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[硕士论文] 李秋玲
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)是一种严重危害棉花的重要入侵性害虫,而班氏跳小蜂(Aenasius bambawalei Hayat)是其专性寄生性天敌,在扶桑绵粉蚧生物防治过程中具有较好的应用潜力。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是气味分子和气味受体之间的桥梁,能够携带疏水性气味分子穿过亲水性淋巴液到达受体细胞,对气味的特异性结合和选择运输上有着重要的研究意义,若能明确班氏跳小蜂气味结合蛋白与配体的相互作用关系,将为筛选班氏跳小蜂寄主定位行为活性物质提供理论依据,也为扶桑绵粉蚧的生物防治提供绿色通道。为此,本课题以班氏跳小蜂为研究对象,在构建转录组的基础上筛选并克隆出了5个AbamOBPs基因,完成AbamOBP50与AbamOBP1的表达与纯化:测定了AbamOBP50与22种寄主挥发物的结合特性;利用荧光猝灭、圆二色谱及同源建模和分子对接分析了AbamOBP1与配基的相互作用关系;利用RNAi及Y型嗅觉仪初步筛选出了对班氏跳小蜂具有行为活性的物质。主要研究结果如下:
  1、班氏跳小蜂AbamOBPs基因克隆、蛋白表达和纯化
  通过RT-PCR技术成功克隆出了班氏跳小蜂基因AbamOBP50、OBP47、OBP43、OBP41及OBP1。开放阅读框分别为369bp、378bp、405bp、402bp、408bp,分别编码123个、126个、135个、134个、136个氨基酸,分别包含有21个、21个、17个、23个、20个氨基酸残基的信号肽,氨基酸序列结果显示AbamOBP50、OBP1和OBP41属于Classic OBPs,OBP47属于Plus-C OBPs,OBP43属于Minus-C OBPs。成功构建重组质粒pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1。pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1主要在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱,在体外成功获得AbamOBP50和AbamOBP1的纯蛋白。
  2、班氏跳小蜂AbamOBP50结合特性分析
  以1-NPN(N-苯基-1-萘胺)为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定了班氏跳小蜂AbamOBP50在中性和酸性环境下与22种棉花挥发物单体的结合特性。在中性环境下,AbamOBP50与挥发物单体均有较强的结合能力;在酸性环境下,AbamOBP50与8种物质结合能力较强,分别是1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、S-(-)-柠檬烯、月桂烯、α-水芹烯、β-石竹烯、莰烯和橙花叔醇,其中月桂烯、S-(-)-柠檬烯、α-水芹烯和β-石竹烯在酸性环境下的结合能力高于中性环境下的结合能力。
  3、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体荧光猝灭分析
  利用荧光猝灭测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯的相互作用关系。实验结果表明,AbamOBP1与1-NPN在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,在pH5.0条件下AbamOBP1与1-NPN是通过静电作用结合,在pH7.4条件下是以疏水作用结合,AbamOBP1与1-NPN是以1∶1比例结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是静态猝灭,在pH5.0条件下是动态猝灭。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下都是通过疏水作用结合,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是以氢键作用结合。AbamOBP1与2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯是以二聚体的方式结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮可能以二聚体,三聚体甚至多聚体结合。
  4、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体圆二色谱分析
  利用圆二色谱(CD)仪测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯的CD光谱。通过CD光谱可以观察到AbamOBP1与配基结合后二级结构构象的变化。实验结果表明,AbamOBP1在pH7.4条件下,在208和222nm处负峰值最低,表明α-螺旋含量最高,其次是pH3.0,在pH5.0条件下的负峰值最高,表明α-螺旋含量最低。在pH7.4条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置四种配比1∶1;1∶3;1∶5和1∶10。在pH5.0和pH3.0条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置两种配比1∶1和1∶3。在这三种不同pH条件下,随着蛋白与气味物质比例的增加,AbamOBP1的CD光谱中负峰逐渐减弱,表明AbamOBP1蛋白中的α-螺旋含量逐渐降低。说明蛋白与气味物质的结合导致蛋白肽链延伸,改变了蛋白二级结构。
  5、AbamOBP1在班氏跳小蜂寄主定位中的功能
  利用Y-型嗅觉仪测定了班氏跳小蜂雄蜂对1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2,4,4-三甲基-2-戊烯和S-(-)-柠檬烯这4种挥发物单体的行为选择实验。结果发现1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯对其有明显的吸引作用,而1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯对其没有吸引作用。RNAi实验表明在干扰48h和72h后AbamOBP1基因的相对表达量显著降低。干扰后对具有吸引作用的两种物质1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯进行行为选择验证。结果表明在干扰48h和72h后,这两种物质对班氏跳小蜂雄蜂的吸引作用明显降低。
  6、班氏跳小蜂AbamOBP1同源建模和分子对接
  以同源蛋白Apis mellifera的ASP1(3CAB pH7.0,3CDN pH4.0)为模板,建模得到AbamOBP1的三维结构,其具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于Classic OBPs。通过预测发现在pH4.0条件下的结合腔要比pH7.0条件下的结合腔要大。分子对接显示,在pH4.0条件下,氨基酸lle3、Phe51、Phe54、Leu56、Leu63、Va168、Arg71、lle72、Gly80、Met83、lle84、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115、Val116和lle117主要参与了AbamOBP1与配基的结合。在pH7.0条件下,氨基酸Phe51、Leu56、Leu57、His62、Leu63、Asp64、Lys67、Val68、Leu69、Arg71、lle72、Ala99、Leu102、Val103、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115和Val116主要参与了AbamOBP1与配基的结合。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 王文君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转Bt基因抗虫作物对大部分鳞翅目害虫具有较高的抗性。Bt杀虫蛋白可能通过对寄主的寄生而传递至其天敌体内。鳞翅目寄主取食转Bt基因抗虫作物后,其生长发育通常受到显著不利影响,从而产生“猎物质量介导效应”导致无法对其天敌进行准确的安全性评价。消除这种效应后,能大大提高转基因植物安全性评价的可靠性。本研究选择鳞翅目害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)及其寄生天敌麦蛾柔茧蜂(Habrobracon hebetor)作为研究对象,通过显微注射Bt蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴中,将印度谷螟幼虫血淋巴作为Bt蛋白的载体,构建了一种适合外寄生寄生蜂的Tier-1安评体系。结果表下:
  (1)单头印度谷螟老龄幼虫注射70ng浓度为0.5ng/nl的Cry1C蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中先快速下降,后缓慢下降。在注射0h时,近注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量显著高于远离注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量;注射0.5h后,两者无差异。被麦蛾柔茧蜂寄生后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的浓度在7天内趋于稳定,且含量始终高于直接取食转Bt基因稻谷印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量(1.72ng/g)的10倍以上,生测结果表明印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C蛋白具有生物活性。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的状态下,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的含量会一直下降。
  (2)印度谷螟幼虫血淋巴中的高剂量Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化(雌、雄)成虫体重、成虫寿命、存活率以及生殖力均无显著负面影响;而阳性对照GNA对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率初羽化雌成虫体重、初羽化雄成虫体重、成虫寿命以及生殖力造成负面影响。(3)Cry1C蛋白能通过印度谷螟血淋巴传递至麦蛾柔茧蜂体内。Cry1C蛋白可在麦蛾柔茧蜂幼虫体内不断累积,在麦蛾柔茧蜂老熟幼虫体内富集量最高;麦蛾柔茧蜂蛹内、成虫体内的Cry1C蛋白含量不断下降,低于麦蛾柔茧蜂幼虫的Cry1C蛋白蛋白含量,远低于印度谷螟血淋巴中的Cry1C蛋白含量。然而,麦蛾柔茧蜂成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测值下限。
[硕士论文] 王梅菊
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究旨在分离和筛选生防细菌菌株,明确其分类属性,评估其生防潜力。取得了如下研究结果:
  1.分离筛选获得了促生细菌菌株AW-17和CanL-30。
  分别从湖北武汉、湖北咸宁和安徽芜湖采集的植物样品中分离到82个菌株,包括细菌菌株和酵母菌菌株。采用拟南芥平板对峙培养试验和油菜浸种促生试验相结合的方法筛选得到2个促进植物生长的细菌菌株AW-17和CanL-30。菌株AW-17和CanL-30均能够通过产生挥发性有机物促进拟南芥幼苗生长,另外菌株AW-17还能够产生吲哚乙酸IAA,具有溶解不可溶性磷的能力。将这两株细菌用于盆栽油菜促生试验,结果表明:菌株AW-17对油菜生长有稳定促生效果,而菌株CanL-30则不具备盆栽促生能力。
  2.明确了菌株AW-17和CanL-30的生物学特性,并对其进行了鉴定。
  菌株AW-17单菌落乳黄色,质地光滑粘稠,在8℃~35℃条件下均能生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阴性,不产生芽孢。生理生化测定结果和16SrDNA序列分析表明:菌株AW-17属于液质沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)。菌株CanL-30单菌落乳白色,质地光滑干燥,在15℃~40℃条件下能较好的生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阳性,产生芽孢。鉴定结果表明菌株CanL-30属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  3.筛选出拮抗菌株CanL-30,并对其产生的抗真菌代谢产物进行了分离纯化。
  利用平板对峙培养和离体油菜叶片接种相结合的方法,筛选到1株能够稳定抑制灰葡萄孢的拮抗菌株CanL-30,其能够对多种病原菌产生拮抗作用,二分格皿试验和带毒平板试验结果表明菌株CanL-30主要通过产生抗真菌代谢产物抑制病原菌的生长。菌株CanL-30在NB培养基中,28℃、150r/min的条件下摇培72h,产生的抗菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌率达到90%,利用酸沉淀和甲醇萃取的方法对该条件下CanL-30产生的抗菌代谢产物进行提取,带毒平板试验结果显示,不同浓度粗提物平板对灰霉菌均有不同程度的抑制作用,其中365μg/mL粗提物平板对灰霉菌的抑菌率高达100%。CanL-30抗真菌粗提物具有耐高温、抗紫外的特性,其在100℃的水浴锅中处理60min钟后,抑菌活性与对照相比无差异。用紫外灯(UV-C,30W)处理抗菌粗提物150min后,其抑菌圈大小与对照无显著差别。对粗提物中的活性物质进行了分离和鉴定,发现CanL-30产生的代谢产物中含有iturin。
  本研究获得的油菜促生菌株AW-17和灰葡萄孢生防菌CanL-30存在着进一步研究和开发的潜力。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 刘俊丽
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pba)通过产生大量果胶酶来降解马铃薯组织细胞的细胞壁果胶成分,破坏细胞组织,造成马铃薯植株茎部变黑腐烂,块茎发生软腐。目前,针对由Pba导致的马铃薯黑胫病仍缺乏有效的防治办法。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒,其中烈性噬菌体导致宿主菌细胞裂解,可用于植物病害的防治。从土壤和水样中分离获得7株烈性噬菌体。噬菌体表征结果表明,噬菌斑直径1.5-2 mm,最佳感染复数0.000001-0.01。吸附时间6-30 min,潜伏时间15-40 min,裂解时间40-80 min。筛选出吸附、潜伏时间短,而裂解时间长的3株噬菌体P-Pba-1、P-Pba-2和P-Pba-7。电镜结果表明这3株噬菌体均为无尾噬菌体,头部直径30-80nm。
  本研究选择P-Pba-1作为单一制剂G1,P-Pba-1、P-Pba-2、P-Pba-7的混合物作为混合制剂G2,在田间网室进行马铃薯黑胫病防治试验,试验包括治疗组(先注射病原菌后喷洒噬菌体)和预防组(先喷洒噬菌体后注射病原菌)。治疗组结果表明,G1处理组的马铃薯植株存活率40-100%,其中处理组G1-A4治疗效果最好,植株存活率为100%;G2处理组的马铃薯植株存活率60-90%,其中处理组G2-A3治疗效果最好,植株存活率为90%。预防组结果表明,G1处理组的马铃薯植株存活率60-100%,其中处理组G1-B1和G1-B2预防效果最好,植株存活率为100%; G2处理组的马铃薯植株存活率80-100%,其中处理组G2-B1和G2-B2预防效果最好,植株存活率为100%。以上结果表明,噬菌体对马铃薯黑胫病有防治效果,可进一步开发噬菌体制剂,用于马铃薯黑胫病的防治。
[硕士论文] 国慧
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以实验室分离得到的萎缩芽孢杆菌SF1为研究对象,为了探究其拮抗蛋白的功能,对其β-1,3-葡聚糖酶基因进行了克隆和表达。本文的主要研究内容和结果如下:
  1、β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆:从萎缩芽孢杆菌SF1中克隆获得了β-1,3-葡聚糖酶基因bgl,基因全长1086bp,G+C含量50.4%,编码358个氨基酸,理论的分子量为47 kDa。
  2、β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达:将克隆得到的β-1,3-葡聚糖酶基因片段与表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-1-bgl,转化宿主菌BL21(DE3),并成功获得工程菌株NDM-1。经SDS-PAGE电泳检测,融合蛋白相对分子量约为73 kDa。
  3、β-1,3-葡聚糖酶酶活力及抑菌效果的测定:异源表达的β-1,3-葡聚糖酶,抑菌率最高达到45%,是菌株SF1抑菌率的61.9%。
[硕士论文] 侯圆圆
植物保护 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:瓜类枯萎病给瓜类生产造成巨大的经济损失,并且其防治十分困难。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)G5菌株是一株具有生防功能的内生细菌。以绿针假单胞菌G5菌株为生防因子,进行苦瓜枯萎病和黄瓜枯萎病生物防治技术的初步研究。研究结果如下:
  1、通过平板对峙试验,绿针假单胞菌G5菌株对苦瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. momodicae)SG-15菌株和黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)FOC菌株的菌丝具有明显拮抗作用,采用不同接种方法,G5菌株对SG-15菌株菌丝生长的抑制率达到60%以上;两点对峙法试验G5菌株对FOC菌株抑制率达到78.39%。
  2、利用绿针假单胞菌G5菌株对温室盆栽苦瓜枯萎病进行防治试验。G5菌株对苦瓜枯萎病幼苗防病效果达到31.32%;利用绿针假单胞菌G5菌株处理黄瓜幼苗,温室盆栽黄瓜枯萎病防病效果达到72.88%。
  3、利用绿针假单胞菌G5菌株处理黄瓜种子,48 h后测量黄瓜种子胚根长度,相对于空白对照处理,促生效果达到37.36%。再用绿针假单胞菌G5菌株处理发芽的黄瓜种子,播种40 d后,株高、茎粗、叶面积、干重、鲜重、壮苗指数均高于空白对照处理,并且G5菌株处理能使黄瓜叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量分别增加1.6%、4.8%、1.1%。
  4、进行绿针假单胞菌G5菌株与海藻肥复配对温室苦瓜幼苗的促生试验,单独施用海藻肥、单独施用生防菌、施用海藻肥与生防菌混合液三个处理的苦瓜苗株高、茎粗、叶面积、干重、鲜重、叶片数、壮苗指数均高于空白对照处理,且生防菌与海藻肥混合使用时试验效果最佳。
  5、单独施用海藻肥、单独施用生防菌、施用海藻肥与生防菌混合液三个处理,均能不同程度提高苦瓜产量,其中施用G5菌株与海藻肥的混合液处理效果最佳,产量显著高于对照处理,增产率达到43.70%。
  6、不同稀释倍数恶霉灵对苦瓜枯萎病菌的生长有抑制作用,随着稀释倍数增大,抑制效果下降。测量不同稀释倍数带毒平板中病原菌的直径,得到毒力回归方程为y=1.9926x+5.0178,相关系数为0.9915。温室盆栽条件下,绿针假单胞菌G5菌株与恶霉灵复配对苦瓜枯萎病和黄瓜枯萎病防治效果要高于单独使用化学药剂和生防菌剂,其中G5菌株与恶霉灵复配对苦瓜枯萎病防病效果达到75.64%,G5菌株与恶霉灵复配对黄瓜枯萎病防治效果达到90.16%。
[硕士论文] 李纪伟
植物保护 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:花绒寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)属鞘翅目(Coleoptera)寄甲科(Bothrideridae),是防治多种林木蛀干害虫的有效天敌。本研究利用三种替代寄主—黄粉虫(蛹)、大麦虫(蛹)、褐梗天牛(幼虫、蛹)进行花绒寄甲的室内扩繁,对三种替代寄主的最大接虫量,不同接种比例下繁育的花绒寄甲的结茧率、羽化率、成虫雌雄比、产卵前期、单雌产卵量、最佳接虫比等方面进行了统计分析。结果表明:
  1、单头大麦虫蛹最多可繁育23头花绒寄甲成虫,作为替代寄主繁育花绒寄甲的潜力最大;单头黄粉虫蛹最多可繁育5头花绒寄甲成虫,单头褐梗天牛幼虫最多可繁育5头花绒寄甲成虫,单头褐梗天牛蛹最多可繁育9头花绒寄甲成虫。
  2、大麦虫蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:5时,结茧率与羽化率最高,分别为72.22%和69.11%。黄粉虫蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:2时,羽化率最高为35%;接种比例为1:5时,结茧率最高,为39.33%,羽化率为21.56%;接种比例以1:2最佳。褐梗天牛蛹与花绒寄甲初孵幼虫接种比例为1:4时羽化率最高,为74.44%;随着接种数目的增加,结茧率不断升高,最高可达到79.44。褐梗天牛幼虫龄期为9龄时、接种比例为1:4时,褐梗天牛幼虫繁育的花绒寄甲结茧率与羽化率最高,分别为69.72%和61.11%。
  3、三种替代寄主繁育的花绒寄甲成虫平均体重随着羽化数目的增加而逐渐降低。
  4、三种替代寄主繁育的花绒寄甲的产卵前期时长差异不显著,均在40d左右;花绒寄甲的雌雄比差异性不显著,均接近1:1。
  5、利用三种人工饲料SL1、SL2、SL3饲喂不同类型花绒寄甲成虫,在9月至次年3月时间段内死亡率差异性不显著;饲喂不同人工饲料的花绒寄甲的月均单雌产卵量差异性不显著;三种人工饲料均可用于花绒寄甲成虫的饲喂。
  6、利用相同人工饲料SL3饲喂不同种类的花绒寄甲成虫,在9月至次年3月为期7个月的时间内,在9月达到产卵高峰期,最产卵数均达400头以上;11月至12月产卵量最低,部分花绒寄甲雌虫出现不产卵的现象,1月份后产卵量逐渐回升。
  7、接种比例相同时,随着寄主化蛹后时长的增加,接种的花绒寄甲羽化率逐渐降低;黄粉虫蛹表皮硬化速度最快;三种替代寄主蛹的最佳接种时间为化蛹后的24h。
[博士论文] 汪波
动物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:狼蛛是农田生态系统中一类重要的捕食性天敌,为更好的发挥天敌控制虫害作用,采用室内行为学实验判断、气相色谱-触角电位联用(GC-EAD)检测技术、气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测技术、扫描电镜观察等方法,探究游猎型蜘蛛捕食寻觅猎物中的机制,实验结果如下:
  1.拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)为狼蛛科豹蛛属的动物。为了探究蜘蛛接收外界信号的机制,通过对拟环纹豹蛛体表进行扫描电镜观察,分析拟环纹豹蛛体表感受器,附肢体毛(触毛、听毛、味觉感觉毛)的类型、分布及特征。结果显示,拟环纹豹蛛的单个裂缝感受器主要分布在触肢的跗节与胫节,数量较少,在整个触肢只能发现一到两个单个裂缝感受器;竖琴器在拟环纹豹蛛体表分布广泛,螯肢、触肢、步足均有发现,且胫节分布较多;而跗节器则见于触肢端部的前跗节上,其形态似水滴状小孔,为圆形或椭圆形空洞。拟环纹豹蛛的触毛与体表形成的角度为锐角,触毛粗大,毛干较挺立,周围有绒毛环绕,触毛主要分布在蜘蛛体触肢的跗节、胫节和步足的跗节、胫节、端部处,其中第一步足分布最多,其数量较听毛和化学感觉毛多。拟环纹豹蛛的听毛细而长,基本垂直于表皮,毛囊深窝有褶皱,听毛主要分布于触肢和第四步足的胫节上,其余腿节分布较少,不同部位的听毛在形态、长度上没有太大的差别。拟环纹豹蛛的味觉感觉毛基部四周有微微隆起的圆形状毛囊,味觉感觉毛大于听毛又小于触毛,四周被绒毛环绕,主要分布于蜘蛛的第一步足和第二步足的跗节胫节处,在触肢和螯肢也有少量分布。
  2.为了探明听觉在游猎型蜘蛛捕食猎物中的作用,在实验室条件下,比较拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)对有模拟果蝇振翅声源端和无声源端的反应状态。结果表明,在近距离条件下,狼蛛能够正确选择声源端,且狼蛛对声源端选择指数显著高于无声源端(P<0.05),但当狼蛛与声源距离增大至15 cm后,狼蛛对声源端和无声源端选择具有随机性,选择指数无显著差异(P>0.05);狼蛛在有声源端停留时间也呈类似变化,当狼蛛和声源间距离在12cm以内,狼蛛在声源端停留时间较长,多于总观察时间的一半,且狼蛛在声源端停留时间显著高于无声源端(P<0.05),当距离增加后,狼蛛对声音敏感程度下降,在声源端和无声源端停留时间无显著差异(P>0.05)。总之,从狼蛛在声源端的停留时间和选择情况来看,与声源距离越近,狼蛛对声音的敏感性越高,随着距离的增加,敏感性逐渐降低,声源间距与狼蛛成功地寻找和定位猎物有明显的负相关性。另外,狼蛛的性别对听觉感受器的敏感度与有一定的影响,雌性狼蛛对果蝇振翅声音更为敏感,定位准确率更高。
  通过测定猎物发声距离(4cm、6cm、8cm、10cm、12cm、14cm、16cm)及发声停顿间隔时间(0s、1s、3s、5s、7s、9s、11s)对蜘蛛定位与捕食猎物的影响,研究听觉在游猎型蜘蛛定位猎物中的作用。实验结果表明蜘蛛运动速度(y)与发声间距(x)呈高度负相关,间距为4 cm和6 cm的时候,运动速度最快,分别达到5.12±0.40cm/min和5.45±0.31 cm/min,显著高于其他组(P<0.05),运动速度最慢的是声源间距为14 cm和16 cm的时候,只有2.95±0.11和2.63±0.11 cm/min。在相同发声间距(6 cm)的条件下,声音停顿间隔增大,蜘蛛的运动速度逐渐下降,当声音停顿间隔为1s和3s的时候,蜘蛛运动速度达到最大,分别为5.02±0.31 cm/min和5.15±0.40cm/min,之后随着发声停顿间隔延长,蜘蛛运动速度显著下降(P<0.05),到声音停顿间隔达到11s时,蜘蛛运动速度只有2.36±0.15cm/min。
  3拟环纹豹蛛能依靠视觉发现位于3、4、5、6 cm这4个距离的猎物。当果蝇距离拟环纹豹蛛3、4 cm时,拟环纹豹蛛的视觉敏感性最好,当果蝇距离达到5、6 cm时,拟环纹豹蛛仍具有视觉敏感性,但选择指数呈明显下降趋势(P<0.05),说明敏感性下降显著,当果蝇距离达到或者大于7 cm时,拟环纹豹蛛仅依靠视觉难以发现猎物的存在。实验结果表明拟环纹豹蛛选择指数(y)与果蝇间距(x)呈高度负相关,标准曲线为y=-9.6770x+118.74,R2=0.8378。拟环纹豹蛛对颜色选择的实验中,结果显示,拟环纹豹蛛对4种实验环境颜色的选择指数分别为,红色为35.40±1.60%,绿色36.03±1.60%,黄色18.01±1.60%,橙色10.56±1.60%,可知,拟环纹豹蛛对红色和绿色环境的敏感性显著高于对黄色和橙色环境的敏感性(P<0.05),拟环纹豹蛛对红色和绿色环境最敏感,说明拟环纹豹蛛能够感知不同波长的光色差异。
  利用单因子变量法和正交试验法,从光照强度、光照颜色、环境温度三个方面对影响拟环纹豹蛛捕食效率的主要环境因素进行了分析。研究结果表明,当环境因素组合为15Lx光照强度,绿色环境颜色,环境温度27℃时,拟环纹豹蛛捕食效率达到最高。
  4.采用Y型嗅觉仪法研究了狼蛛对猎物体液气味和体表气味的灵敏度反应。结果表明在实验距离内,狼蛛均能够正确选择有果蝇体液气味端,选择指数显著高于无果蝇体液气味端(P<0.05),停留时间显著高于无果蝇体液气味端(P<0.05),但当狼蛛与有果蝇体液气味端距离增大后,狼蛛对气味敏感程度下降,当狼蛛与气味源距离达到11 cm后,虽然狼蛛仍然能够正确选择有果蝇体液气味端,但选择指数显著下降(P<0.05),回归分析显示,狼蛛对有果蝇体液气味端选择指数与狼蛛和气味源间距离呈高度负相关。同时,研究结果发现狼蛛对果蝇体液气味比果蝇体表气味的反应更敏感。
  选取狼蛛第一步足的腿节靠近胫节处到跗节进行电生理试验,GC-EAD检测分析得出,猎物体表挥发性成分能够对拟环纹豹蛛的第一步足产生刺激,雌性和雄性拟环纹豹蛛对这两种物质均有反应。猎物浸提液GC-MS测试结果表明,猎物浸提液中共鉴定有10种组分,主要为烯烃(占32.49%)、芥酸衍生物(占28.34%)、酯类(占21.78%)、烷烃(占17.39%)。其中,芥酸酰胺含量最高,占28.34%;其次为十四酸十六酯,占21.78%。
[硕士论文] 徐馨竹
植物保护;农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:夜蛾科(Noctuidae)害虫种类多且危害广,发生周期长,给农业生产带来极大损失。目前夜蛾科害虫的治理仍以化学防治为主,化学农药长期大量施用造成的“3R”问题,使生态环境日趋恶化,也使得有害生物的绿色防控成为众望所归。苏云金杆菌(简称Bt)以其杀虫专一性强、环境友好等特点,在害虫生物防治中得到大量应用,但随着Bt大面积的推广应用,田间抗性种群也不断产生,因此,不断挖掘新的Bt菌株,筛选出高效、广谱的cry基因尤为重要。
  本研究利用醋酸钠选择筛选法从黑龙江省不同类型的土壤中分离出苏云金杆菌,并对其基因型进行了鉴定,以棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae Linnaeus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)为靶标,检测了菌株对夜蛾科害虫的生物活性,并对高毒力菌株的新基因进行了克隆与表达,获得以下实验结果:
  从黑龙江省不同地区采集的352土样中分离出Bt菌株46株,出菌率为13.6%,其中哈尔滨等地区的黑土与伊春等地区的暗棕壤分离出来的Bt菌株最多,出菌率分别占18.81%和18.83%;其次是加格达奇等地区针叶林土和齐齐哈尔等地区的草甸土,出菌率分别占7.89%与9.52%,佳木斯市风沙土的出菌率为2.38%,大庆等地区的盐碱地并没有分离出Bt菌株。
  通过光学显微镜镜检观察,分离株的伴孢晶体形态不一,主要以长菱形、钝菱形等不同类型的菱形为主,还存在不规则形、球形、镶嵌形等一些晶体类型,部分分离株还可观察到几种形态晶体共存的现象。
  采用PCR-RFLP鉴定体系,利用10对通用引物筛选出cry1、cry2、cry8以及cry9四种基因型。其中,检测出cry1类基因的菌株共34株,检出率最高,占73.91%,其次是存在cry2类基因的菌株共计18株,4株检测出cry8类基因,6株存在cry9类基因。有16株菌株仅有单一的cry1或cry2基因,其他呈现基因组合形式,如cry1+cry2型、cry1+cry2+cry9型等多种类型。有9株分离株并未检测出基因型,占总数的19.57%,却有蛋白表达,分析原因可能是鉴定引物数量较少而未检测出杀虫基因型亦或是有未知杀虫基因存在。
  通过SDS-PAGE方法,分析了Bt分离株的Cry蛋白表达的杀虫晶体量,发现分子量在130 kDa、90 kDa、70 kDa以及60 kDa的蛋白量最为丰富。13株仅有cry1型基因的菌株蛋白表达量约为130 kDa;3株仅有cry2型基因的菌株蛋白表达量约为60 kDa-70 kDa;兼有cry1型、cry2型基因的菌株其伴孢晶体为菱形,表达ICPs分子量大小为130 kDa和60 kDa;存在多种基因型的菌株蛋白表达大小多样,多为130 kDa和60 kDa;未鉴定出cry基因型的菌株却检测出了表达的蛋白,而且蛋白的表达量大小不一。
  本研究克隆获得了cry1Ab36与cry2Ab35两个新基因(登录号分别为KY440260和KY501107),均来自对夜蛾科害虫有较高杀虫活性的菌株HT2。对cry1Ab36与cry2Ab35基因进行了克隆与分析,结果表明:cry1Ab36基因开放阅读框共3546 bp,编码1181个氨基酸,分子量133.52 kDa,等电点为4.98;cry2Ab35读码框为1902 bp,编码633个氨基酸,分子量70.72 kDa,等电点为8.73,都具有三个典型的结构域,不含有信号肽。
  经由SDS-PAGE分析、Western blot验证均证:cry2Ab35基因在大肠杆菌内成功表达了70 kDa左右蛋白,其上清液和沉淀均有蛋白的表达,说明该蛋白有部分溶解现象。
[硕士论文] 刘陈
农业昆虫与害虫防治 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:黑肩绿盲蝽(Cyrtorhinus lividipennis Reuter)属半翅目(Hemiptera)、盲蝽科(Miridae)、嗜卵盲蝽属Cyrtorhinus,主要捕食褐飞虱(Nilaparvata lugens)、白背飞虱(Sogatella furciferaHorvath)、叶蝉(Nephotettix virescens Distant)卵,也可捕食稻飞虱和叶蝉低龄若虫,是水稻田中重要的捕食性天敌。为了能有效利用黑肩绿盲蝽控制水稻害虫,本文研究了替代饲料-米蛾(Corcyra cephalonica)卵饲养黑肩绿盲蝽的可行性,并评价了5种亚致死浓度杀虫剂(吡虫啉、三唑磷、溴氰菊酯、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺)对黑肩绿盲蝽初羽化成虫生殖的影响。主要研究成果如下:
  (1)本文研究了以米蛾卵饲养对黑肩绿盲蝽发育历期、若虫存活率、雌性比、雌成虫寿命、产卵前期、产卵量、卵孵化率以及生命参数的影响。结果表明:米蛾卵饲喂组(处理组)的黑肩绿盲蝽卵期与褐飞虱卵饲喂组(CK)无显著差异;处理组1龄、2龄若虫的发育历期与CK相比分别缩短了8.6%和14.7%;而3龄、4龄、5龄若虫的发育历期较对照分别延长15.0%、34.1%和16.8%;处理组黑肩绿盲蝽整个若虫期为11.15±0.13d,较对照长5.2%。米蛾卵饲喂组黑肩绿盲蝽的1龄、2龄、3龄、4龄、5龄以及整个若虫期的存活率与对照均无显著差异。处理组黑肩绿盲蝽的雌性比、产卵前期、单雌产卵量、卵孵化率,均与对照无显著差异,但雌成虫的寿命为12.55±0.5d,较对照缩短了18.5%。处理组黑肩绿盲蝽种群内禀增长率(r)、周限增长率(λ)、净增殖率(Rn)、平均世代周期(T)、种群加倍时间(t)等生命参数均与对照无显著差异。我们的研究结果表明米蛾卵是适合黑肩绿盲蝽取食的替代饲料。
  (2)本文研究了5种杀虫剂(吡虫啉、三唑磷、溴氰菊酯、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺)亚致死浓度(LC20)药膜法处理对黑肩绿盲蝽初羽化成虫生殖的影响。经过吡虫啉亚致死浓度处理的三个交配组合(♀CK×♂t、♀t×♂t、♀t×♂CK)单雌产卵量分别为(92.8±7.2)粒、(95.8±7.6)粒、(102.8±7.4)粒,分别较对照(♀粒,分别)提高了42.9%、58.1%、47.3%。亚致死浓度的三唑磷、溴氰菊酯、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺处理后,三个交配组合(♀CK×♂t、♀t×♂t、♀t×♂CK)也有不同程度的提高。研究结果表明这5种杀虫剂均能显著刺激黑肩绿盲蝽繁殖。亚致死浓度(LC20)的吡虫啉、三唑磷、溴氰菊酯处理黑肩绿盲蝽初羽化雌成虫后,雌成虫体内的卵黄原蛋白(Vitellogenin Vg)mRNA相对表达水平均分别上调了55.1%、48.0%、63.4%。我们推测亚致死浓度杀虫剂刺激黑肩绿盲蝽生殖是与药剂处理刺激卵黄原蛋白合成有关。
[硕士论文] 魏钦钦
农业昆虫与害虫防治 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:南方小花蝽(Orius similis Zheng)是农业生产中一类应用前景广泛的天敌昆虫。目前对南方小花蝽的研究多集中在人工饲养,高龄若虫死亡率高、卵巢发育差的问题尚未得到解决。本文研究了一种现有人工饲料(以蛋黄、蜂蜜、蝇蛆粉为主要成分)对南方小花蝽生物学特性和捕食特性的影响,在此基础之上分析了不同比例动物源食料(蚕豆蚜)短期处理南方小花蝽对其生长发育的影响,为全面评价饲料饲养效果、改进人工饲料和提高人工扩繁技术提供依据和指导。本研究主要结果如下:
  1.人工饲料和自然猎物对南方小花蝽生物学特性的影响。实验发现,取食该人工饲料的南方小花蝽个体能够从初孵若虫发育成成虫并少量产卵,在低龄若虫阶段具有较高的存活率,而末龄若虫阶段出现大量死亡,表明对末龄若虫而言,自然猎物蚕豆蚜的营养质量优于人工饲料;人工饲料会降低南方小花蝽的繁殖力,雌虫产卵前期延长,产卵量显著下降;若虫期和成虫期的取食经历对雌虫产卵力都有显著影响。
  2.人工饲料和自然猎物对南方小花蝽捕食特性的影响。结果显示,不同食物条件下,南方小花蝽四龄若虫、五龄若虫、成虫对蚕豆蚜的捕食功能反应均属于HollingⅡ型。在人工饲料组中,南方小花蝽五龄若虫及成虫对蚕豆蚜的理论最大捕食量为40、40头,自然猎物组为41、35,这表明食物类型对南方小花蝽五龄若虫和成虫的捕食量影响不大。同时,南方小花蝽五龄若虫和成虫并不通过增加日捕食量来应对营养缺乏。猎物密度相同时,自然猎物组的南方小花蝽对猎物的寻找效应与人工饲料组相比无差异,且均随猎物密度的增大而降低。因此,本试验所用人工饲料充分改进后可用于南方小花蝽大量人工饲养。此外,低猎物密度下取食人工饲料的南方小花蝽可以更有效的发挥控害作用,且更易存活。
  3.不同比例动物源食料阶段性饲喂南方小花蝽对其生长发育的影响。用动物源食料饲喂南方小花蝽四龄若虫,发现其四龄历期较饲料组显著缩短,而饲喂五龄若虫时,其五龄发育历期与人工饲料组趋于一致。在动物源食料短期处理中,各处理组五龄若虫存活率均能达到90%以上表明:人工饲料导致的南方小花蝽五龄若虫高死亡率可能是缺乏某种特殊的动物源营养因素引起的;动物源食料短期处理能够显著提高南方小花蝽成虫获得率。四龄若虫动物源食料处理中,7日龄南方小花蝽雌成虫卵巢管长度大多在700-1000μm,与动物源食料添量基本成正比,均高于饲料组666.79μm,但在高添量下仍然显著低于自然猎物组1066.45μm。五龄动物源食料短期处理中,在添饲数量为4头时卵巢管长度达到自然猎物组均值,当添饲数量超过8头时达到最值为1304.00μm,与终身取食自然猎物的南方小花蝽10日龄卵巢管(最长卵巢管)长1341.25μm无显著差异。表明南方小花蝽四龄若虫动物源营养对卵巢发育较人工饲料有一定的促进作用,且这种促进作用与动物源营养的添量密切相关。而五龄动物源食料短期处理能够显著提高南方小花蝽卵巢发育质量,且一定量的动物源食料添饲能够加快雌成虫卵巢发育速率。
[硕士论文] 秦晶
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:内生菌(endophytes)指的是在其生活史的部分或者全数阶段寄生于植物的组织内部,但不对植物造成危害的微生物。其中,内生真菌因其增强植物抗病性、产生活性代谢产物等作用,近年来成为寻找生防菌株的宝库。本研究对一株油菜内生真菌CanS-34A进行了分类属性鉴定,对其产生的抗真菌物质进行了防治油菜菌核病效果评估,以及化学结构解析。取得的研究结果如下:
  1.明确了菌株CanS-34A的分类属性
  采用形态特征观察和分子(ITS、RPB2、CaM及benA)鉴定方法,发现菌株CanS-34A属于Aspergillus capensis。
  2.明确了菌株CanS-34A代谢产物防治油菜菌核病效果
  通过平板对峙培养试验、发酵液抑制生长试验、离体及活体叶片接种等试验,发现菌株CanS-34A对核盘菌的拮抗性,其代谢产物能抑制核盘菌的菌丝扩展和菌核萌发,抑制核盘菌侵染。
  3.明确了菌株CanS-34A抗真菌物质的基本性质
  菌株CanS-34A抗真菌物质在60℃以下可保持活性,对紫外线辐射有一定的忍耐力,在碱性条件下活性较高。能特异性的抑制核盘菌科病原真菌(Sclerotinia属、Botrytis属和Monilinia属)及革兰氏阳性细菌。
  4.从CanS-34A发酵液分离获得3种抗真菌化合物
  采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、HPLC等方法对菌株CanS-34A抗真菌物质进行了分离和纯化,进而采用核磁共振和高分辨率质谱等方法对化合物纯品进行化学结构鉴定。发现所获得的3种化合物为penicillither、methyldichloroasterrate和rosellichalasin。生物活性测定结果表明,这些化合物对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)及桃褐腐(Monilinia fructicola)均表现出抑制效果,其中rosellichalasin对核盘菌的抑制效果最强。
  以上研究结果为开发菌株CanS-34A活性代谢物质防治油菜菌核病打下了基础。
[硕士论文] 雒国兴
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)营养期杀虫蛋白Vip3A类对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。虽然Vip3Aa蛋白间的序列相似性很高(95%-100%),但是,不同Bt菌株来源的Vip3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性存在很大差异。本研究为了探索Vip3 Aa11羧基端点突变对其杀虫活性和敏感性的影响,基于Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白氨基酸序列同源性高而杀虫活性差异大的特点,利用定点突变技术将挑选的位于Vip3 Aa11羧基端的九个差异氨基酸分别突变为Vip3 Aa39相应位点上的氨基酸。得到九个突变体:S543N、I544L、D547E、T681V、T685I、S686R、R704G、I780L和Y784N。将突变体基因在大肠杆菌(E.coli) BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明九个突变基因和vip3Aa11均在可溶组分中表达大小约88 kDa的蛋白片段。
  对小菜蛾(Plutella xyllostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉铃虫(Helicoverp aarmigera)、小地老虎(Agrotis ipsilon)进行生物活性测定。结果显示,突变体以及Vip Aa11蛋白均对小菜蛾无明显杀虫活性。与Vip3Aa11相比,突变体蛋白对甜菜夜蛾、棉铃虫和小地老虎三种试虫的杀虫活性均有不同程度的变化。三个突变体蛋白S543N、I544L和S686R对甜菜夜蛾活性明显升高,其活性分别提高了5倍、2.65倍和8.98倍;而这三个突变体对棉铃虫和小地老虎的杀虫活性均有不同程度的降低;突变体蛋白Y784N对四种试虫完全丧失了杀虫活性。胰蛋白酶消化结果显示,Y784N对胰蛋白酶极度敏感,被胰蛋白酶全部降解,这可能是其杀虫活性完全丧失的根本原因。而其余八个有活性的突变体蛋白经胰蛋白酶消化后均可形成一个稳定的62 kDa抗性核心多肽。
  这些结果表明Vip3 Aa11羧基端543-784区段部分氨基酸对其杀虫特异性以及杀虫毒力均具有重要作用,且不同的害虫所需要的氨基酸位点也不同。本研究为揭示Vip3Aa11蛋白的杀虫活性和特异性奠定了重要基础。
[硕士论文] 方迪
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary)是油菜菌核病的病原菌,每年造成油菜大量减产,经济损失巨大。重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minntans)对核盘菌专性寄生,对核盘菌的生物防治有着广阔的开发前景。实验室前期研究发现盾壳霉能降解核盘菌产生的草酸毒素,这一过程中可以通过产生氨来缓解酸化的环境,也说明这其中伴随着盾壳霉的氮源代谢调控,而参与该氮源代谢的调控基因和功能还未见报道。盾壳霉氮源代谢调控基因(cmareA)对其生长发育,盾壳霉重寄生,降解草酸和产生抗真菌的影响也尚不清楚。因此,该课题在实验室前期研究的基础上,对盾壳霉的氮源代谢调控基因cmareA进行了深入研究,获得的主要研究成果如下:
  从盾壳霉Chy-1中克隆获得cmareA部分序列,比对盾壳霉基因组数据库获得全部cmareA基因序列,基因全长2811 bp,除去一个内含子之后的外显子序列大小为2754 bp,该开放阅读框编码917个氨基酸。系统进化树分析结果表明cmareA编码的氨基酸与小麦颖枯病菌(Parastagonospora nodorum)的同源areA编码的氨基酸亲缘关系最近,同源性高达85%。基因的表达分析证明cmareA基因只有在优先氮源不足或氮源饥饿状态下,cmareA的转录调控才会被激活,cmareA基因才会表达。
  通过Split-Marker技术对cmareA基因进了敲除与互补,获得敲除突变体△cmareA-129和△cmareA-133,相对应的互补转化子△cmareA-129C和△cmareA-133C。对其生物学特性的研究发现,cmareA的缺失会减慢盾壳霉在PDA培养条件下的菌丝生长发育,同时会减低其产孢量。另外,cmareA的缺失会导致盾壳霉在以硝酸和铵盐为氮源的MCD培养条件下的菌丝生长受到抑制,生长速率显著下降。
  通过平板对峙试验和菌核沙皿寄生菌核试验,测定各突变体寄生核盘菌的能力。结果显示,cmareA敲除后,敲除转化子△cmareA-129和△cmareA-133对核盘菌菌丝和菌核的寄生能力减弱。进一步测定重寄生相关酶(胞外蛋白酶、葡聚糖酶和几丁质酶)活性,结果发现敲除突变体的重寄生能力的减弱可能是由于cmareA缺失导致几丁质酶活性降低所引起的。通过液相色谱的方法,测定各突变体降解草酸的能力,结果显示,cmareA缺失后盾壳霉降解草酸的能力也同样减弱。在不同氮源的培养条件,发现可能由于cmareA敲除突变体的生长速度减慢导致产生的抗真菌物质的能力也有不同程度的降低。另外,在研究氮源与pH对盾壳霉抗菌作用的交互影响实验中,发现盾壳霉以硝酸盐为氮源时产生AFS,酸性pH是必须的,cmareA也是必须的。
  综上所述,盾壳霉氮源代谢调控基因cmareA不仅参与了盾壳霉的生长发育、硝酸和铵类氮源的调控,cmareA基因还能正调控着盾壳霉的重寄生,草酸的降解,同时还调控抗真菌物质的产生。
[硕士论文] 叶罗娜
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鸡腿菇(Coprinus comatus)是一种风味和口感十分独特的美味食用菌,营养和药用价值高,深受消费者的喜爱。鸡腿菇从菌丝生长到子实体形成耗时较短,同时生物转化效率非常高,栽培过程简单容易掌握。但栽培的一系列过程中病虫害发生严重,常造成惨重的经济损失。特别是细菌性病害发生快、蔓延快和传播范围广,防治相当困难。本课题研究了鸡腿菇菌柄腐烂病的发生规律,后根据柯赫氏法则对病原分离物的致病性进行验证,同时鉴定病原物所属属名和种名,并将分离的病原物和对应的临床标准菌株进行了动物致病性验证。采集不同地点的土壤样品,分析病原物的来源。筛选植物提取物和生防细菌,进行了鸡腿菇腐烂病生物防治初探。
  2015年7月在山东省平阴县鸡腿菇栽培场内发现一种鸡腿菇菌柄腐烂病。从发病部分分离纯化到了3种细菌菌株,分别命名为JTG-A,JTG-B1,JTG-B2。根据柯赫氏法则,验证3种分离物的致病性,采用摩擦伤口接种的方式,分为四组进行接种,每组25个健康的子实体,重复4次,在接种16h、36h和52 h后连续观察发病情况。结果显示,JTG-B1在16h后可使50%以上的子实体发病,形成明显的病斑,并有菌脓出现,后期整个子实体腐败,直至死亡。JTG-A和JTG-B2接种后仅少数子实体出现症状,致病力明显低于JTG-B1。
  对JTG-B1采用菌落形态观察、生理生化反应和16s rDNA序列分析进行鉴定,确定其为人体病原菌-氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。从华中科技大学医学院附属同济医院得到对应的临床标准菌株TJ-ade,采用腹腔注射小白鼠验证JTG-B1和TJ-ade的动物致病性。结果显示80%JTG-B1悬浮液和20%生理盐水混合物腹腔注射小白鼠,在21 d后进食率为33%,TJ-ade在相同处理下进食率为29%。小鼠在各处理组中均表现出明显的不活跃性,眼紧闭,有抱团现象,体毛有脱落现象,但未出现死亡现象。对两个菌株最适pH和温度进行测定,JTG-B1和TJ-ade在16-34℃时均可生长,28℃为最适生长温度,在pH4-11之间两者均可生长,pH7为最适生长pH值。
  对JTG-B1和TJ-ade的7个管家基因nusA、rpoB、eno、gltB、lepA、nuoL、和nrdA进行扩增,测序后输入MLST数据库,将等位基因编号进行一对一的比对,从而确定对应的ST型。PCR扩增后对产物进行琼脂糖凝胶电泳,可知管家基因扩增片段大小为300-400bp,JTG-B1和TJ-ade分别为ST14和ST29。采用上述相同方法进行鸡腿菇子实体致病性实验,TJ-ade在16h时伤口接种也能使50%以上的健康鸡腿菇子实体菌柄发病,症状与JTG-B1接种后相同。生理生化反应观察两者对不同糖类分解情况,CIT(柠檬酸盐利用试验),VP(丙酮酸盐试验),GLU(葡萄糖发酵试验),SAC(蔗糖发酵试验),AMY(苦杏仁苷发酵试验)和ARA(阿拉伯糖试验)的反应均为阳性,但JTG-B1所有阳性反应小管的颜色反应均深于TJ-ade,可知其代谢反应速率和相关酶类表达量高于TJ-ade,结合动物致病性实验,可综合分析两者种间差异情况。
  从山东省平阴县鸡腿菇栽培基地周边的7处位置采集土壤样品,提取土壤总DNA,扩增目的病原菌JTG-B1的blaOXA-114基因。洞穴外地面土壤PCR反应产物在电泳时出现了大小500bp左右的条带,表明病原物可能在栽培场地周边存在,通过人为携带、覆土材料或栽培料等进入栽培场地中。
  制备大蒜、梧桐树叶、银杏、蒲空、龙葵、茶叶、肉桂油、石榴皮和辣椒等植物的提取物。结果显示,仅肉桂油在浓度100mg/mL和120mg/mL时,可以对病原菌产生直径1.0mm和9.0mm的抑菌圈。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)发酵液对病原菌没有抑制作用。120mg/mL肉桂油对鸡腿菇菌丝生长无影响,且在12h和24h时肉桂油在鸡腿菇子实体上可以预防病原菌感染。
[硕士论文] 乔琳涛
微生物学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:农业害虫的防治始终是人们亟待解决的难题,目前微生物农药以生物防治生物且具有安全,无污染等特点,而受到人们越来越多的关注。在微生物农药中,以昆虫病原真菌为主的杀虫剂在害虫生物防治中起重要作用,昆虫病原真菌的研究也日益成为人们的研究热点。罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)作为虫生真菌的模式生物,在虫生真菌的代谢调控,致病机理等研究中起着重要的作用。DHN(1,8-dihydroxynaphthalene)黑色素合成途径存在于大部分真菌中,且与真菌的致病力,抵御不利条件有着密切的关系,其中小柱孢酮脱水酶(SCD,scytalone dehydratase)基因是DHN黑色素合成途径中的一个关键基因。前期研究表明绿僵菌中可能不存在DHN黑色素合成途径,且关于绿僵菌中的色素合成途径仍需要进一步的研究。
  本研究以绿僵菌为研究对象,通过NCBI查找得到绿僵菌的SCD基因序列,及其上下游基因序列,设计合适的引物,通过酶切连接构建重组质粒,将重组质粒导入农杆菌,利用农杆菌介导的同源转化机制,获得SCD阳性敲除株及相应的回补株;最后通过比较敲除株与野生型之间的表型差异,分析SCD基因的功能。具体研究结果如下:
  (1)通过NCBI查找得到罗伯茨绿僵菌的SCD基因序列,及其上下游基因序列,得到相应的重组质粒。
  (2)利用农杆菌介导的基因敲除方法获得SCD的敲除突变株;同时用相同的方法,获得敲除株的回补株。
  (3)对野生型,敲除株,回补株进行相关的生物学特性实验,比较分析敲除株与野生型,回补株之间的表型差异,结果发现:
  1)与野生型罗伯茨绿僵菌相比,SCD敲除株菌落边缘圆滑规则,菌丝向四周呈现放射状,菌落颜色和菌落大小也未发生改变,特别是在在PDA上生长的菌落孢子均呈现墨绿色,再次证明罗伯茨绿僵菌中不存在DHN黑色素合成途径。
  2)将野生型,敲除株,回补株分别接于PDA,SDAY,1/4SDAY培养基上,测量其生长直径。与野生型和回补株绿僵菌相比,SCD敲除株在PDA,SDAY,1/4SDAY培养基上的生长速率均未发生变化。
  3)将野生型,敲除株,回补株的孢悬液分别等量接种于PDA培养基上,培养12d后计算其孢子数。与野生型和回补株绿僵菌相比,SCD敲除株在PDA培养基上的产孢量有了明显的下降趋势。
  4)将野生型,敲除株,回补株的孢悬液点接于分别加有甲萘醌、刚果红、多菌灵、氯化钠、十二烷基硫酸钠、双氧水的PDA培养基中,观察记录其生长情况。结果表明SCD基因与罗伯茨绿僵菌的抗杀菌剂能力,抗氧化能力以及抗高渗能力无关,并且不参与罗伯茨绿僵菌细胞壁的相关合成。
  5)将野生型,敲除株,回补株的孢子置于紫外灯下照射后,补足萌发液保湿培养,26h后观察其萌发情况。与野生型罗伯茨绿僵菌相比,SCD敲除株对紫外的耐受能力有了明显的下降趋势。
  6)将玉米虫分别浸泡在野生型,敲除株,回补株的孢悬液中,之后于25℃饲养,观察绿僵菌对玉米虫的侵染情况。与野生型罗伯茨绿僵菌相比,SCD敲除株对玉米虫的侵染能力没有发生变化。
  从分子水平再次证明SCD基因不参与绿僵菌色素的合成,为绿僵菌不存在DHN黑色素合成途径提供实验支持,同时分析了SCD基因在绿僵菌中的功能,为更好的将绿僵菌用于生物防治和今后研究绿僵菌的色素合成途径提供一定的理论依据。
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