绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 71671 条结果
[博士论文] 杨立为
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:血液接触材料广泛应用于生物医学材料领域。材料与血液接触后会引起一系列生物反应,如血小板和白细胞在材料表面的粘附,不仅造成血栓和炎症等不良后果,同时也影响生物材料的功能。目前设计抗血小板和白细胞粘附材料主要有两种策略:1)利用具有防污效应的亲水高分子构建生物惰性表面;2)利用抑制细胞粘附的生物分子构建生物活性表面。上述方法存在的主要问题是:生物惰性表面的构建需要复杂的化学合成和表面修饰步骤;生物活性分子的引入不仅增加了材料的成本,还容易出现变性和降解等问题。由于天然多酚类化合物含有抗血小板激活和抗炎症等优异的生物活性,且能通过螯合自组装作用简单快速地对材料表面进行修饰。基于此,本论文提出在材料表面修饰自组装多酚涂层而实现抗血小板和抗白细胞粘附的研究思路。论文首先研究了构建稳定自组装多酚涂层的技术和方法,进一步将构建的多酚涂层应用于抗血小板粘附研究,最后探讨了该涂层抗白细胞粘附的效果以及在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
  论文首先研究了自组装多酚涂层的成膜过程和稳定性。以单宁酸(TA)为模型多酚分子,利用TA与Fe3+的螯合作用在材料表面自组装成膜(TA-FeⅢ)。重点考察了关键影响因素即反应物的投料顺序、成膜溶液pH值和基底材料的亲疏水性对涂层厚度和稳定性的影响。结果表明,以先加入Fe3+后加入TA的投料顺序能促进多酚涂层厚度的逐级稳定增长,经过五次修饰后可得到稳定的、厚度约为85nm的多酚涂层;在pH为3的环境下成膜后,将溶液pH值调节至8,可促进配位键Fe-O的形成,有利于形成更加致密的TA-FeⅢ骨架,进而提高多酚涂层的稳定性;与亲水的基底材料相比,疏水基底材料表面更有利于稳定多酚涂层的形成。
  论文进一步研究了自组装多酚涂层的抗血小板粘附能力。重点考察了涂层的厚度、在自然状态下的存放时间、多酚分子类型、不同基底材料等因素对涂层抗血小板粘附效果的影响。研究结果表明:五次修饰、厚度约为85nm的TA-FeⅢ多酚涂层表面几乎观察不到血小板粘附;存放21天后,多酚涂层抗血小板粘附能力未见明显降低,效果显著优于对照组聚乙二醇(PEG)修饰的抗血小板粘附材料;利用表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)制备的EGCG-FeⅢ和ECG-FeⅢ多酚涂层同样表现出优异的抗血小板粘附能力;在聚醚砜膜材料、聚碳酸酯板材和硅胶管表面修饰TA-FeⅢ多酚涂层,均实现了抗血小板粘附的效果。
  论文随后对TA-FeⅢ多酚涂层抗血小板粘附的机理进行了深入探讨。基于TA-FeⅢ多酚涂层表面与蛋白相互作用的基团为没食子酰基(galloyl),因此推测galloyl在抗血小板粘附中起了重要作用。由于纤维蛋白原(Fgn)是介导材料表面粘附血小板的关键蛋白,首先构建了含有不同galloyl基团数量的多酚涂层,考察涂层表面galloyl基团数量对吸附Fgn质量以及吸附Fgn构象的影响,并建立与抗血小板粘附之间的关系。结果表明,多酚涂层表面galloyl基团数量对吸附Fgn质量的影响不大,但对吸附Fgn构象的影响较大,其中,表面吸附Fgn的γ链暴露程度与血小板粘附的数量呈正相关。随着涂层表面galloyl基团数量的增加,吸附Fgn的γ链暴露程度降低,血小板粘附的数量减少。推测含有大量galloyl基团的TA-FeⅢ多酚涂层能与Fgn产生强氢键作用,阻止吸附的Fgn发生构象改变,使得Fgn的γ链上血小板粘附受体隐藏,因而TA-FeⅢ多酚涂层能够有效地排斥血小板粘附。
  最后,论文探索了TA-FeⅢ多酚涂层在循环肿瘤细胞(CTCs)捕获中的应用。由于材料表面的白细胞粘附严重干扰材料对CTCs的捕获,因此首先考察了TA-FeⅢ多酚涂层抗白细胞的粘附能力。研究发现基底材料经TA-FeⅢ涂层修饰后,外周血单核细胞(PBMCs)粘附的数量从~74个/mm2降为~11个/mm2,同时显著降低了PBMCs释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)促炎症因子的水平。进一步将TA-FeⅢ涂层应用于对CTCs的捕获,考察了该涂层对多种癌细胞系(MCF-7、A431、HeLa和A549)的CTCs捕获效果。结果表明,TA-FeⅢ涂层能实现对多种癌细胞的高效捕获,捕获率均达到76%以上,且不依赖于细胞表面表达的蛋白。同时TA-FeⅢ涂层还具有良好的细胞相容性,捕获的癌细胞表现出90%以上的存活率,有利于对捕获的癌细胞进行再培养。
  综上所述,自组装多酚涂层提供了一种简单高效的抗血小板和抗白细胞粘附的策略,在血液接触材料领域具有潜在的应用前景。此外,该涂层还提供了一种无需抗体标记的CTCs捕获方法。与传统方法相比,该方法无需引入微纳米基质、复杂的微流控芯片和生物识别分子,为开发CTCs捕获装置而用于癌症早期诊断提供了新的设计思路。
[硕士论文] 夏静
临床医学(生殖) 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究旨在探索miRNA-194-5p能否通过Stra8来调控精子发生。通过对出生后第11天的Stra8基因敲除(Stra8-/-)及野生型雄性小鼠睾丸组织进行RNA测序分析,筛选Stra8缺失时差异表达的miRNAs。验证其中差异表达的miRNAs与Stra8之间的关系,并进一步探索miRNA-194-5p是如何通过Stra8来影响精原细胞增殖分化过程的。
  方法:
  1、饲养并收集不同周龄的野生型和Stra8-/-小鼠,用HE染色法分析其睾丸组织结构。选取出生后11天的野生型及Stra8-/-小鼠睾丸进行RNA-seq检测,筛选出差异表达的miRNAs。应用实时定量PCR法验证miRNAs在两种小鼠睾丸组织中的表达水平,并检测它们在小鼠不同组织中的表达情况。
  2、构建pGL3-Basic-Stra83'UTR重组质粒及pMSCV-PIG-miR-194-5p/miR-205-3p/miR-3544-3p重组质粒。利用双荧光素酶报告基因实验探索它们之间有无转录调控关系。应用TargetScan数据库分析miR-194-5p与Stra8之间的结合位点,并突变其结合位点,再次应用双荧光素酶报告基因实验验证两者之间的关系。
  3、在293T细胞中用PEI法包装pMSCV-PIG-miR-194-5p慢病毒,用此病毒感染P19细胞并经嘌呤霉素筛选,获得过表达miR-194-5p的P19细胞株。并利用实时定量PCR法进行验证。
  4、将不同状态下的P19细胞株用RA处理,利用Western Blot及细胞免疫荧光检测miR-194-5p是否能通过Stra8来影响P19细胞向生精细胞分化的进程。
  结果:
  1、与野生型小鼠相比,出生后第7天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内的支持细胞和精原细胞并未出现明显的形态学差异。出生后第14天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内精母细胞明显减少,有些精原细胞核出现异常深染。出生后第21、28、35、56天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内大部份生精细胞消失,部分生精小管内呈现多个生精细胞具有浓缩细胞核的初级精母细胞。
  2、应用RNA-seq法比较了出生后11天的野生型和Stra8-/-小鼠睾丸,发现了6个差异表达的miRNAs:miR-194-5p、miR-205-3p、miR-3544-3p、miR-1a-3p、miR-337-3p、miR-30c-1-3p。经QRT-PCR检测证实前5个miRNAs表达趋势与RNA-seq结果相一致。多组织表达分析发现:miR-194-5p在睾丸组织中相对表达量较高,miR-205-3p相对表达量一般,而miR-3544-3p在睾丸中的相对表达量较其它组织高。
  3、双荧光素酶报告实验表明miR-194-5p能显著降低Stra83'UTR的荧光素酶活性,miR-205-3p和miR-3544-3p不能降低Stra83'UTR荧光素酶活性。同时miR-194-5p不能降低Stra83'UTR-mut的荧光素酶活性。
  4、利用PEI转染法制备了pMSCV-PIG-miR-194-5p慢病毒,且成功感染P19细胞株并经嘌呤霉素筛选。QRT-PCR结果提示:与空载体对照组比较,miR-194-5p在感染慢病毒的P19细胞内表达水平明显提高,具有显著性统计学意义(P<0.05)。
  5、RA诱导pMSCV-PIG-miR-194-5p-慢病毒感染的P19细胞株后,发现Stra8mRNA及蛋白水平均明显下调,而一些参与干细胞分化相关基因Oct4、Plzf、Nanos3、Vasa的表达均发生改变,说明miR-194-5p可能直接或间接通过Stra8调控P19细胞向生殖细胞方向分化。
  结论:
  发现了6个与Stra8相关的miRNA,其中miR-194-5p具有与Stra83'UTR结合的位点,能够显著抑制其荧光素酶活性,其过表达并能够抑制P19细胞中Stra8的mRNA及蛋白的表达水平。同时,其过表达后能够影响多种精原细胞增殖及分化相关蛋白的表达水平。上述结果表明:Stra8是miR-194-5p的直接靶基因,miR-194-5p通过靶向调控Stra8的表达来调节生精细胞的增殖与分化。
[硕士论文] 申雪沂
人体解剖与组织胚胎学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:Stra8(stimulated by retinoic acid gene8,Stra8),是视黄酸(retinoic acid,RA)诱导基因之一,对于减数分裂启动和男性生殖发育具有重要作用。Stra8在正在分化的精原细胞到前细线期精母细胞表达。而且Stra8在细胞核与细胞质均具有定位,并根据发挥功能的不同在核质之间穿梭。Stra8敲除小鼠不育,但其在精子发生中的作用及机制尚未阐明。本课题通过以下两个部分研究Stra8在精子发生中的作用与机制:第一,Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。第二,体外研究Stra8与Setd8的相互作用。该研究为揭示Stra8在精子发生中的作用奠定了基础。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。
  (一)通过体内和体外实验,发现并鉴定Stra8在精子发生中具有抑制细胞凋亡的作用。在Stra8KO小鼠模型、维生素A缺乏小鼠(VAD)及VAD恢复小鼠(VAR)中发现Stra8具有抑制凋亡的作用。我们选择11dpp的StraSKO小鼠睾丸进行TUNEL实验并计数凋亡细胞,结果发现:与WT小鼠相比,Stra8KO小鼠生精细胞管内凋亡细胞数量明显增加。其次,构建维生素A缺乏和VAD恢复小鼠模型(VAD and VAR)。通过TUNEL实验发现在45天和61天的VAD小鼠模型中,凋亡细胞明显增加,进一步验证Stra8具有抑制凋亡作用。最后,在Stra8过表达精原细胞验证了Stra8抑制凋亡的作用,应用TUNEL实验和流式细胞术对凋亡细胞进行计数,也发现在Stra8过表达精原细胞内凋亡细胞数量明显减少。
  (二)通过基因微阵列分析,探索Stra8抑制细胞凋亡的机制及相关通路。通过基因微阵列分析,我们发现了5个上调基因和4个下调基因与细胞凋亡相关。通过qRT-QCR验证与文献查阅发现,在这些DEGs中,PDK1(AKT重要上游因子)、ANG2(BCL2抑制因子)、USP33、TCF4、GSTP1(MAPK相关因子)、OSGIN1(P53相关因子)和Caspase3与AKT信号通路相关,同时BCL2、P53、ERK(MAPK1/3)、JNK(MAPK8/9)和P38(MAPK14)是AKT信号通路的关键因子。
  (三)Stra8在精子发生中抑制凋亡作用的潜在通路绘制。我们进一步在mRNA和蛋白水平检测发现,与对照组相比,Stra8过表达精原细胞内PDK1、AKT、BCL2和ERK的表达水平均明显升高,P53mRNA表达水平显著降低,但其蛋白表达没有明显差别。同时,通过检测发现,与对照组相比,Stra8过表达精原细胞内Caspase3在mRNA和蛋白水平均表达降低。因此,Stra8可能通过AKT通路直接或间接抑制P53或激活BCL2家族基因,与MAPK通路相互作用,进而抑制caspases家族基因,发挥抑制凋亡作用。
  第二部分 体外研究Stra8与Setd8的相互作用。
  (一)Stra8过表达精原细胞和P19细胞中Stra8、Setd8和H4K20me1的表达。应用WB检测Stra8过表达精原细胞内Setd8和H4K20me1的表达发现,与对照组相比,在Stra8过表达精原细胞中,Set8表达降低,而H4K20me1表达增高,提示三者之间可能具有相互调控关系。之后,我们应用4μM RA诱导P19细胞36-48hr,使其瞬时过表达Stra8,然后检测诱导后P19细胞内Set8和H4K20me1的表达,结果发现,与未诱导P19相比,RA诱导P19细胞分化后,Set8表达水平降低,而H4K20me1表达增高,与在Stra8过表达精原细胞的表型一致,进一步验证三者之间具有相互调控关系。
  (二)Stra8过表达细胞株的细胞周期同步化方法的建立。由于Stra8、Setd8和H4K20me1的表达与细胞周期相关。因此我们参照Hela细胞的细胞周期同步化方法,将Stra8过表达精原细胞同步化至细胞周期的不同阶段。首先,应用血清剥夺法同步化Stra8过表达精原细胞至G1期,分别血清剥夺培养细胞24,36,48,60,72,84,96hr,发现血清剥夺培养72hr后,细胞周期同步化至G1期效率最高,达60-70%。其次,应用“二次胸苷(2.5mM)阻滞法”同步化Stra8-GC1至S期,第二次释放时间分别为0,3,6,9hr,发现二次释放时间3hr后细胞的S期同步化效率最好,达60-70%。最后,应用100ng/ml诺考达唑分别处理4,8,12hr,发现处理8hr后细胞的M期同步化效率最好,达90%以上。
  (三)Stra8,Setd8和H4K20mel在Stra8过表达细胞株在细胞周期不同阶段的表达。我们应用细胞免疫荧光和Western Bloting法检测Stra8过表达精原细胞细胞周期不同阶段Stra8,Setd8和H4K20me1的表达,发现在Stra8-GC1内,Stra8表达在G1期低,S期达到高峰,信号核质均有,在G2/M期表达降低;Setd8表达在G1期无表达,在S期后期开始表达,信号主要在细胞核,在G2/M期表达水平达高峰;H4K20me1表达模式与Setd8表达相似。经过表型分析与文献查阅我们猜测在细胞周期S期中,Stra8抑制E3泛素连接酶相关基因表达,CRL4Cdt2,SCFSkp2等,减弱其对Set8的降解作用,导致Setd8总体表达下降;而由于H4K20me1提前表达,反而导致H4K20me1总体表达水平提高。
[硕士论文] 李雪丽
妇产科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在辅助生殖技术促排卵过程中,卵巢低反应患者常常出现获卵率低、卵母细胞质量差及妊娠结局不良,目前有很多的治疗措施被建议用于提高卵巢低反应患者的IVF-ET妊娠结局,促排卵方案中适时添加生长激素是其中之一。本研究通过探讨生长激素对卵巢低反应患者IVF-ET胚胎质量及妊娠结局的影响,进一步明确生长激素对不同年龄卵巢低反应患者卵巢反应的影响及应用价值,为卵巢低反应患者的治疗方案提供相应的理论依据。
  方法:
  1、选择2015年01月至2016年12月在本院生殖中心行IVF/ICSI-ET助孕的并确诊为卵巢低反应的共72个新鲜周期为研究对象,将促排卵方案中加用生长激素的为实验组(32个周期),同样的促排卵方案中未加用生长激素的为对照组(40个周期),比较两组卵巢低反应患者的基本情况、卵母细胞质量、胚胎质量及妊娠结局。
  2、按年龄将纳入患者分为<35岁和≥35岁两组,每组中都包括生长激素组和对照组,分别比较不同年龄组中生长激素组和对照组患者的基本情况、卵母细胞质量、胚胎质量及妊娠结局,探讨生长激素对卵巢早衰患者IVF-ET周期中卵巢反应的影响及其应用价值。
  结果:
  1、GH组和对照组比较,两组间的年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量、HCG日子宫内膜厚度、移植胚胎数及受精方式均无明显统计学差异(P>0.05),但HCG日E2水平(P=0.010)生长激素组较对照组显著增高,有显著统计学差异。
  2、GH组和对照组比较,两组的卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率、临床妊娠率及活产率均无显著统计学差异(P>0.05),而获卵数(P=0.002)和MⅡ卵数(P=0.015)在GH组较对照组明显增高,有显著统计学差异。
  3、年龄<35岁的生长激素组和对照组,两组间的年龄、BMI、不孕年限、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量、HCG日子宫内膜厚度及HCG日E2水平均无明显统计学差异(P>0.05);年龄≥35岁的生长激素组和对照组,两组间的年龄、BMI、不孕年限、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量及HCG日子宫内膜厚度均无显著统计学差异(P>0.05),但HCG日E2水平(P=0.005)GH组明显高于对照组,有显著统计学差异。
  4、年龄<35岁的生长激素组和对照组,两组间的获卵数、MⅡ卵数、卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率均无统计学差异(P>0.05);年龄≥35岁的生长激素组和对照组,两组间的卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率也均无统计学差异(P>0.05),但GH组获卵数(P=0.001)及MⅡ卵数(P=0.013)明显高于对照组,有显著统计学差异。
  结论:
  1、添加生长激素对卵巢低反应患者IVF-ET的临床妊娠率没有影响,但能显著提高≥35岁患者HCG日E2水平、获卵数及MⅡ卵数;
  2、高龄卵巢低反应患者IVF-ET促排卵方案中添加生长激素可能对患者受益更大。
[硕士论文] 单一波
外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:气管病变可由外伤、肿瘤、气管软化等原因引起,切除病变气管并行端-端吻合被普遍认为是最有效的手术方式。当气管环切长度超过成人总长的1/2或婴幼儿的1/3时,由于张力等原因需行气管替代治疗。组织工程将种子细胞、支架材料和细胞因子有效结合,从而修复相关组织缺损,进行器官重建。3D打印技术仿生制造的器官、组织具有较好的生物力学特性和细胞相容性,弥补了传统组织工程的缺点与不足。随着对可吸收生物材料的研究深入,其开发应用已成为当前组织工程和生物医用材料的研究重点。近年来,聚已内酯(PCL)材料在3D打印气管中备受瞩目。但PCL表面疏水性极大地影响了细胞与材料的相互作用,进而影响细胞在材料表面的粘附、增殖等行为。表面修饰可以在不影响材料原有性能的同时,提高表面亲细胞性。材料的多孔结构可以为种子细胞提供更好的营养输送,加强细胞间的交流,进而提高种子细胞的存活率。本研究旨在通过3D打印技术制备PCL多孔气管支架,评价其生物力学性能;遴选适宜的孔径大小及表面修饰方法,探讨其对细胞粘附、增殖行为的影响;通过体内埋植实验,评估所构建材料的生物相容性及免疫排斥反应,从而为体内气管移植寻求更合适的支架材料。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 3D打印气管的制备及生物力学性能检测
  目的:
  利用3D打印技术制备PCL多孔气管支架并评价其生物力学性能。
  方法;
  1.利用3D打印技术制备PCL多孔气管支架;
  2.采用纵向拉伸、径向压缩和三点弯曲试验评价PCL气管的生物力学性能。
  结果:
  1.3D打印PCL气管支架具有与兔新鲜气管相似的形态结构;
  2.3D打印PCL气管支架的生物力学性能明显优于新鲜气管,且与孔径大小成反比。
  结论:
  1.3D打印技术可成功制备PCL多孔气管支架;
  2.3D打印PCL气管支架具有良好的生物力学性能。
  第二部分 3D打印气管的孔径大小遴选与表面修饰
  目的:
  遴选3D打印气管适宜的孔径大小和表面修饰方法。
  方法:
  1.通过水解、胺化和纳米二氧化硅修饰对支架材料进行表面改性;
  2.通过能谱分析、电镜扫描等物理性能测定评价其表面修饰效果;
  3.通过CCK-8检测不同孔径和修饰方法对细胞粘附、增殖行为的影响;
  4.通过电镜扫描观察细胞与支架共培养的微观结构。
  结果:
  1.气管支架孔径大小为200μm更适合细胞的粘附与增殖;
  2.与水解、氨化的修饰方法相比,纳米二氧化硅修饰后的支架表面更加光滑,修饰效果更佳;
  3.纳米二氧化硅修饰后气管支架的亲细胞性明显改善,更利于细胞粘附与增殖。
  结论:
  1.3D打印PCL多孔气管支架管壁适宜孔径大小为200μm;
  2.纳米二氧化硅修饰为适宜的表面修饰方法。
  第三部分 3D打印气管的生物相容性与免疫排斥反应评价
  目的:
  评价孔径为200μm的3D打印气管经纳米二氧化硅修饰后的生物相容性及免疫排斥反应。
  方法:
  1.体外细胞毒性试验检测修饰后3D打印气管的生物相容性;
  2.动态监测受体体内血常规和血清免疫球蛋白的变化;
  3.对埋植物行组织学分析;
  4.免疫组织化学染色检测埋植物CD68及MHC-Ⅰ、Ⅱ抗体的表达量。
  结果:
  1.体外细胞毒性试验显示,修饰后的气管支架周围BMSCs生长良好,具有良好的生物相容性;
  2.实验动物的白细胞在术后一周左右达到高峰,随后消退;IgM峰值出现早于IgG,符合体液免疫应答抗体产生的规律;
  3.新鲜气管埋植术后30d的HE染色显示,软骨基质结构扭曲、紊乱,软骨陷凹内空虚,外壁可见大量深染的炎细胞浸润,而内壁可见致密排列的纤维,有出血坏死及炎症细胞;而PCL多孔气管支架在30d时炎症反应较15d时明显消退,肉芽组织内纤维排列较前疏松,有核细胞数量显著减少;
  4.新鲜气管埋植术后30d的免疫组化染色显示,新鲜组气管基质折叠断裂,软骨陷凹内的细胞核消失,管腔内侧炎症细胞数量较前增多,局部有出血坏死表现;管腔的结缔组织外侧也可见CD68及MHC-Ⅰ、Ⅱ抗原表达阳性的细胞分布,细胞膜呈棕色;术后30d,PCL多孔气管支架以排列规则的梭形细胞核为主,阳性细胞数较15d时显著减少,肉芽组织内可见新生血管形成,血管内皮细胞核呈类圆形排列。
  结论:
  孔径为200μm的3D打印气管经纳米二氧化硅修饰后具有良好的生物相容性和低免疫原性。
[硕士论文] 单彩龙
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)都属于奈瑟氏菌科细菌,均已成为严重的全球公共卫生问题。鲍曼不动杆菌常引起肺炎、菌血症、脑膜炎、伤口感染等疾病,死亡率高。淋病奈瑟菌感染引起的淋病是全球第二大性传播疾病,可导致不孕不育等严重后果。两种病原菌耐药形势日趋严峻,由于耐药问题导致治疗失败的病例不断有报道。
  细菌获得耐药性可能导致其毒力发生改变,鲍曼不动杆菌耐药株往往形成生物膜的能力更强,但也有相反结论的报道,其他毒力与耐药性之间的相关性未见报道。本研究第一部分旨在研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力之间的相关性,为有效防治耐药鲍曼不动杆菌引起的感染提供有效依据。
  细菌中存在大量非编码RNA(sRNA),sRNA参与调控细菌耐药性的作用已被广泛证明,但淋病奈瑟菌中尚未有调控耐药性sRNA的相关报道。本研究第二部分旨在发现淋病奈瑟菌中调控头孢曲松耐药性的sRNA,为解决其耐药性问题提供一个新的思路。
  一、鲍曼不动杆菌耐药性与毒力相关性研究
  为研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的相关性,对课题组收集的36株临床分离株进行16S rRNA基因鉴定,确认为鲍曼不动杆菌的菌株用纸片扩散法和微量液体稀释法检测其对9类21种抗生素的耐药性;为检测血清抗性,用10%菌液与90%正常人血清(热灭活人血清作对照)混匀后置于37℃培养箱中共孵育1-3h后检测存活细菌数(CFU),当实验组CFU小于对照组CFU且存在显著统计学差异时认为该菌株血清抗性弱,无显著差异的为强血清抗性菌株;粘附试验中以感染复数(MOI)为100将菌液与人肺上皮细胞混匀后置于37℃培养箱中孵育1h,用PBS洗去未粘附在细胞表面的细菌,裂解细胞后通过细菌计数检测粘附于细胞的细菌数,计算得到粘附于每个细胞的细菌数表示该菌株的粘附能力;菌株体内毒力检测时用气管插管法构建小鼠肺炎模型,选择5株耐药性不同的菌株进行感染,统计小鼠7天内死亡率。统计学分析鲍曼不动杆菌耐药性与上述3种毒力的相关性。结果显示,36株细菌中的34株为鲍曼不动杆菌,其中多重耐药株和广泛耐药株比例高达97.06%;血清抗性检测发现26株强血清抗性菌,9株弱血清抗性菌,耐药株具有更强的血清抗性;鲍曼不动杆菌耐药株粘附A549细胞的能力相对非耐药株更强;小鼠感染广泛耐药鲍曼不动杆菌7天内死亡率更高。上述结果提示鲍曼不动杆菌耐药形势非常严峻,耐药株具有更强的毒力,耐药性与毒力之间呈正相关。
  二、淋病奈瑟菌头孢曲松耐药相关sRNA筛查
  为筛选淋病奈瑟菌WHO-A株中调控头孢曲松耐药性的sRNA,首先提取WHO-A株总RNA进行转录组测序,然后通过梯度剂量诱导淋病奈瑟菌头孢曲松耐药株,生物信息学方法筛选并荧光定量PCR验证候选sRNA表达水平,反转录PCR验证耐药相关sRNA在淋病奈瑟菌临床分离株中的分布。结果显示经诱导WHO-A株产生MIC=1μg/ml的耐药变异株,野生型WHO-A株存在1051条sRNAs,其中80条与penA、porB、mtrR等8个耐药相关基因间存在互补关系,检测发现10条表达水平随耐药性增高而降低的sRNAs,并且其中6条sRNAs在3株淋病奈瑟菌临床分离株中检测到转录产物。提示部分sRNAs参与淋病奈瑟菌头孢曲松耐药性调控,并广泛分布于淋病奈瑟菌中。
[硕士论文] 孔苏伟
遗传学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,Li)作为李斯特菌属中唯一致病的两个种深受研究者的关注,其中Li主要感染羊、牛等反刍动物,极少引起人类的感染和发病;而Lm除感染动物外还能感染人类,引起人侵袭性和胃肠炎性李斯特菌病。Lm是兼性胞内寄生的病原体,能侵袭宿主的多种细胞(包括吞噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等)进行增殖,并扩散到毗邻的细胞中。Lm能够突破宿主的三道屏障(胃肠道、胎盘和血脑屏障),引起的李斯特菌病致死率约为20-30%。虽然目前已经发现70多种毒力因子参与该病原菌的粘附、侵入和胞内增殖,但其与宿主互作与致病的分子机制尚未完全阐明,有待通过高通量的组学技术进行深入研究。
  本研究在前期对强毒株Lm XYSN全基因组测序的基础上,对Lm XYSN中新发现的伊氏李斯特菌来源的基因smcL及其功能进行研究,并初步探讨了其表达产物与李斯特菌溶血素O(listeriolysion O,LLO)之间的关系;此外,还利用动物模型从Lm XYSN的转座子突变文库中筛选出与Lm XYSN的高致病力相关的新毒力因子。Lm XYSN中的毒力相关基因的挖掘及功能解析,有助于揭示该菌株高毒力的分子致病机制,为李斯特菌病的预防和控制提供科学的依据。
  1、自然重组单核细胞增生李斯特菌中smcL基因的功能研究
  将Lm XYSN smcL的基因序列与数据库进行比对,发现smcL的基因和与Li来源的基因序列同源性为97%,而迄今为止未见Lm中携带smcL基因的报道,因此这是首次在Lm中发现smcL基因。smcL基因编码的鞘磷脂酶C(SmcL)能特异性地作用于鞘磷脂,且具有一定的溶血活性,为Li的重要毒力因子,由此提示,SmcL蛋白的表达很可能在增强Lm XYSN毒力中发挥重要作用。
  为了深入研究Li来源的smcL基因的功能,成功构建了Lm XYSNΔhly、Lm XYSNΔsmcL、Lm XYSNΔhly-ΔsmcL缺失突变株,以及能表达SmcL蛋白的Lm EGDe∷pIMK2-smcL和Lm NTSN∷pIMK2-smcL菌株。与马红球菌(Rhodococcus equi,R.equi)的协同溶血试验表明,只有当Lm中smcL基因得到表达时,才会与R.equi形成铲形的溶血现象。通过测定突变株和重组菌株的溶血效价,发现smcL基因的缺失会导致LmXYSN溶血能力下降2倍,而其在Lm EGDe中的表达,则使重组菌株的溶血能力提高了4倍,提示smcL基因显著增强了Lm XYSN的溶血能力,很有可能有利于其在体内的感染和致病。对结肠腺癌上皮细胞系Caco-2BBE进行的体外感染试验显示,smcL基因能显著提高Lm对该细胞系的粘附、侵袭和增殖能力。接下来以口服感染动物模型对smcL基因的功能进行了体内实验,结果表明,在感染72h以后,smcL和hly基因双缺失的突变株与hly基因单缺失的菌株相比,其在肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。非常重要的是,smcL基因在NTSN中的重组表达显著增强了其在回肠和肠系膜淋巴结中的定殖能力(P<0.01,P<0.001)。总之,以上结果证明smcL基因作为Lm的独有基因,对其宿主体内的生存和内脏组织中的定殖中发挥重要作用,因此该基因是XYSN毒力增强的关键毒力因子之一。
  2、基于转座突变文库技术筛选的李斯特菌新毒力基因LMxysn_0620的功能研究
  以BALB/c小鼠口服感染动物模型,筛选Lm XYSN的转座子突变文库。从突变文库中随机挑取500个突变菌株进行口服感染实验,最后获得13株毒力下降100倍以上的突变株。通过反向PCR和基因测序后的比对分析,发现7株突变株的转座子插入位点基因与细胞生长代谢相关(xysn_1358、ysn_1979、xysn_2165、ysn_2795、ysn_1812、ysn_2865、xysn_2030),3个基因分别与DNA的转录(xysn_0972)、蛋白质的修饰(xysn_1491、xysn_1284)相关,还有2个基因的功能是未知的(xysn_2490、xysn_0620)。利用小鼠口服感染突变株来测定LD50,xysn_0620∷Tn的毒力(LD50=107.85CFU)比Lm XYSN(LD50=105.08CFU)降低了588倍,表明xysn_0620参与Lm XYSN感染小鼠的过程。
  构建xysn_0620基因的缺失突变株Lm XYSNΔ0620,对Lm XYSNΔ0620在不同培养条件下的生长能力进行测定,结果发现缺失突变株与亲本株在BHI培养基和在含有1%Triton的BHI培养基中的生长速率并无差异。在不同培养时间和温度下,对缺失株和野生株的生物被膜形成能力进行测定,结果表明,Lm XYSNΔ0620在42℃形成生物被膜的能力均显著下降(P<0.05,P<0.01)。药敏试验发现xysn_0620基因缺失使细菌对克林霉素(Clindamycin,DA)的抗性由耐受变为中度敏感。以上结果提示,具有跨膜结构的xysn_0620基因编码产物可能为Lm XYSN的细胞结构成分。此外,体外细胞感染实验发现,xysn_0620基因的缺失会引起Lm XYSN对Caco-2BBE细胞黏附、侵袭、增殖的能力均显著性降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。最后对Lm XYSNΔ0620缺失株在体内的感染动态进行测定,发现Lm XYSNΔ0620在小鼠脾脏中定殖的时间晚于野生菌株,在感染后的48h和72h,在脾脏中的定殖能力(P<0.01,P<0.001)和肝脏中的定殖能力(P<0.05,P<0.001)显著弱于野生菌株,提示其在脾脏和肝脏中的定殖能力显著弱于野生菌株。总之,XYSN_0620作为一跨膜蛋白,在Lm抗胁迫应答及对宿主内的侵袭、定植等致病过程中发挥着极其重要的作用。
[硕士论文] 强斌
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:在世界范围内,由肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,S.Enteritidis)导致的沙门菌病是一种重要的食源性传染病。肠炎沙门菌能够导致禽类的发病及死亡,在感染种鸡后,常表现为隐性带菌而不发病,该菌能够感染人类和其他多种动物,是一种重要且危害严重的人兽共患病原菌。抗菌药物的使用是防治肠炎沙门菌感染的重要手段之一,而肠炎沙门菌耐药性的产生和传播则极大地制约了抗菌药物的使用效果。耐药基因的产生和传播是肠炎沙门菌耐药性的重要分子机制之一,高通量测序技术的发展和突破为研究耐药性的分子机制提供了极大的便利。本研究通过对190株肠炎沙门菌的全基因组重测序研究,探讨高通量测序技术在肠炎沙门菌耐药性研究中的应用,分析我国肠炎沙门菌的分子耐药机制和演化规律。
  一、肠炎沙门菌的生物辨识
  利用生物信息学技术对190株分离菌株的全基因组测序raw reads进行质量控制与拼接,得到组装长序列,将最终assembly文件作为全基因组数据材料进行后续分析。首先使用MicrobeTrakr在线工具鉴定种属,190株测序菌株均为沙门菌属。然后使用sistr_cmd软件鉴定测序菌株血清型,均为肠炎沙门菌。最后使用PubMLST工具鉴定其ST型,除SAL0000131和SAL0000132两株为新型以外,其余均为ST11,符合肠炎沙门菌的ST型特征,而SAL0000131和SAL0000132的aroC基因的突变是导致该两株菌株表现为新ST型的原因。
  二、肠炎沙门菌的耐药基因与耐药性
  对190株肠炎沙门菌进行耐药表型测定,肠炎沙门菌对NAL的耐药率最高,为83.7%,对AMP和AMC的耐药性分别达到62.6%和62.1%,对CFZ(41.6%)、STR(45.8%)、SXT(29.5%)和TET(21.6%)的耐药菌株也较多,其他药物的耐药菌株数量较少,AMK甚至没有任何菌株表现为耐药。在不同宿主中,43株人源肠炎沙门菌不仅有非常宽的耐药谱,其耐药水平也相当高,整体耐药情况最复杂,多重耐药率达到65.1%,且多重耐药菌株的耐药谱非常宽,其中NAL耐药率最高,达到81.4%;对AMP、AMC和CFZ的耐药率均超过50%,分别达到62.8%、65.1%和53.5%;对ATM和STR的耐药率较高,分别达到23.3%和37.2%;对KAN、GEN、TET、SXT、CHL和OLA的耐药率较低,分别达到16.3%、16.3%、16.3%、11.6%、11.6%和9.3%;CIP和ENR的耐药率仅有2.3%和4.7%;对MEM、AMK和NIT无耐药菌株。鸡源肠炎沙门菌耐药谱较宽,耐药率较高,耐药水平较高,整体耐药情况较为复杂,其中NAL耐药率最高,为94.3%,MIC50达到512μg/ml;其次为AMP、AMC、CFZ和STR,耐药率分别达到69.9%、68.3%、42.3%和52.0%;SXT和TET的耐药率较高,分别为31.7%和25.6%;其余药物的耐药率则较低,均不超过10%;AMK没有任何耐药菌株。其余宿主肠炎沙门菌数量较少,其耐药率远低于人源与鸡源肠炎沙门菌。
  使用blast软件将组装序列与ResFinder数据库比对,共检测到50种耐药相关基因,分别为aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(6')Ⅰb-cr、aac(3)-Ⅰva、aac(3)-Ⅱd、aph(3')-Ⅱa、aph(3')-Ⅰa、aph(3')-Ⅰc、aph(4)-Ⅰa、aph(3)-Ⅰva、arr-3、blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaOXA-1、blaNDM-5、blaMIR-2、blaMIr-6、blaCMY-2、catA1、catB、catB3、cmlA1、dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27、ermB、fosA、floR、lnuF、mEFB、mphA、oqxA、oqxB、qnrA7、strA、strB、sul2、sul1、sul3、tetA、tetB和tetC。去除相似度低于80%和覆盖度低于70%的基因,得到与表型试验相关的耐药基因共计35种,分别为β-内酰胺类耐药相关基因7种(blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaOXA-1和blaCMY-2),氨基糖苷类耐药相关基因13种(strA、strB、aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(3)-Ⅱd、aph(3')-Ⅱa、aph(3')-Ⅰa、aph(4)-Ⅰa、aph(3)-Ⅰva和aac(6')Ⅰb-cr),喹诺酮类耐药相关基因3种(qnrA7、oqxA、oqxB),四环素类耐药相关基因2种(tetA和tetC),磺胺类耐药相关基因3种(sul1、sul2和sul3),三甲氧苄二氨嘧啶类相关耐药基因3种(dfrA1、dfrA17和dfrA27)以及酰胺醇类耐药相关基因4种(catB3、catB、floR和cmlA1)。基因型与表型对应关系良好,blaTEM-1基因与青霉素类药物AMP和AMC的对应率达到96.1%和95.1%,strA基因和strB基因与氨基糖苷类药物STR的对应率达到90.9%,tetA基因与四环素类药物四环素对应率达到82.9%,dfrA17基因与磺胺类药物复方新诺明的对应率达到88.9%,catB3、catB、floR和cmlA1与酰胺醇类药物CHL对应性达到了100%,均表现出优良的对应性,但仍然存在表型与基因型不对应的情况,说明仍然有未知的耐药机制在发挥作用。
  基因的点突变研究显示,基因点突变确实能够影响耐药表型。blaTEM-1基因的A120C突变在6株肠炎沙门菌中被检测到,该6株菌株中的5株表现出头孢唑林的高耐药表型(MIC≥512μg/ml)。strA中检测到2种非共有点突变(C295T和G445C),未发现其对表型存在显著影响。strB检测到11种非共有点突变(A139G、T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C、G364C、T535G、G592T和G574T),其中T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C和G364C在基因序列上的位置相当接近。tetA基因中共检测到10中非共有点突变,其中发生A124G突变的YZU0232和YZU0266的四环素耐药表型均为不耐药,该突变可能对tetA基因功能有减弱作用,发生G250A(SAL0000212和YZU0228)和G277A(YZU0254)的菌株表现出的MIC水平达到耐药突破点的8倍,该两种点突变可能对耐药性有提高作用。喹诺酮类药物的耐药性产生与QRDR的点突变具有关联,并且由于各基因之间、各点突变之间的相互配合导致不同的耐药表型和水平。
  在质粒检测分析中发现IncX1型质粒携带有众多耐药基因,可能与肠炎沙门菌的耐药流行有密切关联。对不同质粒所携带的耐药基因进行检测,我们发现95个IncX1型质粒携带了77个strA基因中的76个、77个strB基因中的76个、77个sul2基因中的76个、35个tetA基因中的31个和103个blaTEM-1基因中的95个,IncX1型质粒主要携带的基因为strA、strB、sul2、tetA和blaTEM-1,与氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和β-内酰胺类抗生素的耐药性相关,而其余质粒均不携带耐药基因,显示IncX1型是肠炎沙门菌耐药基因流行的关键性可移动元件。
  三、肠炎沙门菌的进化与耐药性研究
  使用Parsnp软件对190株肠炎沙门菌作核心基因组进化树,并与背景信息对应分析。MIC表型、耐药基因型和质粒分型在进化关系上呈现出明显的谱系差异,核心基因组进化树的构建所产生的不同分支能够与耐药相关背景信息较为准确清晰的对应。使用Parsnp软件对国内外共计208株肠炎沙门菌进行核心基因组进化树构建,结果显示国内菌株与美国、加拿大、韩国、莫斯科、丹麦和巴西的菌株在进化树上可以明显区分,国外菌株处于独立分支且能够按照宿主和年代来源形成较为明确的谱系。国内肠炎沙门菌的流行则由两部分组成,其一为国内流行的肠炎沙门菌,其二可能是来自于美国和加拿大等北美国家的肠炎沙门菌。根据国内外菌株的进化关系对比分析,国内肠炎沙门菌的进化结构比国外菌株更为复杂,国内各宿主、地区的肠炎沙门菌在进化关系上非常接近,而非国外菌株所表现出的不同谱系,可能意味着国内肠炎沙门菌的流行范围更大,宿主间的菌株交流更频繁。基于全基因组重测序的进化分析在一定程度上能够对肠炎沙门菌耐药性作出预测和指导。
[硕士论文] 周明娟
通信与信息系统 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:表面肌电信号(sEMG)发源于脊髓中的运动神经元,是一种常见的生物电信号,也是产生肌肉力的电信号根源,它可以通过表面电极的引导来获得,反映了神经肌肉的功能状态,蕴含了有关肌肉活动的各种信息,因此它的检测及分析对神经肌肉诊断、运动医学等方面都具有重要意义。本文旨在研究设计一整套具有良好抗噪声性能的表面肌电信号采集装置,并通过实验测试其可靠性和有效性。
  (1)对肌电信号的产生机理、数学模型等进行了阐述,为后续采集装置的研究和设计奠定了理论基础。
  (2)在了解表面肌电信号自身特征的基础上,充分考虑采集过程中可能面临的各种噪声干扰,针对以上问题,确定采集装置的设计方案。包括采集信号检测部分、前置信号放大部分、带通滤波部分、工频陷波部分、信号二级放大部分和显示终端。本论文所设计的装置采用低阻抗差分电极形式,从源头上降低了信号的损耗,抑制了共模干扰。对信号的放大采用分级放大方案,一方面降低了对芯片、元件的性能要求,节约成本,另一方面也有助于防止在信号被滤波前内含的直流分量被过分放大造成微弱的肌电信号被淹没,同时也便于放大增益的灵活调节。此外,采用10阶Sallen-Key带通滤波器,阻带衰减速度极快,能够对环境噪声以及其它干扰信号有很强的衰减能力。实验结果表明,所设计的采集装置,具有较好的抗干扰性能,采集效果显著。
  (3)设计表面肌电信号采集实验。通过物理运动、理疗仪刺激及直流电刺激三种方式进行表面肌电信号的采集,在时域分析的基础上,运用MATLAB对信号进行频域分析,并加以结果比对,以验证所设计装置的可靠性和有效性。
[硕士论文] 王航
动物学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)为革兰氏阳性菌胞内寄生菌,广泛存在于生鲜食品和环境中。单增李斯特菌可穿过肠屏障,通过血流传播并到达肝脏,脾脏,中枢神经系统和胎儿,最终引起人败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎及孕妇流产,死亡率可达30%,是最严重的人类食源性感染之一。单增李斯特菌在感染过程中,需要表达多种毒力蛋白来完成对宿主细胞的感染。单增李斯特菌将毒力因子分泌到胞外,需要不同的分泌系统参与,目前已知主要是Sec分泌系统和Tat分泌系统承担分泌功能,而鞭毛分泌系统是否也参与了特殊因子的分泌目前还未有报道。因此,本研究主要阐明了:1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的体外酶学功能及其在细菌感染过程中的生物学作用。2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能。
  1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的酶学特征与参与细菌感染
  我们通过生物信息学分析预测Lmo1711属于氨基肽酶M29家族,氨基肽酶Ⅱ型,可以水解氨基酸N端残基对蛋白进行修饰。酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大。在单肽对硝基苯胺底物中,Lmo1711与亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)、精氨酸对硝基苯胺(Arg-pNA)和赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)反应对应的Kcat/Km分别为3.149×105min-1M-1、1.536×105min-1M-1和1.035×104min-1M-1,由此可见Lmo1711对Leu-pNA的催化效率最高,即对亮氨酸残基的亲和程度最高;对多肽对硝基苯胺切割能力较弱。Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co2+、Cd2+、Zn2+等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co2+的激活效应最显著。酶学分析表明,Lmo1711保守的关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380)决定了Lmo1711的催化活性。生物学功能研究发现,缺失lmo1711后细菌生长能力不受影响,但缺失株感染Caco-2细胞后其侵袭和增殖能力显著低于野生株。此外,缺失该基因后细菌在L929细胞中的迁移能力亦显著降低。本研究首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性,并且在一定程度上参与了细菌在细胞中的感染。
  2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB生物学功能研究
  本研究发现单增李斯特菌鞭毛结构蛋白FlhB(由lmo0679基因编码)参与了细菌的鞭毛合成与运动。缺失flhB后李斯特菌不形成鞭毛,运动能力完全丧失,并导致motA、flaA、fliN、fliI、fliK、flgC等多种鞭毛相关基因的转录水平和FliM、FliY和FlaA等鞭毛蛋白的表达水平降低。基于细菌鞭毛与Ⅲ型分泌系统的亲缘性,本研究以单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB为主要研究对象,进一步探索了李斯特菌鞭毛结构与蛋白分泌功能之间的关联。我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)方法分别对flhB和fliS的基因缺失株中分泌蛋白进行了差异蛋白质谱分析。iTRAQ结果显示,李斯特菌缺失flhB和fliS后大量的鞭毛与非鞭毛相关蛋白分泌量下降。具体来看,在37℃条件下,缺失flhB后有38种蛋白分泌量上调,39种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有25种蛋白分泌量上调,25种蛋白分泌量下调。在30℃条件下,缺失flhB后有29种蛋白分泌量上调,62种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有23种蛋白分泌量上调,57种蛋白分泌量下调。可以看出,在30℃条件下,flhB和fliS缺失后下调的蛋白数量明显多于在37℃。COG(Cluster of orthologous group)功能分类显示,这些差异蛋白主要参与翻译,核糖体结构与生物发生以及糖转运与代谢等过程;GO(Gene ontology)分析鉴定发现,差异蛋白主要是细胞组分(27.74%),巨分子复合物(12.19%)和细胞器(12.01%)。经过查询Uniprot等蛋白信息网站与相关文献,我们从中选取了鞭毛钩调节蛋白FliK、鞭毛丝组件蛋白FlaA和细胞分裂调控蛋白DivIVA等李斯特菌中报道较少的蛋白进行Western blot验证。WB结果显示,在30℃条件下,flhB缺失后,DivIVA,FliK和FlaA分泌量显著下降;fliS缺失后FliK和FlaA分泌量显著下降。其中DivIVA与细菌的分裂增殖相关。本研究首次发现并证实单增李斯特菌FlhB参与了细菌运动,鞭毛合成,鞭毛与非鞭毛蛋白分泌等过程,为进一步探索单增李斯特的非经典分泌机制与致病机制提供了初步试验基础。
  综上,本研究:(1)首次探索并证实了单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711属于金属离子依赖的M29氨基肽酶家族成员,并参与了细菌在细胞中的感染和迁移,与细菌毒力相关。研究结果对于深入完善和挖掘李斯特菌新的毒力因子及致病机制具有重要意义。(2)首次探索了单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能和介导的分泌作用,为后续进一步研究革兰氏阳性菌鞭毛T3SS及新的分泌型蛋白的生物学功能奠定了关键基础。
[硕士论文] 杜志锋
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:对于成年女性而言,其生育力随年龄增长而下降。其中卵巢衰老,包括卵泡在数量上的减少和功能上的衰退等,成为生育力下降的重要原因。挽救衰老的卵巢,是提高女性生殖力的一个重要策略。藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,PC)是一种具有抗氧化、抗炎症、增强免疫力的钝顶螺旋藻类蛋白质,在医学和生物领域具有广泛应用价值。
  我们的前期研究利用D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)致衰小鼠模型,表明PC可通过抑制活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)途径改善致衰小鼠卵巢功能;进一步又通过转录组测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq)技术筛选到致衰组和致衰改善组差异表达基因提高生殖力的富集通路。但在自然衰老小鼠模型中,PC能否改善雌性生殖力,以及PC的作用功效和机制尚未得知。
  本研究取6周龄小鼠为年轻组(Young),8.5月龄小鼠为自然衰老组(Aged),灌胃PC的8.5月龄小鼠为处理组(Aged+PC),小鼠品系均为ICR。经45天灌胃处理后,利用RNA-Seq技术,分析卵巢在转录组水平表达变化,得到以下结论:
  (1)高通量二代测序获得Young组、Aged组、Aged+PC组三组卵巢转录组的数据,数据过滤后总共得到约58.14G数据量,平均有92.85%比对到基因组上,9个样品Q30指数均在93.20%以上,说明测序质量高,后续分析结果可靠。
  (2)构建了自然衰老小鼠卵巢表达谱,鉴定了597个差异基因,其中上调基因数为252,下调基因数为345。根据GO分析,差异表达基因在生物学过程中主要富集在循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答、补体激活经典通路、B细胞介导的免疫等;在细胞组分中主要富集在血液微粒、免疫球蛋白复合物循环、染色体浓缩运动等;在分子功能中主要富集在抗原结合、免疫球蛋白受体结合等方面。根据KEGG分析,差异表达基因在细胞周期、细胞粘附分子方面发生显著富集。
  (3)同Aged组相比,Young组与Aged+PC组鉴定了13个共同差异表达基因,根据GO分析,共同差异表达基因在生物学过程中主要富集在细胞对干扰素-β的反应、细胞因子应答、先天免疫应答、对原生动物的防御反应等;在细胞组分中主要富集在液泡膜共生体、宿主细胞质、宿主细胞内部分等方面。
  (4)基于Young组与Aged组差异表达基因,并结合RT-qPCR结果表明,在Aged+PC组中,Aurka、Gdf9、Mest、Rad5等基因出现上调,其中Gdf9和Rad51为显著上调;另外Cd74、Cxcl10、Nlrc5、Zbp1等基因出现显著下调,这与RNA-Seq结果相符。上调基因涉及卵母细胞微管形成、卵泡发育、促进生长、DNA修复等过程,下调基因涉及到炎症反应、低甲基化参与的衰老调控等作用。推测灌胃PC有助于提高卵巢功能,延缓衰老,为PC抵抗卵巢衰老、提高生殖力提供理论依据。
[硕士论文] 郭叔瑾
软件工程 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着医院开始重视医疗信息化,以及国家对全民医保的重视和投入,来医院就诊的病人逐渐增加,产生的医疗数据越来越多。此外,由于医院购置了各种大型的高科技医疗设施,当广泛的将其投入使用时也会产生海量的医疗数据。针对海量的医疗数据,如何把数据中潜在的、有价值的信息挖掘出来,如何通过数据挖掘的方法了解某种疾病发生的危险性因素,提前预防或提前就诊来降低发病率已经成为一个问题。目前,国内外的研究者针对医疗数据挖掘的研究已经取得了一些进展,但是目前的研究主要集中在对随机森林、神经网络、支持向量机等传统分类算法的改进及使用上,虽然分类准确度较高,但是并不能发现一些影响疾病发生的特征。而关联分类算法可以挖掘出和某种疾病相关的特征,它是数据挖掘领域中主要的研究课题之一。
  专家系统对医学应用中提取可以提供结果解释的if-then规则很感兴趣。为了有效地从数据中挖掘知识,提出了各种规则归纳算法,它们可以结合分类方法,形成以规则为基础的分类算法。然而,大多数以规则为基础的分类算法不能直接处理数值型数据。而离散化数据预处理可以将数值型数据转变成分类格式。但是现有的离散化算法没有考虑到数据集中数值变量的分布,这可能会降低以规则为基础的分类器的性能。针对现有离散化算法不能保持原始数据的分布这一问题,本文提出了一种基于高斯混合模型的离散化算法(Discretization Algorithm based on Gaussian Mixture Mode,DAGMM),该算法通过考虑数值变量的分布以保留原始数据的最频繁模式。DAGMM算法的有效性是使用四个公开可用的医疗数据集进行验证的。根据实验结果,在产生的规则数和关联分类算法的分类准确度方面,DAGMM算法优于其它六个静态离散化方法。因此,在临床专家系统中运用DAGMM算法,可以提高以规则为基础的分类器的性能。
  由于许多学者利用关联分类技术来准确地帮助医师预测乳腺癌疾病,并且应用关联规则可以加强分类过程。所以接下来将DAGMM算法和常见的关联分类算法结合,用于对乳腺癌疾病的分类和预测。然而,大多数关联分类算法都受到规则评估过程中使用的估计方法以及属性级别使用的优先级技术的影响。在本文中,提出了一个基于统计调和平均值的特征加权关联分类算法(Feature Weight Association Classification algorithmbased on based on statistical harmonic mean,FWAC)。通过统计测量技术进行剪枝,生成更准确的关联规则,以提高关联分类器的准确度。将FWAC与五个著名的关联分类算法在UCI机器学习数据库中的两个乳腺癌数据集上进行比较。实验结果显示,在大多数情况下,FWAC在本案例研究中优于其他关联分类算法。此外,FWAC生成的规则更准确。本文的研究成果对于乳腺癌的预防和诊断具有很好的作用。
[硕士论文] 刘帆
中药药理学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  基于UPLC/Q-TOF-MS,探讨慢性睡眠剥夺不同时间对大鼠脑脊液中内源性代谢产物的变化并寻找睡眠因子。
  方法:
  1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
  取实验动物SD雄性大鼠48只,在实验条件下饲养一周,以适应环境,期间自由饮水和获取食物。一周后将大鼠随机分为6组,分批次置于睡眠剥夺仪,每次8只,分别进行睡眠剥夺1、3、5、7、9天,期间自由饮水和获取食物,睡眠剥夺仪速度设置为5m/分钟,运动5秒,暂停5秒。空白对照组的实验动物在睡眠剥夺仪上饲养,速度设置为0m/分钟,自由饮水和获取食物。
  2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  于慢性睡眠剥夺后,为避免睡眠剥夺的消退,立即腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,用脑立体定位仪固定,头部剪毛,消毒,并于腹下垫恒温垫。参考大鼠脑立体定位图谱,以枕骨嵴下3毫米处的肌肉间隙处为进针点。进针角度与身体平行,针坡面向上缓慢向前进针到小脑延髓池,深度约为0.5厘米。缓慢抽取约80微升脑脊液,后迅速退针,将脑脊液移入EP管中,放入液氮中速冻后移入-80℃中保存。待所有样品采集完毕,集中将脑脊液进行处理,利用UPLC/Q-TOF-MS进行分析。筛选出内源性代谢产物并探究其变化趋势。
  结果:
  1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
  本课题睡眠剥夺的原理是利用实验动物所站立的平台的随机移动而使实验动物无法进入睡眠,减少了水环境睡眠剥夺或电刺激睡眠剥夺给实验动物造成的伤害。运行和休息时间可以循环进行,达到了慢性睡眠剥夺的目的,很好地模拟了人的睡眠不足状态,成功地完成了慢性睡眠剥夺动物模型的复制。
  2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  2.1正离子模式下,基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品集中在第四象限,慢性睡眠剥夺3天、5天、7天的样品集中在第一象限,慢性睡眠剥夺9天的样品离散在第一象限与其他各组在主成分1上存在明显差异。经过交叉验证,在经过标签打乱后累积R2Y由0.77下降到0.51,累积Q2由0.56下降到-0.14,模型不存在过拟合现象,模型中分组信息可信,有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
  筛选出的内源性代谢产物有:组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、辛酰左旋肉碱、L-谷氨酰胺、左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、戊酰基左旋肉碱、己左旋肉碱等25种。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中L-蛋氨酸、癸左旋肉碱和L-色氨酸的含量总体呈先升高后降低的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的L-组氨酸、L-谷氨酰胺、丁酰左旋肉碱、十四烷左旋肉碱与磷脂(O-16∶0/0∶0)的含量总体呈升高趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的1-亚油酰甘油磷酸胆碱与戊二酰左旋肉碱的含量变化无显著性趋势,基本保持平稳。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的己烯-左旋肉碱、甲基戊二左旋肉碱、十六烷左旋肉碱、溶血磷脂(16∶0)和溶血磷脂(18∶1)的含量基本呈先降低再升高的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的辛酰左旋肉碱和戊酰基左旋肉碱的含量变化相对平稳,只有第3天左右显著升高,并有显著性差异。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、十一烷左旋肉碱和溶血磷脂(18∶0)的含量变化整体呈先升高再降低而后升高的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中组氨半胱氨酸和L-赖氨酸的含量在睡眠剥夺的前5天均无显著性变化,组氨半胱氨酸在第7天显著降低并在之后快速升高,L-赖氨酸在第7天左右迅速降低。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的己左旋肉碱的含量变化趋势幅度较大,在第1天至第7天急速上升,并在第7天至第9天保持稳定。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的硬脂酰左旋肉碱的含量变化呈下降趋势,在第3天左右有短暂的小幅度升高。
  在正离子模式下筛选出的25个离子中,L-色氨酸、L-组氨酸和组氨半胱氨酸与睡眠有关。
  在有关睡眠的代谢产物中,大鼠脑内组氨半胱氨酸的含量虽有波动但始终上升,猜测其为睡眠因子,组氨半胱氨酸与睡眠的关系,需要通过药效学试验,进一步研究证实。
  2.2负离子模式下,基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品、慢性睡眠剥夺3天和5天的样品与慢性睡眠剥夺7天和9天样品离散开。经过交叉验证,在经过标签打乱后累积R2y由0.74下降到0.58,累积Q2由0.41下降到-0.034,模型不存在过拟合现象,模型中分组信息可信,有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
  筛选出的内源性代谢产物有:柠檬酸、d半乳糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸、琥珀酸、(R)-3-羟基-十六烷酸、磷脂(O-16∶0/2∶0)。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的d半乳糖、L-天冬氨酸和L-谷氨酸盐的含量变化趋势大体均呈先降低,而后升高,再下降的趋势。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的L-丝氨酸、柠檬酸、琥珀酸和磷脂(O-16∶0/2∶0)的含量先升高再降低,在第7天左右最大,而后急速降低。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的L-酪氨酸的含量整体呈下降趋势,差异显著。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的(R)-3-羟基-十六烷酸的含量变化相对平稳,只有第5天左右显著升高。
  在负离子模式下筛选出的9个离子中,L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸与睡眠有关。
  在有关睡眠的代谢产物中,大鼠脑内的L-丝氨酸的含量在睡眠剥夺的前7天始终上升,猜测其为睡眠因子,L-丝氨酸与睡眠的关系,需要通过药效学试验,进一步研究证实。
  结论:
  1.慢性睡眠剥夺会使大鼠脑脊液中的多种内源性代谢产物发生一定变化,且变化趋势不一致。
  2.通过UPLC/Q-TOF-MS检测技术,在正离子模式下,在大鼠脑脊液中检测到25个内源性代谢产物,在负离子模式下,检测到9个内源性代谢产物。
  3.这些代谢产物中,组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸和L-酪氨酸与睡眠有关,其中L-组氨酸和L-丝氨酸随着睡眠剥夺的进行含量升高,猜测其为睡眠因子。
[硕士论文] 肖楠
测试计量技术及仪器 山东科技大学 2018(学位年度)
摘要:心脏病已经成为威胁人类健康的主要疾病之一,人工心脏移植作为一种治疗严重心脏病的重要手段,在医疗方面有重要的作用和地位,然而捐献心脏的人非常少,人工心脏的需求十分迫切,因此,本项研究具有重要的现实意义和学术价值。
  为减小人工心脏体积,简化内部工作机理,提高运行效率,提出了一种新型磁悬浮人工心脏结构。采用空间上分离的悬浮结构和旋转结构,既克服了转子旋转过程存在的摩擦问题,又解决了不同磁场之间的耦合问题。在确定参数的基础上,对内部永磁作用力、电磁悬浮力和电磁转矩进行深入分析,得到数学模型表达式,并采用Maxwell3D实体建模仿真,验证表达式的正确性。
  设计高可靠性的磁悬浮人工心脏控制系统。采用双闭环控制方式,内环调节磁悬浮转子的径向悬浮稳定性,外环调节磁悬浮转子的旋转转矩波动。将各功能电路模块化,将控制器S3C6410里移植BP神经网络算法代码,为实现神经网络自适应控制奠定硬件基础。
  采用2-3-1神经网络细胞结构,根据电磁悬浮控制样本数据,求得6个隐含层权值,3个输出层权值,3个隐含层阀值,1个输出层阈值,共13个神经网络初值参数。建立电磁悬浮仿真模型,分析闭环扰动下阶跃响应特性、权值变化情况,分析外部干扰力、横截面积、静态电流、功率放大器增益、传感器增益,多参数同变等情况下,BP神经网络对悬浮稳定性的影响规律。
  采用2-4-1神经网络细胞结构,根据电磁转矩控制样本数据,求得8个隐含层权值,4个输出层权值,4个隐含层阀值,1个输出层阈值,共17个神经网络初值参数。建立电磁转矩仿真模型,分析闭环扰动下转矩波动情况、权值变化情况,分析外部干扰转矩、尺寸大小、旋转速度、功率放大器增益、传感器增益,多参数同变等情况下,BP神经网络对转矩波动性的影响规律。
[硕士论文] 白宝丽
基础数学 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:传染病流行于世界各地,即使现如今医学科学技术的提高可以很好地预防和控制一些传染病,但情况还不是那么尽人意,仍有部分传染病依然在暴行,所以传染病模型作为经典的数学模型,向来备受广大学者的青睐。影响传染病传播的因素有很多,地域、气候、年龄等的差异都可能引起其传播速度的不同。除此之外,便于分析常忽略的多种随机因素也不可避免地会影响其传播速度,比如温度、湿度、酸碱度、辐射性等。尤其对于维数越高的非线性动力系统,若忽略随机因素,其分析过程不严谨可能受到的影响越大,导致分析结果不利于处理实际问题。在实际中,系统会不可避免地受到内部或外部环境白噪声的影响,而随机激励耗散系统对自然规律的描述更接近实际情况。本文将主要应用随机激励耗散的Hamilton系统理论知识,对受随机激励扰动的高维传染病模型的动力学行为进行研究,并分别通过数值仿真模拟得出受随机激励扰动的传染病模型保持稳定和发生Hopf分岔需满足的条件。本论文的主要内容为:
  1.首先对传染病模型的研究现状和研究目的意义进行了简述,并综述了随机动力系统的研究现状与进展。然后详细阐述了中心流形定理,随机激励耗散的Hamilton系统理论的相关知识。
  2.研究了一个具有三维结构的随机SIR流行病模型的动力学行为,将系统受到的温度、湿度、酸碱度、辐射性等环境噪声的影响用高斯白噪声代替。然后对稳定的SIR流行病模型引入了随机项,建立了具有阶段结构的随机SIR流行病模型的非线性微分方程。应用随机中心流形定理和随机平均法相关定理进行降阶处理,扩散的Markov过程将系统的运动微分方程模型化为Ito方程,利用随机激励耗散的Hamilton理论分析所得系统的动力学行为。最后,选取参数作为分叉参数,对发生分岔的概率和位置进行验证。
  3.为研究一个四维的麻疹传染病模型的随机动力学行为,首先针对受随机因素影响的一个具有部分免疫和潜伏期的麻疹传染病模型引入了随机项,建立一个随机的具有部分免疫和潜伏期的麻疹传染病模型的非线性微分方程。然后,同样应用随机中心流形定理将原系统降维,比三维系统的降维更复杂一些,对其利用极坐标变换进行简化为二维随机微分方程,由随机平均法相关定理处理该二维方程得到相应的Ito随机微分方程。利用随机激励耗散的Hamilton理论分析所得系统的动力学行为。最后对发生分岔的概率和位置进行模拟验证。
[硕士论文] 刘书宏
预防兽医学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:沙门氏菌(Salmonella)是引起食源性疾病的首要因素,被全世界认为是首选控制的食源性致病菌之一。人和动物感染Salmonella后可引起严重的胃肠炎导致食物中毒,感染严重者还能导致其死亡,是危害人类健康的重大隐患,造成了巨大的经济损失。由于Salmonella表型特征并不稳定,因此利用表型分型所能获得的菌株之间韵相关信息并不详尽,无法鉴别生化特性、血清型相同的不同Salmonella菌株。为了能够更好地对Salmonella进行流行病学调查和溯源,更快地应对食品安全的紧急情况,具有高通量、灵敏度高、重复性好、便于推广等优点的分子分型技术将成为必需的技术。本课题利用两种基因分型技术分别对广西地区市售生鲜肉源的Salmonella优势血清型分离株进行基因分型,目的是寻找一种能够对食品污染的Salmonella进行快速溯源的分子技术。同时对近年来广西生鲜肉源Salmonella的喹诺酮类药物的耐药现状进行研究。
  本课题选取实验室保存的2011-2016年从广西部分地区超市及自由市场售卖的生鲜鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉中分离的Salmonella两个优势血清型S.derby和S.agona之71株和21株进行基于肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的分析,并根据分离株的年份、地域及ERIC-PCR基因型选取13个代表菌株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的分析。结果92株Salmonella分离株的ERIC-PCR的指纹图谱均在250bp处得到沙门菌属的特异性扩增条带;71株S.derby指纹图谱的相似系数在0.74~1.00之间,可分为6个基因型,其中Ⅰ和Ⅲ型为优势基因型,分别占了54.93%(39/71)和19.72%(14/71);21株S.agona指纹图谱的相似系数在0.68~1.00之间,可分为6个基因型,其中基因型A(28.57%,6/21)和B(33.33%,7/21)为优势基因型;进一步研究发现,同一市场里不同种类的肉品存在同一Salmonella的污染、同一市场里同种类的肉品存在不同的Salmonella的污染、同一市场里不同采样时间的同种类肉品存在同一Salmonella的污染等情况;MLST基因分型的研究结果表明,7株S.derby均为ST40(19-20-3-20-5-22-22)、6株S.agona均为ST13(3-3-7-4-3-3-7)。
  本课题还对71株S.derby进行包括萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星5种常用喹诺酮类抗生素耐药性研究。首先,通过常规药敏纸片(K-B)法对菌株进行耐药表型的检测,然后对质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)之qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-lb-cr oqxA、oqxB、qepA共7种基因分别进行PCR检测,并对gyrA和parC基因的喹诺酮类耐药决定区进行测序并分析其氨基酸位点突变情况,最后将耐药表型与耐药基因进行关联分析。结果显示,71株受试S.derby对第一代的喹诺酮类药物萘啶酸之耐药性严重,耐药率为19.72%、不敏感率为43.66%;对第三代的环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星敏感(敏感率分别为71.83%、74.65%、70.42%),但其中介率也比较高(分别为23.94%、25.35%、25.35%);对第四代的加替沙星则最敏感(敏感率为84.51%),中介率为14.08%。有76.06%(54/71)的菌株检测到了PMQR基因,其中oqxA检出率最高(53.52%)、oqxB检出率次之(49.30%)、qnr与aac(6')-Ib-cr的检出率相近,分别为29.58%(21/71)、25.35%(18/71),qnrA与qnrB基因检出率较低,分别为4.23%(3/71)、5.63(4/71),未检测到qepA基因;携带2种PMQR基因菌株的的百分比最高,占菌株数的32.39%(23/71),有12.68%(9/71)、11.27%(8/71)的菌株分别携带3种、4种PMQR基因,oqxA和oqxB两种基因与对萘啶酸耐药的表型符合率较高,都达到了70%以上,aac(6')-lb-cr和qnrS基因的符合率都在40%左右;14株对萘啶酸耐药的菌株中,有92.86%(13/14)的菌株在gyrA或parC两个基因共检测到21个氨基酸突变位点,其中gyrA的D87N和S83I两个位点突变分别有35.71%(5/14)和21.43%(3/14),parC的主要位点突变为T57S(42.86%,6/14)和T57V(21.43%,3/14)。
  本课题研究结果证明,广西地区生鲜肉源Salmonella基因型呈现多样性,表明Salmonella的污染源广泛;ERIC-PCR分型技术可用于生鲜肉污染的Salmonella之溯源;Salmonella对喹诺酮类的耐药现象较严重,gyrA和parC基因的位点突变是Salmonella对喹诺酮类药物产生耐药的主要机制,而PMQR基因的携带也是Salmonella产生耐药的一个重要机制。
[硕士论文] 尹思睿
临床兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:抵抗素是一种炎性细胞因子,能够参与机体的免疫调节,与Ⅱ型糖尿病和肥胖等多种疾病的发生有关。NLRs(NOD-like receptors),包括NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain1)、NOD2、NLRP3等是天然免疫系统中的重要受体,可接受多种物质的调控,与多种免疫相关信号通路的激活有关。实验室前期研究表明,抵抗素不影响RAW264.7细胞NOD1的表达,但能促进其NOD2的表达,活化NOD2-NF-κB信号通路并释放IL-6、IL-18、TNF-α等炎性细胞因子,但NOD2并不是抵抗素作用的必需受体。NLRP3受NF-κB的调控并参与炎症过程,是NLRP3炎性体的中心,但目前尚无抵抗素与NLRP3关联的报道,抵抗素能否通过NF-κB信号通路活化NLRP3,启动NLRP3炎性体的组装,尚有待研究证明。因此,利用RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)研究抵抗素对其NLRP3基因和蛋白表达,以及活化NF-κB信号通路促进炎性细胞因子释放的影响,明确抵抗素与NLRP3的作用机制。
  方法与结果:(1)用终浓度为50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7至预定时间(0h、3h、6h、12h、24h)。运用Real Time-PCR和Western Blot技术分别检测细胞NLRP3、NF-κB的基因和蛋白表达水平,ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1α等细胞因子的浓度。结果表明,抵抗素上调RAW264.7中NLRP3及NF-κB基因和蛋白的表达;培养上清液中TNF吨、IL-6、IL-18和IL-1β的含量随抵抗素终浓度(50-200ng/mL)的增高及培养时间(0-24h)的延长而增加。
  (2)设计三条不同的siRNA沉默NLRP3基因,荧光显微镜下检测转染效率,Real Time-PCR检测沉默效果。结果发现在转染效率较高的条件下,三条siRNA沉默效果均不好。随后更换为用终浓度为10nmol/L的MCC950(NLRP3的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞0.5h,添加200ng/mL的抵抗素继续孵育24h,检测NLRP3及NF-κB的基因、蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加MCC950,RAW264.7细胞中NLRP3基因和蛋白表达水平较抵抗素组极显著下调(P<0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度极显著降低(P<0.001)。表明NLRP3是抵抗素促进RAW264.7细胞释放促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的关键调控因子,但不影响抵抗素激活NF-κB的表达。
  (3)用终浓度为25μmol/L的小白菊内酯(NF-κB的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞1h,添加200ng/mL的抵抗素继续孵育24h,检测NLRP3及NF-κB的蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加小白菊内酯,RAW264.7细胞中NLRP3和NF-κB蛋白浓度显著降低(P<0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度显著降低(P<0.001)。表明NF-κB是抵抗素促进RAW264.7细胞NLRP3蛋白表达和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的释放的必需因子。
  结论:(1)抵抗素促进RAW264.7细胞的NLRP3基因表达上调、蛋白表达增高,激活NF-κB并促进细胞因子如TNF-旺、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放。(2)NLRP3参与抵抗素诱导RAW264.7细胞促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放过程,但其并非抵抗素激活NF-κB的必需因子。(3)NF-κB是抵抗素诱导NLRP3表达升高和RAW264.7释放促炎细胞因子的关键调控因子之一。
[硕士论文] 刘徐妹
影像医学与核医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  桡神经的桡神经沟段是肱骨骨折手术过程中最易损伤的部位之一,其损伤可导致预后差、患者生活质量下降等严重后果。因此,如何避免桡神经损伤是手术治疗肱骨干骨折时最关注的问题之一。术中准确定位该区域桡神经的解剖位置,确定相应“安全区”,对避免医源性桡神经损伤十分关键。相关解剖研究目前仅限于尸体解剖研究,这些研究勾画了桡神经与其周围解剖结构的基本位置关系,为减少医源性桡神经损伤提供了一定程度的帮助,但尚存在标本量少、改变神经的原始走行、尸体标本异于正常人的解剖结构、标本解剖和测量的体位固定、标本来源有限和相关信息完整性差等诸多局限性,有待进一步改善和补充。因此,本研究旨在通过超声引导定位的方式来测量正常人群的桡神经的桡神经沟段位置参数,并分析相关参数与上臂长度(HL)、肱骨髁宽(TW)、身高和体质量等之间的关系,以及探讨上臂体位、左右两侧、性别等因素对其影响,提高神经定位的准确性,为建立桡神经体表定位的正常参考值和确定手术“安全区”提供了必要的解剖学基础,从而减少或避免医源性桡神经损伤。
  方法:
  1.研究对象
  2016年10月-2017年6月于南方医科大学珠江医院随机招募志愿者56名,纳入标准:无上肢神经损伤症状、无桡神经损伤或上肢手术病史的健康成年人(年龄>18岁);外科临床功能检查上肢肌力和感觉均无异常;无糖尿病或其他可能引起神经病变的全身性疾病。
  2.仪器与方法
  (1)仪器GE LOGIQ E9彩色多普勒超声仪,线阵探头L6-15MHz。
  (2)方法
  第一部分(5-9页):①利用高频超声对上臂桡神经的桡神经沟段进行定位,并体表标记该神经节段的上缘(R1)、下缘(R3)和中点(R2)等三处位置参考点(图1-2);②体表标记肩峰后角(A1)、肩峰前角(A3)、肩峰中点(A2)、三角肌的止点(DI)、肱骨内上髁最凸点(E1)、肱骨外上髁最凸点(E3)、肱骨内外上髁连线中点(E2)等解剖学标志(图1-2);③利用标准的皮尺分别测量R1到A1的距离(A1')、R1到E1的距离(E1')、R2到A2的距离(A2')、R2到E2的距离(E2')、R3到A3的距离(A3')、R3到E3的距离(E3')和R3到DI的距离(DI')等(图1-3),每处均测量3次,取平均值;(附注:整个定位及测量过程中,受检者始终取坐位,并保持肘关节屈曲90°和前臂自然置于胸前的体位;本部分均以左侧上臂为测量对象)④分析上述参数与受检者HL、TW、身高和体质量等之间的相关关系。
  第二部分:①在肘关节屈曲90°和肘关节完全伸直两种体位下,获取30名随机志愿者左侧上臂的相关位置参数;②在肘关节屈曲90°时,对37名志愿者左右两侧上臂的相关参数进行测量;③在肘关节屈曲90°时,分别获取男、女两组左侧上臂的相关位置参数;(附注:上述测量的具体方法均与第一部分相同)④分析肘关节体位、左右侧和性别等因素对桡神经位置参数的影响。
  结果:
  1.第一部分:高频超声可清晰地显示所有纳入志愿者的上臂桡神经(桡神经沟段)。结果表明,距离A1'约14.4±1.7cm(范围11.2-19.2cm),距离E1'约16.0±1.5cm(范围13.5-20.1cm),距离A2'约16.9±1.5cm(范围14.1-21.5cm),距离E2'约13.6±1.5cm(范围11.2-18.5cm),距离A3'约18.1±2.2cm(范围11.9-23.3cm),距离E3'约11.4±1.3cm(范围9.5-16.0cm),距离DI'约6.1±1.2cm(范围4.3-11.4cm)。HL约30.5±2.3cm,TW约7.0±0.7cm。本部分所测量的相关参数与HL、TW、身高和体质量等均具有明显的相关关系,其中HL与相关解剖参数的相关程度最高,呈强线性相关关系(r=0.65-0.79,p<0.0001),可作为预测上臂桡神经位置的重要指标。HL与A1'、E1'、A2'、E2'、A3'和E3'的平均比值分别为2.1、1.9、1.8、2.3、1.7、和2.7。研究表明,所研究神经节段上缘大约位于上臂中点的水平,即上臂的中点可作为快速识别桡神经的桡神经沟段入点的简易方法。
  2.第二部分:本研究表明,上臂桡神经相关位置参数受肘关节体位变化和性别等因素影响,而左右两侧对比无明显统计学差异。肘关节体位变化主要影响的是各位置参考点与肘部解剖学标志之间的空间关系,而对桡神经本身的位置影响不大,可对桡神经沟段下缘的位置产生一定影响。除了DI'外,男性组的相关参数均明显大于女性组的相应参数(P<0.001,男vs女:A1'16.0±1.4cmvs13.7±1.3cm,E1'17.6±1.3cmvs15.4±1.2cm,A2'18.4±1.3cm vs16.3±1.1cm,E2'15.2±1.4cm vs13.0±1.1cm,A3'20.2±1.7cm vs17.4±1.8cm,E3'12.7±1.2cm vs10.9±1.0cm)。与其他解剖学标志不同,三角肌止点与R3之间的距离(即DI'区间)均与肘关节体位变化、左右两侧、受检者性别、身高和体质量等因素无明显相关关系,可作为桡神经定位的一个稳定的解剖标志。
  结论:
  1.高频超声作为引导桡神经定位的简便、无创、有效方法,使得在正常人群中探究桡神经与其周围结构的解剖关系成为可能;
  2.本研究测量了桡神经(桡神经沟段)的正常位置参数,为建立桡神经体表定位的正常参考值提供了必要的解剖学依据和重要的参考信息;
  3.本研究可为临床确定手术“安全区”提供定位信息,即近端为肱骨内侧缘距A1约11.1cm、肱骨中线距A2约14.0cm和肱骨外侧缘距A3约11.2cm的区域,远端为肱骨内侧缘距E1约13.4cm、肱骨中线距E2约11.1cm和肱骨外侧缘距离E3约9.4cm的区域,有助于避免医源性桡神经损伤(如图1-4);
  4.上臂长度(HL)与A1'、E1'、A2'、E2'、A3'和E3'等桡神经位置参数皆具有明显的线性相关关系,可作为预测上臂桡神经解剖位置的实用指标;
  5.三角肌止点是上臂桡神经定位的一个稳定且实用的解剖标志。
[硕士论文] 孙坦
生物工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)简称单增李斯特菌,是一种自然界普遍存在的人畜共患病病原菌,也是一种食源性病原菌,它能引起人、畜的李斯特菌病。食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的安全,该菌在温度较低的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。Lm-p60蛋白为单核细胞增生李斯特菌产生的一种胞外蛋白,由iap基因编码,与李斯特菌的致病性密切相关。Lm-p60蛋白具有酰胺水解酶的活性,能够水解细菌细胞壁,具有很高的研究价值。
  Lm-p60蛋白的三级结构预测及结构域功能的研究结果显示:Lm-p60蛋白存在着N端和C端两个独立的结构域,其中N端结构域存在两个LysM结构域和一个SH3结构域,而C端只含有一个NlpC/P60家族结构域。Lm-p60蛋白在裂解细菌细胞壁的过程中,只有N端结构域中的LysM和SH3具有结合底物功能,从而确定了N端结构域行使识别并结合底物的功能,而C端结构域行使裂解底物功能。目前,Lm-p60蛋白是否具有抗菌性及抗菌效果如何还不是很清楚,而且Lm-p60蛋白在异源表达过程中还存在表达量不足和活性较低的问题。为了获得大量高活性Lm-p60蛋白,本研究通过SDS-PAGE分析比较不同载体构建的重组蛋白的表达量来确定最适表达载体,结果表明最适表达载体为pET30a。随后,本研究以SDS-PAGE分析和比浊法测重组蛋白裂解细菌细胞壁活性确定了以pET30a载体构建的重组蛋白最佳诱导表达条件是:在细菌培养至OD600值为0.553时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,在摇床温度为30℃,转速为160rpm条件下诱导培养4h。然后通过SDS-PAGE分析和比浊法测裂解活性确定了最佳超声波破碎时间为20min。在最佳条件下诱导表达并用镍柱亲和层析纯化Lm-p60蛋白,通过计算后Lm-p60蛋白的纯化倍数为1.2,回收率达95%。
  细菌抗药性及耐药性问题日益突出,开发新的抗菌剂十分迫切。Lm-p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性,研究Lm-p60蛋白是否具有抗菌作用及抗菌效果如何成为一项重要的工作。本研究以溶壁微球菌为指示菌,琼脂打孔法确定了Lm-p60蛋白具有抑菌活性,其抑菌效果比溶菌酶要弱。溶菌酶作为研究较为透彻的抗菌酶,其裂解细胞壁原理与Lm-p60蛋白有所不同,本研究发现,在溶菌酶中混合有Lm-p60蛋白后具有增强抑菌效果的重要结论。为溶菌酶的改造提供很好的材料。本研究还以pET30a载体构建Lm-p60蛋白的N端结构域与LysM2-C端重组蛋白。并通过比浊法测定发现N端结构域也具有裂解活性,但抑菌效果不明显,同时还发现只含有一个LysM结构域的C端重组蛋白裂解活性较弱。
[硕士论文] 周于用
预防兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:乙型脑炎病毒(JEV)是流行性乙型脑炎的病原体。本研究旨在进行JEV关键毒力位点分析、鉴定E-I176R(E蛋白第176位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸)突变位点能否影响其神经毒力。首先,分析预测了JEV神经毒力相关突变位点6个。在进行了JEV SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株的全基因序列测定的基础上,进行了其神经毒力的鉴定,分析获得了JEV神经毒力相关氨基酸突变位点6个:E蛋白A72T、I176R、S251Y、E273K,NS2B蛋白V44A和NS4A蛋白G168E。其次,成功拯救了JEV E-I176R单点突变病毒。利用定点突变和反向遗传操作方法构建并包装了JEV E-I176R单点突变病毒,利用蚀斑形成试验、PCR、序列测定等方法对包装的病毒进行了鉴定,在BHK-21细胞进行了体外生长特性的研究,发现目标点突变对JEV的蚀斑形成特性与生长曲线没有显著影响。最后,阐明了乙型脑炎病毒E-I176R突变位点能够显著降低其神经毒力。将84只小鼠平均分为14组进行神经毒力实验,每个病毒滴度重复3次进行验证,发现200与2000PFU的未突变病毒引起小鼠的死亡率分别为55.56%与88.89%,而200与2000PFU的E-I176R单点突变病毒引起小鼠的死亡率分别为11.11%与50%。荧光定量检测结果显示,未突变病毒在鼠脑内含量在攻毒后3、5、7天逐渐升高,而E-I176R单点突变病毒在3、5、7天保持稳定。本研究分析出了6个JEV神经毒力相关氨基酸突变位点,证实了E-176为影响乙脑病毒毒力的关键位点,E-I176R单点突变能够能显著降低其神经毒力。本研究为乙脑病毒致弱机制的深入研究奠定了基础。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

万方选题

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部