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[博士论文] 唐颖
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:蓝莓作为近年来新兴的水果,因其果实具有极高的营养价值和突出的保健作用,被誉为“水果皇后”,在国内外各地区迅速发展起来。目前随着设施栽培模式的发展,为了追求更高的经济效益,生产上普遍存在频繁及过量施肥等问题,出现土壤养分富集和盐分积累等盐害现象。温室蓝莓盐害主要源于施肥,其中氮肥对蓝莓生长最为重要。有研究表明,相较于硝态氮肥,蓝莓更喜铵态氮肥。但是,不同的铵态氮肥对蓝莓施用效果是否存在差异,过量施肥对蓝莓生长和土壤化学性质的影响如何,蓝莓植株对高铵胁迫的生理反应如何,以及能否针对不同铵盐的高铵胁迫找到缓解的方法和物质,这些问题都有待探讨和解决。
  本论文以蓝莓幼苗和组培苗作为试验材料,对生产上常用的6种铵盐进行比较,得出6种铵盐对蓝莓幼苗和组培苗最适施氮量和胁迫施氮量,并围绕高铵胁迫对土壤性质、蓝莓苗生长及生理反应进行研究,在此基础之上,筛选对蓝莓高铵胁迫有缓解作用的外源物质。主要研究内容及成果如下:
  1)比较了6种铵盐在蓝莓幼苗上的施用效果,明确得出6种铵盐在蓝莓幼苗上最适施氮量和高铵胁迫施氮量。结果显示,(NH4)2HPO4和NH4H2PO4处理在蓝莓幼苗上施用效果最好,合适施氮量明显增加株高和分支数,高铵胁迫施氮量对蓝莓幼苗伤害最小。NH4Cl和NH4HCO3处理施用效果最差,高铵胁迫施氮量死苗严重。6种铵盐在蓝莓幼苗上最适施氮量都为0.50-0.75g kg-1,高铵胁迫施氮量为1.00-1.25g kg-1。研究结果为蓝莓施肥品种的选择及施氮量的确定提供了参考标准。
  2)研究了高铵胁迫对蓝莓幼苗生长的影响。结果显示,高铵胁迫导致蓝莓幼苗株高和分支数显著降低,叶片N含量超过标准值(2.1%),叶绿素含量明显下降,叶绿素a/b的比值上升。研究结果为蓝莓叶片营养监测提供参考依据,当叶片N含量超过2.1%,叶绿素a/b的比值上升时,提示植株氮含量超标,应减少施氮量。
  3)研究了6种铵盐对土壤化学性质的影响。结果显示,6种铵盐短期内都降低土壤pH值,增加土壤电导率值和碱解氮含量,高铵胁迫处理降低和增加的趋势更加明显。(NH4)2SO4、NH4NO3和NH4Cl处理降低土壤pH值的趋势较强,(NH4)2SO4和NH4Cl处理增加土壤电导率和碱解氮含量比较明显,(NH4)2HPO4和NH4H2PO4施入土壤后增加土壤电导率和碱解氮的趋势比较平缓。明确得出高铵胁迫时土壤电导率阈值为2.0mS cm-1,碱解氮含量阈值为250mg kg-1。同时还明确了土壤化学性质发生转折的主要时间点:施肥后1、4和16周。研究结果为不同土壤条件选择合适的肥料品种提供了科学依据,为土壤监测标准提供了合理建议。同时结合生长情况,从土壤化学角度揭示了不同阴离子铵盐在蓝莓幼苗上施用效果不同的原因。
  4)以组培苗为试验材料研究了高铵胁迫对蓝莓生理反应的影响。结果显示,高铵胁迫导致组培苗矿质元素失衡,N和Fe3+含量升高,K和Fe2+含量降低,同时Ca含量降低也比较明显,这几种元素的失衡是造成植株生长不良的主要原因。高铵胁迫后,与细胞质膜氧化及渗透调节相关的物质丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)及可溶性蛋白(SP)含量多呈下降趋势,与抗氧化相关的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性上升,超氧化物歧化酶(SOD)活性下降。说明细胞膜及渗透调节物质在高铵胁迫后期所起的作用较小,抗氧化酶活性在高铵胁迫后期起主要作用。高铵胁迫导致谷氨酰胺合成酶(GS)活性上升,有利于转化过多的游离NH4+,从而缓解高铵毒害。研究结果从生理层面揭示了高铵胁迫对蓝莓造成伤害的原因,为蓝莓高铵胁迫机理的研究打下基础,同时也为蓝莓高铵胁迫的缓解提供了研究方向。
  5)将傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)引入蓝莓高铵胁迫的研究,从代谢产物方面为高铵胁迫对组培苗的生理影响揭示了部分原因。高铵胁迫时,不同阴离子铵盐处理的组培苗代谢产物种类变化不同,分别产生不同的多糖、蛋白质和酯类以适应高铵胁迫。高铵胁迫导致组培苗代谢产物含量大多呈现下降的趋势,也有一些处理在蛋白质、多糖和脂类方面有部分物质呈现上升趋势,可能正是这些物质对胁迫起到适应或者缓解的作用。高铵胁迫还导致组培苗多糖/蛋白质比值升高,生长越差的处理二者比值越高,说明多糖/蛋白质比值与植株抗逆性相关,也可以将二者比值作为植株抗逆性筛选的指标。
  6)对蓝莓高铵胁迫缓解的外源物质进行了筛选及效果验证。结果显示,能够恢复离子平衡和保护抗氧化酶系统的物质对高铵胁迫缓解效果较好,而增强渗透调节系统的物质对高铵胁迫缓解效果较差。最终确定CaCl2对6种铵盐在组培苗上造成的高铵胁迫都有很好的缓解效果,将其应用到幼苗上进行高铵胁迫缓解效果验证,结果发现,CaCl2对(NH4)2HPO4、NH4H2PO4和NH4HCO3胁迫造成的失绿有明显的缓解效果,缓解浓度分别为10、20和30mmol L-1。研究结果为蓝莓高铵胁迫的缓解工作打下基础,为高铵胁迫的缓解提供了研究方向。
[博士论文] 陈磊
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:基因表达的特异性调控对植物-病原物互作和抵抗逆境胁迫是至关重要的。microRNAs(miRNAs)作为一类长度在18到25个核苷酸之间的非编码小RNA分子,可以在转录后和翻译水平的过程中通过抑制靶基因的表达,参与植物体内多种生理生化反应过程。因此,揭示miRNAs在植物应答生物和非生物胁迫中的调控作用及分子机制具有重要意义。在番茄(Solanum lycopersicum)中已经发现了多种miRNAs与生物和非生物胁迫是密切相关的,其中非保守的miR1916和保守的miR396均在多种胁迫条件下作出响应,但具体的分子机制尚不明确,特别是对番茄在与晚疫病菌(Phytophthora infestans)和灰霉菌(Botrytis cinerea)互作中miR1916和miR396的研究很少,且茄科植物中的抗逆作用也未得到广泛的关注。针对上述问题,本研究通过基因工程改造策略、次生代谢水平分析及基因功能鉴定等方法,系统阐释了番茄miR1916和miR396在抗逆过程中的多效调控机制。主要研究内容及结果如下:
  (1)通过荧光实时定量检测发现了miR1916在番茄与晚疫病菌和灰霉菌互作中表达量变化明显,借助生物信息学方法预测到了miR1916的靶基因STR-2、UGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG,且这6个靶基因的表达均受到晚疫病菌和灰霉菌的诱导,利用PPM-RACE和5'-RACE验证了miR1916对STR-2、UGT、MYB12和CC-NBS-LRR的切割位点。借助过表达和沉默技术获得了转基因植株。通过观察感病表型,发现了过表达或(沉默)miR1916降低或(提高)了番茄对晚疫病菌和灰霉菌侵染的耐受性。基于分子水平和次级代谢产物检查分析确定了miR1916调控多种靶基因的表达,证实其既可以抑制识别病原体基因CC-NBS-LRR与CC-NBS,又可以影响花青素和α-tomatine积累的相关基因STR-2、UGT和MYB12。
  (2)对番茄与晚疫病菌和灰霉菌互作过程中miR396进行检测,发现了miR396的表达量变化较明显。并通过生物信息学方法预测到miR396的靶基因GRF1、SAMT、GH和NBS-LRR,且检测到了这些靶基因在二种病原菌侵染时表达量发生改变。番茄对病原菌耐受性实验结果显示,miR396的过表达减弱了番茄对晚疫病菌和灰霉病菌的抗性,且提高了病原菌侵染时ROS的水平。对靶基因的表达量分析结果表明,miR396抑制了GRF1、SAMT、GH和NBS-LRR的表达,最终导致抑制下游抗病相关基因TGA1、TGA2和PR1及JA依赖的PIⅠ和Ⅱ基因的表达,但却增强了内源SA含量和NPR1表达。miR396通过SA或JA信号途径负调控靶基因及其下游基因表达是影响番茄响应生物胁迫的关键。
  (3)利用miR1916过表达和沉默载体,获得了转基因烟草。干旱胁迫实验分析结果表明了miR1916在烟草抗旱过程中是负调控因子,异源过表达和沉默miR1916影响了烟草靶基因HDAC和STR的表达量,及在干旱处理后的脯氨酸、可溶性糖和ROS的积累。
  (4)利用异源过表达miR396获得了转基因烟草,并进行了盐、干旱和冷胁迫的耐受性分析,证实了过表达miR396会抑制GRF1、GRF3、GRF7和GRF8,进而引发了渗透调节能力的增强和ROS积累的减少,从而提高了烟草的抗逆性。因此,作为正调控因子参与多种胁迫的miR396具有全局调控的特性。
  综上所述,本课题一方面发现感染晚疫病菌和灰霉菌的番茄与未感染番茄相比显示出miR1916和miR396表达量的降低。miR1916的过表达和沉默可以影响靶基因STR-2、UGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG基因的表达,进而影响番茄对病原菌感染的抵抗。miR396通过抑制SA和JA信号的防御相关基因,作为负调控因子参与番茄防御病原菌。另一方面,通过异源转基因改变miR1916和miR396的表达可以调控相应的靶基因表达水平揭示miR1916以负向调控的方式参与烟草抗旱,而miR396以正向调控的方式参与烟草耐盐、抗旱和耐低温的过程。
[硕士论文] 刘正阳
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:在生产上,梨繁殖以营养繁殖为主,即先播种砧木种子,培育成苗,而后嫁接栽培品种。梨种子需要经过层积处理才能萌发,因此在层积处理前无法测定种子质量。而种子层积又需较长时间。如果种子质量不好,发芽率较低,或者层积过程中因水分或通气条件把握不好造成种子发生霉烂都将严重影响当年苗木生产。目前生产上还没有高效、快速打破梨种子休眠的有效方法。因此,开展梨种子休眠相关的研究将有助于建立快速解除种子休眠的方法。本论文以梨砧木豆梨种子为研究材料,采用液相色谱法、二硝基水杨酸比色法和紫外分光光度计法测定了豆梨种子休眠解除过程中蔗糖、淀粉、葡萄糖和果糖含量及蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和α淀粉酶活性及相关基因表达变化情况,利用反义寡聚核苷酸技术揭示蔗糖合成酶及GA20氧化酶基因在豆梨种子休眠解除过程中的作用,具体结果如下:
  1.建立一种打破梨种子休眠的新方法。利用脱脂棉包裹种子,放置于培养皿中,于4℃低温层积,2~3天湿润脱脂棉一次。每隔10天统计种子萌发率。处理30天后,种子开始萌发,60天后种子萌发率为76.7%,已经完全打破休眠。表明该方法可以用于打破梨种子休眠。
  2.确定豆梨种子解除休眠过程中糖类物质及相关酶活性和基因表达量变化情况。豆梨种子解除休眠的过程中蔗糖和淀粉含量逐渐降低,而葡萄糖和果糖含量不断升高;降解蔗糖的蔗糖合成酶和降解淀粉的α淀粉酶的活性逐渐升高,而合成蔗糖的蔗糖磷酸合成酶的活性则不断降低;蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和α淀粉酶基因的相对表达量都呈现先下降,然后迅速升高的趋势。表明蔗糖降解和葡萄糖合成与豆梨种子休眠解除以及种子萌发有密切关系。
  3.确定蔗糖合成酶在豆梨种子解除休眠过程中起重要作用。利用反义寡聚核苷酸技术抑制蔗糖合成酶表达后,种子萌发被明显抑制。与正常层积种子相比,反义链抑制处理后种子萌发率仅为20%,蔗糖、葡萄糖和果糖含量明显增高,蔗糖合成酶和α淀粉酶活性显著降低,蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、GAI和ABI-3等8个与糖代谢及激素信号转导相关基因的相对表达量全都显著减少。表明蔗糖合成酶在豆梨种子解除休眠过程中发挥重要作用。
  4.确定GA20氧化酶基因调控蔗糖代谢和淀粉降解相关酶活性。利用反义寡聚核苷酸技术抑制赤霉素合成关键酶GA20氧化酶的表达。反义链抑制处理后种子几乎不能萌发,抑制效果比抑制蔗糖合成酶更显著,相比于正常层积的种子萌发率仅为1.1%。种子内积累大量的蔗糖、葡萄糖和果糖,蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和α淀粉酶在内的三种酶活性及基因相对表达量全部显著降低,且ABA信号因子的表达量明显高于GA信号因子。表明GA20氧化酶基因与糖代谢相关酶活性调控密切相关。
[硕士论文] 耿园
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:茭白(Zizania latlfolia Turcz.)是中国传统的水生蔬菜之一,茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)是导致肉质茎膨大的重要因素,茭白的孕茭机制、形成机理,黑粉菌对于单、双季茭形成的影响,生产上容易形成的雄茭和灰茭的原因等问题尚不明确,这些问题严重制约了茭白优质高产栽培的发展。
  为此,本研究以“YD-3”茭白为试验材料,探索黑粉菌在其体内的生长发育变化及分布位置、分离鉴定方法及适宜黑粉菌的培养条件,初步建立雄茭组织培养再生体系及人工接种技术,试图为黑粉菌影响茭白形成机理提供一些线索,为生产上单、双季茭和雄茭、灰茭形成机理提供一定的技术基础。结果如下:
  1、在茭白植株生长发育过程中,芽与苗期生长点、肉质茎膨大初期、中期、中后期,商品期及成熟老化期适宜的脱水时间依次是5/12h、1h、2h、4h,8h和12h,能清晰地观察到组织内茭白黑粉菌的变化和分布过程;芽期是茭白黑粉菌的初始生长阶段,肉质茎膨大初期是黑粉菌形态变化最为剧烈的时期,商品期和成熟老化期分别是黑粉菌的稳定生长和孢子形成期,这两个时期适合作为分离黑粉菌的材料;雄茭叶鞘中没有黑粉菌,而正常茭叶鞘中含有黑粉菌菌丝,可以作为黑粉菌人工接种雄茭是否成功的验证手段之一。
  2、用3%次氯酸钠对整个茭白消毒4min,再使用切片和孢子悬浮液涂布的分离方法可以成功分离出茭白黑粉菌,在鉴定过程中发现真菌通用引物ITS1和ITS4扩增黑粉菌的ITS-5.8S rDNA不能特异鉴定出黑粉菌,选用茭白黑粉菌Lam16A和Pra2两个基因片段设计了两对特异引物,可特异鉴定茭白黑粉菌;黑粉菌培养最适的培养基是PDA培养基,YEB不适宜培养黑粉菌。
  3、成功建立了雄茭组织培养再生体系,探索出组织培养过程中外植体适宜的消毒方法和最佳植物生长调节剂配方。外植体芽在清水冲洗2h后用0.1%氯化汞消毒8min,诱导、增殖和生根的最佳激素浓度配方依次是1.0mg/L IAA+1.0mg/L6-BA、1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA和0.5mg/L NAA,增殖系数为3.5±0.5。
  4、初步研究了黑粉菌人工接种雄茭的技术体系,发现经过形态鉴定和分子鉴定能成功接种的方法是菌液注射接种,具体流程是将带根的雄茭苗基部用75%酒精消毒擦干后,用带针头的注射器吸取黑粉菌菌液注射基部至有菌液溢出,栽入含有6cm基质的塑料盆中,保持2~3cm浅水层放在植物生长箱中,温度设置为15℃夜间,25℃白天,光周期12h/d,当菌液OD600为2.5时,接种成功率为40%。
[硕士论文] 王露
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:茄子(Solanum melongena L.)为茄科茄属植物,在中国各地广泛种植。在中国长江流域及其以南地区,由于季节性降雨,茄子极易遭受雨涝胁迫,如果栽培土壤过湿,茄子叶片会发黄,植株萎蔫甚至逐渐枯死,严重影响茄子生产。本研究以广泛收集的219份性状各异的茄子材料(包括栽培种、半栽培种和野生种等)进行苗期耐涝性鉴定,筛选出不同耐涝性的品种并选取极端品种构建遗传群体,同时,研究涝胁迫处理中及胁迫解除后茄子幼苗生理指标的变化。对遗传群体进行耐涝遗传模型分析,同时通过表型-基因型关联分析的方法寻找与茄子耐涝性相关的位点。主要研究结果如下:
  1.鉴定的219份茄子种质资源耐涝恢复指数在0-90.54之间,耐涝性差异显著。其中耐涝性强的材料有84份,耐涝性中等的材料有109份,耐涝性弱的品种有26份。根据恢复指数值,从耐涝性强的材料中选取纯合材料08C-02作为耐涝父本;从耐涝性弱的茄子材料中选取栽培茄自交系09-12-3作为敏涝母本。6个不同耐涝性的茄子品种在遭受涝胁迫后,茄子幼苗中SOD、POD、CAT在涝胁迫初期活性增加,随着胁迫时间的延长,抗氧化酶活性均逐渐降低,其中耐涝性强的品种(08C-02、雎县紫茄和西安绿茄)比耐涝性弱的茄子品种(09-12-3、安阳紫冠和引茄一号)下降幅度更小;与不耐涝品种相比,耐涝品种丙二醛(MDA)增幅较小、可溶性糖含量增幅较大、叶绿素含量降幅较小。在恢复生长期,6个茄子品种的抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量和叶绿素含量均有不同程度的恢复,整体表现为耐涝性强的品种较耐涝性弱的品种更易恢复到对照水平。
  2.茄子耐涝性状由1对加性-显性主基因+加性。显性-上位性多基因模型(D-0)控制。主基因表现正向的加性效应,效应值为0.1918;主基因呈现负向显性效应,效应值为-0.0042;主基因显性度的绝对值为0.0219,F23世代中主基因的遗传率在为82.58%,多基因遗传率为6.11%,环境因素对茄子耐涝性有一定影响,遗传率为11.31%。说明茄子耐涝性育种在早期世代中进行选择效果较好。
  3.通过对群体结构分析,219份茄子品种可分为3个亚群。196个位点的8525种两两组合中,取p<0.01作为标记显著性相关的阈值,p<0.01的不平衡位点有771对,占总位点组合数的9.04%。将耐涝表型与基因型相关联,共有27个与茄子耐涝表型相关的标记位点。
[硕士论文] 李换平
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着中国设施蔬菜产业的快速发展,设施土壤养分失衡、土壤酸化、盐渍化及连作障碍问题日益明显,已成为阻碍其发展的主要因素。设施内淹水种植水生蔬菜或土表充分湿润种植水生蔬菜均能很好的缓解土壤盐渍化。中国是农业大国,每年都会产生大量的农作物秸秆,秸秆含有丰富的有机物质以及大量可被利用的营养元素,因此秸秆的利用问题一直以来备受关注。秸秆焚烧以及田间无序堆放显然违背了资源的可持续发展,因此秸秆直接还田是最简便最有效的利用途径。本试验于设施内种植水生蔬菜土表覆盖截段的小麦秸秆,利用设施高温、高湿加有氧发酵的条件加快秸秆的腐解,并改善土壤性质,提高当季蔬菜产量和品质,探究不同还田量及不同长度的小麦秸秆腐解效应,可望为小麦秸秆的高效利用和设施蔬菜田有机肥替代化肥技术提供理论依据。主要研究结果如下:
  1、2015年11月-2016年4月,低温季节越冬茬口按照500kg/亩的还田量,将小麦秸秆截段成10cm的小段,土表覆盖后种植豆瓣菜(Nasturtium officinale R.Br)。土表水层电导率最大值为1180.7μS.cm-1,土表水层氧化还原电位最低值为-80mv;经140天腐解后,小麦秸秆腐解率为66.67%;处理第1次采收的豆瓣菜产量低于对照,第2、3次均高于对照,处理组的产量呈上升趋势;豆瓣菜磷、钾含量上升且高于对照;豆瓣菜VC含量、可溶性蛋白、可溶性糖、黄酮、总酚等养分含量优于对照;相比对照而言,处理组增加了土壤有机质、全氮和全钾含量,全磷含量的降幅低于对照。说明小麦秸秆截段后土表覆盖还田能够提高腐解率,并能够提高豆瓣菜产量和品质,培肥土壤。
  2、2016年4月-10月,鉴于低温越冬茬口试验小麦秸秆已有较高的腐解率,所以本季试验增加小麦秸秆还田量,按照1000kg/亩进行还田并种植水蕹菜(Ipomoea aquatica Forsk.)土表水层电导率最大值为1806μS.cm-1,土表水层氧化还原电位最低值为-180.3mv,163天后,腐解率达85.00%;水蕹菜总产量处理高于对照,VC、黄酮含量、DPPH自由基清除率优于对照;土壤有机质、全磷及全钾含量增加。说明高温高湿环境加有氧发酵更有助于小麦秸秆的腐解。
  3、2017年3月-7月,将小麦秸秆截成小段并种植水蕹菜,设置处理1为10cm,处理2为15cm,经129天的腐解,小麦秸秆腐解率分别为78.77%和77.57%;水蕹菜总产量处理均高于对照,其中处理1高于处理2,VC及可溶性糖含量处理1高于处理2,均高于对照,NO3-含量低于对照;土壤有机质含量处理2高于处理1、NO3-含量处理显著低于对照。说明小麦秸秆的长度越短,越有利于秸秆的腐解,对水蕹菜的产量和品质的影响越显著。
  在设施高温环境下,高温季节试验小麦秸秆的腐解率显著高于低温季节,高温季节对小麦秸秆进行加量还田,对土壤养分含量的补充效果更好。10cm的小麦秸秆覆盖还田后腐解率高于长度为15cm的小麦秸秆,不同还田量的小麦秸秆还田均能提高了土壤有机质含量,增加了土壤全氮、全钾、速效磷等含量,小麦秸秆截段还田还降低了土壤硝态氮含量。
[硕士论文] 王倩
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:樱桃(Cerasus pseudocerasus)为蔷薇科樱属落叶果树,营养价值高,经济效益好,但其根系浅,在栽培过程中易发生涝害,影响其经济收益,因此,进行樱桃耐涝性的遗传改良与种质创新具有重要的理论和实践意义。本实验室前期以筛选到的耐涝樱桃种质‘沂蒙山樱’(Prunus serrulata‘Yimeng’)为试材,克隆获得了PsERF与PsCIPK两个基因,发现它们可能参与调控樱桃的耐涝性。本文在此基础上,进一步构建基因的过表达载体和RNAi载体,并采用农杆菌介导的遗传转化法将2个基因转入模式植物拟南芥中,获得纯合转基因阳性植株,并通过淹涝胁迫处理,观察比较其表型变化,测定转基因和野生型植株中碳水化合物代谢相关酶活性的变化规律,为深入揭示樱桃耐涝的分子机理提供理论依据,并为下一步利用基因工程培育耐涝樱桃新种质奠定基础。主要研究结果如下:
  (1)克隆了樱桃耐涝相关PsERF和PsCIPK基因。提取樱桃‘沂蒙山樱’叶片总RNA,反转录合成cDNA第一链,根据Genebank中PsERF和PsCIPK基因的序列设计引物,克隆获得了两个目的基因的全长序列,均包含完整编码区,且推测氨基酸序列与NCBI数据库中登录的PsERF和Ps CIPK基因的氨基酸序列相似性均为100%。
  (2)构建了PsERF和PsCIPK基因的过表达载体和PsERF基因的RNAi表达载体。在扩增获得带有合适酶切位点的编码区后,用BglⅡ单酶切目的基因PsERF和双元表达载体pCAMBIA1304,用NcoⅠ单酶切目的基因PsCIPK和双元表达载体pCAMBIA1304,用AscⅠ和SwaⅠ正向双酶切目的基因PsERF和RNAi表达载体pFGC5941,用SpeⅠ和BamHⅠ反向双酶切目的基因PsERF和第一步获得的带有正向目的基因的RNAi表达载体pFGC5941-PsERF-正向,胶回收、连接目的片段与载体后,成功构建植物过表达载体pB1304-PsERF、pB1304-PsCIPK和RNAi表达载体pFGC5941-PsERF-RNAi,空载pB1304和pG5941。测序验证正确后,采用冻融法将重组质粒以及空载体转化农杆菌EHA105,获得了可以用于遗传转化的农杆菌转化子。
  (3)获得了纯合的转PsERF、PsCIPK基因拟南芥。利用农杆菌介导的Floral-dip法把目的基因PsERF、PsCIPK和空载导入拟南芥,经过T1代抗性筛选、GUS组织化学染色、T2和T3代分离比筛选,最终筛选得到过表达T3代纯合PsERF转基因拟南芥株系9个,过表达PsCIPK转基因拟南芥株系16个,沉默表达PsERF转基因拟南芥株系5个,纯合空载体对照株系各3个。GUS染色、PCR鉴定及qRT-PCR分析显示,纯合转基因拟南芥均能在基因组中检测到目的基因,过表达转基因拟南芥相对于对照组在转录水平表达水平明显提高,沉默表达转基因拟南芥与对照相比表达明显下调。
  (4)比较分析了转基因与野生型拟南芥的表型。对转基因拟南芥株系的表型分析发现,过表达PsERF、PsCIPK基因的拟南芥根系明显比野生型长。进行2周的淹涝胁迫处理发现,过表达樱桃PsERF、PsCIPK基因能够增强拟南芥的耐涝性,而沉默PsERF基因使植株的耐涝性减弱,表现出提前枯死的现象。
  (5)测定了淹涝胁迫对野生型和转基因拟南芥碳水化合物代谢相关酶活性的影响。以野生型为对照,对5周龄转基因拟南芥植株进行淹涝胁迫处理0d、1d、2d、3d、4d、5d,并测定碳水化合物代谢相关蔗糖合成酶(SUS)、α-淀粉酶(RAMY)、乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)以及可溶性蛋白质含量的变化。结果发现,淹涝胁迫过程中,过表达PsERF基因的拟南芥叶片中SUS、RAMY、ADH和PDC酶活性均明显高于对照组和野生型,表明其可通过调整植株糖代谢来抵抗淹涝胁迫,减少淹涝带来的损害。而过表达PsCIPK基因的拟南芥叶片中糖代谢相关酶活性的变化与过表达PsERF基因的变化趋势基本相反。因此,认为,PsERF基因可能是调控‘沂蒙山樱’耐涝性的关键基因。
[硕士论文] 苏江洪
观赏园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是我国的传统名花,因性喜冷凉干燥,多分布或栽培在我国华北、东北、西北和西南地区。近年来,随着芍药在园林花境景观中的广泛应用和芍药高档切花市场的兴起,浙江杭州、江苏扬州和上海等“长三角”地区纷纷从山东菏泽、河南洛阳等北方主产区开展“芍药南移”工作。然而,由于我国江南地区夏季高温持续时间长,使得大多数优良芍药品种“南移”后出现生长不良、难以展现原产地的优良观赏性状。夏季高温已然成为限制芍药切花在南方规模化生产及其在园林景观中广泛应用的主要因素之一,而找到调控芍药耐高温能力的关键基因对于培育耐高温能力强的芍药品种至关重要。为此,本研究克隆了芍药HSP70基因并对其序列进行生物信息学分析,通过表达模式、原核表达、亚细胞定位等研究明确芍药HSP70基因的表达特性,构建芍药HSP70基因的超表达载体并遗传转化拟南芥、观察高温胁迫对转基因植株的影响,从而深入了解芍药HSP70基因在调控芍药耐高温能力方面的功能。主要结果如下:
  (1)通过RACE技术克隆了芍药HSP70基因的cDNA全长序列,该基因长2195bp,具有5'非编码区(70bp)、起始密码子、完整的开放阅读框(1953bp)、终止密码子、3'非编码区(175bp)和poly(A)尾巴(12bp),共编码650个氨基酸,与已报道的其他植物HSP70基因核苷酸和氨基酸序列同源性较高,该基因登录号为JN180465,并将其命名为PlHSP70。
  (2)通过PCR扩增获得了PlHSP70基因的DNA序列,该序列长为3636bp,包含2个外显子和1个内含子,并且内含子序列符合“GT-AG”剪切规律,该基因登录号为MF817498。随后,通过构建的重组质粒在大肠杆菌中表达明确了PlHSP70蛋白分子量约为71kD;通过构建PlHSP70-GFP融合瞬时表达载体、转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位,明确了PlHSP70基因定位于细胞质中。
  (3)通过qRT-PCR技术检测了PlHSP70的表达模式,在高温胁迫下,PlHSP70的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐增加,其表达模式与植株中REC、H2O2和O2-积累水平、MDA含量的趋势相一致,而与叶片中相对含水量的趋势相反。
  (4)构建了以PlHSP70基因为目的基因的过量表达载体pCAMBIA1301-PlHSP70,采用冻融法将其转化农杆菌EHA105,并通过农杆菌介导的floral-dip法侵染拟南芥,将收获的T0代种子在含有抗生素的MS培养基上进行初步筛选,得到转化的T1代拟南芥。同时,通过GUS染色及PCR扩增共同鉴定了转PlHSP70基因拟南芥株系。
  (5)在高温胁迫下,转PlHSP70基因拟南芥植株较野生型拟南芥WT的耐高温能力更强,植株生长良好,叶片并未出现黄化、卷缩的症状;Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qN和ETR等叶绿素荧光参数在转PlHSP70基因拟南芥植株均相对较高;叶片相对含水量在转PlHSP70基因拟南芥植株中较高,而H2O2、O2-积累较少,REC较低,AtCu/ZnSOD、AtCAT和AtAPX3个保护酶基因的表达水平相对较高;此外,转PlHSP70基因拟南芥植株叶片的细胞结构更为完整,具有较多的叶绿体和淀粉粒及较少的脂质球体。
[硕士论文] 李笑
蔬菜学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:茄子黄萎病(Verticillium Wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)侵染引起的茄子重要病害之一。可造成茄子(Solanum melongenaL.)大幅度减产,对茄子生产的危害极大。目前,在普通栽培茄品种中缺少高抗种质,而其近缘野生种水茄(Solanum torvum)高抗黄萎病,是研究茄子抗黄萎病分子机制的重要试验材料。本研究根据野生茄水茄接种黄萎菌后的转录组测序结果,筛选出一个上调表达的WRKY转录因子基因StWRKY-1。通过荧光定量qRT-PCR对其表达进行研究,同时利用烟草瞬时侵染对其进行亚细胞定位分析和抗病鉴定。而且通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)及转基因拟南芥植株的抗病性鉴定,研究了St WRKY-1基因在黄萎病抗性中的作用。主要研究结果如下:
  1、从野生茄水茄中克隆出一个受黄萎病诱导表达的WRKY转录因子基因,并命名为StWRKY-1。该基因编码区为1650bp,编码550个氨基酸。将StWRKY-1蛋白序列与其他物种WRKY蛋白序列进行比对,并构建系统进化树后发现其与辣椒的CaWRKY6和CaWRKY1同源性较高。通过荧光定量qRT-PCR分析StWRKY-1在水茄中的表达模式,发现StWRKY-1在根中表达量较高,在叶中表达量较低;在接种黄萎病菌24h表达量最高。构建亚细胞定位载体,瞬时侵染本氏烟,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况,结果发现,该基因行使功能的主要区域定位在细胞核。
  2、通过构建StWRKY-1的VIGS沉默载体,将水茄的内源StWRKY-1基因沉默。利用qRT-PCR进行沉默效果分析,表明该基因表达量下降。对沉默植株的抗病性鉴定表明,接种黄萎病菌20d后,沉默植株的黄萎病菌的量约为对照的3倍,同时,叶片出现扭曲、皱缩等表型。进一步在本氏烟中瞬时表达StWRKY-1基因,接种烟草疫霉病菌后发现StWRKY-1瞬时表达后的烟草叶片病斑面积为1.13cm2,而对照组为3.14cm2;而且StWRKY-1可以通过调控植物激素通路防卫反应基因的表达来增强植物的抗病性。将StWRKY-1转入野生型拟南芥中,经过筛选及鉴定最终获得T3代拟南芥转基因株系,以此为试验材料对其功能进行了初步研究。在接种茄子黄萎病菌后,转基因拟南芥植株生长无明显变化,而野生拟南芥虽无明显的黄化萎蔫现象,但是其生长受阻或生长迟缓,比同期转基因拟南芥矮小。
  上述结果表明,水茄的StWRKY-1基因对茄子黄萎病具有抗性,并同时对烟草疫霉具有抗性,可应用于抗病新种质创制。
[硕士论文] 朱丽丽
蔬菜学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着设施蔬菜的大规模发展,人们为追求产量盲目的施用大量化肥,以及设施的高复种指数,高温高湿,缺少雨水淋溶的特点导致连作障碍日益明显,严重影响了蔬菜的产量和品质。实验室前期通过调查后发现设施蔬菜水旱轮作能有效改善土壤性质,缓解连作障碍。水稻秸秆含有丰富的营养物质,已有试验表明,长期秸秆还田能有效改善土壤性质,提升土壤有机质含量等。实验室前期的研究发现截为2段的水稻秸秆腐解率在春、夏茬分别为75.33%和89.11%,大幅高于前人研究的秋季水稻茬口切段秸秆淹水还田腐解率49.11%。因此,本试验在设施内采用水旱轮作加秸秆土表覆盖的方式,于水作茬口土表覆盖水稻秸秆种植蔬菜,探究水稻秸秆不同切段规格土表覆盖及秸秆还田量在不同季节茬口的腐解规律及对土壤性质、蔬菜产量品质的影响并进一步探讨了秸秆还田对旱作小白菜后盐渍化土壤的缓解效果。得出如下主要结果:
  1、2015年7月-10月水稻秸秆切5cm小段以500kg/亩于高温季节土表覆盖还田种植蕹菜;秸秆的腐解率为100%,秸秆还田处理较对照未还田的土壤而言,土壤全磷、速效磷、全钾、速效钾含量降幅均小于对照,蕹菜处理前期处理低于对照,后期高于对照,总的产量高于对照;土表溶液电导率处理前期迅速上升,第2天即达最大值1584μS·cm-1,对照则变化较为平缓,说明切小段秸秆可显著加大与微生物的接触面积提高腐解率,且设施的高温高湿土表有氧环境利于秸秆的充分腐解释放养分。
  2、2015年11月-2016年3月水稻秸秆切5cm小段以500kg/亩于低温季节土表覆盖还田种植豆瓣菜;秸秆的腐解率为83.3%,低于高温季节的腐解率100%,说明温度的高低能显著影响秸秆的腐解速度。低温季节处理土表溶液电导率到第3天才达最大值且仅为1109μS·cm-1,处理土壤有机质降幅为6.5%显著低于对照15.3%,两次采收的豆瓣菜产量均高于对照;豆瓣菜的硝酸盐含量均低于对照,说明秸秆还田在低温季节也可大量腐解且养分释放速度较缓,前期对蔬菜生长抑制作用较小;还可降低硝酸盐含量改善蔬菜品质。
  3、2016年4月-10月加大秸秆土表覆盖量量即以750kg/亩的水稻秸秆切段5cm还田,水稻秸秆腐解率为100%,土壤硝态氮的含量处理降幅显著大于对照,说明在秸秆腐解过程中能吸收土壤中的硝酸盐,缓解土壤盐渍化;本次试验蕹菜共采收7次,前两次的采后追肥处理与对照追施量相同,而后面4次的采后追肥均按处理10kg/亩,对照15kg/亩的尿素进行追施,7次采收每一次产量均为处理高于对照,说明秸秆还田可有助于减量施肥的推进。
  4、加大秸秆切段规格,空茬约半年后即2017年4月-7月重新进行秸秆还田以10cm、750kg/亩的土表覆盖量种植蕹菜后,秸秆达到了较高的腐解率90.5%,说明10cm的切段规格秸秆也几乎可以完全腐解,释放出养分,且10cm较5cm而言可减少切段成本;处理土壤的全氮含量上升,对照下降,全磷含量处理与对照变化均不显著,处理土壤的硝态氮含量下降。蕹菜共采收3次,采收追肥继续遵循减量施肥的原则,处理总的产量略低于对照,但秸秆还田种植蕹菜黄酮含量总体上均为处理高于对照。
  5、2016年12月-2017年1月以不同施肥量旱作小白菜,处理进行大量施肥,对照常规施肥,发现土壤全氮含量较种植前显著提升,而对照则出现了下降,处理土壤硝态氮含量也显著上升,说明大量施肥会导致土壤硝酸盐含量不断提升,土壤盐渍化;小白菜产量两次采收均为处理显著高于对照,两次采收的小白菜粗纤维处理均低于对照,旱作小白菜后,处理硝酸盐含量均大幅高于对照,说明大量施肥会导致蔬菜中积累过多硝酸盐危害人体健康。2017年4月-7月于旱作小白菜后的土壤中以切段10cm水稻秸秆按750kg/亩土表覆盖淹水种植蕹菜,秸秆的腐解率为86.2%。秸秆还田后处理土壤硝酸盐含量显著下降,对照变化不显著,说明秸秆土表覆盖对目前设施内普遍存在的盐渍化问题具有良好的缓解效果,蕹菜共采收3次,总产量为处理高于对照。
  因此,秸秆土表覆盖种植水生蔬菜,秸秆均以相同规格5cm覆盖还田时,高温季节腐解率显著高于低温季节;延长水生蔬菜种植时间可腐解更多秸秆;秸秆以10cm切段规格土表覆盖时也可获得90%左右的高腐解率低于5cm切段的腐解率,说明切小段加大与微生物的接触面积,促进腐解。各茬腐解率均显著高于露地秸秆淹水还田腐解率49.11%,且较一截两段的水稻秸秆可腐解更多秸秆。说明设施的高温高湿加有氧发酵的环境促进腐解。水稻秸秆土表覆盖种植水生蔬菜,蔬菜总产量总体上均高于对照。秸秆土表覆盖还田对超量施肥后的盐渍化土壤具有显著的缓解效果,有效改善土壤性质,且有利于减量施肥的推进。
[硕士论文] 陈敏炀
蔬菜学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄瓜是我国重要的蔬菜之一,其产量及栽培面积均位居全球第一。瓜蚜是危害黄瓜生长的主要害虫之一,其通过吸食黄瓜生长所必须的营养物质和传播病毒病等方式,严重影响黄瓜生长、产量、品质和效益。目前黄瓜生产上对瓜蚜的防治仍以化学农药防控为主,但是化学农药的使用不可避免的带来了包括害虫抗药性增强,环境污染加剧,蚜虫天敌与授粉益虫受害等问题。挖掘黄瓜抗蚜虫基因/蛋白,改良并提高黄瓜抗蚜性,是防控黄瓜蚜虫最有效的途径。
  本研究运用iTRAQ(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术,以抗蚜黄瓜品系‘EP6392’为材料,进行接蚜虫(接5头无翅成蚜)和不接蚜虫处理,接虫6天后取样分离鉴定黄瓜抗蚜虫蛋白质;通过外源茉莉酸处理,研究用80头无翅成蚜接虫处理6天后与对照之间抗蚜性的差异及相关蛋白质基因的表达。主要研究结果如下:
  共得到54个差异蛋白,其中19个为上调蛋白,35个为下调蛋白。选取其中9个可能与黄瓜抗蚜性相关的蛋白进行实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)基因表达检测,发现基因表达趋势与蛋白基本相同。
  通过GO(Gene Ontology)分析,发现差异蛋白主要集中在生物过程中的代谢过程、细胞过程、和单生物体等;所处细胞位置中的细胞、细胞器和高分子配合物等;分子功能中的结合、催化反应和结构分子活动等。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析发现在黄瓜在受到蚜虫的胁迫后,差异蛋白主要的代谢通路为核糖体代谢、淀粉与蔗糖代谢途径、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、α-亚麻酸代谢、和碳代谢途径等。通过STRING分析,发现一些差异蛋白之间存在着某些联系,如基因共表达等。
  外源茉莉酸处理后瓜蚜繁殖量显著少于未用茉莉酸处理,其中外源茉莉酸处理浓度在1mmol/L时蚜虫数最少,说明茉莉酸增强了黄瓜的抗蚜性;编码与茉莉酸合成相关的差异上调蛋白12-oxophytodienoate reductase11的基因Csa2G395815也在不同接虫量处理和不同外源茉莉酸浓度处理后上调表达。
  此外,与乙烯的合成相关的1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase homolog6-like(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶同源物6)、peroxidase2(过氧化物酶2)、anthocyanidin3-o-ghcosyltrans ferase2-放e(花青素糖基转移酶)、scopoletin glucosyltransferase-like(东莨菪糖基转移酶)、pathogenesis-related family protein(病因相关家族蛋白)和pectinesterase-like(果胶酯酶),一共6个在蛋白质和基因表达中均上调表达;与黄酮类化合物相关的2个蛋白Chalcone-flavonone isomerase family protein(查尔酮-黄酮异构酶)和Flavanone-3-Hydroxyhse(黄烷酮-3-羟化酶)在蛋白质和基因表达中均下调表达。
[硕士论文] 刘倩雅
蔬菜学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=2x=14)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年生攀援性草本植物,起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林区域,是世界十大蔬菜作物之一[1]。黄瓜的外观包括表皮色泽、刺瘤、果长和果把长等,是影响消费者选择的重要因素[2]。研究其遗传效应、挖掘其关键基因将为今后进行遗传改良和选育新品种奠定重要的理论基础。
  本研究利用两个果长及果把长差异极显著的黄瓜自交系YN(P1)和JIN5-508(P2)为材料,通过杂交、自交和回交等方式繁育了6个世代群体,运用性状遗传分析方法进行黄瓜的果长和果把的遗传分析;运用QTL-seq方法对黄瓜果长和果把长的主效QTL进行了定位;运用qRT-PCR技术,对控制果长和果把长的候选基因进行了初步验证。主要研究结果如下:
  1、黄瓜果长和果把的的遗传模型均是E-1-1模型,环境等因素影响黄瓜的果实长度和果把长度。
  2、在Chr1上定位到了一个控制果长的基因位点,该区间位置在13,210,000-23,570,000,区间大小为10.36MB。结合双亲重测序开发的SNP标记,对重组株进行精细定位,将果长的候选区域精细定位在Chr1:19470146-1994290区间,区间大小约为0.47Mb,共预测到46个基因。在Chr7上定位到了一个控制果把的基因位点,该区间位置在9,998,000-14,610,000,区间大小为4.63MB,再利用重组株进行精细定位,将区间缩小到12140074-12626141区间,区间大小约为0.49Mb,共预测到45个基因。
  3、对控制果长候选基因进行qRT-PCR验证,结果表明Csa1M53753.1、Csa1M537600.1Csa1M538180.1、Csa1M538200.1和Csa1M538260.1在亲本不同发育时间点的相对表达量呈一致趋势,在短果YN中的相对表达量低于长果品种JIN5-508。将这5个基因上在不同果长的黄瓜品系中进行验证,Csa1M537530.与不同品种的果长基本上呈现正向调控的关系,Csa1M538180.1与不同品种的果长基本上呈现负向调控的关系。
  对控制瓜把长候选基因进行qRT-PCR验证,结果表明Csa7M338120.1、Csa7M341240.1、Csa7M339690.1、Csa7M341250.1、Csa7M343310.1和Csa7M351880.1在亲本不同发育时间点的相对表达量呈一致趋势,在短果YN中的相对表达量低于长果品种JIN5-508。将这6个基因上不同果长的黄瓜品系中进行验证,Csa7M341240.1和Csa7M339690.1基因与不同品种的果把长总体上呈现正向调控的关系。
[博士论文] 奚小波
农业水土工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:果树林木为多年生植物,由于定植后无法翻耕,致使土壤板结严重,不利于根系生长发展;同时现有开沟施肥机械耕作阻力大、易伤树木根系,且肥料集中施加在沟槽内,扩散不均,不利于果树根系均衡吸收。为解决上述问题,本文提出了气爆松土注肥方法,以理论分析与试验相结合的方法,系统研究了气爆松土的作用机理,研究了气爆注肥的扩散效果,优化了气爆钻杆注肥关键部件,并研制了气爆松土注肥机。本文完成的主要工作和取得的成果如下:
  (1)基于圆孔扩张力学模型,分析了气爆土体应力关系,研究了气爆作用土体破坏形式及发生条件;介绍了Murdoch L C土体裂隙扩展模型,指出Murdoch L C模型为土体裂隙在二维平面内扩展的局限性,提出了建立全土层气爆土体裂隙扩展模型见解;建立了气爆松土土体扰动的评价方法。
  (2)建立钻杆钻土土力学模型,以最小钻土阻力为目标优化钻杆构型,优化后的钻头锥角为60°、钻杆圆柱半径为12.5mm;利用FLUENT数值仿真,以出流效果为目标优化钻杆出流孔结构,优化后的出流孔数量为4、直径为7mm、结构为倒圆锥形、锥角为60°。
  (3)利用平面正冲击波理论建立基于气压泄露衰减的全土层裂隙扩展数学模型,开展气爆松土土体裂隙及扰动试验,研究了气爆参数(气爆深度H及气爆压力P)对土体裂隙扩展的影响规律,建立了基于土体裂隙迹线方程的全土层土体扰动模型,并优化了气爆参数,为整机设计提供理论依据。气爆作用在全土层内的土体扰动区域为抛物体,抛物体底面圆半径为裂隙迹线在土表面的截距,抛物体体高为裂隙迹线扩展的最大深度。当H小于25cm时,土体以张拉破坏为主,气爆起劈力为0.17MPa,土体扰动系数为50%;当H大于25cm时,土体以剪切破坏为主,气爆起劈力为0.39MPa,土体扰动系数大于50%。H为30cm、P为1MPa左右适宜,气爆劈裂深至49cm,土体扰动系数达79.5%,松土效果显著。
  (4)开展了气爆松土注肥试验,研究了气爆参数对土壤坚实度下降率(SCDR)的变化规律,揭示了气爆参数、液肥浓度对注肥扩散分布的影响规律。气爆后的SCDR呈圆环带分布,离气爆中心越近区域的SCDR越大,其松土效果越好。P对SCDR的影响显著,且P越大,测试域内的SCDR在径向与纵向范围内均整体提高,在H为30cm条件下,当P达到0.8MPa时,测试域的SCDR大于20%,且作用域深及土层以下45cm处,松土效果显著。H对SCDR的影响表现为:当H<25cm时,土面易抬升,随着H的减小,SCDR越大,当H为10cm时,测试域的SCDR均高于45%,土体扰动域的松土效果较好;当H>25cm时,随着H的增大,因土体所受自应力增大,H为30cm时的整体松土效果较好。
  在注肥前气爆松土可促进液肥扩散,P越大,土壤孔隙度越大,越利于液肥扩散流动。气爆注肥深度日决定了液肥在土内的扩散形势,当H≤20cm时,液肥易从土面溢出,造成肥料浪费;当H>20cm,液肥集中域范围随深度的增大而减小,且深度越深,受土体自应力作用,液肥趋于径向流动扩散。液肥浓度决定了其扩散半径的大小,浓度较高时,液肥与土壤的粘阻力较大,液肥流动性较弱,扩散半径较小,扩散效果较差;浓度较低时,液肥在土内的入渗率较快,扩散性一般,总体上液肥浓度为300g/L时的扩散效果较好。
  (5)研制了气爆松土注肥机,并进行了田间试验。采用液力辅助气铲激振的钻杆结构,建立了液力辅助气铲钻土的力学模型,优化了气铲选型及液压元件,实现钻杆的快速钻土及回升;采用基于PLC控制的多旋钮开关操作系统,实现了机具的手动、自动控制作业,一键操作可完成钻杆钻土、气爆松土、液肥注射、钻杆回升四步操作,简单快捷。田间试验表明,气爆作用在土体内产生裂隙并扩散,30cm钻深、0.8MPa气爆压力下的土体最大裂隙宽约3~4mm,裂隙扩展扰动半径约40cm;土壤坚实度降幅明显,水平半径40cm范围内的平均降幅可达40.5%;土壤在气爆下发生扰动,扰动系数达72.17%,优于铲式深松,深松效果显著;机具作业性能可靠,作业效率至少0.048hm2/h,因农艺要求不同,机具的作业效率将有所提高。
[硕士论文] 陆慢
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄瓜(Cucumis sativus L.)反季节栽培时经常遭遇低温胁迫,研究其低温响应机制将有助于创制黄瓜耐低温栽培和育种的新方法。积累棉籽糖家族寡糖(RFOs)是植物抵御低温胁迫的有效途径之一,前期研究表明,黄瓜作为一种RFOs运输型植物,低温同样会导致RFOs在叶片中积累,低温解除后RFOs含量又逐步恢复至正常水平。但是,在低温胁迫与解除过程中,RFOs合成与分解的生理过程并不清楚。水苏糖合成酶(STS,EC.2.4.1.67)和α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)分别是催化水苏糖合成与分解的关键酶。黄瓜叶片中存在3种不同的STS转录本和6种不同的α-半乳糖苷酶转录本,其中各STS转录本由同一基因编码、通过选择性剪切生成;而各α-半乳糖苷酶转录本则是由6个不同的基因所编码。在低温胁迫与解除过程中,这些转录本在RFOs合成与降解中的具体作用目前不清楚。
  为此,本试验首先建立了特异鉴定3种STS转录本的方法,探明了这3种转录本的稳定性及其受胞内糖水平调节表达的特点,并在此基础上研究了STS与α-半乳糖苷酶各种转录本在黄瓜低温胁迫与解除过程中的表达、酶活性及相关糖含量的变化。此外,前期研究表明黄瓜低温胁迫后RFOs在液胞、细胞质、叶绿体中均有积累,低温解除后各亚细胞空间中的RFOs水平均逐步下降至正常水平。为探索各亚细胞空间中的RFOs分别由哪种α-半乳糖苷酶分解,本实验还研究了各种α-半乳糖苷酶亚细胞定位。所得结果如下:
  1.本试验建立的“3碱基锚定引物法”可特异鉴定3种STS转录本,保证在实时荧光RT-PCR反应中特异地区分3种转录本,为后续研究提供了有效实验手段。
  2.黄瓜愈伤组织STS的表达丰度显著低于叶片。黄瓜愈伤组织转至无糖MS培养基后,3种STS转录本的表达量上升;将愈伤组织从无糖培养基再转入蔗糖、棉籽糖、水苏糖、半乳糖为碳源的MS培养基中,3种STS转录本的表达量下降;表明STS各转录本的表达受细胞内糖水平的调节。放线菌素D抑制实验结果表明,STSⅡ转录本的稳定性显著低于其他2种转录本。
  3.黄瓜叶片中STSⅠ、STSⅡ的表达丰度显著高于STSⅢ,在黄瓜低温适应过程中起主导作用。4℃低温胁迫后,黄瓜叶片中各可溶性糖含量上升,3种STS转录本表达上调,酶活性提高。结合愈伤组织的研究结果,表明该上调确为低温所诱导,而不是糖水平上升所导致。恢复至常温后,各可溶性糖含量下降,酸性α-半乳糖苷酶3基因(GAL3)、碱性α-半乳糖苷酶2和3基因(AGA2,AGA3)的表达上调,GAL和AGA活性上升,表明这3个基因在温度恢复后RFOs降解过程中起重要作用。
  4.亚细胞定位研究结果表明,GAL1与GAL2定位于细胞壁;GAL3主要分布于液胞;AGA1和AGA2主要分布于细胞质;AGA3则定位于叶绿体。结合前期研究结果,表明低温解除后,GAL3、AGA2,AGA3分别在液胞、细胞质和叶绿体中起降解RFOs的作用。
[硕士论文] 卢俊成
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=2x=14)是葫芦科甜瓜属一年生攀缘性草本植物,是世界上普遍栽培的一种瓜类作物,也是中国种植范围最广的主要蔬菜作物之一。随着全球气候的日趋变暖,高温热害给黄瓜的生产带来的影响日益严重,已经成为中国黄瓜生产中急需解决的难题之一。有关黄瓜热害分子机理尚缺乏系统、深入的研究。
  本研究在对八十份黄瓜种质资源进行耐热性鉴定与筛选的基础上,以黄瓜耐高温品系‘GY2’为试材,运用RNA-seq技术,分析了43(±1)℃高温胁迫6h(T1)和12h(T2)全基因组转录组水平上的差异,对候选基因在耐高温品系‘GY2’和高温敏感品系‘平望乳瓜’中进行表达验证。主要研究结果如下:
  1.高温胁迫处理后对两个时间点进行差异表达基因进行分析,一共得到6063个差异表达基因。其中,43℃条件下处理6h有3196个基因差异表达,1702个基因上调表达,1494个下调表达;处理12h有4711个基因差异表达,2038个上调表达,2673个下调表达。
  2.通过对差异基因GO富集、KEGG通路分析,并结合黄瓜基因组数据库的功能注释,发现黄瓜响应高温胁迫的基因主要集中在光合作用、热激转录因子和热激蛋白等3大类,结合功能注释共确定耐高温候选基因18个用于qRT-PCR分析。
  3.18个候选基因在耐高温品系‘GY2’与高温敏感型品系‘平望乳瓜’中表达验证结果表明,其中的6个基因可能与黄瓜应答耐热胁迫相关,包括2个热激转录因子基因和4个热激蛋白相关基因。6个候选基因在‘GY2’中随着高温胁迫的时间延长表达量明显逐渐增加,而在‘平望乳瓜’中,表达量无明显变化;Csa1G467710在耐/敏高温品系中均上调表达,不同温度下在‘GY2’中该基因的表达量均显著高于平望乳瓜。初步认为,Csa1G467710在黄瓜应答高温胁迫中具有重要作用。
[硕士论文] 杨健君
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科莲属多年生水生草本植物,原产于中国和印度,现于东南亚、日本及中国均有栽培。莲藕是中国种植面积最大的水生蔬菜,其产品包括鲜藕、莲籽和藕粉,含有丰富的蛋白质、淀粉、矿质营养及多种维生素,具有较好的保健功能,深受大众消费者的喜爱。目前莲藕栽培种对盐敏感,而耐盐品种存在于野生资源中。随着中国土壤盐渍化范围及沿海滩涂面积不断扩大,培育莲藕耐盐新品种,使其在含盐量较高的盐渍化土壤中栽培,既有利于提高土地利用率,同时又改善了当地环境。质膜内在蛋白(Plasma Membrane Instrinsic Protein,PIP)是目前研究较多的水通道蛋白中的一种,研究表明PIP具有提高植物耐盐性的作用[1]。由于受细胞膜的限制,PIP可能通过介导叶和根中水分的跨细胞运输来提高植物的耐盐能力。因此,本研究从耐盐野生莲中克隆了PIP家族基因,并研究了其在逆境胁迫下的表达特征,同时对盐诱导的基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1和NnPIP2-7)进行了过表达载体的构建,结果如下:
  1、采用RT-PCR技术,从野生耐盐莲藕资源H5中克隆得到8个PIP家族基因,基因核苷酸全长在843bp-864bp之间。通过对比NCBI数据库,发现本实验得到的莲藕PIP家族基因和拟南芥、水稻和玉米PIP家族基因的同源性较高,家族基因之间的同源性在67%-90%,因此把本实验克隆的基因命名为NnPIPs。进一步研究表明NnPIP1与AtPIP1和NnPIP2与AtPIP2之间的同源性要高于NnPIP1与NnPIP2之间的同源性,表明NnPIP1和NnPIP2属于同一基因家族中的2个亚类。在基因结构上,NnPIPs中每个成员都具有6个α-跨膜螺旋和5个相连接的环(A环-E环),且B环和E环上均有一个NPA(Asn-Pro-Ala)结构域,这是植物体运输水和CO2等一些小分子的基本结构。
  2、利用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术,以β-actin为内参,分别在NaCl、甘露醇、ABA、低温和PEG处理0h、6h、12h、18h、24h研究了NnPIPs在莲藕H5中的表达特性。结果表明:在250mM NaCl处理下,NnPIP1-2的表达量在0-24h呈上调趋势,处理24h达到最高,NnPIP2-1和NnPIP2-7的表达量在0-12h呈上调趋势,12h后达到最高,NnPIP1-3和NnPIP1-4的表达量在NaCl处理后下降,NnPIP1-1和NnPIP2-8在处理的时间内不受盐诱导,表达量无显著改变;在200mM甘露醇处理下,NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP1-4、NnPIP2-1和NnPIP2-7的表达量均无显著改变,NnPIP2-8的表达量在处理12h后显著增加,18h表达量达到最大值;在50μM ABA处理下,NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnPIP2-8的表达量在ABA处理后6h至18h期间呈不同程度的增加,NnPIP1-1、NnPIP1-2和NnPIP1-4的表达量在处理时间内无显著变化;在低温(4℃)处理下,NnPIP1-1和NnPIP2-7的表达量在低温处理后18h达到最大,NnPIP1-2、NnPIP1-3和NnPIP2-8的表达量在处理24h内无显著变化,NnPIP1-4和NnPIP2-1的表达量在0-24h内呈下降趋势;利用10%PEG6000处理莲藕幼苗24h,发现NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnPIP2-8的表达量在24h内显著增加,而NnPIP1-4的表达量先下降,然后上升。以上数据表明,NnPIPs在响应不同逆境胁迫时,其表达模式具有多样性特征。
  3、本实验利用pAMBIA1301过表达载体对上述3个盐诱导的PIP家族基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1、NnPIP2-7)进行了载体构建,以便进一步研究基因功能。通过双酶切和PCR鉴定,认为成功地构建了pAMBIA1301-NnPIP1-2、pAMBIA1301-NnPIP2-1和pAMBIA1301-NnPIP2-7过表达载体。
[硕士论文] 王丽楠
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着中国综合国力的不断提高和社会经济水平的飞速发展,在给人们带来美好生活的同时也伴随着环境污染问题的出现,土壤的盐碱化和重金属污染问题日益严重。土壤是人类在地球上赖以生存的物质,是植物正常生长和动物生活的重要载体,而盐碱化和重金属污染不仅使中国农用地的利用率降低,而且对植物和作物的伤害较大,影响其正常生长。盐碱土包含着中性盐和碱性盐,而土壤中重金属铅(Pb)和镉(Cd)也是中国许多地市地表土层超标最多的重金属。本论文以草坪草高羊茅(Arid爱瑞)、高羊茅+黑麦草(Derby德比)、普通狗牙根(Mirage米瑞格)为研究材料,采用温室盆栽的方法,用NaCl和NaHCO3来模拟盐分、碱分胁迫条件,用蒸馏水分别配制浓度梯度为0mmol·L-1、50mmol·L-1、150mmol·L-1、250mmol·L-1的NaCl和NaHCO3溶液,以及不同浓度的Pb(NO3)2-Pb2+(0、500、1000、2000mg/L)、3CdSO4·8H2O-Cd2+(0、50、100、200mg/L)水溶液分别处理三种草坪草,通过测定草坪草的形态及生理指标等,探讨了对盐碱和重金属的耐性效果较好的品种,结果表明:
  三种草坪草在不同浓度盐胁迫下所表现出来的生长态势较好,没有死亡枯萎的现象,而在不同浓度碱胁迫下生长状况不是很理想,随着胁迫浓度的升高,其叶长的生长都受到抑制作用;分蘖数都呈现下降的趋势,在处理前期,低浓度处理下的草坪草分蘖数有升高的现象,说明轻度盐胁迫对草坪草分蘖数有促进作用;根冠比呈显著上升的趋势,说明盐和碱的胁迫处理对草坪草根长的抑制作用小于地上部分,相对含水量随着盐和碱的处理浓度的升高而下降;叶绿素含量随着处理浓度的升高而降低,说明胁迫浓度与光合作用呈反比;三种草坪草的根系活力在盐胁迫和碱胁迫条件下随着处理浓度的升高根系活力表现为先升高再降低的趋势;可溶性糖的含量也逐渐升高,与处理浓度呈正相关。但综合其形态特征和生理指标来说,耐性大小依次为高羊茅>混合草>狗牙根,混合草和狗牙根在强碱胁迫下不能正常生长。综上所述,高羊茅可以作为盐碱地草坪植物栽培。
  三种草坪草在不同浓度镉胁迫处理下所表现出来的生长态势较好,在铅的胁迫处理下,高浓度铅处理下表现出来的生长态势不是很理想,部分叶片出现发黄现象,但不影响其正常生长。三种草在受到重金属铅和镉的胁迫后其叶绿素含量和根系活力随着处理浓度的升高而降低,而影响植物代谢的丙二醛含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性随着重金属离子浓度的升高而呈现上升的趋势。草坪草中对重金属铅和镉吸收量较多的是高羊茅,较少的是狗牙根,而混合草居中,所以高羊茅较适合作为重金属积累植物进行培养,且对重金属的吸收量均为地下部分>地上部分,综合铅镉胁迫处理,其耐性大小依次为混合草>高羊茅>狗牙根。
[硕士论文] 陈伟男
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:番茄(Solanum lycopersicum L.)属于茄科,番茄属植物,是中国设施栽培面积最大的水果蔬菜。近些年随着复种指数和设施栽培面积的增加,根结线虫病害日趋严重,使得番茄减产严重甚至绝收,而抗根结线虫品种的选育无疑是防治根结线虫病害最科学有效的方法。Mi-1基因是唯一被克隆并商品化运用的根结线虫抗性基因,但该基因具有热不稳定性,土壤温度一旦高于28℃,就会丧失对根结线虫的抗性,对番茄的栽培生产构成了巨大威胁。论文研究了高温胁迫和根结线虫侵染对番茄苗期相关生理指标的影响,克隆得到热稳定抗根结线虫基因Mi-9的两个候选基因,并通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了在高温下抗根结线虫的番茄转基因株系。主要结果如下:
  1、番茄苗期在高温胁迫和根结线虫侵染条件下,番茄叶片的光化学量子产量、光合电子传递速率、光化学猝灭系数均显著降低。其中热稳定抗根结线虫材料‘288’降幅最小,其次是热敏感材料‘VFN’,感病材料‘Money Marker’降幅最大;荧光参数qN在根结线虫侵染和复合胁迫下均呈上升趋势,热稳定抗根结线虫材料‘288’增幅最大,显著大于感病材料‘Money Marker’。在高温胁迫和根结线虫侵染条件下,热稳定抗根结线虫材料‘288’叶绿素含量、干鲜重降幅最小,感病材料‘Money Marker’降幅最大;在根结线虫线虫侵染和复合胁迫下,根系活力均呈下降趋势,其降幅由高到低依次为‘Money Marker’>‘VFN’>‘288’;热稳定抗根结线虫材料‘288’在单一胁迫和复合胁迫下根系的SOD、POD、CAT活性均显著增高且增幅高于其它材料。热敏感材料‘VFN’、感病材料‘Money Marker’根系的SOD、POD、CAT活性在单一胁迫条件下均呈上升趋势,但在复合胁迫条件下表现为显著下降,抗氧化酶活性显著低于高温胁迫。
  2、利用已克隆的Mi-1基因序列信息,通过同源克隆方法得到Mi-9基因的两个候选基因,分别为2157-1、2157-3基因,DNA序列分析显示,2157-1和2157-3两者同源性为96.35%,与Mi-1基因核酸序列同源性分别为90.47%和93.13%,2157-1和2157-3基因核苷酸全长分别为3984bp、4000bp;氨基酸序列分析结果表明,2157-1和2157-3具有93.16%的同源性,与Mi-1基因氨基酸序列同源性分别为90.99%和95.77%,2157-1蛋白由1271个氨基酸组成,2157-3蛋白由1276个氨基酸组成。以Mi-9候选基因为目的基因,成功构建pBI121+2157-1、pBI121+2157-3过表达重组载体;并利用农杆菌介导的遗传转化方法,将目的基因2157-1、2157-3成功导入到栽培番茄‘Micro-tom’中;转基因植株的PCR检测和测序结果表明,44株番茄转基因植株中,26株扩增出特异条带,其中包括2157-1转基因植株18株,2157-3转基因植株8株,平均阳性率为59.1%。
[硕士论文] 吴晨阳
果树学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:试验分别以甜柿品种‘太秋’和采集自江苏的18份柿属植物种质资源为试验材料,研究了供试材料种子的休眠及萌芽特性,评价了不同种质资源作为砧木和授粉品种对接穗品种‘太秋’生长结果及果实品质变化的影响,比较了‘太秋’与供试材料不同砧穗组合嫁接亲和性的变化,探讨了嫁接时期和方法对提高‘太秋’嫁接苗成活率的影响,主要研究结果如下:
  1、供试柿属植物种子对低温层积的反应存在两种类型,一类无需低温层积也能正常萌芽,另一类则需低温层积解除休眠后才能萌芽,需冷量最高为1200h,最低为240h;层积温度10~11℃能够有效解除供试材料种子的自然休眠;温度31℃可促进柿属种子的萌发;GA3对柿属种子的休眠解除和萌发有促进作用;
  2、不同嫁接时期和方法对‘太秋’嫁接成活率有显著影响,‘太秋’枝接宜在2月中旬进行,9种砧穗组合的平均成活率为86.7%,3月中旬对‘太秋’采用嵌芽接,9种砧穗组合的平均成活率可达88.3%;
  3、不同砧木上‘太秋’的萌芽期最大可相差15d,单位结果母枝上的雌花枝数量最多可相差8根以上,嫁接在‘大别山1’和‘高邮1’上的‘太秋’雌花枝数量较多;不同砧木上‘太秋’果形大小和糖酸组分间存在明显差异,其中以‘大别山1’、‘高邮1’、‘溧阳1’和‘禅寺丸’为砧木的果形较大,以‘高淳1’、‘高淳2’、‘高邮1’、‘禅寺丸’和‘仪征1’为砧木的果实葡萄糖含量较高,以‘大别山1’为砧木的果实柠檬酸和奎宁酸含量较低;
  4、‘大别山1’与‘太秋’的异花授粉坐果率为95.82%,‘太秋’自花授粉坐果率可到达90.1%,3种供试授粉组合对‘太秋’的果形指数、单果重,以及果实中柠檬酸和奎宁酸含量未见显著影响,但‘太秋’自花授粉显著增加了果实中葡萄糖、果糖和麦芽六糖含量,‘大别山1’有希望成为‘太秋’的适宜异花授粉树;
  5、综合考虑供试砧木对接穗品种‘太秋’的嫁接亲和性、果实生长和品质形成等的影响,‘大别山1’和‘高邮1’可作为‘太秋’甜柿专用砧木的候选株系进一步观察利用。
[硕士论文] 周星宇
园艺 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:草绣球(Hydrangea macrophylla)是重要的盆栽、地栽两用的观赏花木,其花大色艳,形态优美,应用广泛,市场开发前景广阔。夏季中国的光照过强,远超过草绣球的光饱和点,会产生光抑制现象,严重时会造成光合器官不可逆转的光氧化破坏。本论文以‘大花绣球’和‘圆锥绣球’两个草绣球品种为材料,研究了水杨酸处理对强光胁迫下草绣球耐光性的影响,旨在为生产上利用水杨酸(SA)提高草绣球耐光性提供理论依据。结果如下:
  (1)当光合有效辐射(PAR)小于600μmol·m-2·S-1时,两品种的叶片的净光合速率(Pn)随着PAR的增加迅速上升,当PAR大于600μmol·m-2·s-1后,Pn升幅较为平缓。‘大花绣球’和‘圆锥绣球’的光补偿点(LCP)、光饱和点(LSP)和最大净光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)、表观量子效率(AQE)分别为6.890和7.955μmol·m-2·S-1、645.391和716.173μmol·m-2·S-1、6.582和7.428μmolCO2·m-2·S-1、0.294和0.289μmolCO2·m-2·S-1、0.044和0.037μmol·μmol-1。
  (2)SA处理有效提高了两品种在强光胁迫下的Pn,随着SA浓度的变化先上升后下降,SA处理提高了草绣球的光合能力。
  (3)SA处理有效降低了两品种在强光胁迫下的超氧阴离子(O2-)产生速率和过氧化氢(H2O2)含量,随着SA浓度的变化先下降后上升,减少了草绣球活性氧自由基的积累。
  (4)SA处理有效降低了两品种在强光胁迫下的相对电导率和丙二醛(MDA)含量,随着SA浓度的变化先下降后上升,减少了强光胁迫对细胞膜的膜脂过氧化伤害。
  (5)SA处理有效提高了两品种在强光胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,随着SA浓度的变化先上升后下降,提高了草绣球清除活性氧自由基的能力。
  (6)综合生理生化指标的表现,SA水溶液处理对提高‘大花绣球’和‘圆锥绣球’的耐光性效果最好的浓度分别为0.80mmol·L-1、0.60mmol·L-1。‘大花绣球经’SA处理对提高耐光性的效果更为显著。
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