-nirB双启动子能高效地诱导唾液IgA,从而更有效地阻止变链菌在牙面的定植。CMV-nirB这一双启动子系统作为新的策略应用于粘膜免疫,充分利用了共同粘膜免疫系统,为龋病及其它相关粘膜疾病的防止展示了有价值的前景。
[硕士论文] 白银
口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过CBCT对C1、C2型根管进行扫描,测量比较颊舌侧管壁最小厚度及分布,来指导临床应用,避免根管预备意外的发生;通过比较三种预备方法应用于24颗根管类型为C1、C2型的下颌第二恒磨牙的预备效果,探索一种能够相对有效的预备下颌第二恒磨牙C型根管的方法。
  方法:
  收集根管类型为C1、C2型的下颌第二恒磨牙离体牙,各12颗。按不同分型将样本采用区组随机法分为ProTaper镍钛旋转根管锉与用NSK回旋手机载02锥度不锈钢K锉联合预备组(机用联合组)、ProTaper镍钛旋转根管锉与手用不锈钢K锉联合预备组(手用联合组)、ProTaper镍钛旋转根管锉预备组(ProTaper组)。每组每种类型各4颗。在根管预备前进行CBCT扫描和三维重建,测量C型根管距根尖2mm、5mm、8mm处影像颊舌侧根管壁的最小厚度,进行方差分析;记录C型根管距根尖2mm、5mm、8mm处影像颊舌侧根管壁的最小厚度的位置,进行卡方检验。根管预备后再进行CBCT扫描和三维重建,将预备前后同一截面影像重叠,评价各组器械根管预备后根管未预备面积百分比。采用SPSS20.0软件包进行数据统计及方差分析。
  结果:
  1.24颗下颌第二恒磨牙舌侧根管壁最小厚度均小于颊侧根管壁最小厚度(P<0.05);根冠部及根中部的颊舌侧根管壁最小厚度在根面沟中央区多见,根尖部则在近远中区多见。
  2.3种方法预备下颌第二恒磨牙的C1、C2型根管均有未预备区域。ProTaper镍钛旋转根管锉与用NSK回旋手机载02锥度不锈钢K锉联合预备组分别在根冠部[未预备面积百分比为(6.60±4.23)%]及根中部[未预备面积百分比为(13.87±2.61)%]未预备面积较小; ProTaper镍钛旋转根管锉与手用不锈钢K锉联合预备组分别在根中部[未预备面积百分比为(13.91±1.92)%]及根尖部[未预备面积百分比为(13.43±2.06)%]未预备面积较小。
  结论:
  1.下颌第二恒磨牙C1、C2型根管的舌侧根管壁较薄,是根管预备过程中侧穿危险区。
  2.对于下颌第二恒磨牙的C1、C2型根管的机械预备方式宜采用 ProTaper镍钛旋转根管锉预备主根管,使用NSK回旋手机载02锥度不锈钢K锉水平运动方向的预备方式预备峡区的根冠部,手用不锈钢K锉沿根管方向提拉式预备峡区的根中部及根尖部。
[硕士论文] 李芳芳
口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过检测复发性阿弗他溃疡(Recurrent aphthous ulcers,RAU)伴肥胖(Obese, OB)患者、单纯RAU或OB患者与健康人的血清胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)情况及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,分析RAU对肥胖个体IR情况的影响及与TNF-α的相关性,为指导RAU患者进行IR的早期筛查、诊断和干预,以预防前期糖尿病的发生并延缓其向糖尿病的转化提供参考依据。
  方法:
  本研究随机选择了于2015年11月至2016年12月在山西医科大学第一医院口腔科门诊就诊并被确诊为轻型RAU的40例患者,根据身体质量指数分为RAU伴肥胖组(20例)和RAU组(20例);并选择同期就诊于山西医科大学第一医院体检中心既往无RAU病史的40例志愿者,根据身体质量指数分为肥胖组(20例)和对照组(20例)。四组分别应用美国贝克曼库尔特公司生产的AU5821系列全自动生化分析仪使用已糖激酶法检测血清中空腹血糖含量,中国科大创新有限公司生产的GC-1200γ放射免疫计数器使用放射免疫法检测血清中空腹胰岛素含量,并通过公式计算得出胰岛素抵抗指数HOMA-IR分值,采用美国分子仪器公司生产的连续波长酶标仪使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-α含量。由同一名口腔科医师对患者进行口腔黏膜检查并记录RAU发作的部位、大小及数目。收集并记录四组个人资料包括年龄,性别,身高,体重及既往病史以及检测、计算所得数据。采用SPSS22.0统计分析软件根据实验数据行统计学分析,并认为P<0.05时结果有统计学差异。
  结果:
  1. TNF-α含量RAU+OB组高于RAU组和OB组(P<0.05, P<0.05);RAU组和OB组高于对照组(P<0.05, P<0.05)。RAU与OB均可作为主效应影响TNF-α含量(P<0.05,P<0.05),且两者具有相互协同作用(P<0.05)。
  2.空腹血糖浓度RAU+OB组高于RAU组(P>0.05);RAU+OB组高于OB组(P<0.05);RAU组和OB组高于对照组(P>0.05,P>0.05);RAU可作为主效应影响血糖浓度(P<0.05),OB对血糖浓度无明显影响(P>0.05),两者无明显交互作用(P>0.05)。
  3.空腹胰岛素浓度RAU+OB组高于RAU组和OB组(P<0.05,P<0.05);RAU组和OB组高于对照组(P<0.05,P<0.05)。RAU与OB均可作为主效应影响胰岛素浓度(P<0.05,P<0.05),但两者无明显交互作用(P>0.05)。
  4. HOMA-IR值RAU+OB组高于RAU组和OB组(P<0.05,P<0.05);RAU组和OB组高于对照组(P<0.05,P<0.05)。RAU与OB均可作为主效应影响HOMA-IR值(P<0.05,P<0.05),但两者无明显交互作用(P>0.05)。
  5.相关性分析显示,血清TNF-α含量与HOMA-IR分值呈正相关性(P<0.05)。结论:
  1. RAU患者处于活动期时可能存在机体血清TNF-α、IR表达水平升高的现象,在肥胖个体更加明显。
  2. RAU患者处于活动期时可能存在机体血清空腹血糖浓度升高的现象。
  3.血清TNF-α表达水平与胰岛素抵抗指数呈正相关。
[硕士论文] 樊彧丰
口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  目前对于根管冲洗剂的研究大多拘泥于 MTAD与次氯酸钠的各自原始研究上,研究指出两者存在去除玷污层、杀灭细菌以及溶解牙髓这三点共性,基于此本文通过循证医学系统评价的方法来客观判定 MTAD能否取代(部分取代)次氯酸钠在临床上的使用,探索 MTAD与次氯酸钠在玷污层去除能力以及杀菌能力方面能否替代;对 MTAD与次氯酸钠在玷污层去除能力、杀灭粪肠球菌能力、杀菌有效率三者的差异进行统计学假设检验;
  方法:
  通过检索Pubmed、Embase、Ovid MEDLINE(R) In-Process&Other Non-Indexed Citations, Ovid MEDLINE(R) Daily and Ovid MEDLINE(R)(via.ovid)、Cochranelibrary、CNKI、WANFANGDATA、SinoMed等数据库,并手工检索山西医科大学图书馆以及山西医科大学口腔医院牙周科藏书,相关会议文献,以及所有纳入研究的参考文献。严格按照 PICOS原则、纳入和排除标准,对所纳入文献进行数据提取以及偏倚风险评估。分别选择SMD、OR作为效应量指标对MTAD与次氯酸钠之间玷污层去除能力以及其杀菌有效率采用revman5.3进行META分析。当50%<I2<75%对其实验设计、实验器械及实验地点进行分析,未能找到者选择随机效应模型,谨慎接受结果;当I2>75%且异质性无法找出之者,进行描述性系统评价报道各个文献的研究过程及结果,对效应量不进行合并,采用Greadpro3.6.1对结局指标进行评级,使用AMSTAR量表评估方法学。
  结果:
  本课题共检出文章220篇,经过初筛剩余文献21篇,复筛之后排除6篇,最终纳入15篇,对照组与试验组总共483例样本,根据各结局指标分组,分别进行META分析及系统评价,META分析结果显示:在玷污层去除能力纳入4项研究,样本共计60例,其合并效应量95%可信区间是:-1.58[-2.35,-0.82],Z检验结果Z=4.07,P<0.0001,说明在次氯酸钠组与MTAD组在玷污层去除能力上差异具有统计学意义;杀灭粪肠球菌能力纳入研究3项,样本量在103例,其合并效应量95%CI:0.26[-0.14,0.65],其结果 P=0.2,说明研究结果次氯酸钠组与 MTAD组在杀灭粪肠球菌能力上差异不具有统计学意义;抑菌环直径纳入研究4项,样本量100例,因异质性为96%故放弃合并统计量的计算,转作描述性评价,针对异质性讨论结果来说,本课题并未将四者做合并,而是分述四者的结果统计:Tay组未通过无效线,95%CI:3.89[2.62,5.17];而李新军组通过无效线,95%CI:-0.43[-1.15,0.30];于鑫未通过无效线,95%CI:16.17[11.10,21.23];Torabinejad,通过无效线,95%CI:0.36[-0.63,1.35];在杀菌有效率OR这一指标中,纳入研究4项,样本量共计220例,其合并效应量Z=4.72、95%CI:14.80[4.84,45.29],说明在次氯酸钠组与MTAD组在杀菌有效率上差异具有统计学意义。
  结论:
  通过META分析可以得出:MTAD在玷污层去除能力和杀菌有效率就目前资料来说是优于次氯酸钠,两者在杀灭粪肠球菌能力上不认为有差别;对于两者在抑菌环指标上所展现的性能优劣,就目前所获的资料中尚不能得出一个如是或者否一样有明确意义的清晰结论。
[硕士论文] 王锦华
临床口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分实验:
  目的:
  观察NF-κB非经典通路IKKα介导的Maspin在HPDLCs中的表达。
  方法:
  组织块法原代培养HPDLCs,倒置显微镜及SP免疫组化鉴定细胞来源。CCK-8检测LPS对HPDLCs增殖的影响。免疫细胞化学定位Maspin在HPDLCs中的表达位置。实验分空白对照组(NC)、LPS1-4组(LPS终浓度分别为0.1,1,10,50 mg/L), RT-PCR及Western Blot分别检测不同浓度LPS刺激下HPDLCs中Maspin、IKKαmRNA及蛋白的表达,ELISA检测炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。
  结果:
  免疫细胞化学显示Maspin在正常与LPS刺激的HPDLCs中均呈胞浆表达。Western Blot结果显示,随着LPS浓度增加Maspin蛋白表达逐渐下调,呈浓度依赖性,LPS1-4组与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05);IKKα蛋白表达逐渐上调,呈浓度依赖性,LPS1-4组与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05);且二者相关性分析可知,Maspin蛋白与IKKα蛋白表达呈负相关(r=-0.959,P<0.05)。mRNA表达与蛋白表达趋势相同。ELISA结果显示,NC组中TNF-α、IL-1β分泌量较低,加入LPS刺激后,TNF-α、IL-1β随着LPS浓度增加分泌增加,与Maspin蛋白表达呈负相关。
  结论:
  Maspin在人牙周膜细胞中呈胞浆表达,且LPS刺激下人牙周膜细胞中NF-κB非经典通路IKKα介导的Maspin表达下调,并与TNF-α、IL-1β呈负相关。
  第二部分实验:
  目的:
  观察黄芩苷对HPDLCs中IKKα介导的Maspin表达的影响。
  方法:
  CCK-8检测黄芩苷对HPDLCs增殖的影响。实验分空白对照组(NC组:黄芩苷终浓度为0 mg/L,LPS终浓度为0 mg/L)、LPS刺激组(黄芩苷终浓度为0 mg/L,LPS终浓度为10 mg/L)、黄芩苷+LPS1-4组(黄芩苷终浓度依次为0.01,0.1,1,10 mg/L, LPS终浓度为10 mg/L),RT-PCR及Western Blot分别检测药物作用下Maspin、IKKαmRNA及蛋白的表达,ELISA检测炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。
  结果:
  LPS组与NC组相比Maspin蛋白表达下调,IKKα蛋白表达上调(P<0.01)。黄芩苷+LPS1-4组与LPS组相比,随着黄芩苷浓度的增加,Maspin蛋白表达逐渐上调,呈浓度依赖性,且黄芩苷+LPS1-4组与LPS组相比差异具有统计学意义(P<0.05);IKKα蛋白表达逐渐下调,呈浓度依赖性,且黄芩苷+LPS1-4组与LPS组相比差异具有统计学意义(P<0.01);同时Maspin蛋白与IKKα蛋白表达呈负相关(r=-0.886,P<0.05)。mRNA表达与蛋白表达趋势相同。ELISA结果显示,LPS组与NC组相比TNF-α、IL-1β分泌显著增加,黄芩苷+LPS1-4组与LPS组相比,随着黄芩苷浓度的增加TNF-α、IL-1β分泌逐渐减少,与Maspin蛋白表达呈负相关。
  结论:
  黄芩苷介导了人牙周膜细胞中NF-κB非经典通路IKKα调控的Maspin表达上调,同时抑制TNF-α、IL-1β分泌,对LPS刺激引起的细胞炎性损伤起保护作用。
[硕士论文] 李美平
麻醉学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  针对2型糖尿病患者存在的血液高黏度的病理改变,本课题选用羟乙基淀粉(130/0.4)氯化钠注射液(商品名:万汶)术前预扩容进行血液稀释,观察其对糖尿病患者血液流变学指标的影响,以探讨此方法应用于围术期糖尿病患者的临床意义。
  方法:
  根据课题的纳入、排除标准选取了进行择期手术的2型糖尿病患者40例,并随机分成两组:试验组和对照组,入手术室后给予面罩吸氧、开放静脉液路、咪达唑仑镇静、常规监测,试验组于麻醉开始前30分钟内给予羟乙基淀粉(130/0.4)氯化钠注射液8ml/kg扩容,而对照组于麻醉开始前30分钟内给予等量的乳酸钠林格液扩容。扩容期间密切关注血流动力学的波动以及输液相关并发症和过敏事件的发生,同时记录监测指标:分别于扩容前、扩容结束时、麻醉开始时、手术切皮时及扩容后(液体输注完毕)1h五个时间点记录患者的心率、血压;与扩容前、扩容结束时及扩容后1h三个时间点记录患者的血糖值;于扩容前、扩容后1h两个时间点抽取静脉血检测血液流变学指标包括全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数、Hb、HCT以及抽取动脉血检测血乳酸值。
  结果:
  两组患者的一般资料包括性别、年龄、身高、体重、BMI、糖尿病病史等比较,差异无统计学意义;与扩容前相比,两组扩容结束时的心率无明显变化,麻醉开始时、手术切皮时、扩容后1h的心率均有减慢,两组扩容结束时血压明显升高,麻醉开始时、手术切皮时、扩容后1h血压降低;与对照组相比,试验组患者的血压在麻醉开始时、手术切皮时降低程度较小;与扩容前相比,两组患者的血糖值在扩容结束时无明显变化,而在扩容后1h均有明显升高,但与对照组相比,试验组各时间点血糖无明显升高,结果无统计学意义;与扩容前相比,对照组扩容后的血浆粘度、红细胞聚集指数降低不明显,差异无统计学意义(P>0.05),而全血粘度、血红蛋白量、红细胞压积以及动脉血乳酸值有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);试验组扩容后的全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数、血红蛋白量、红细胞压积以及动脉血乳酸值均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,试验组扩容前的所有检测指标差异无统计学意义(P>0.05);试验组扩容后的血浆粘度、红细胞聚集指数、红细胞压积以及动脉血乳酸值下降程度更大,差异有统计学意义(P<0.05),其余指标的比较差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  择期手术的2型糖尿病患者在术前应用乳酸钠林格液和羟乙基淀粉(130/0.4)氯化钠注射液扩容均能降低患者血液的全血粘度、血红蛋白量、红细胞压积以及动脉血乳酸值,但羟乙基淀粉(130/0.4)氯化钠注射液还能明显降低患者的血浆粘度和红细胞的聚集性,且更能稳定循环功能,对围术期糖尿病患者具有一定的临床保护作用。
[硕士论文] 郝宇红
口腔临床医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较传统注射器冲洗技术和根尖负压冲洗技术分别在离体牙与实验动物体内根管系统中对根尖区牙本质碎屑的清理效果。初步分析根尖负压冲洗技术和传统注射器冲洗技术在清理根尖1mm水平处牙本质碎屑的效果,为临床根管冲洗技术及方法的选择提供实验依据。
  方法:本研究分别在离体牙和犬牙上进行实验。实验一:20颗新鲜拔除下颌单根管第一前磨牙,随机分为传统注射器正压冲洗组(positivepressure irrigation,P组)和根尖负压冲洗组(negative pressure irrigation,N组),每组10颗。根据根尖周组织解剖结构构成特点建立体外根尖周组织模型,Protaper Universal镍钛系统采用冠向下技术预备根管。两组根管分别采用正负压方式进行冲洗,具体如下:P组采用31号注射器进行传统冲洗,N组采用31号注射器进行根尖负压冲洗,冲洗液均为5.25%NaOCl和17%EDTA,根管预备完成后,将标本固定,脱钙包埋,于距根尖孔冠方1mm水平处取三张连续切片作为观察片,HE染色。光学显微镜下分析根管内有机碎屑含量(取三张观察片的平均值),计算距根尖冠方1mm水平处根尖区域清洁度,并将数据进行统计学分析。
  实验二:健康成年雄性杂种犬2只,选取牙位为16,17,26,27,3636,37,46,47前磨牙共16颗(32个根管可用)作为实验牙。所有的实验牙术前拍摄X线片显示根尖孔闭合,根尖发育完全,未见根尖低密度影像。选取一只犬建立感染根管模型,一个月后影像学显示所有实验牙根尖部有低密度影像。在健康犬牙上将8颗实验牙随机分为两组,即传统注射器正压冲洗组(conventional needle positive pressure irrigation,CPP1组)和根尖负压冲洗组(apical negative pressure irrigation,ANP1组);在根管感染后的犬牙上将8颗实验牙随机分为2组,每组4颗实验牙,分别为传统注射器正压冲洗组(CPP2,组)和根尖负压冲洗组(ANP2组)。四组CPP1、ANP1、CPP2、ANP2依照正负压方式采用以下方法处理。全身麻醉下固定于手术台,橡皮障隔湿,Protaper Universal机用镍钛预备系统采用冠向下技术预备实验牙。四组根管冲洗具体方法同实验一,分别如下:CPP1组和CPP2组均采用31号针头注射器进行正压冲洗,ANP1组和ANP2组均采用31号注射器进行根尖负压冲洗,冲洗液均为5.25%NaOCl和17%EDTA,根管预备完成后光固化树脂充填,拔除实验牙共8颗作为标本。将标本固定,脱钙包埋,在距根尖1mm冠方水平处时取三张连续切片作为观察片,HE染色。在光学显微镜下分析不同冲洗技术对根尖区域有机碎屑的清除量(取三张观察片的平均值),计算距根尖1mm冠方水平处根管的碎屑清除率并对数据进行统计学分析。
  结果:实验一:P组根尖1mm水平处的平均清洁率为90.15%,N组根尖1mm水平处的平均清洁率为99.64%。N组根尖区清洁度优于P组,N组和P组根尖1mm水平处的根管清洁率具有统计学差异(P<0.05)。
  实验二:传统注射器冲洗CPP1组、CPP2组根尖1mm水平处的平均清洁率分别为85.94%、84.06%;根尖负压冲洗APP1组和ANP2组根尖1mm水平处的平均清洁率分别为98.18%、98.30%。APP1组根尖区清洁度优于CPP1组,APP1组和CPP1组距根尖1mm冠方水平处的平均根管清洁率具有统计学差异(P<0.05)。APP1组根尖区清洁度优于CPP1组,APP1组和CPP1组根尖1mm冠方水平处的根管清洁率具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:体内外实验均证实:根管冲洗过程中,根尖负压冲洗技术对距根尖冠方1mm水平处的碎屑清洁效果较好,对根尖区域碎屑的清除率优于传统注射器冲洗技术。
[硕士论文] 义彬玲
口腔临床医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究不同放射剂量腮腺组织及同一剂量放射后不同时间点腮腺组织SSB1的动态表达及细胞凋亡规律,为涎腺放射性损伤修复机制的研究提供理论依据。
  方法:
  将大鼠随机分为对照组,不同剂量放射6组,同一剂量放射后不同时间点8组,建立大鼠放射模型并且取材;应用TUNEL方法检测正常组,不同剂量放射组及同一剂量放射后不同时间点的细胞凋亡情况;应用IHC方法检测正常组,不同剂量放射组及同一剂量放射后不同时间点SSB1蛋白在腮腺组织中分布及表达情况;应用RT-qPCR方法检测正常组,不同剂量放射组及同一剂量放射后不同时间点SSB1mRNA在腮腺组织中表达规律;应用WB方法检测正常组,不同剂量放射组及同一剂量放射后不同时间点SSB1蛋白在腮腺组织中表达情况。
  结果:
  TUNEL结果示不同剂量放射后,凋亡细胞阳性率随放射剂量先增高后降低,并在12Gy组凋亡细胞阳性率达到最高(P<0.05)。同一剂量放射后不同时间点组,随着时间的变化,1小时组凋亡细胞阳性率最高(P<0.05),后期降低且无明显变化;IHC,RT-qPCR及WB结果示经不同剂量照射和同一剂量照射后,SSB1表达明显增加。不同剂量放射后,SSB1的表达随剂量先增高后降低,并在12Gy组表达量达到最高(P<0.05)。同一剂量辐射后,SSB1的表达随放射后时间呈先增长后减少的趋向,前期相对表达量高于在后期(P<0.05)。
  结论:
  正常腮腺组织中也能表达一定量的SSB1;辐射能诱导大鼠腮腺组织SSB1的表达增加;SSB1的表达与辐射剂量有关,与辐射后时间长短也有一定的关系;细胞凋亡是大鼠腮腺放射早期的损伤形式,其与SSB1的表达规律大体上具有平行性,呈现先增高后降低的趋向。这些成果均为进一步研究涎腺放射性损伤修复机制提供新的理论依据。
[硕士论文] 焦洛莹
化学工程 广东工业大学 2017(学位年度)
摘要:慢性根尖周炎是一种以厌氧菌感染为主的混合感染性疾病,其主要感染菌为具核梭杆菌和Solobaccterium moorei等。慢性根尖周炎破坏根尖周的牙槽骨或形成肉芽肿,具有容易复发、难以根治的特点,给人们的生活和工作带来诸多不便和麻烦。
  目前,治疗慢性根尖周炎主要通过常规根管治疗的方法,但该法操作繁琐、价格昂贵且治疗不彻底。因此寻找一种更为安全、有效的方法变得非常重要。近年来人们发现,利用IgY技术产生的抗特定病菌的抗体,能够治疗由致病菌感染引起的疾病,并且具有安全无残留、价格便宜等优点,具有很大的开发前景。
  本研究以灭活的具核梭杆菌、Solobaccterium moorei和两种菌的混合菌分别作为免疫原,免疫产蛋母鸡,共免疫五次。先用两步PEG6000沉淀法提取得到IgY粗品,再用硫酸铵盐析法纯化制得IgY纯品。然后用考马斯亮蓝染色法检测蛋白含量,用SDS-PAGE凝胶电泳法检测抗体分子量及纯度,用间接酶联免疫吸附法检测抗体效价和交叉反应,用免疫印迹法和间接荧光免疫分析法检测抗原抗体的特异性结合,并对IgY的热稳定性、酸碱稳定性、反复冻融稳定性以及对消化酶的稳定性进行了研究,最后研究了特异性IgY的抑菌活性以及交叉抑菌活性。
  实验结果显示抗具核梭杆菌IgY、抗Solobaccterium moorei IgY和抗混合菌的复合IgY的纯度分别可达到98.0%、97.8%、97.1%,它们的效价分别可达到1:32000、1:32000、1:16000,均能维持三周左右。免疫印迹分析和间接荧光免疫分析表明,特异性IgY能分别与抗具核梭杆菌和Solobaccterium moorei特异性结合。用酶联免疫吸附法检测发现特异性IgY的交叉反应较弱。稳定性的结果分析表明,IgY在温度低于75℃、pH值在4-9范围内能保持较好的的稳定性。在模拟胃液环境中,IgY对胃蛋白酶十分敏感,而在模拟肠道环境中IgY对胰蛋白酶有较好的的抵抗力。抑菌实验表明,抗具核梭杆菌IgY能够显著抑制(P<0.05)具核梭杆菌的生长,抗Solobaccterium moorei的IgY能够显著抑制(P<0.05)Solobaccterium moorei的生长,抗两种混合菌的复合IgY对具核梭杆菌和Solobaccterium moorei均有抑制作用(P<0.05)。
  在本实验中,制备了抗具核梭杆菌IgY、抗Solobaccterium moorei的IgY以及抗具核梭杆菌和Solobaccterium moorei混合菌的复合IgY。其特异性强、纯度高。此外,特异性IgY能在体外与对应病原菌发生特异性结合,并对其有较好的抑制作用。本研究为特异性IgY在慢性根尖炎的防治应用奠定了基础。
[硕士论文] 刘双
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景和目的:
  牙周病是口腔的常见疾病之一,是由牙菌斑引起的慢性炎症,导致牙周组织的破坏甚至牙槽骨的严重吸收。随着组织再生工程领域的深入研究,牙周组织再生技术得以提高,其中相关细胞因子及干细胞技术的研究已取得显著成就,因牙周炎病因比较复杂,修复机制尚未明确,再生的牙周组织与健康生理性牙周组织相比不论从生理形态还是功能上都有较大的差距,临床中很难实现健康生理性牙周组织的再生。
  降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种神经多肽物质,由37个氨基酸组成,因其有较多的重要调节作用且分布广泛而在实验中作为人们研究的主要神经肽物质。大量研究证实CGRP可通过多种途径调节骨组织生长代谢,实现骨组织再生的功能。本课题组前期实验研究发现:在离断下牙槽神经的大鼠实验中发现中后期再生的骨质较正常骨质疏松,骨小梁也表现的较稀疏。CGRP作为神经肽的主要物质之一可通过多种途径调节骨组织生长代谢,实现骨组织再生的功能。
  针对以上临床难题和理论基础我们做了牙周组织再生的相关研究,借助于CGRP可促进牙槽骨代谢,重点解决再生的牙周组织在生理形态及功能上最大程度接近于健康的牙周组织,为临床中解决牙周炎引起的牙槽骨破坏实现生理性再生提供重要的理论基础。
  方法:
  1.rBMSCs的分离培养及鉴定
  分离获取Wistar大鼠股骨处全骨髓并培养传代,获得稳定的第三代rBMSCs。Flow cytometer检测表面标志抗原,Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs的成脂及成骨分化能力。
  2.rBMSCs高表达CGRP基因的构建
  将重组慢病毒载体pLenO-DCE-CGRP与辅助包装系统共转入293T细胞中,48h、72h后收集上清液,高速离心过滤后得到高滴度病毒液,置于-80℃备用。慢病毒感染rBMSCs后检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。实验分为三组:CGRP组、Vector组、对照组。
  3.高表达CGRP对rBMSCs增殖和成骨分化的影响
  1) CCK-8、Flow cytometer检测高表达CGRP对rBMSCs增殖能力的影响;
  2) Realtime PCR、Western Blot检测ALP(alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)、BSP(bonesialoprotein,骨涎蛋白)、OPN(Osteopontin,骨桥蛋白)、Runx2(核心结合因子-2)mRNA和蛋白的表达水平;
  3)通过Alizarin Red染色测定三组rBMSCs的成骨分化能力。
  4)高表达CGRP促进rBMSCs成骨分化的机制研究
  Western Blot检测三组细胞OPG、RANKL的蛋白表达量,统计分析OPG/RANKL。
  结果:
  1.rBMSCs的分离培养及鉴定
  分离获取Wistar大鼠股骨处全骨髓并培养,细胞形态良好,大部分呈梭形,放射状排列。Flow cytometer检测第三代rBMSCs的表面标志抗原-CD34、CD45、CD44、CD90,表达率依次为0.3%、2.8%、92.3%、97.6%,符合rBMSCs表面标志物表达的特性。Oil red O、Alizarin Red染色检测成脂及成骨诱导后的rBMSCs,染色结果显示都为阳性。
  2.rBMSCs高表达CGRP基因的构建
  病毒液感染rBMSCs后,相对于Vector组和对照组,CGRP组的CGRP蛋白及mRNA的表达量明显升高(P<0.05),而Vector组和对照组表达较弱且无明显差异(P>0.05)。
  3.高表达CGRP对rBMSCs增殖和成骨分化的影响
  CCK-8、Flow cytometer检测结果均显示CGRP组的rBMSCs增殖能力高于Vector组和对照组(P<0.05);检测三组细胞矿化诱导1w、2w后ALP、BSP、OPN、Runx2 mRNA和蛋白的表达水平,检测结果显示:CGRP组较Vector组和对照组ALP、BSP、OPN和Runx2 mRNA和蛋白在1w、2w时的表达量明显增强(P<0.05),Vector组和对照组无明显差异(P>0.05);rBMSCs成骨诱导4w后Alizarin Red染色CGRP组的矿化结节较其余两组多(P<0.05),其余两组无显著差异(P>0.05)。高表达CGRP促进rBMSCs成骨分化的机制研究:矿化诱导1w后三组rBMSCs OPG蛋白的表达量CGRP组高于Vector组和对照组;而RANKL蛋白的表达量CGRP组低于其他两组;OPG/RANKL的统计结果显示CGRP组OPG/RANKL高于其他两组(P<0.05),其他两组间OPG/RANKL无明显差异(P>0.05)。高表达CGRP基因可以通过调节OPG/RANKL促进rBMSCs的成骨分化。
  结论:
  1.高表达CGRP基因可以促进rBMSCs的增殖。
  2.高表达CGRP基因可以通过调节OPG/RANKL促进rBMSCs的成骨分化。
[博士论文] 申丽丽
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的
  目前,由炎症、损伤、畸形和肿瘤等原因引起的口腔牙槽骨吸收与颌骨缺损是口腔科许多疾病最常见的临床表现之一,严重影响人们的美观、咀嚼、发音以及进一步的义齿修复。因此,如何调控骨重塑、恢复组织功能成为临床和基础研究的重点[1]。我们口腔科的常见病多发病之一牙周病就是其中的一种以牙槽骨吸收、牙齿松动脱落为主要特征的炎性骨代谢疾病。在牙周病的进程中,骨改建的两大参与者成骨细胞和破骨细胞均浸浴于慢性炎性环境中,其功能都会受到不同程度的影响。然而,虽然现有的研究对成骨细胞或者破骨细胞在炎性刺激过程中表现出的功能变化已有了较为清晰的认识,但这些研究大多是将成骨细胞(骨形成)或破骨细胞(骨吸收)各自作为独立的个体分离开进行研究,因此缺乏在炎性环境刺激下,成骨细胞和破骨细胞之间在信息交流和互相调控等方面是否存在失衡的准确信息[2,3]。
  关于成骨细胞和破骨细胞之间互相交流的分子信号通路,主要分为以下两大通路:RANKL-RANK-OPG通路和EphrinB2-EphB4信号通路。以往文献中报道最多的是RANKL-RANK-OPG信号通路,而对另一通路知之甚少,在口腔领域的研究更少。EphrinB2-EphB4信号通路是2006年由Matsuo等首先报道的骨改建过程中成骨细胞-破骨细胞间信号传递的一条新通路,这条信号通路是通过破骨细胞表面表达的ephrinB2和成骨细胞表达的EphB4跨膜蛋白受体间产生双向信号传导从而实现信息的传递和互相调控。其作用机理简言之,破骨细胞表面表达的NFATc1的靶基因ephrinB2和成骨细胞表面表达的EphB4受体相结合产生双向的信号传递,其中逆向信号由ephrinB2介导将信息传入破骨细胞,并通过抑制c-Fos-NFATc1的活性从而抑制破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞;另一方面,正向信号由EphB4介导通过增强RhoA的活性诱导成骨细胞的分化。ZhaoC的研究表明,通过在转基因小鼠的成骨细胞中过度表达EphB4,骨基质的沉积量被显著增加[2]。由EphB4-ephrinB2参与的信号通路在促进骨形成的同时限制了过度的骨吸收,因而对于维持骨改建的平衡起着至关重要的作用。
  TNF-α是目前公认的炎性微环境中最重要的一种内源性的炎性介质,在炎症过程中起着最基本的作用,也是牙周病发生发展过程中重要的介导因子。它的作用原理是通过激活靶细胞内NF-kB通路和MAPKS通路如p38,ERK和JNK通路使细胞发生增殖、分化、炎症等应激反应[4,5,6]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是广泛存在于真菌、植物和动物等真核生物体内一种序列特异性基因沉默,而小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是RNA干扰的中间产物,它是通过外源性或内源性的双链RNA(ds RNA),特异性结合了与其序列互补的mRNA,诱导该mRNA的降解,沉默该基因的表达,属于转录后水平的基因沉默[7,8]。慢病毒载体是常用的介导RNA干扰的病毒载体之一,其优点为既可以感染分裂期细胞,又可以感染非分裂期细胞,且不易诱发宿主免疫反应,转染效率高,表达的持续时间较长,因此是基因沉默的有效工具[9,10]。
  本研究采用慢病毒干扰载体降低小鼠体内目的基因ephrinB2和EphB4的表达,研究ephrinB2和EphB4基因沉默后骨缺损处骨形成和骨吸收活动的变化,并进一步探讨了ephrinB2-EphB4信号通路对炎性骨缺损愈合的作用及意义,以期为临床研发新的牙周治疗方法和牙周病新药的研发开辟一条新思路,并为牙周病新药的研发提供新的药物作用靶点,因而具有重要的临床意义和科研价值。
  材料与方法
  第一部分小鼠炎性徽环境模型的构建及对骨缺损愈合的影响
  方法
  雄性C57BL/6小鼠30只,体重18-20g,随机分为3组:0.5μg/kg组(下颌骨缺损,隔日腹腔注射TNF-α0.5μg/kg)、3μg/kg组(下颌骨缺损,隔日腹腔注射TNF-α3μg/kg)和5μg/kg组(下颌骨缺损,隔日腹腔注射TNF-α5μg/kg)。于术后当天、3天、7天、10天、14天通过小鼠的内眦静脉采血,酶联免疫吸附实验检测血液中TNF-α的水平;36只雄性C57BL/6小鼠体内建立下颌骨实验性骨缺损,手术当天开始腹腔注射0、0.5、3或5μg/kg的TNF-α,隔天注射一次。于术后3天、7天、14天取缺损侧的下颌骨组织,HE染色观察骨缺损处新骨形成的情况。
  结果
  Elisa(酶联免疫吸附实验)结果显示:0.5μg/kg腹腔注射组3天时血清中TNF-α的含量上升至1.50±0.25 ng/ml,14天时又降低至0.31±0.35 ng/ml,呈先上升后下降的趋势;而3μg/kg组呈先上升后下降的趋势,10天时小鼠血清中TNF-α的含量最高,但14天时又有所下降;5μg/kg组血清中TNF-α的含量随时间呈现升高的趋势,7天后达到稳定的血药浓度。因此,为了在小鼠体内形成稳定的炎性环境,我们选择了5μ g/kg TNFα腹腔注射,隔天注射一次的方法用于后续的实验。HE染色结果发现,术后3天,0.5μg/kg组、3μg/kg组和5μg/kg组新生骨量低于对照组(0μg/kg组),但四者无统计学差异(p>0.05);术后7天和14天时,3μg/kg组和5μg/kg组缺损处的新生骨量显著低于对照组(p<0.05),但0.5μg/kg组与对照组相比,新生骨量无统计学差异(p>0.05)。
  第二部分 EphrinB2和EphB4小干扰RNA慢病毒载体的构建和包装
  方法
  1.包含目的基因的siRNA干扰载体的构建
  委托ThermoFisher Scientific公司合成含设计好的针对ephrinB2和EphB4干扰序列的单链DNA(single strand DNA, ssDNA)oligo,共8对,然后退火延伸形成互补双链。用特异限制性内切酶酶切干扰序列两端所含酶切位点后,使用DNA连接酶接入酶切后的pcDNA6.2TM-GW/ EmGFP-miR载体上,将产物转染进入细菌感受态细胞,测序验证。PCR反应检测ephrinB2和EphB4的mRNA水平,筛选干扰效率最高的两组干扰载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-DEST重组,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。
  2.慢病毒载体的包装和滴度测定
  扩增构建完成的含有目的基因干扰序列的慢病毒表达载体,将其与三种包装载体质粒pLP1,pLP2和pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并收集病毒原液,超速离心浓缩后,梯度稀释法测定病毒的滴度,分装保存备用。
  结果
  1.包含目的基因的siRNA干扰载体的构建
  DNA序列测定结果证明所插入的片段序列与合成序列完全一致,表明已成功构建了针对ephrinB2和EphB4基因的干扰载体。转染48小时后,PCR筛选结果显示,针对目的基因ephrinB2,1#干扰载体的基因沉默效果最佳(87%),针对目的基因EphB4,2#干扰载体的基因沉默效果最佳(77%)。所以我们选择了ephrinB2 siRNA1#和EphB4 siRNA2#载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组,获得含靶基因干扰序列的慢病毒表达载体。
  2.慢病毒载体的包装和滴度测定将Lenti-E21#和Lenti-E42#慢病毒感染HEK293T细胞,96小时后梯度稀释法测定病毒的滴度,经计算得知,Lenti-E21#病毒的滴度为3.5*108TU/ml,Lenti-E42#病毒的滴度为2.5*108TU/ml,分别命名为pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA,将慢病毒液稀释至1*108TU/ml,分装保存于-80度备用。
  第三部分 EphrinB2-EphB4信号通路对炎性环境下骨缺损愈合的影响
  方法
  选用6-8周龄健康雄性C57BL/6小鼠108只,随机分成pLenti6.3-ctrl、pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA3组,建立下颌骨骨缺损,各组缺损内分别注射5μl pLenti6.3-ctrl, pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA,隔日腹腔注射TNF-α5μg/kg,分别于术后7、14和21天取缺损侧的小鼠下颌骨标本,Real-time PCR检测骨缺损处ephrinB2和EphB4两种因子以及成骨因子Runx2,Osterix,OC,ALP,BSP和骨吸收因子Nfatc1mRNA的表达;Western blot检测Runx2和BSP蛋白的表达;HE染色观察骨缺损处新骨形成的情况;免疫组化观察Runx2和OC在骨缺损处的定位和蛋白表达情况,并进行光密度值分析;TRAP染色观察缺损处骨吸收情况并进行破骨细胞计数。
  结果
  Realtime-PCR结果显示,实验组(pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ephb4siRNA组)目的基因ephrinB2和EphB4的表达水平相对于对照组pLenti6.3-ctrl组在三个时间点(7天、14天和21天)均是显著降低的(p<0.05);7天和14天时,pLenti6.3-ephb4组Runx2和Osterix mRNA表达显著低于对照组(分别p<0.01,p<0.05),而ALP mRNA的表达量在三个时间点均显著低于对照组,晚期成骨因子OC和BSP mRNA的表达量在14天和21天时亦显著低于对照组(分别p<0.01,p<0.05),而Nfatc1(7天和14天)mRNA的表达显著高于对照组(分别p<0.01,p<0.05);Western blot结果显示,Runx2和BSP蛋白表达的结果与PCR分析相一致;HE染色发现,14天时,pLenti6.3-ephb4组新生骨量显著低于对照组(p<0.01);免疫组化结果显示:Runx2和OC在小鼠的成骨细胞、骨细胞和成纤维细胞中均有广泛的表达,光密度分析显示Runx2和OC蛋白表达的结果与PCR分析相一致;TRAP染色结果表明:7天和14天时,pLenti6.3-ephb4siRNA组TRAP(+)破骨细胞数显著高于对照组(分别p<0.01,p<0.05),而pLenti6.3-efnb2siRNA组骨形成因子和骨吸收因子、缺损处的新生骨量以及破骨细胞计数与对照组相比均无统计学差异(p>0.05)。
  结论
  1.采用5μg/kg TNFα腹腔注射,隔天注射一次的方式,成功构建了小鼠体内稳定的炎性环境模型。
  2.成功构建了针对目的基因ephrinB2和EphB4的稳定高效的慢病毒载体:pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA,基因沉默效果分别为87%和87%,可用于后续的体内实验。
  3.通过下调EphrinB2和EphB4的表达发现:EphB4表达降低,骨形成抑制,同时伴有成骨相关标志物mRNA和蛋白表达的下降,破骨细胞数及破骨标志物表达的升高;而ephrinB2表达降低,上述各指标无明显影响,推测可能由于体内EphrinB1或其他因子对其提供了代偿作用。因此,我们推断EphB4在炎性骨缺损愈合的过程中起着至关重要的作用。
[硕士论文] 余佳丽
口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  建立无对磨牙小鼠模型研究伸长牙齿的根周组织形态学变化及检测SPARC、Ι型胶原蛋白的表达,进而了解牙齿伸长的机制,为临床口腔修复工作奠定理论基础。
  方法:
  选取30只C57BL/6小鼠分为两大组,分别为形态学观察组和Micro-CT组,形态学观察组分为5个亚组,分别为正常对照组(未处理组)、拔除右侧上颌磨牙后3天组、6天组、9天组、12天组,每组各5只。形态学观察组小鼠分别于对应的天数经处死后取下颌骨组织并包埋,对包埋的组织行HE染色、Masson染色观察各组小鼠右侧下颌磨牙的根周组织变化,免疫组化染色检测SPARC、Ι型胶原蛋白的表达及探讨二者相互联系。Micro-CT组小鼠于拔牙后3天、6天、9天、12天行Micro-CT扫描重建测无对时右侧下颌磨牙的伸长量。
  结果:
  右侧下颌磨牙随着拔牙后时间的延长而逐渐伸长,差异具有统计学意义(P<0.05);HE染色结果:伸长的右侧下颌磨牙根周有新骨沉积;Masson染色结果:伸长牙齿的牙周膜间隙中胶原纤维分布更加致密;免疫组化染色结果:小鼠右侧下颌磨牙的根周组织中SPARC与Ι型胶原蛋白均随着拔牙后时间的延长而表达增强,差异在统计学方面有意义(P<0.05),SPARC与Ι型胶原蛋白的表达具有正相关关系(r=0.951,p<0.05)。
  结论:
  拔除小鼠右侧上颌磨牙后的12天期间,SPARC、Ι型胶原蛋白在右侧下颌磨牙伸长过程中均表达增强,二者可能对牙齿伸长过程起作用。
[硕士论文] 张磊
口腔临床医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  为探究磨牙症的监测方法,运用非接触型无线传输监测系统,采集磨牙症患者睡眠状态下磨牙时下颌骨振动产生的生物信号,分析其特征及与睡眠周期的关系,为磨牙症启动及结束机理提供依据。
  方法:
  筛选符合标准的夜磨牙症受试者20例,应用非接触型无线传输监测系统连续监测3日,监测装置于受试者枕下采集磨牙时下颌骨振动的生物信号,经可折叠线缆与主体控制器连接,内部完成A/D转换成数字电信号,并进行数据储存,安装手机(Application APP)绑定设备蓝牙,完成监测设备的wifi配置,与云端建立链接,上传数据至手机及云端,电脑APP下载处理分析每日数据;监测的同时开启录音设备,采集受试者整夜睡眠时声音信号,分别提取同一时间相对应的磨牙声音信号及振动信号,作为声谱组及振动组,记录每日总磨牙时间、最长磨牙时间、整夜磨牙频率及睡眠周期,以声音信号为基准运用统计学方法验证该监测方法的稳定性及一致性。
  结果:
  1.获得受试者每晚睡眠状态下的原始波形曲线,依此设计滤波算法得到过滤处理后的磨牙波形曲线,分析整理得到整夜磨牙频率、磨牙时间、运动幅值;2.配对t检验分析:声谱组和振谱组受试者每日总磨牙时间及最长磨牙时间相比,两组间差异无统计学意义(P>0.05);3.声谱组和振谱组每日整夜磨牙频率相比无显著差异(p>0.05),两组具有较高的一致性;4.声谱组及振谱组3日的总磨牙时间及最长磨牙时间(各60对数据)配对t检验无统计学意义(p>0.05),且经一致性检验Bland-Altman分析:每组仅有2/(60)3.3%个点位于95%一致性界限外,两组具有较高的一致性;5.亦可分析出每晚睡眠状态下睡眠周期、心率及体动变化指示图,尚无规律可寻,有待于扩展病例继续深入研究;6.依据睡眠周期变化指示图,测得20例受试者每日磨牙事件主要集中于(Rapid eye movement REM)期及浅睡眠期。
  结论:
  1.非接触型磨牙症监测系统实现了磨牙信息的数字化表达与信息存储分析,携带便捷;2.针对睡眠状态下磨牙时下颌骨振动信号进行监测,为监测研究磨牙症的启动及结束机理提了提供了新的方法;3.与声音信号相比一致性较高,且二者的波性特征均表现为“双峰波”,说明本监测系统不仅提供了稳定的监测结果而且可靠性较大。
[硕士论文] 段小琪
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景和目的
  牙周病最普遍临床表现为导致牙周支持组织的破坏及骨再生困难,近年来,骨组织工程学在牙周病学治疗方面得到广泛应用研究,因此促进骨再生方面细胞增殖、迁移及成骨是提高该类疾病治愈率的关键。小鼠骨髓间充质干细胞(BoneMarrow Stromal Cell Line,ST2)是一种多能干细胞,取自源于小鼠体内,研究证明其拥有来源广泛并在一定条件下具有成脂、成骨、成软骨细胞能力的特点,因此作为基础研究中优秀的种子细胞也广为应用在组织工程技术方面及原位组织工程技术。碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, bFGF)及基质细胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)在牙周组织再生及骨再生领域已得到广泛研究。在转化医学方面,目前种子细胞及生长因子依然在很多方面受限,而原位组织工程技术(in situ engineering technique)的发展可以通过募集干细胞作用的各类生长因子有效地解决这一个问题。碱性成纤维细胞生长因子及基质细胞衍生因子是近年来的明星生长因子,得到了学术界的广泛关注。很多体内实验研究已证实,bFGF能够促进细胞增殖及其成骨且效果明显。SDF-1则是经典的趋化因子,对免疫、循环及中枢系统的发育有着关键作用,且SDF-1在受伤组织(心脏、肾、大脑、皮肤及骨髓)中高表达,其表达的提高被认为是促进干细胞和前体细胞迁移进行组织修复再生的重要信号。但是对于二者对于ST2细胞增殖迁移的差异并无相关研究,其细胞机制也不清楚。
  各种细胞的增殖迁移涉及多条信号转导通路的调节,目前研究较多并得到相关文献资料验证支持的是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activatedproteinkinase,MAPK)家族外加PI3K/AKT信号通路,其对于细胞增殖、生长、分化、凋亡等生理现象均有显著作用。
  本实验的目的在于为内源性干细胞归巢理论提供依据,bFGF与SDF-1分别处理ST2细胞探究其增殖迁移方面的差异,为组织工程技术选择一种更为优质的生长因子,并探讨bFGF如何发挥其作用机制及相关信号通路,以及丝裂素活化蛋白激酶家族MAPK及PI3K/AKT是否在细胞增殖迁移中扮演重要的角色且孰轻孰重。
  材料和方法
  ST2细胞购自日本Riken Cell Bank,采用体外培养ST2,进行细胞的复苏、冻存、传代及培养等操作。细胞培养传代,倒置相差显微镜下观察,细胞生长状态形态良好,繁殖能力强,即达到实验要求。1、将ST2细胞分为2组,分别为bFGF实验组,SDF-1实验组,相关文献参考,bFGF实验组因子浓度分别设置为0(对照组浓度)、10、20、40、80、100 ng/ml,SDF-1实验组因子浓度分别设置为0(对照组浓度)、50、100、200、400 ng/ml,分别置于无菌培养箱内培养24、48、72 h,通过Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒检测不同浓度两种生长因子对于细胞增殖的影响,获得增殖ST2细胞的最佳生长因子浓度。2、实验共分为三组:空白对照组,bFGF组(20 ng/ml),SDF-1组(200 ng/ml),采用CCK8方法检测不同浓度两种因子在24h,48h时间对骨髓基质细胞增殖的影响。3、实验共分为三组:空白对照组,bFGF组(20 ng/ml),SDF-1组(200 ng/ml),通过transwell小室法检测不同浓度两种因子对骨髓基质细胞趋化的影响。4、实验采用蛋白质免疫印迹实验(western blot)技术,分为用20 ng/mlbFGF刺激培养骨髓基质细胞0、5、10、15、30、60、120 min,根据时间进行分组,观察ST2细胞对于AKT/P-AKT、Erk/P-Erk蛋白相对表达含量的变化。5、实验采用western blot技术,分别单独加入PI3K/AKT抑制剂LY294002,Erk抑制剂U0126+bFGF(10ng/ml)组对ST2细胞进行活化,检测各通路磷酸化蛋白的表达变化。6、实验分为两组:抑制剂LY294002组及抑制剂U0126组,每组又分为单独抑制剂组、抑制剂+bFGF组,采用CCK8技术检测细胞增殖情况变化,transwell小室法及划痕实验检测细胞迁移变化。
  结果:
  1、与空白对照组相比,24h时bFGF实验组在浓度为10、20、40、80 ng/ml时对于骨髓基质细胞系增殖有促进作用(p<0.05),相反地在bFGF浓度为100 ng/ml时,表现为高浓度抑制作用(p<0.05),且最佳浓度为20ng/ml。SDF-1实验组在浓度为50、100ng/ml对ST2细胞增殖有效果,浓度为200ng/ml可有效促进细胞增殖最佳(p<0.05),相反地浓度为400ng/ml时对ST2细胞增殖表现出高浓度抑制(p<0.05),且最佳浓度为200ng/ml。
  2、经CCK8细胞增殖实验显示:与空白对照组相比,在24、48、72h时间,20 ng/mlbFGF和200 ng/ml SDF-1均能促进ST2细胞增殖(p<0.01),同时,20 ng/ml bFGF组较之于200 ng/ml SDF-1组效果更为显著(p<0.01)。
  3、经transwell小室法检测,与空白对照组相比,20 ng/mlbFGF和200 ng/ml SDF-1对小鼠骨髓基质细胞系ST2均有迁移趋化作用(p<0.01),且bFGF的迁移趋化作用较SDF-1更为明显(p<0.01)。
  4、相同剂量的20 ng/ml bFGF刺激ST2细胞后,随着作用时间的延长,磷酸化AKT、Erk的表达逐渐升高,分别在30min、15min时磷酸化AKT、Erk表达到顶峰,随后磷酸化逐渐降低。
  5、给予ST2细胞关于PI3K/AKT、MAPK相关通路Erk特异性阻断剂进行处理,经Western Blot测定验证,与空白对照组相比,单独抑制剂组磷酸化蛋白表达含量降低,抑制剂预处理后加生长因子组相关蛋白磷酸化较空白组升高但与单独生长因子组比较含量降低。
  6、将PI3K/AKT, MAPK相关通路Erk特异性阻断剂LY294002及U0126对ST2细胞进行处理,CCK8细胞增殖实验,transwell小室及细胞划痕实验均可同等证明PI3K/AKT通路能更好的阻断细胞的增殖与迁移,加入bFGF生长因子细胞生理状况不会有明显改善,但是MAPK/Erk通路可后续被bFGF生长因子再次激活,促进细胞的增殖、迁移。
  结论
  bFGF和SDF-1处理ST2细胞后,细胞增殖迁移确有增强,最佳有效浓度分别为20 ng/ml和200 ng/ml,且20 ng/ml bFGF增殖迁移效果优于200 ng/ml SDF-1。bFGF的增殖迁移机制主要是通过PI3K/AKT通路以及MAPK经典通路的Erk调节细胞增殖迁移的能力。相反地,特异性阻断以上通路,ST2细胞的增殖迁移能力现象表达会减弱,且PI3K/AKT通路为主控信号通路,Erk仅为辅助通路。
[硕士论文] 刘雯华
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  运用原位组织工程修复破坏的牙周组织是牙周组织再生研究领域的新热点,其中趋化因子的应用是原位组织工程的重点。经典的趋化因子以基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)为代表,SDF-1能促进干细胞的募集、增殖,是组织再生领域研究的热点。有部分研究表明低剂量的碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)同样具有促进干细胞募集、增殖,且能维持细胞干性。细胞因子、趋化因子和粘附分子能够促进干细胞的募集,运用自身募集的干细胞恢复缺损组织是近年来原位组织工程学(in situ tissueengineering technique)研究的热点。本研究选取ST2细胞株来完成实验,ST2细胞株作为从BC8小鼠骨髓中分离出来的一种间质细胞株,具有骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的特点,是再生组织领域常用的种子细胞。虽然两种因子均能促进干细胞募集和增殖,但募集、增殖的干细胞需要成骨分化才能发挥促牙周再生的作用。故了解两种因子作用后干细胞的成骨分化潜能对于原位组织工程中趋化剂的选择有指导意义。本课题首次探究bFGF和SDF-1预处理对BMMSCs(ST2细胞株)成骨分化潜能的影响。
  材料和方法:
  将ST2分别用普通培养基(对照组)、含20 ng/mlbFGF的培养基和含200ng/mlSDF-1的培养基预处理48小时。预处理后的BMMSCs在成骨诱导培养液中继续培养3、7、14天, qRT-PCR及Western Blot检测BSP、Runx-2和ALP的基因及蛋白表达;28天后进行茜素红染色观察钙结节的形成。
  结果:
  bFGF预处理组:第3天时,ALP和Runx-2 mRNA表达和ALP蛋白表达显著低于对照组;第7天时,ALP、BSP和Runx-2 mRNA表达和ALP蛋白表达均显著高于对照组;14和28天成骨相关指标与对照组无显著差异。
  SDF-1预处理组:第3天时,ALP mRNA和蛋白表达显著低于对照组,而Runx-2蛋白表达显著高于对照组;第7天时,与对照组比较,仅ALP蛋白表达显著升高;14和28天成骨相关指标与对照组无显著差异。
  bFGF预处理组和SDF-1预处理组相比,第3天时的ALP mRNA、第7天时的BSP和Runx-2 mRNA的表达前者显著高于后者;第3天时的Runx-2 mRNA和ALP及Runx-2蛋白的表达后者显著高于前者。
  结论:
  bFGF和SDF-1预处理后,BMMSCs成骨分化活性在早期被抑制,中期增强。其中以bFGF的作用更显著。提示,bFGF比SDF-1在维持干细胞成骨分化潜能方面更具有优势。
[硕士论文] 付昌盛
口腔临床医学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:牙周炎是最常见的口腔疾病之一,是导致牙齿缺失的主要疾病,其病因及发病机制仍是牙周病学研究热点。牙周炎患牙的部分牙根表面牙骨质暴露于牙周袋内,感染后会发生结构性和理化性变化,严重影响牙周功能性细胞在牙根表面的生长和附着,阻碍牙周组织再生修复。人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligamentfibroblasts,hPDLFs)是构成牙周韧带的重要细胞,在牙周致病菌及其毒性产物作用下会发生直接损伤或引发免疫应答反应,导致牙周组织破坏。本研究主要观察内毒素对hPDLFs增殖及IL-8分泌的影响;不同方法处理牙周炎患牙根面牙骨质后内毒素水平变化及其根面处理后的牙周炎牙骨质片对牙周膜成纤维细胞分泌细胞因子水平变化,为选择临床牙周炎治疗方法提供依据。
  本研究主要分为三部分实验其目的、方法和结果如下:
  实验一:内毒素对人牙周膜成纤维细胞增殖及IL-8分泌的影响
  目的:观察不同浓度的内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)对PDLFs的影响及IL-8的分泌情况。
  方法:本实验分为五组,PDLFs组(阴性对照组)、1μg/ml LPS组、10μg/ml LPS组、100μg/ml LPS组、200μg/ml LPS组。各组细胞进行培养,MTT法观察细胞增殖变化。24h,96h ELISA法检测IL-8分泌情况。
  结果:与PDLFs组比较,10μg/ml LPS促进PDLFs增殖;200μg/ml LPS抑制PDLFs增殖;24h:200μg/ml LPS组促进IL-8分泌,有显著性统计学差异。96h:100μg/ml LPS、200μg/mlLPS组促进IL-8分泌,有显著性统计学差异。
  结论:不同浓度的内毒素对PDLFs增殖、IL-8分泌合成释放有调节作用。
  实验二:根面处理牙周炎患牙根面牙骨质后内毒素水平变化研究
  目的:观察不同方法处置牙周炎患牙根面牙骨质后内毒素水平变化。
  方法:选择临床上正畸拔除的健康的前磨牙6例,重度牙周炎拔除的后牙36例。每颗牙进行编号,依分组根面处理后于釉牙骨质界下2mm制成2片4mm×4 mm×1 mm的牙骨质片。健康牙为阴性对照组,36颗牙周炎患牙每颗牙中1个牙片不进行根面处理,为牙周炎组。其余36片牙周炎牙片随机平均分成6组:龈下刮治及根面平整(scaling and rootplanning,SRP)组、SRP+抗菌肽A组、SRP+抗菌肽B组、SRP+EDTA组、SRP+ Nd∶YAG激光组和SRP+Er∶ YAG激光组。显色基质鲎试剂检测每个牙片内毒素浓度。按照编号记录每颗牙齿内毒素浓度,计算每组每个牙周炎患牙处理前后内毒素浓度变化。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。
  结果:与牙周炎组相比,各处理组内毒素浓度有不同程度降低,均有显著性差异(P<0.01)。与SRP组相比,SRP+抗菌肽A组、SRP+抗菌肽B组、SRP+Er∶ YAG激光组,内毒素浓度显著下降(P<0.01);SRP+EDTA组、SRP+ Nd∶ YAG激光组均无显著性差异(P>0.05)。
  结论:不同方法处理牙周炎患牙根面均可降低内毒素含量,抗菌肽A+SRP处理牙周炎根面降低内毒素含量最多。
  实验三:根面处理牙周炎患牙根面牙骨质对牙周膜成纤维细胞分泌细胞因子的影响
  目的:观察不同方法处理牙周炎患牙根面对PDLFs分泌细胞因子的影响。
  方法:实验二根面处置的牙周炎牙骨质片(6组)及健康牙牙骨质片与PDLFs共培养,ELISA检测24h时上清液IL-6、IL-8、TNF-α水平。
  结果:(1)与SRP组比较:其余组IL-8、TNF-α含量均低于SRP组,有显著性差异(P<0.01)。(2)抗菌肽A+SRP组IL-6含量与健康牙组无显著性差异(P>0.05)。(3)除SRP组,其余根面处理组IL-8含量与健康牙组比较无显著性差异(P>0.05)。(4) Nd∶ YAG激光+SRP组与Er∶ YAG激光+SRP的TNF-α含量与健康牙组无显著性差异(P>0.05)。
  结论:抗菌肽(A、B)、Er∶ YAG激光、Nd∶ YAG激光、EDTA联合SRP处理组IL-8、TNF-α含量均少于SRP组,其IL-8含量组间无差异。抗菌肽A+SRP在处理组中IL-6含量最低。Nd∶ YAG激光+SRP在处理组中TNF-α含量最低。
[博士论文] 王惠宁
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景和目的
  牙周病是由多种革兰氏阴性菌引起感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌是牙周病主要致病菌。脂多糖是牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子,对宿主细胞具有破坏作用。因此,细菌感染可引起牙周组织的炎症反应,进而引起牙槽骨的破坏和牙齿脱落。牙周病导致的牙槽骨吸收过程受破骨细胞调控。
  破骨细胞来源于造血干细胞的单核/巨噬细胞系统。THP-1细胞可分化成成熟的巨噬细胞,进而诱导分化成为破骨细胞。许多细胞因子可以正性或负性调节破骨细胞增殖、存活、分化和功能。M-CSF和RANKL可由成骨细胞或活化的T细胞产生,是调控破骨细胞重要的细胞因子。RANKL可以诱导活化T细胞核因子1(NFATc1)的表达。活化T细胞核因子1可以和破骨细胞相关基因如如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶K等结合,参与破骨细胞分化和成熟。
  MicroRNAs(miRNAs)是一段由19-22个核苷酸组成的非编码的小分子RNA,对基因转录后水平进行调控。microRNAs主要参与调控成骨细胞,破骨细胞以及骨细胞的分化、增殖以及功能,从而参与胚胎期骨质发育和成年骨组织功能的保持。
  MiR-20a是miR-17-92基因簇的典型代表,miR-17-92基因簇是研究较为广泛的家族之一。文献报道,miR-17-92基因簇在单核细胞分化和成熟中具有关键作用。MiR-17-92基因簇不仅参与骨骼形成过程,而且在保持骨骼功能正常方面具有重要作用。研究表明,许多miRNAs都参与成骨细胞分化、增殖以及形成过程。研究证实,miR-20a可以负性调节BMP信号通路的抑制剂如Bambi和Crim1的表达水平。进一步的研究还发现,miR-20a可以上调BMP2,BMP4,Runx2, OSX/Sp7,Ocn和Opn的表达,从而促进骨形成。近年来,miRNAs在破骨细胞方面的作用受到普遍关注。但是miR-20a对破骨细胞的功能和分化的研究还未见报道。
  MiR-20a可在多种组织和细胞内高度表达。它通过靶向不同基因,从而调控肿瘤,免疫疾病的发生,骨骼肌肉细胞等的分化,抑制内皮细胞的迁移,受损血管的修复。PPARγ是miR-20a调控一个重要的靶向基因。文献表明,miR-20a表达上调可以导致小鼠表达成脂的PPARγ基因的蛋白水平水平升高。在骨组织的代谢中,miR-20a可以靶向PPARγ基因对成骨细胞分化起到调控作用。抑癌基因PTEN位于染色体10q23区域。在乳腺癌,卵巢癌,肝癌,肠癌中,PTEN也是miR-20a调控一个重要的靶向基因。近年研究已经证实,PTEN在调控细胞一系列活动如增殖,粘附,迁移,入侵,细胞凋亡等信号通路中发挥着重要的作用。
  本实验分三部分进行,首先检测miR-20a对THP-1细胞生物学性能的影响其中包括转染实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验和细胞增殖实验。其次探讨miR-20a对破骨细胞分化的影响,最后检测在LPS作用下,miR-20a对破骨细胞分化的影响,通过RT-PCR和Western Blot检测TRAP、NFATc1表达以及靶基因PPARγ,PTEN分子水平和蛋白水平表达情况,
  方法
  1.miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响
  人THP-1细胞在加入含10%FBS的1640培养液中培养,细胞培养至较高密度时,向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度为10ng/ml。72h后,细胞贴壁,用PBS轻轻漂洗3次。实验分5组,空白对照组,Mimics NC组,miR-20a mimics组,InhibitorNC组,miR-20a inhibitor组。根据转染效率评价的结果,转染试剂Lipofectamin2000,用于转染各oligo,于转染24h后,收取细胞,用于RT-PCR检测。
  将上述转染的5组(空白对照组,Mimics NC组,miR-20a mimics组,InhibitorNC组,miR-20a inhibitor组)细胞种入96孔板中,避光加入CCK-8试剂,酶标仪450nm波长测其OD值,得到数据。细胞转染至48h后,PBS洗细胞,加入细胞70%乙醇固定至少12小时,再次PBS洗细胞,加入1mLPI工作液室温避光染色30分钟。通过FSC/SSC散点图收集细胞,利用Flowjo软件处理。细胞转染至48h后,离心收集细胞,微量离心机转速1000RPM,离心时间5min,弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM,离心时间5min收集细胞)。用400ul的Binding Buffer重悬细胞。在细胞悬液中避光加入5ul AnnexinV-FITC染液,4℃反应15min。反应后再避光加入10ul的PI混匀,4℃反应5min。在1小时内用流式细胞仪检测。
  2.转染miR-20a,检测破骨细胞分化中TRAP,NFATc1, PPARγ,PTEN基因表达
  THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时,再加入含10%FBS的1640培养液,向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后,根据转染效率评价的结果,转染试剂Lipo fectamin2000,用于转染各oligo。实验分三组,空白对照组,Mimics NC组,Mimic-20a组。6h后换液,并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养,并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,收取一套复孔进行TRAP染色与计数,一套复孔收取Western样品,一套复孔收取RT-PCR样品。
  3.转染miR-20a,检测在LPS作用下,破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表达
  THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时,加入含10%F BS的1640培养液,吹打使细胞形成单细胞悬液。向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后,根据转染效率评价的结果,转染试剂Lipo fectamin2000,用于转染各oligo。实验分三组,空白对照组,Mimics NC组,Mimic-20a组。6h后换液,并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养,并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,在三组中加入PG-LPS,使得用药终浓度为1ug/ml,于PG-LPS加药24h收取细胞样品,一套复孔进行TRAP染色与计数,一套复孔收取Western样品,一套复孔收取RT-PCR样品。
  结果
  1、miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响
  实验中,我们使用CCK8法检测miR-20a对THP-1细胞增殖的影响。结果证实,与空白对照组相比,miR-20a过表达和miR-20a抑制剂均抑制了THP-1细胞的增殖。但是对THP-1细胞的抑制作用在转染后的第三天最为显著。
  我们检测miR-20a转染THP-1细胞48h后,对THP-1细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果显示,miR-20a过表达组与空白对照组相比,细胞周期中S期的不同具有统计学意义。然而miR-20a抑制组与空白对照组相比,不同在于G1期和S期。我们推论,miR-20a通过延长G1期,缩短了S期,阻滞了G1/S期时相转换,抑制了THP-1细胞的生长和增殖。
  进而我们使用流式细胞仪验证miR-20a对THP-1细胞增殖的抑制作用是否是由于MiR-20a促进了THP-1细胞凋亡所致。结果显示,和空白对照组相比,miR-20a转染48h后, miR-20a过表达抑制了早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞,促进了活细胞的增殖。然而miR-20a抑制剂呈现出促进细胞凋亡的趋势。因此,我们得出结论,miR-20a对于THP-1细胞增殖的抑制不是由于抑制细胞凋亡所致,miR-20a对于细胞增殖和细胞凋亡的影响是来源于不同的两个信号通路。
  2、转染miR-20a,检测破骨细胞分化中TRAP,NFATc1, PPARγ,PTEN基因表达
  为了证实miR-20a在破骨细胞分化过程中的作用,我们先使用PMA处理THP-1细胞分化为巨噬细胞,再将miR-20a转染至贴壁的巨噬细胞中,在M-CSF和RANKL诱导剂的诱导下继续培养3天,应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATc1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中具有关键作用的转录因子,研究显示,与空白对照组和NC对照相比,miR-20a过表达组,TRAP和NFATC1的mRNA水平和蛋白水平明显下降,提示在M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞分化中,miR-20a起到抑制的作用。
  本实验选择PPARγ作为miR-20a预测的靶基因。为了证实PPARγ是否是miR-20a靶向目的基因,我们使用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测了在M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a过表达情况下,PPARγ的分子水平和蛋白水平的表达情况。实验结果显示,与空白对照组和NC对照组相比,在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a下调了PPARγ基因的mRNA水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测结果发现,与空白对照组和NC对照组相比,在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a下调了PTENmRNA水平。但是,我们并没有检测到PTEN蛋白水平的变化。因此,我们推测,PPARγ是miR-20a在RANKL诱导THP-1破骨细胞分化中的靶向基因。
  3.转染miR-20a,检测在LPS作用下,破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表达
  我们首先使用PMA处理THP-1细胞72h,再将miR-20a转染至贴壁的THP-1细胞中,加入M-CSF和RANKL诱导剂,继续诱导培养3天,加入LPS,24h后应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATC1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中起关键作用的转录因子,我们研究证实,与空白对照组和NC对照相比,miR-20a过表达组,TRAP,NFATc1的mRNA水平明显升高。我们结果表明,在LPS作用下,miR-20a对RANKL诱导破骨细胞起到促进的作用。
  本实验采用人THP-1细胞,在PMA诱导贴壁,转入miR-20a-Mimic和NC-FAM,在M-CSF和RANKL诱导THP-1细胞破骨分化72h,加入LPS刺激24h,采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法,检测PPARγ和PTEN的分子水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR结果显示,与空白对照组和NC对照组相比,在M-CSF和RANKL诱导下,PTENmRNA水平和PPARγmRNA明显升高。蛋白免疫印迹法检测PTEN和PPARγ蛋白水平,实验发现,相比于空白对照组,在LPS作用下,PPARγ蛋白水平明显升高,但是PTEN的蛋白水平与空白对照组相比没有变化。因此,我们推测,在LPS作用下,PPARγ仍然是miR-20a的靶向基因,PPARγ的上调促进了THP-1破骨细胞的分化和成熟。
  结论
  1、miR-20a抑制细胞增殖,阻滞G1/S时相的转换,对细胞凋亡呈现抑制作用。
  2、miR-20a对破骨细胞分化具有抑制作用,靶向PPARγ基因。
  3、在LPS作用下,miR-20a对破骨细胞分化具有促进作用,靶向PPARγ基因
[博士论文] 刘梦冬
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及研究目的:
  根管治疗术被认为是牙体牙髓病领域中极为重要的治疗技术,它有效提高了牙齿的保留率和生存时间,最大程度保证了患者的咀嚼效率和生活质量。
  在临床治疗中,由于种种原因,如根管复杂的解剖形态,患牙冠部的渗漏、根管内残留感染物、根尖周炎症及全身因素的影响,都会导致根管治疗的失败。此时,非外科的根管再治疗术是保留患牙的首选方法。根管再治疗的主要目的是在不损伤软硬组织形态功能的前提下,通过彻底清除根管系统内的坏死组织、细菌以及原有充填材料,保持根管系统的无菌状态,并再次建立通畅的根管通路。
  影响根管再治疗成功率的原因有很多,其中根管形态的复杂性和根管再治疗方法的差异性是重要因素,它们会导致根管再治疗过程中出现大量的根尖溢出碎屑,这是造成术后炎症反应的主要原因。另外根管再预备不彻底,残留根充材料和坏死组织,导致持续存在根管内的感染也可以造成再治疗的失败。因此,为了有效地解决以上两个主要问题,从而获得良好的再治疗效果,选择具有理想再治疗特性的器械和安全、高效的再治疗方法极为重要。
  目前,国内外关于根管再治疗的研究很多,在再治疗过程中碎屑产生量的控制、根管原有充填材料的清除效果,以及在治疗过程中对根管原有形态的影响方面是研究的主要方向。在以往的研究中,有多种根管再治疗的方法被采用,如应用手用扩大器械、携热器械、激光、超声器械,以及根管充填材料溶解剂的辅助应用等。这些技术各有优缺点,但不同程度地都会导致根尖部碎屑溢出,且均不能完全去除根充材料,导致根管内残留充填材料及感染物,因而根管再治疗技术的标准化治疗流程、操作规范和质量评定标准至今没有制定。近年来,随着镍钛旋转器械的兴起,在牙体牙髓领域引起了一场革命,它的独特功能和特性提高了根管预备的效果和效率。在应用于根管预备领域取得巨大成功后,镍钛旋转器械又被试用于根管再治疗领域中,产生了一些专用于再治疗的旋转器械,如ProTaper再治疗系统、Self-Adjusting再治疗锉等,其主要依据是利用它们独特的设计、旋转作用和镍钛金属具有的物理特性,提高清除根充材料的能力和效率,在弯曲根管再治疗中减少对根管壁牙本质的过度切削,并减少根尖碎屑的产生和溢出,从而预防治疗期间炎症的发生,保证再治疗疗效,它代表了根管再治疗技术今后的研究方向。此外,以往再治疗实验多涉及直根管,但临床上弯曲根管造成再治疗困难的情况最为常见,主要有两个方面的原因:一,镍钛旋转器械在根尖部会造成严重的根管偏移,进而导致无法在根尖弯曲处彻底清除根充材料。二,操作者在操作中由于根管弯曲度的限制严重影响视野,即使在根管显微镜的辅助下,也无法直视到根管每一区域。因此根管过高的弯曲程度提升了再预备的操作难度,增加了操作过程中根尖碎屑的产生量。本研究采用重度弯曲根管作为研究样本,为今后临床上根管再治疗技术的实际应用提供理论指导和参考依据。由于以往镍钛旋转器械由于受到自身物理特性和加工工艺的限制,使的有利于提高再治疗效果的某些性能不能得到充分体现,如器械旋转速度、弹性等,也影响了再治疗技术的发展。
  本研究根据以往研究经验,选用新型的根管预备系统Twisted Files(TF;卡瓦盛邦,美国)作为根管再预备的主要器械。它具有特殊的器械设计理念,拥有良好的弯曲特性,抗循环疲劳的能力,以及特殊的尖端设计和工作螺纹,有利于顺利进入弯曲根管,预备效果良好,能最大限度地顺应根管的原有形态,避免产生台阶、穿孔和根管偏移等现象,在复杂根管预备中表现出了优于其它预备器械的特点,另外作为高速旋转器械,它的工作速度远远高于其他品牌产品,预期可以提高根管再预备的工作效率,较高旋转速度产生的热量可能会促进根充材料的有效清除,并减少根尖碎屑的产生量,具备根管再治疗器械所应该具有的特质。关于TF在根管再治疗过程中根管充填材料清除效果的的研究,至今罕有报道。
  本研究的目的是通过对其根管再治疗特性的体外研究,评价根管镍钛旋转器械在不同旋转速度下对弯曲根管进行再治疗充填材料的清除效果,并计算溢出根尖孔的碎屑质量,以及根管内残余充填材料的比例,同时记录操作时间,初步评估其再治疗的性能,为提高根管再治疗清除效果提供理论依据和数据支持,从而确立未来根管再治疗技术的研究方向。
  材料与方法:
  选用因为牙周病而拔除的具有弯曲近颊侧根管的离体下颌第一磨牙48颗作为实验牙齿。要求牙体形态完整、牙根发育完成仅有单一根管孔,未进行过牙体牙髓治疗。用Schneider法以及Sch(a)fer法,对下颌第一磨牙近中颊根根管弯曲程度进行评估,弯曲角度用α表示,弯曲半径用r表示。选用25°≤α≤35°,r≤10mm的根管作为实验对象。应用10号K型扩大锉通畅根管至根尖,清除牙面上附着的软组织、牙石和色素,并储备在0.09%的生理盐水中。应用ProTaper机用镍钛锉以冠向下预备法,对样本根管进行初次预备后,选用热牙胶连续波充填技术完善充填根管,冠部封闭后置于37℃水浴中2周备用。并将样本随机分为四组,应用TF机用镍钛锉以500rpm、1000 rpm、1500 rpm的旋转速度,分别对A、B、C组进行二次预备,去除根管充填材料。应用手动器械对D组进行二次预备。用预先称重的离心管收集溢出根尖孔的碎屑,比较并计算再治疗前后离心管的质量差,得出碎屑量。另外采用显微CT技术,对二次预备前后的样本进行扫描,评估各组根管内各部分残留根管充填材料的百分比例,同时比较各组工作时间。应用单因素方差分析法对各组实验结果进行统计学分析。
  结果:
  1.根尖溢出碎屑
  本实验中所有再治疗技术均能产生根尖碎屑,手工器械组(D组)产生的碎屑量(0.69±0.04 mg)明显多于其他应用旋转器械各组(A:0.54±0.05 mg;B:0.48±0.04 mg;C:0.42±0.03 mg; all P<0.001)。C组产生的溢出碎屑量最少,与其他各组碎屑量有显著差异。镍钛器械旋转速度越快,溢出的碎屑量也就越少。A、B、C三组之间的数据差异有统计学意义(A vs.B:P=0.006;B vs.C:P<0.001; A vs.C:P<0.001)。
  2.根管残余充填材料
  结果显示,本实验中所有应用的再治疗技术均不能完全清除根充材料。剩余材料比例在4%-8%之间。与其它各组相比,C组剩余的残余充填材料比例(4.01±0.68)明显少于其各组(A:5.78±0.93;B:5.28±0.53;D:5.03±0.60; allP<0.01),有显著差异,尤其在根尖5mm处尤为明显(A:7.72±0.76;B:6.95±0.78;C:6.04±0.79;D:6.90±0.75; all P<0.01)。手动器械组与A、B组剩余充填材料比例之间无统计学意义。
  3.工作时间
  各分组再治疗器械首次到达工作长度所耗时间(T1)相比:C组所耗时间最少,各分组之间的数据差别有统计学意义(Avs.B:P<0.001; Bvs.C:P<0.001;A vs.C: P<0.001; A vs.D: P=0.036).
  各分组完成根管再预备所耗时间(T2)相比:手工器械组(D组)操作时间(19.70±0.30)明显多于其他应用旋转器械各组(A:8.08±0.23min;B:5.80±0.26min;C:3.53±0.33min)。4组间均有统计学差异(P<0.01)。
  结论:
  本研究对减少根尖溢出碎屑的产生,以及如何提高根管再治疗清除效果提供了重要的参考依据,并得出以下结论:
  1.第一部分实验中,各组均有根尖碎屑溢出,TF的旋转速度越快,根尖产生碎屑越少,较高的旋转速度与低速以及手动器械相比,可以显著减少根尖碎屑的产生,旋转速度与碎屑产生量呈正相关关系。
  2.在第二部分实验中,所有分组均留有残余充填材料,TF旋转速度1500rpm时,残余的根管充填材料比例最少,其余各组残余材料比例之间无显著性差异。在重度弯曲根管中,当旋转速度达到一定要求时,较高的旋转速度与低速以及手动器械相比,可以带来更佳的再治疗效果。在较低旋转速度1000rmp以下时,尚不能达到预期的清除效果。
  3.TF的旋转速度越快,所需要的再治疗的操作时间越少。在1500rpm时,所用的操作时间最少。
  综上所述,镍钛器械的旋转速度有可能成为影响根管再治疗效果的重要因素。在一定的速度范围内,同一旋转速度对根尖碎屑的产生和残余根充材料比例的影响程度并不完全一致。在今后,我们还需要进一步改进离体实验设计,尽可能模拟体内环境,对器械的旋转速度以及影响根管再治疗疗效的各种因素作进一步的深入评估,找出最适宜的工作速度和工作方式,在减少根尖碎屑产生和减少残余充填材料,以及提高工作效率等方面同时达到理想效果,建立根管再治疗的标准化操作流程。
[硕士论文] 陈庆勇
口腔临床医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  使用小干扰 RNA(siRNA)沉默人牙周膜细胞(HPDLCs)中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的基因;观察在LPS刺激下,TRAF6基因沉默对HPDLCs增殖能力和成骨分化能力的影响。
  方法:
  (1)酶消化联合组织块法体外培养HPDLCs,并进行免疫细胞化学鉴定。(2)实验分组:TRAF6 siRNA组、Control SiRNA组、转染试剂组、空白对照组,脂质体法将TRAF6 siRNA、control siRNA分别转染入对应组HPDLCs中,转染试剂组仅加入等量的转染试剂,空白对照组不做任何处理,再使用10μg/ml LPS刺激HPDLCs,RT-PCR、Western blot检测细胞中TRAF6的mRNA及蛋白的表达情况。(3)CCK-8法检测TRAF6 siRNA组、Control SiRNA组、转染试剂组在转染后使用含或不含10μg/ml LPS的培养基培养24h、48h时细胞增殖情况。(4)使用10μg/ml LPS+成骨分化诱导培养基培养转染细胞3d,碱性磷酸酶检测试剂盒检测ALP的活性,RT-PCR检测Runx-2和I型胶原蛋白(Col-I)基因表达情况。
  结果:
  (1)免疫细胞化学实验结果显示 HPDLCs培养成功;(2)TRAF6 siRNA组的TRAF6 mRNA和蛋白的表达水平与其余三组相比显著下降,差异有统计学意义(p<0.001),表明TRAF6基因沉默的细胞模型构建成功;(3)CCK-8法检测结果显示,10μg/ml LPS刺激各组细胞24、48h时,LPS刺激下Control SiRNA组、转染试剂组的 A值要高于对照组,差异有统计学意义(p<0.001),表明 LPS刺激能促进HPDLCs增殖;LPS刺激24h时TRAF6 siRNA组在LPS刺激下A值与未受LPS刺激组无差异,LPS刺激48h时TRAF6siRNA组的A值在LPS刺激组低于未受LPS刺激组,表明TRAF6基因沉默能抑制LPS引起的HPDLCs增殖;(4)10μg/ml LPS+成骨分化诱导培养基培养细胞3d后,TRAF6 siRNA组的ALP表达量要高于空白对照、转染试剂组和 control siRNA组,差异有统计学意义(p<0.05);TRAF6 siRNA组的Runx-2和Col-I的mRNA表达均明显高于其余三组,差异有统计学意义(p<0.05),表明TRAF6基因沉默能提高LPS刺激下HPDLCs的成骨能力。
  结论:
  TRAF6基因沉默能抑制LPS刺激下HPDLCs的增殖,促进LPS刺激下HPDLCs的成骨分化,推测TRAF6可能是牙周病
  潜在的治疗靶点。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部