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[博士论文] 雷卫强
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。
  RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。
  (一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析
  本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的cDNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的gDNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。
  (二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析
  体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。
  (三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析
  预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过dsRNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。
  本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
[硕士论文] 胡锦阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。
  起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(gRNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也己应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:
  (1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型
  本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的iL3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。
  (2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究
  以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒pAJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。
  (3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用
  本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对CeCas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512bp大小的序列作为gRNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条gRNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条gRNA是否具有良好的打靶效率,做了spCas9/gRNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的SsCas9和gRNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将pAJ50-Cas9质粒和pXL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到SsCas9和gRNA片段,说明SsCas9和gRNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将pAJ50-Cas9分别与pXL-BACII-gRNA4、pXL-BACII-gRNA7和pXL-BACII-gRNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。
  本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[博士论文] 田斌
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的疾病,一直对全世界的公共卫生造成极大的威胁,并导致每年约59000死于狂犬病。狂犬病的致病原为狂犬病毒(Rabies virus,RABV),其逃逸宿主中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)天然免疫的机制目前仍未完全清楚。我们之前的研究发现,在小鼠和犬感染模型中,狂犬病毒实验室固定毒株(弱毒株)能够激活天然免疫反应,而野毒株则不能激活。星状胶质细胞是组成血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)的重要元件,其被证实可在中枢神经系统中通过激活天然免疫和调控BBB通透性来限制或清除病原微生物的感染,对中枢神经系统起到重要的保护作用。
  本文研究中,我们重点探索了星状胶质细胞在狂犬病毒感染时发挥的各方面功能。首先,为了验证本研究中所使用的狂犬病毒(DRV-AH08,简称DRV)具有野毒株的特性,我们建立了小鼠感染模型,发现DRV感染的小鼠死亡时间明显早于弱毒株B2c感染的小鼠,且DRV感染小鼠后并未表现出炎症反应和外周免疫细胞入侵中枢神经系统的现象,表明本研究中所使用的野毒株DRV具有野生型狂犬病毒的特性,符合后续实验需求。其次,我们分离、纯化和培养了原代星状胶质细胞(Primary astrocyte),并用DRV和B2c分别对原代星状胶质细胞进行感染,我们发现B2c表现为暂时性感染,而DRV则可以持续的感染星状胶质细胞。我们进一步比较了DRV和B2c感染星状胶质细胞后MAVS通路关键分子的表达水平,结果显示B2c感染后的MAVS通路激活水平显著高于DRV,且这种激活是由于病毒复制转录过程中产生的RNA引起的。因此,我们继续对狂犬病毒两种不同毒株感染星状胶质细胞后dsRNA的产生水平进行了分析,结果表明B2c感染星状胶质细胞后产生的dsRNA水平要明显高于DRV感染组。我们进一步利用MAVS和TLR7基因敲除小鼠进行了体内、体外的感染实验,发现B2c能够持续感染从MAVS基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,但依旧不能感染TLR7基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,验证了MAVS通路是狂犬病毒强弱毒株感染星状胶质细胞后产生差异的关键通路。此外,我们还发现B2c感染星状胶质细胞后产生的与MAVS通路相关的炎症因子要明显高于DRV,与DRV感染相比,狂犬病毒B2c感染星状胶质细胞后能够显著增加体外BBB模型对大分子物质的通透性,且B2c感染的星状胶质细胞培养上清能显著降解紧密连接蛋白ZO-1。
  总之,本研究发现星状胶质细胞在限制狂犬病毒感染中发挥这重要作用,具体表现在它可以通过活化MAVS通路产生IFN和ISG来直接限制狂犬病毒弱毒株的复制,同时可以产生大量的炎症因子促使BBB通透性增加来促进中枢神经系统中的病毒清除;与之相反的,狂犬病毒的野毒株在感染星状胶质细胞后则可通过限制dsRNA的产生来逃避MAVS通路的激活,从而实现持续性感染,不改变BBB的通透性,使病毒逃避被清除。本研究结果为阐明狂犬病毒的野毒株逃逸天然免疫的机制奠定基础,并对狂犬病的临床治疗提供了新的思路。
[硕士论文] 李彬酉
兽医公共卫生与食品安全 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。
  生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。
  外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对ΔtolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在ΔtolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:
  1.基因缺失菌株的构建
  设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌x7213感受态细胞构建x7213-pRE-ΔcpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及ΔtolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到ΔcpxA基因缺失株和ΔtolCΔcpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建ΔcpxR基因缺失株和ΔtolCΔcpxR双基因缺失株。
  2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建
  以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至ΔtolCΔcpxA菌株中,构建回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-ΔtolCΔcpxR。
  通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化ΔtolCΔcpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-ΔtolCcpxA。
  3.实验菌株的部分生物学特性研究
  首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。
  其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明ΔtolC和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。
  4.试验菌株生物被膜形成能力分析
  使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比ΔtolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA和Cm-R-ΔtolCΔcpxR生物被膜形成能力恢复到ΔtolC的水平;M-A-ΔtolCΔcpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。
  5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态
  使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06mol/LNaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但ΔtolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。
  6.Curli菌毛合成能力分析
  刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,ΔcpxA和ΔcpxR单基因缺失突变株和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-ΔtolCΔcpxA、Cm-R-ΔtolCΔcpxR的菌落形态与ΔtolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
[硕士论文] 李娜
生物医药工程 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在Aβ25-35诱导人源性SH-SY5Y损伤细胞上,筛选能差异化表达并与MRTF-A相关的miRNA,探讨MRTF-A介导miRNA对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制。
  方法:
  1.在Aβ25-35诱导SH-SY5Y损伤细胞模型中,用基因芯片筛选与MRTF-A调控相关的miRNA:建立细胞模型;细胞分组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理,24h后,用western blot方法检测MRTF-A的蛋白表达水平,并提取RNA。用Agilent RNA6000Nano/Pico Assay法检测各组RNA质量合格后,使用miRNA OneArray芯片技术分析各组中发生显著差异变化的miRNA。得到各组显著变化的miRNA,再通过各组间相互比较得到MRTF-A调控的miRNA。筛选出差异性表达最为显著的miRNA,并用RT-qPCR检测MRTF-A对目标miRNA的调控作用。
  2.MRTF-A对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制:
  1)MRTF-A对细胞自噬的影响:实验分为4组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  2)miR-1273g-3P对细胞自噬的影响:实验分为4组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic,miR-1273g-3p mimic control+Aβ25-35,miR-1273g-3pmimic+Aβ25-35)。转染miR-1273g-3p48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白检测LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  3)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p有关:实验分为5分组(control,Aβ25-35,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予Aβ25-35处理24h后,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  4)miR-1273g-3p对靶基因mTOR的作用:采用mirwalk、targetscan软件预测其靶基因,并验证其对靶基因(自噬上游靶基因)mTOR表达的影响。实验分为2组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic);转染miR-1273g-3p mimic48h后,提取RNA和蛋白,分别检测mTOR蛋白表达水平。
  5)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p抑制mTOR有关:实验分为5组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3pinhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测mTOR的蛋白表达水平。
  结果:
  1.基因芯片筛选miRNA:在给予Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,MRTF-A蛋白表达水平明显降低,转染MRTF-A质粒使细胞过表达MRTF-A,将各组通过RNA质检的RNA进行miRNA基因芯片杂交,依据|Fold change|≧0.585且P-value<0.05的条件筛选条件,共筛选出295个显著差异的miRNA。将得到的295个miRNA在各组间交集比较,共得到8个与MRTF-A调控相关的miRNA;其中上调的有miR-1273g-3p,下调的有hsa-miR-6772-3p、hsa-miR-6736-3p、hsa-miR-6740-3p、hsa-miR-7106-3p、hsa-miR-6747-3p、hsa-miR-6776-3p及hsa-miR-3653-5p。我们选择上调明显的miR-1273g-3p,用RT-qPCR验证显示MRTF-A能明显上调miR-1273g-3p的表达,与芯片结果一致。
  2.MRTF-A调控miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生:结果显示,在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,过表达MRTF-A能明显增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,说明MRTF-A促进经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,转染miR-1273g-3p mimic也能明显促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,表明miR-1273g-3p也能够促进自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,共转染MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达较单转MRTF-A有明显降低,提示miR-1273g-3p参与了MRTF-A促进自噬的的作用。
  3.MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现:利用mirwallk、Targetscan软件总共预测到1090个miR-1273g-3p靶基因,并找到负性调控自噬的靶基因mTOR。RT-qPCR和western blot结果显示,单转miR-1273g-3p能明显抑制了mTOR的mRNA和蛋白表达水平;另一方面,单转MRTF-A也能抑制mTOR的表达,而共转MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后能逆转MRTF-A对mTOR表达的上调,提示MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现。
  结论:
  MRTF-A能够促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生,而miR-1273g-3p通过抑制mTOR的表达促进细胞自噬的发生;另一方面,MRTF-A能够上调miR-1273g-3p的表达,MRTF-A促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬可能与其上调miR-1273g-3p抑制mTOR的表达相关。
[硕士论文] 欧阳生群
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:节球藻毒素-R(NOD-R)是由丝状浮游蓝藻节球藻(Nodularia spumigena)产生的一种蓝藻肝毒素。研究表明,NOD-R不仅具有强烈的促癌作用,而且还是一种致癌剂。NOD-R的水溶性强、热稳定性好,而且耐受pH变化,因此,现有的自来水处理工艺,如沉淀、过滤和活性炭吸附等都无法将其完全去除。吸入NOD-R污染的水和误食NOD-R污染的水产品是导致中毒的主要途径。NOD-R是通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和2A(PP2A)的活性来发挥毒性作用的,其中毒症状主要表现为腹泻、乏力、厌食等,甚至死亡。目前,常用的NOD-R的检测方法主要有三种,即生物分析法、物理化学分析法和免疫化学法。但是,这些检测方法都存在一定的局限性,例如特异性差、成本高、耗时长等,亟需发展一种可以克服传统方法缺点的新型检测方法。
  适配体是一种新型分子识别元件,被誉为“化学抗体”。研究者们通过将其与生物传感器相结合,开发出了新的检测方法,并被广泛应用于毒品检测、食品安全和分析诊断等领域。本课题组通过磁珠筛选法(MB-SELEX)获得了NOD-R的最佳适配体N13,该适配体能够以很高的亲和力(KD=138 nM)和NOD-R特异性结合。根据在线工具themfold web server对适配体N13二级结构的预测结果,本课题组对适配体N13进行了截短优化,并获得了其核心区域N13-T-O2。优化后,适配体N13-T-O2与NOD-R之间的亲和力有所提高(KD=29.6 nM)。
  生物膜干涉(BLI)技术是一种无需标记的技术,可以提供实时、高通量的生物分子相互作用信息。因此,借助BLI技术平台,本课题组以适配体N13-T-O2为识别分子,成功构建了一种灵敏度高、特异性强的NOD-R适配体传感器。该适配体传感器能够在15 min内完成NOD-R的检测,其线性检测范围为40-200 nM,检测限为167 pM,而且不和NOD-R类似物MC-LR以及其他类型的毒素,如GTX、STX、BTX和PTX等发生交叉反应。另外,该适配体传感器具有很好的稳定性和重复性(CV=8.23%)。为了评估该适配体传感器在实际样品检测中的应用潜能,本课题组还将该其应用于自来水中NOD-R的检测,结果表明该适配体传感器具有较高的回收率(91.92~102.16%)和较低的CV值(1.31~3.73%)。
  综上所述,本课题组获得了高亲和力、强特异性的NOD-R适配体N13-T-O2,并且,基于该适配体,构建了BLI适配体生物传感器,具有特异性强、灵敏度高、以及稳定性好等优点。因此,我们相信,这种新型BLI适配体传感器检测法有望成为NOD-R准确和快速检测方法的雏形,并为传统NOD-R检测方法的更新提供基础。
[博士论文] 张子腾
卫生毒理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  当前人们工作竞争激烈,生活节奏加快,不可避免地处于应激状态。持续的应激状态会对人体的正常生理机能造成严重影响,进而导致多种疾病发生发展,其中就包括疲劳[1]。疲劳以及过劳已经日益成为全球性公共健康问题。长期的疲劳会造成学习记忆能力下降和及工作效率低下,影响人们正常生活,甚至可能引发安全生产问题。特别在高强度的军事冲突或非战争军事行动中,疲劳应激损伤严重影响战士身体健康。因此研究疲劳发生发展过程中的相关机制,并开发有效的抗疲劳药物具有非常重要的科学意义和社会意义。
  疲劳发生的病理生理机制复杂,目前尚不明确。现有的观点认为,疲劳的发生是神经系统、免疫系统以及内分泌系统等多因素共同参与的结果[2]。研究表明疲劳发生发展过程中免疫系统异常激活,体内多种炎症因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)显著升高,并作用于中枢神经系统,诱导机体产生疲劳样症状[3]。
  炎症小体的研究近年来受到了越来越多的关注。NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组成部分,它可以通过自身的NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)识别损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),进而激活下游的信号转导通路,并诱导机体产生适应性免疫应答[4]。当被激活时,NOD样受体将募集凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前体pro-Caspase-1形成多蛋白复合体,即NLRP3炎症小体。活化的NLRP3炎症小体可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割IL-1β及IL-18前体并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,发挥致炎作用。炎症小体的适当活化可以抵抗病原体感染和减轻应激损伤,但是当其活化失控时也能造成炎症效应的放大和器官损伤[5]。
  目前已有研究发现,慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平显著升高,而IL-1β是NLRP3炎症小体活化后的重要产物,因此推测NLRP3炎症小体可能参与了疲劳的发生发展。但是对于NLRP3炎症小体是否参与疲劳的发生发展,以及涉及的具体机制目前尚无文献报道。因此深入研究NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用及其相关分子机制,对于阐述疲劳的发生机制,以及提出新的疲劳防治策略具有重要意义。
  研究目的:
  本研究拟利用急性疲劳和慢性疲劳两种小鼠模型,检测中枢神经系统中NLRP3炎症小体的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3/-)小鼠明确NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用;检测活性氧水平,阐明NLRP3炎性小体激活的活性氧机制;最后应用Ω-3不饱和脂肪酸对上述疲劳模型进行干预,验证NLRP3炎症小体和活性氧在改善和治疗疲劳过程中的作用。
  研究方法:
  本课题首先探索建立了(1)急性疲劳模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)复合强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型;(2)慢性疲劳模型:反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型。选择小鼠的自发活动距离和转棒仪在棒时间作为其疲劳状态的行为学指标,判定疲劳模型是否成功以及小鼠的疲劳程度。
  然后以小鼠中枢神经系统作为研究靶器官,检测NLRP3炎症小体在中枢神经系统中的激活水平。
  再次对Nlrp3-/-小鼠进行相同的疲劳模型建模处理,并检测包括自发活动距离和转棒仪在棒时间在内的行为学指标。同时检测野生型和基因敲除型小鼠脑中活性氧的生成情况,探究NLRP3炎症小体活化的具体机制。
  最后,选用Ω-3不饱和脂肪酸—DHA对反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳进行干预,进一步验证NLRP3炎症小体作为疲劳治疗靶点的价值。
  研究结果:
  1、NLRP3炎症小体参与了LPS复合强迫游泳诱导的小鼠急性疲劳模型
  1.1成功建立小鼠急性疲劳模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3mg/Kg LPS然后进行强迫游泳20min,小鼠出现了明显疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,说明模型建立成功。
  1.2该疲劳模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,脑中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表达水平升高,免疫荧光结果显示NLRP3炎症小体组装形成并激活。
  1.3与野生型小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠在LPS复合强迫游泳诱导下所表现的疲劳行为显著减轻。Nlrp3-/-小鼠在相同的LPS复合强迫游泳诱导下脑组织中Caspase-1酶的激活显著减少,并伴有IL-1β水平的明显降低。
  2、NLRP3炎症小体参与了反复强迫游泳诱导的小鼠慢性疲劳模型
  2.1成功建立小鼠慢性疲劳模型,通过反复强迫游泳,负重每12h游泳10min,连续持续14天,建立了慢性疲劳模型。反复强迫游泳可以诱导野生型小鼠产生明显的疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,与之相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为明显减轻。
  2.2反复强迫游泳建立的慢性疲劳模型,野生型小鼠大脑前额叶皮质脑区的NLRP3炎症小体显著组装并活化,IL-1β水平显著升高。和野生型疲劳小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为显著减轻,并伴有前额叶皮质脑区和血清中IL-1β的水平显著降低。
  2.3在反复强迫游泳诱导的疲劳下,野生型和Nlrp3-/-小鼠脑中的活性氧水平,血清中丙二醛都显著升高,但在野生型和Nlrp3-/-小鼠之间的差异没有统计学意义。
  3、Ω-3不饱和脂肪酸在反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型中的作用及其可能机制
  3.1Ω-3不饱和脂肪酸可以明显改善反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳样行为,小鼠自发活动距离和转帮仪在棒时间显著延长。
  3.2Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制反复强迫游泳诱导的疲劳小鼠前额叶皮质脑区中NLRP3炎症小体的组装激活、IL-1β的升高以及疲劳小鼠脑中活性氧的生成来改善疲劳状态。
  研究结论:
  本课题发现中枢神经系统NLRP3炎症小体激活导致两种不同模型的疲劳发生;NLRP3-IL-1β通路在疲劳发生过程中起重要作用。Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制NLRP3炎症小体的激活和活性氧的生成,进而缓解小鼠疲劳样行为。
[硕士论文] 牛筱雯
营养与食品卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  通过体外实验了解铁过负荷引起的HNF4α表达下降的生物学特点,阐明铁过负荷导致HNF4α表达下降的分子机制,为更深入的研究铁过负荷对肝脏组织细胞的影响提供线索,并为研究铁过负荷相关肝脏疾病的防治措施提供理论基础。
  研究方法:
  1、细胞的培养
  L02细胞在含10%胎牛血清,1%双抗的1640培养基中培养。Huh7、G2细胞以及Hepa16细胞均在含10%胎牛血清,1%双抗的高糖DMEM培养基中培养。根据实验目的,各组分别加入Apo-Tf(终浓度30uM)、Holo-Tf(终浓度30uM)及FeSO4(终浓度100uM)对细胞进行干预培养(5%CO2,37℃)。
  2、RT-PCR
  用Trizol提取细胞、组织的总RNA,测定其浓度,再用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,与引物,SYBR green,水混匀后,在StepOne Plus实时定量PCR仪上进行扩增,得到结果,统计分析。
  3、Western blot
  用全蛋白提取试剂盒提取细胞、组织的总蛋白,测定浓度,变性后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,孵育一抗及荧光二抗,显像,分析。
  4、检测细胞内的铁含量
  细胞接种于12孔板,37℃培养至融合度为80%左右时,在培养液中加入终浓度为30uM的Holo-Tf,培养0.5h。去除含Holo-Tf的培养基,用适量PBS洗3次,加入PGFL(phen Green FL)二价铁荧光染料(DMSO配制),终浓度为5uM,避光孵育20min,加入适量PBS洗3次,在共聚焦显微镜下观察绿色荧光(波长490nm,发射波长520nm)强度的变化。
  5、甲基化检测
  将L02细胞铺于24孔板,并分为两组,IO组和IO+5-Aza-CdR(5-aza-2'-deoxycytidine,5-脱氧杂氮胞苷)组,IO组加入终浓度为30uM的Holo-Tf,IO+5-Aza-CdR组除了加入相同量的Holo-Tf,同时还加入了终浓度为2.5uM的5-Aza-CdR。细胞干预后,依次在0、1、2、4、8h进行收集。并通过实时定量PCR检测各组HNF4α的表达变化。
  6、转录因子结合活性芯片
  采用转录因子结合活性芯片,对对照组,Holo-Tf-1h(Holo-Tf干预1h)组,HNF4α组(加入了HNF4α片段)的L02细胞转录因子结合活性进行检测,筛选。
  7、染色质免疫共沉淀(ChIP)
  L02细胞接种于6cm2培养皿中,分为对照组,Apo-Tf组和Holo-Tf组,培养1h,按照CST公司染色质免疫共沉淀说明书的步骤进行实验。
  8、蛋白稳定性检测
  放线菌酮(CHX)可以抑制蛋白合成,通过用CHX(终浓度0.6uM))干预对照及铁过负荷组的L02细胞,并在0、0.5、1、2、4、8h收集细胞,提取总蛋白,用Western blot检测比较两组细胞蛋白的表达量变化,观察铁过负荷后YY1蛋白的稳定性情况。
  9、siRNA及过表达质粒转染
  L02细胞接种培养板,当融合度为80%时,按说明书进行转染。将siYY1或YY1过表达质粒以及转染试剂按体积1∶1混匀后,室温静置15min,再加入各组培养基中,培养48-72h后收集细胞检测。
  10、实验动物小鼠分组及造模方法
  铁过负荷小鼠:
  50只雄性,四周龄,C57小鼠适应2天后,随机分为3大组:对照组,0.3%高铁饲料组,3%高铁饲料组。对照组与0.3%高铁饲料组又分为4个亚组:1月组,3月组,6月组,12月组。饲养期间,小鼠自由饮水。分别于1月,3月,6月,12月处死,采集血清及肝脏组织标本备用。
  腺相关病毒小鼠:
  40只雄性C57小鼠随机分为八组:①阴性对照组②YY1干扰组③过表达YY1组④喂养3%高铁饲料组⑤喂养3%高铁饲料+干扰YY1组⑥喂养3%高铁饲料+过表达YY1组⑦喂养0.3%高铁饲料组⑧喂养0.3%高铁饲料+过表达YY1组。
  病毒通过尾静脉注射,注射量分别为,NC病毒:2×1011vgs;YY1干扰病毒:2×1011vgs;过表达YY1病毒:2×1010vgs。各组小鼠均于尾静脉注射四周后处死,并取样本检测。
  11、小鼠肝铁含量检测
  将小鼠肝脏消化后的液体定容至10ml,再将样本溶液导入火焰原子吸收仪,测定吸光度,并计算出样本铁含量。
  12、肝脏组织普鲁士蓝染色,HE染色
  肝脏样本固定在4%多聚甲醛中,包埋石蜡,然后切片,用普鲁士蓝染色,苏木精和伊红染色,显微镜观察并采集图像。
  13、血清生化指标的检测
  血清ALT、AST,血清铁,总铁结合力,转铁蛋白饱和度,均采用血生化自动分析仪进行测定。
  研究结果:
  1.铁过负荷下调入肝原代细胞、人和鼠肝癌细胞HNF4α表达
  1.1不同时间铁干预对肝细胞HNF4αmRNA表达的影响
  将人肝细胞L02和人肝癌细胞Huh7在添加30uM HOLO-Tf或100uM FeSO4的培养液中分别暴露1~8h,结果显示暴露1h,HNF4αmRNA表达即明显下降。延长暴露时间,两种细胞的HNF4αmRNA表达未见进一步明显下降。
  1.2铁干预1h对多种肝细胞株HNF4αmRNA及蛋白表达的影响
  将人原代肝细胞、人肝细胞L02、人肝癌细胞Huh7、G2和小鼠肝癌细胞Hepa16在含30uM Holo-Tf的培养基培养1h,结果发现,上述细胞HNF4αmRNA和蛋白表达均明显下降。
  1.3Holo-Tf干预0.5h对细胞内铁含量的影响
  用PGFL(Phen Green FL)荧光染料对铁干预的细胞进行了染色,结果显示用Holo-Tf干预人原代肝细胞、人肝细胞L02、人肝癌细胞Huh7、G2以及鼠肝癌细胞Hepa160.5h,与对照组相比,其细胞内荧光减弱,表明干预0.5h,铁已进入细胞内;另外,实时定量PCR结果也显示,30uM Holo-Tf干预1h,上述肝细胞铁调节分子表达发生了铁过负荷的相应变化,即Hamp、FTL1mRNA表达升高,TRFC mRNA表达下降。
  2.转录因子YY1与HNF4α基因结合位点结合活性下降是铁过负荷导致HNF4α表达下降的重要原因
  2.1铁干预不同时间对细胞miR-34a表达的影响
  通过生物信息学分析,miR-34a与HNF4α基因有结合位点,因此,将L02细胞在含30uM Holo-Tf的培养基中分别暴露了0.5、1、2、4、8h,结果显示,各时间点细胞miR-34a的表达均没有明显变化,提示,铁干预1h肝细胞HNF4αmRNA表达下降可能与miR-34a无关。
  2.2铁过负荷对HNF4αDNA甲基化的影响
  采用5-AZA-CdR抑制HNF4αDNA甲基化的方法,了解铁干预是否通过改变L02细胞HNF4αDNA甲基化进而影响其基因的表达,结果显示,与单独用Holo-Tf干预组比较,铁干预同时加入5-AZA-CdR组细胞HNF4αmRNA的表达没有明显变化,提示,L02细胞铁过负荷HNF4α表达下降可能与其DNA甲基化程度改变无关。
  2.3铁过负荷对HNF4α转录因子的影响
  2.4不同时间铁干预对L02细胞YY1表达的影响
  对铁干预不同时间后,YY1的表达变化进行了检测。结果显示,在铁干预0.5、1、2、4、8h后,与0h相比,YY1mRNA表达并没有出现明显变化,而YY1蛋白则从0.5h开始就出现明显表达下降,且在1h进一步下降后基本保持不变。
  2.5铁过负荷对YY1蛋白稳定性的影响
  放射菌酮(CHX)可以抑制蛋白合成,用于观察蛋白降解速率,分析蛋白稳定性。向对照组和铁过负荷组的细胞培养基中分别加入CHX(终浓度0.6uM),并通过Western blot检测不同时间点的蛋白表达量,结果发现,铁过负荷组的YY1蛋白与对照组比较,降解速率明显增加。说明铁过负荷是通过使YY1蛋白稳定性下降,降解增加,从而导致蛋白表达量减少的。
  2.6体外实验干扰及过表达YY1对HNF4α表达的影响
  通过分别向L02细胞、铁过负荷L02细胞转染siYY1和过表达质粒,观察HNF4α表达的变化,结果显示YY1表达被抑制时,HNF4αmRNA表达也下降,相应的YY1过表达时HNF4αmRNA表达升高,并且过表达YY1还可以逆转由铁过负荷引起的细胞HNF4α表达下降。
  研究结论:
  1、铁过负荷可以在细胞水平和整体动物水平下调HNF4α表达;
  2、转录因子YY1可以在转录水平调控HNF4α的表达;
  3、铁过负荷可以通过影响YY1蛋白的稳定性使其蛋白量减少,与HNF4α的结合活性减弱,导致HNF4α表达下降;
  4、过表达YY1可以缓解铁过负荷对小鼠肝脏HNF4α表达的抑制作用以及炎症反应的发生。
[博士论文] 林云凯
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知的抗原作用最强的专职抗原递呈细胞,被认为是连接特异性免疫和非特异性免疫应答的桥梁,并且可决定机体特异性免疫应答的类型。DCs起源于骨髓前体细胞,经过一系列的发育分化成为不同的亚群:即单核样DCs、浆细胞样DCs(plasmacytoid DCs,pDCs)及经典DCs(conventional DCs,cD Cs)。肠道中DCs主要分布在肠道固有层(Lamina propria,LP)和肠道相关淋巴组织中,包括了派尔集合淋巴结(Peyer's patches,PPs)和肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)等,肠道DCs有许多不同的特异性亚型,其形成与肠道微环境和细胞因子有关,CD103+CD11b+DCs是小鼠小肠固有层(Small intestine lamina propria,SI-LP)中主要的DCs亚群。DCs能严密监视通过肠粘膜屏障移位的细菌和病原菌,不断摄取抗原并将其携带进入次级淋巴结,在淋巴结内激活初始T和B淋巴细胞,诱导特异性免疫反应。肠道特定DCs亚群能够分泌多种细胞因子影响初始辅助性T细胞(Thelper cells,Th cells)向Th1、Th2或Th17等分化,从而参与不同类型的免疫应答反应。肠道正常功能的维持有赖于免疫和耐受之间的精确平衡,对微生物免疫调控失常将导致肠道慢性炎症,如炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)。由此可知肠道DCs在肠道黏膜免疫稳态中扮演着至关重要的角色,然而关于肠道DCs不同亚群的特性及其调节的研究尚不深入。
  信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)是一类具有抑制性的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,选择性表达在髓系细胞和神经细胞膜表面。胞质区高度保守,具有富含酪氨酸残基的免疫抑制性基序(Immune receptor tyrosine inhibitory motif,ITIMs),多种生长因子、细胞因子能够诱导其酪氨酸磷酸化。SIRPα胞外区由三个免疫球蛋白超家族结构域(Immunoglobulin super family domain,IgSF)组成,SIRPα通过胞外区与其配体CD47相互作用,介导免疫抑制反应。许多研究表明SIRPα-CD47通路能够参与DCs的发育成熟和促进DCs的抗原递呈功能等。小鼠肠固有层SIRPα的缺失会导致CD103+CD11b+DCs亚群和肠黏膜Th17细胞数量减少,柠檬酸杆菌感染引起的Th17反应减弱。也有研究表明小鼠肠道固有层中CD11c+CD11b+DCs高表达SIRPα,其能促进鞭毛蛋白诱导的IL-17a、IFN-γ和IL-6等的产生,从而促进初始CD4+T细胞向Th17和Th1的分化。综上提示我们SIRPα可能通过调节DCs和Th17的数量和功能参与肠道免疫稳态,然而SIRPα影响肠道DCs稳态的确切机制以及对肠道免疫微环境的影响仍不清楚。
  本课题中,我们通过TALEN技术构建了SIRPα全身性敲除小鼠,通过流式检测小鼠脾脏、肠道固有层和淋巴结组织中DCs、巨噬细胞(Macropages,Mψ)和T细胞各亚群数量和比例,探究SIRPα在肠道免疫稳态中的作用。为了进一步明确SIRPα的功能,我们采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mψ上SIRPα特异性敲除小鼠,通过流式检测肠道淋巴组织中免疫细胞亚群的数量和比例,深入探讨DCs和Mψ等不同来源的SIRPα对于肠道免疫系统的固有调节作用。体外利用共培养研究体系和中和抗体干预手段,初步探讨SIRPα发挥调节肠道DCs作用的机制。为了进一步探讨SIRPα对于肠道稳态的调节作用,我们通过16SrDNA测序对SIRPα敲除小鼠肠道菌群组成和多样性进行了检测。利用DSS诱导的肠炎模型,探讨了SIRPα在炎性肠疾病中作用。通过超高效液相色谱/质谱联用技术开展了SIRPα敲除小鼠胆汁酸组分分析,初步探讨了SIRPα对于胆汁酸代谢的调节作用,确定了SIRPα在肠道免疫和代谢稳态中的重要作用,为IBD和脂质代谢相关疾病的治疗提供新策略和新思路。
  方法:
  1.采用TALEN技术构建了SIRPα全身敲除小鼠,采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mψ上SIRPα特异性敲除小鼠动物模型;
  2.建立多色染色方案用于区分肠道DCs和Mψ,通过流式细胞仪检测小鼠脾脏、肠道固有层和肠系膜淋巴结中DCs和Mψ的数量和比例,通过胞内染色检测组织中T细胞亚群的数量和比例;
  3.体外诱导培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),利用共培养体系,检测Mψ对于组织DCs、Th1和Th17等的吞噬作用;
  4.抗原特异性T细胞增殖实验。体外实验:脾脏纯化的DCs与OT-Ⅱ小鼠来源的初始T细胞共培养4天,检测培养上清IL-17a浓度;体内实验:受体小鼠尾静脉注射OT-Ⅱ初始CD4+T细胞,1天后进行免疫接种,10天后分析肠道固有层Th17/Th1细胞的数量和比例;
  5.骨髓移植模型:受体小鼠接受致死性γ射线(Co60源)照射,从供体小鼠中分离骨髓细胞,通过尾静脉注射入辐照受体小鼠中;
  6.喂食2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液构建小鼠肠炎模型;
  7.腹腔注射氯膦酸盐脂质体清除小鼠体内Mψ;
  8.小鼠肠道通透性检测。通过强饲法给予小鼠FITC标记的右旋糖酐水溶液,4小时后使用荧光光度仪检测小鼠血清中FITC标记的右旋糖酐浓度;
  9.通过16S rDNA测序检测小鼠肠道菌群组成和多样性;
  10.使用半自动生化分析仪检测血清生化指标。使用ELISA试剂盒检测组织和血清IL-6,IL-1β,TNF-α,IFN-γ,IL-17a和FGF15的浓度;
  11.使用超高效液相色谱(UPLC)-质谱联用系统检测小鼠粪便、血清和组织中的胆汁酸组成和含量。
  结果:
  1.小鼠脾脏、小肠固有层和肠系膜淋巴结中Mψ均高表达SIRPα,而在DCs亚群中存在分化;
  2.SIRPα-KO小鼠脾脏CD4+cDCs特异性减少,肠道固有层和肠系膜淋巴结中CD103+CD11b+DCs数量和比例特异性减少;
  3.造血细胞来源的SIRPα参与肠道DCs亚群的调节;
  4.DCs和Mψ上SIRPα特异性缺失均会导致脾脏CD4+cDCs、肠系膜淋巴结和小肠固有层中CD103+CD11b+DCs数量的特异性减少。
  5.SIRPα依赖的CD103+CD11b+DCs影响肠道Th17/Th1细胞的产生;
  6.阻断SIRPα-CD47通路能够增强SLAMF7依赖的肠道CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1的吞噬;
  7.SIRPα-KO小鼠肠黏膜上皮菌群数量增加且抗菌功能减弱,肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈调节通路受抑制;
  8.SIRPα的缺失加重小鼠DSS诱导的肠炎症状;
  9.SIRPα-KO小鼠出现系统性胆汁酸水平升高。
  结论:
  本研究利用SIRPα全身敲除小鼠和SIRPα条件性敲除小鼠模型,系统地研究了SIRPα在肠道免疫稳态中调节作用和分子机制,本课题研究发现SIRPα的缺失能够引起肠道和淋巴结中CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1数量和比例的特异性减少;阻断SIRPα-CD47信号通路能够增强Mψ对特定DCs和T细胞亚群的吞噬作用,这一过程依赖于SLAMF7;小鼠肠道CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1数量的减少,导致肠黏膜上皮菌群数量增加和肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈通路受到抑制,进而引起系统性胆汁酸水平升高。综上所述,我们发现SIRPα依赖的CD103+CD11b+DCs在肠道免疫和代谢稳态中扮演着至关重要的角色。
[博士论文] 王钢
生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 主要围绕11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用进行研究。
  子痫前期是妊娠期特有的疾病,严重影响着母体和胎儿的健康,是导致孕产妇和胎儿发病死亡的主要原因之一。目前,针对子痫前期并没有有效的诊断和治疗措施,临床上最有效的治疗方法仍然是提前终止妊娠。胎盘被认为在子痫前期发病过程中起着至关重要的作用,因为随着胎盘的娩出,子痫前期的相关症状也会随之消失。但是,胎盘是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未完全阐明。近年来,子痫前期二元发病理论被广泛接受,即在子痫前期发病机制的第一阶段,由于胎盘发育不良滋养层细胞侵入能力受损,使胎盘滋养层细胞无法侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉,从而子宫螺旋动脉无法从高阻力,低容量的血管转变为低阻力,高容量的血管。由于子宫螺旋动脉重构障碍,胎盘无法得到充足的氧气和血液供应致使胎盘处于缺血缺氧的不良状态。之后,在子痫前期发病机制的第二阶段,胎盘处于缺氧缺血的状态下会释放大量有害的细胞因子进入到母体循环中,造成母体广泛的内皮功能紊乱,继而造成母体出现高血压,蛋白尿等症状。
  糖皮质激素在妊娠期间很多过程如胚胎着床,胎盘胎儿的生长发育以及胎儿的分娩中都发挥着重要的调节作用。糖皮质激素可以作用到胎盘、胎儿、胎膜等妊娠期组织。随着妊娠期的进行,母体和胎儿血液循环中的糖皮质激素水平都会随之升高,但母体循环中的糖皮质激素升高水平是胎儿侧的数倍。如果胎儿暴露在母体过量的糖皮质激素水平之下,会导致胎儿生长发育不良。胎盘中的11β-HSD2可以将有活性的糖皮质激素转变为无活性的糖皮质激素,从而可以阻止母体过量的糖皮质激素进入胎儿循环中。有研究显示,子痫前期产妇胎盘中的11β-HSD2表达是降低的,糖皮质激素水平是升高的。也有研究发现,妊娠期SD大鼠皮下注射地塞米松会导致大鼠出现高血压,蛋白尿等子痫前期相关症状。这些研究提示11β-HSD2可能参与到子痫前期的发病机制当中,但是11β-HSD2是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未阐明。由于子痫前期二元发病理论被广泛认可,那么,胎盘中11β-HSD2表达异常是否是通过抑制胎盘滋养层细胞侵入功能和促进胎盘释放有害细胞因子进入母体等过程参与到子痫前期发病过程中呢?因此,为了探究11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用,分别在整体动物和离体细胞水平上,进行了相关实验探索。
  结果:
  1、妊娠期间抑制11β-HSD2活性可以导致大鼠产生子痫前期相关症状。在大鼠妊娠期间(GD7.5-19.5)皮下注射11β-HSD2抑制剂CBX180μg/d、360μg/d、720μg/d,3种剂量观察抑制11β-HSD2之后是否会直接导致大鼠出现子痫前期的相关症状。结果显示:(1)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组胎盘中11β-HSD2蛋白表达减少并且活性受到抑制。(2)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。
  2、胎盘特异性抑制11β-HSD2活性导致妊娠期大鼠产生子痫前期相关症状。由于胎盘在子痫前期的发病过程中起着至关重要的作用,建立了胎盘特异性抑制11β-HSD2活性的妊娠期大鼠模型。动物实验分为五组:空白对照组(CON)、CBX180μg/2d、CBX-NPs、CBX-SRC、CBX-CSA。从GD7.5开始尾静脉给药处理,每两天1次持续到GD19.5。结果显示:(1)只有带有胎盘靶向多肽标签的CBX-CSA组大鼠胎盘中11β-HSD2的蛋白表达和酶活性是减少的。(2)胎盘特异性抑制11β-HSD2之后妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。
  3、妊娠期(GD7.5-19.5)皮下注射地塞米松(DEX)导致大鼠产生高血压、蛋白尿、肾损害等子痫前期相关症状。
  4、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以抑制胎盘滋养层细胞的侵入。PAS、α-actin、CK免疫组化染色结果显示,360μg/d和720μg/d两组全身给药动物模型和CBX-CSA组靶向给药动物模型胎盘中,滋养层细胞侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉功能受损。
  5、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以导致子宫胎盘血流灌注不足。多普勒超声结果显示,全身给药模型中360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠中子宫螺旋动脉,胎盘中母体通道,胎儿侧脐动脉内血流速度均受到抑制。
  结论:
  动物模型和离体细胞实验结果都表明,胎盘中11β-HSD2表达异常可以导致胎盘滋养层细胞侵入功能受损和血管生成因子与抗血管生成因子表达失衡,进而参与到子痫前期的发生发展当中。
  第二部分 主要围绕H2S对红细胞携氧功能的调节作用进行研究。
  H2S是继NO、CO之后被发现的第三类气体信号分子,可以参与调节人体很多生理和病理过程。H2S可以参与调节血管舒张,血管形成,炎症反应以及氧化应激等过程。机体是在L-半胱氨酸的相关代谢通路中产生H2S,其介导H2S产生的两种酶分别是胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)。CSE和CBS两种酶可以将同型半胱氨酸和胱硫脒代谢产生L-半胱氨酸,在产生L-半胱氨酸的过程中会伴随着H2S的释放。CSE与CBS两种酶在人体心血管系统,呼吸系统,神经系统之中广泛表达。有研究显示,在缺氧应激的环境下,机体很多组织和细胞如脑、肺、内皮细胞、心肌细胞等都会出现H2S生成减少的现象。课题组前期的研究也显示,胎盘在缺氧的状态下,CBS和CSE的蛋白表达降低,H2S的生成也随之减少。
  红细胞是人体血液中最常见的细胞,其主要的生理功能是负责氧气的运输。红细胞可以在肺脏中结合氧气使细胞内血红蛋白转变为氧合血红蛋白,之后红细胞随血液流经外周组织将血红蛋白携带的氧气释放到外周组织之中。氧气与血红蛋白的亲和性和氧分压的关系可以用氧离曲线表示。氧气与血红蛋白结合为50%时的氧分压称之为P50,其可以反应血红蛋白与氧气的亲和能力。血红蛋白与氧气的结合和释放受到很多因素如pH、温度、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-BPG)的调节。2,3-BPG可以变构调节血红蛋白的构象,使其与氧气亲和性降低,利于氧气的释放。2,3-BPG是通过红细胞内糖酵解通路产生的1,3-BPG在2,3-二磷酸甘油酸变构酶(bisphosphoglycerate mutase,BPGM)的作用下生成的。2,3-BPG可以被2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶降解,但是由于磷酸酶的活性较低,因此2,3-BPG在红细胞内蓄积并发挥作用。有研究显示,人体在缺氧的环境下,红细胞内的2,3-BPG表达升高,使血液在流经外周组织时释放更多的氧气。也有研究显示,人体在高海拔缺氧的环境下,随着缺氧时间的增加,血清中H2S的水平也随之减少。那么,H2S是否可以调节红细胞中2,3-BPG的表达进而调节红细胞的携氧功能呢?为了解决上述问题,设计了相关实验。
  结果:
  1、首先建立了Cse-/-基因敲除小鼠模型,之后收集野生型小鼠和Cse-/-小鼠的红细胞进行代谢组学的分析,结果显示,两组红细胞有30种差异代谢物,其中Cse-/-小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。代谢组的结果提示,H2S的减少可以导致红细胞中2,3-BPG表达升高。
  2、为了进一步验证H2S对红细胞携氧功能的调节,采用2,3-BPG检测试剂盒检测红细胞中2,3-BPG水平,结果与代谢组分析一致,Cse-/-小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。之后,外源性的注射H2S供体GYY4137之后可以逆转这一现象。同时,通过血气分析检测了红细胞的携氧功能指标氧离曲线和P50。结果显示,H2S减少同样会导致红细胞氧离曲线右移和P50升高。GYY4317处理Cse-/-小鼠之后可以逆转这一现象。
  3、为了探究血清中H2S的来源,建立了Cse-/-基因敲除小鼠与野生型小鼠骨髓移植模型,分为3组:野生型小鼠骨髓移植到野生型小鼠(WT-WT),野生型小鼠骨髓移植到Cse-/-小鼠(WT-Cse-/-)以及Cse-/-小鼠骨髓移植到野生型小鼠(Cse-/-WT)。结果显示,红细胞本身H2S的减少不会导致血清中H2S的改变,然而,外周组织H2S的减少会影响血清中的H2S水平。同时,红细胞携氧能力检测显示,外周组织H2S减少会导致红细胞2,3-BPG以及P50升高。GYY4317处理WT-Cse-/-组小鼠之后,可以逆转2,3-BPG以及P50的升高。
  4、为了探究H2S对红细胞的直接作用,离体培养了人和小鼠的红细胞,应用GYY4137(250μM,500μM)处理之后,检测红细胞携氧功能,结果显示,H2S可以抑制红细胞2,3-BPG和P50的水平并导致氧离曲线左移。
  5、为了探究H2S是通过何种机制调节2,3-BPG的水平,在整体动物模型和离体细胞水平检测了红细胞中BPGM酶活性的变化,结果显示,Cse-/-基因敲除小鼠红细胞中BPGM的酶活性升高,GYY4137注射处理之后可以逆转这一现象。人和小鼠离体细胞GYY4137处理之后,同样可以抑制红细胞中BPGM的酶活性。
  结论:
  H2S通过影响红细胞中BPGM的活性进而改变2,3-BPG的表达导致红细胞携氧功能的改变。
[博士论文] 王智巍
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上多种骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨结构修复重建,如创伤、肿瘤、骨折不愈合、骨组织发育不良、脊柱融合手术等等。骨结构修复重建是改善骨缺损患者日常生活质量、使其重新投入社会劳动的唯一有效方法,因此骨替代物的研究对社会发展具有极其重要的意义,也是骨组织工程的终极目标。
  目前已有数十种复合骨移植替代产品获美国FDA批准用于临床治疗,这些产品虽然具有良好的生物相容性,能一定程度上诱导成骨分化,但难以同时满足与宿主骨组织相匹配的机械性能和供成骨细胞渗透生长的合理三维孔隙结构,尤其在治疗大段骨缺损时,现有的骨移植替代物产品难以达到临床骨组织重建要求。鉴于天然骨组织特殊的生理微观结构,理想的骨替代产品应具备以下条件:(1)与宿主骨组织相匹配的机械强度;(2)恰当的孔隙率和孔隙结构;(3)利于细胞粘附、分化和增殖的表面结构;(4)良好的生物相容性以及与骨组织生长相适应的可控降解率。由此可见,当前的众多产品还远远达不到理想骨替代物的标准。如何改进骨替代原材料模拟构建骨组织结构技术,显得尤为重要。
  近年来,3D打印技术用于骨缺损的修复重建已成为一种新的热点及趋势,但单纯的3D打印支架成骨诱导和骨传导性能均欠佳,支架表面需要用一些具有骨诱导或成骨作用生物活性材料做修饰,才能改善其性能。目前用于表面修饰的材料主要是生物活性玻璃,生物陶瓷及纳米羟基磷灰石等,但上述材料成分均为无机物,且成骨诱导性能较差,表面修饰物中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)虽然能改善支架成骨诱导功能,但其确实效果有待进一步实验考证。
  脱钙骨基质(DBM)主要由93%的胶原(传导成骨表面活性物质)、5%的可溶性蛋白(诱导成骨的骨形态发生蛋白和转化生长因子、胰岛素样生长因子等协同蛋白)以及2%的残余矿化基质,是具有良好的诱导成骨、传导成骨特性的商业化生物材料。它以单独或联合其他材料的方式广泛用于骨折、骨不连、骨肿瘤、骨融合、股骨头坏死等手术。但是DBM缺少骨矿物质,因机械强度较差而难以成为理想的骨移植替代物。但若将DBM经过一定的物理方法进行颗粒尺度上的改变,而后作为3D打印支架的表面修饰,这有可能使支架在获得稳定机械强度的同时,增加支架的骨诱导性和骨传导能力。
  将材料纳米化并应用于骨缺损的修复成为近年来骨组织工程的研究热点。其研究方向主要集中于矿化机理、改善支架骨诱导性能、组织修复、药物载体、细胞载体及基因载体等医学领域的应用,国内外学者在这一领域已取得了良好的进展。但众多骨移植材料中鲜有关于纳米同种(异体)脱钙骨基质(nDBM)的研究报道。纳米材料具有特殊的比表面积效应,它极易与外来原子吸附键结合,表现的特性不同于它在整体状态时的性质。研究表明,骨髓间充质干细胞及成骨细胞对纳米尺度材料极其敏感,在60-150nm时尤为明显,纳米颗粒及粗糙的纳米凹槽结构可有效增加丝状伪足的感知能力,促进细胞扩散及粘附,使其在纳米纤维构成的三维微环境快速增殖。
  为此,本课首先通过改良Urist法制备冻干脱钙骨基质,运用二次低温物理研磨法将DBM研磨至纳米级别,电镜检测其粒径尺度并对其生物安全性进行系统评价。随后将实验组前期制备的PCL-TCP3D打印支架进行nDBM表面修饰,并通过体外细胞实验及动物骨缺损模型填充等实验,对其生物相容性及体内骨缺损修复效果进行评估。通过以上努力,发展具有中国自主知识产权的高生物安全性骨修复用生物材料的制备新方法,并为该种新型骨组织工程支架的进一步的应用提供科学依据。
  第一部分:nDBM的制备及性能检测
  目的:旨在通过物理研磨法将块状DBM处理至纳米级,并对研磨效果及材料的生物安全性进行检测
  方法:采用低温研磨法,先将DBM初步研磨至微米级别颗粒,再通过高能球磨机进行纳米尺度研磨,扫描电镜观测研磨效果及材料形貌。而后按医用生物植入材料安全标准ISO10993(GB/T16886)对nDBM行急性毒性实验、溶血实验、致敏试验及细胞毒性试验,评价材料的生物安全性。
  结果:经二次低温物理研磨后,所制得的nDBM底层致密,呈纤维状相互连接,纤维粗细不等,直径约40-80nm,表面充满不规则纳米颗粒,颗粒直径20nm-50nm左右,纳米颗粒相互团聚,表面密布纳米级别凹槽,纳米纤维结构间相互连接,内部形成大量相互连通的微米级别孔隙,其微观结构符合纳米生物材料范畴。实验结果证明,nDBM不引起实验动物急性毒性反应,溶血率复合生物材料安全性要求,无致敏现象发生,细胞毒性实验显示细胞增殖良好。因此,nDBM具有良好的生物相容性,可用于体内植入实验。
  结论:低温物理研磨法能成功将DBM纳米化,材料的生物安全性指标符合医用植入材料安全标准。
  第二部分:nDBM/PCL-TCP复合支架的构建及生物学性能检测
  目的:将nDBM修饰于PCL-TCP3D打印支架表面,并对各组材料的生物相容性及成骨诱导性进行检测。
  方法:采用浸泡冻干法将nDBM均匀负载于支架表面,通过扫描电镜观察复合支架构建效果,而后进行体外细胞学实验,CCK-8法检验骨髓间充质干细胞的增殖情况,实时荧光PCR、Westen bolt检测材料成骨诱导相关基因及蛋白的表达,并对统计结果进行分析。
  结果:采用75%的乙醇作为溶剂,按nDBM与稀释剂1∶5的比例浸泡后的支架,经冻干后,可使支架各纤维表面均匀覆盖nDBM颗粒,电镜扫描观察发现,nDBM与支架粘附良好,底层致密,表面布满大小不一的nDBM颗粒,纳米颗粒部分团聚,表面布满纳米级别凹槽,成功构建了一种新型的nDBM/PCL-TCP复合支架。通过CCK-8检测BMSCs的增殖情况,通过绘制细胞生长曲线,发现细胞在nDBM修饰的支架表面不断增殖,各时间点细胞增长数量均高于单纯PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架各成骨相关基因及蛋白表达水平明显高于单纯支架组。
  结论:采用冻干法能成功制备具有纳米级别表面结构的nDBM/PCL-TCP复合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架有利于BMSCs增殖并向成骨细胞方向分化。
  第三部分:nDBM对兔股骨和nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损修复的实验研究
  目的:评价nDBM对兔股骨缺损及nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损的修复能力。
  方法:建立兔股骨缺损模型,将nDBM填充入缺损部位并设立空白对照组;建立兔桡骨大段骨缺损模型,将nDBM/PCL-TCP复合支架植入缺损部位,对照组植入单纯PCL-TCP支架。术后一定的时间点处死动物取材,通过大体观察,Micro CT及组织切片染色等评价材料骨缺损修复情况。
  结果:大体观察见nDBM填充组骨缺损区皮质已基本愈合;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨缺损两端已有骨痂形成。影像学检查提示nDBM组骨修复效果优于空白组;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨痂明显生成,部分支架纤维表面甚至已形成骨桥,优于单纯PCL-TCP支架。组织切片染色显示nDBM修饰的复合支架孔隙内大量骨细胞长入、纤维形成,部分支架表面甚至形成板层骨,骨诱导及成骨性能均优于单纯PCL-TCP支架组。
  结论:nDBM/PCL-TCP复合支架能有效促进大段骨缺损区域骨再生与骨重建,PCL-TCP支架经nDBM修饰后,骨诱导与骨传导性明显增强,有利于新生骨向支架内长入。
[硕士论文] 曾敏
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  中国是终末期肝病(End stage liver disease,ESLD)的高发地区,肝移植是治疗终末期肝病最重要的有效手段,但由于供体不足,大量肝衰竭患者无法得到及时救治。随着再生医学的发展,工程化肝脏技术为终末期肝病的治疗带来了新的希望。虽然目前研究众多,但是种子细胞的来源、三维结构的构建、血管网络和胆管结构的重建等一系列技术问题仍未得到很好的解决,制约着肝脏组织工程的发展。至今为止,尚未有任何一款组织工程肝脏可在真正意义上走向临床。
  肝脏组织工程最佳的种子细胞选择当属人的原代肝细胞。但是,原代肝细胞在体外培养时会逐渐失去其形态学特征和肝细胞特异功能,且它的体外扩增一直是肝再生领域尚未解决的瓶颈问题,此外还必须考虑伦理限制和细胞来源匮乏的问题。现有的解决方法主要包括:使用永生化肝细胞株替代原代肝细胞;将各类干细胞在体外定向分化为功能性肝细胞;通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为诱导多能干细胞再进行肝向分化;将体细胞(例如成纤维细胞)直接基因重编程为诱导肝细胞。此外,近期研究团队和日本科学家几乎同时发现,通过小分子重编程技术,可以将小鼠的原代肝细胞去分化形成肝脏前体样细胞,该细胞可在体外进行规模化扩增,且分化后可重新获得成熟肝细胞的功能。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功能,但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性不高和致瘤风险等应用障碍。
  肝芽是具有发育能力和肝功能的初期肝脏组织,是肝脏发育的起源。最近,Takebe团队将人类诱导多能干细胞诱导分化的肝脏前体细胞(iPSC-HEs)与人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人类骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在体外进行混合培养,建立了一种培育肝芽的方法。将这些肝芽移植入小鼠体内后,会快速地生成血管结构并与小鼠本身的血管连接,还可以表现出部分人类肝脏所特有的功能。然而这些肝芽的规模太小了,不能形成胆管结构,无法在体外进行功能分化和长期维持,移植后也未能在体内发育成完整的肝脏功能模块,所以在将这种方法引入临床前还需要进行相当大量的研究及优化。
  结合上述问题,本研究通过实现人原代肝细胞的体外扩增,以及基于肝芽的形成构建了具有生理功能和三维立体形态的工程化肝脏。为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源,并为肝脏组织工程的构建开辟了新思路及新策略,对人类重要器官的再生和重建具有重要的科学意义。
  方法:
  1.通过两步灌流法分离获取人的原代肝细胞,用改良的肝细胞转化增殖培养基(TEM)进行扩增,并对增殖的肝细胞进行验证;
  2.将HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs按比例在体外混合培养,对形成的肝芽进行观察,并对其培养条件进行摸索和优化;
  3.采用ELISA、CCK8、生化检测以及PCR等检测手段确定体外培养的肝芽的细胞活力、肝细胞功能、以及是否具有肝胆双向分化的潜能;
  4.通过低温化学方法制备肝脏脱细胞生物支架,并对其进行去细胞效果、生物成分、形态结构以及细胞学毒性的检验;
  5.每上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,构建工程化肝脏,并在体外用搭好的循环灌注培养系统进行培养;
  6.对在体外构建的工程化肝脏在不同时间点进行肝功能评价和组织学评价。
  结果:
  1.发现在特定的培养条件刺激下,人的原代肝细胞可以在体外转化为HepLPCs来进行规模化扩增;
  2.来自于不同供体的、不同培养时间点的、不同代数的HepLPCs具有肝前体细胞的特征,且在长期的培养过程中能够保持稳定,具有高度的相似性;
  3.建立HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs三种细胞共培养体系,发现它们在体外混合培养后可以形成肝芽;
  4.肝芽在体外维持培养时细胞的损伤和凋亡情况不明显,肝功能没有稳定上升,但胆系转录因子有所提高,发现肝芽存在向胆管分化的潜能;
  5.制备有效去除细胞成分、形态结构以及基质成分保存良好的肝脏脱细胞生物支架;
  6.基于肝芽的形成,将上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,在体外构建具有生理功能和三维立体结构的工程化肝脏,并进行维持培养。12天后,观察到类胆管结构。
  结论:
  本研究通过对培养条件进行改良和优化,用小分子重编程技术使得人的原代肝细胞在体外可以去分化为HepLPCs来进行增殖,为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源。随后发现HepLPCs可以与HUVECs和hUC-MSCs在体外混合培养形成肝芽。基于这种肝芽的形成,将三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,经过灌注培养构建了具有三维立体结构和生理功能的工程化肝脏。我们的研究能够为肝脏组织工程的构建提供新的思路,对人类重要器官再生和重建具有重要的科学意义。
[硕士论文] 王宾宾
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  因创伤、炎症、肿瘤、先天畸形等因素导致的寰枢椎生理关系破坏或运动功能异常称为寰枢椎不稳和/或寰枢椎脱位。作为常见的上颈椎疾患,因其易导致延髓、脊髓受压出现四肢感觉、运动功能障碍甚至死亡等严重后果。因此,对于寰枢椎脱位,临床上多采用手术治疗。主要的手术方式有经口前路复位植骨融合内固定、后路寰枢椎复位植骨融合内固定、后路枕颈融合内固定以及前后联合入路手术。后路手术因术野显露充分、固定切实牢靠、并发症少等优点在临床广泛应用。随着内固定器械的更新换代以及相关解剖学与生物力学知识的发展,内固定技术也由早期的线缆技术、椎板夹技术到一度被认为是金标准术式的经关节螺钉内固定技术(Magerl技术),再到如今应用最为广泛的钉棒技术。每一种内固定技术的出现都极大地促进了后路寰枢椎内固定水平及临床救治能力的提升。
  寰枢椎椎弓根螺钉或侧块螺钉固定因良好的生物力学稳定性、较高的植骨融合率及灵活多样的组合形式经久不衰,已成为后路寰枢椎内固定的首选术式。但因寰椎位置深在,毗邻复杂及解剖变异,显露及置钉过程中存在损伤椎动脉、C2神经根、静脉丛的风险导致术中出血增加及术后枕后区麻木,甚至出现无法置钉的情况。另外,现有的寰椎内固定方法对手术器械及术者的技术要求较高,且学习曲线长,不利于推广应用,导致相当一部分患者被迫接受了枕颈融合内固定手术,从而使颈部活动丢失,严重的影响了生活质量。因此,需要一种既能有效降低寰椎置钉风险与置钉难度同时又可提供足够稳定性的内固定技术。该技术既可作为寰椎椎弓根螺钉或侧块螺钉固定的良好补充,又可作为后路寰枢椎翻修的可选术式。国外曾有文献报导寰椎后弓锁定钉板系统,但其设计尚存部分缺陷且规格参数完全按照欧美人种设定,不完全适用于国人且国人相关解剖学数据尚属空白。为此,本课题通过CT与人寰椎骨标本两个方面测量健康成人寰椎后弓系列解剖参数并依据所测得数据初步设计成人寰椎后弓板,通过三维有限元分析探究后弓板的应力分布情况及三维稳定性,经过体外生物力学试验进一步探究其生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供参考。
  目的:
  1、对健康成人寰椎三维螺旋CT及健康寰椎骨标本进行测量,获取寰椎后弓相关的解剖参数,并依据所测数据初步设计寰椎后弓板。
  2、建立寰枢椎不稳的三维有限元模型并分别模拟寰椎后弓板内固定及后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定,初步探究后弓板的应力分布情况及三维稳定性。
  3、建立寰枢椎不稳的体外模型并分别进行寰椎后弓板与后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定,测量并比较各组模型中C1-C2节段三维活动度(ROM),进一步评价寰椎后弓板的生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供依据。
  方法:
  1、通过医学影像存档与通信系统(PACS),随机抽取60例(男30,女30)成人寰椎三维CT(simenz)影像资料并用自带测量工具测量后弓相关解剖结构。选取30例(年龄、性别不详)干燥寰椎骨标本,应用国产游标卡尺(精确度0.01mm)及角度测量仪(精确度0.01°)测量后弓相关解剖结构。测量内容为:后结节中央及距中央5mm、10mm、15mm处后弓高度(矢状面垂直距离)及厚度(轴位距离)、水平面后弓夹角、内侧面椎动脉沟半距、外侧面椎动脉沟半距,并根据测得数值初步设计寰椎后弓板。
  2、查阅相关文献,利用Mimics10.01、Geomagic Studio2013、SolidWorks2017、Abaqus6.14等有限元分析软件,设定相关参数,建立寰枢椎完整状态、失稳状态、寰椎后弓板+枢椎椎弓根钉棒内固定、寰枢椎椎弓根钉棒内固定的三维有限元模型并进行分析,探究后弓板的应力分布情况;测量各组模型在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个方向的C1-C2节段ROM,比较各组间ROM有无差异,初步评价寰椎后弓板的科学性及稳定性。
  3、应用人体颈椎骨标本建立寰枢椎完整状态、失稳状态、寰椎后弓板+枢椎椎弓根钉棒内固定、寰枢椎椎弓根钉棒内固定的体外模型,验证模型有效性后测量各组模型在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM,比较各组ROM值有无差异,进一步探究寰椎后弓板的生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供参考。
  结果:
  1、获得了国人成人寰椎后弓系列解剖参数并据此初步设计了寰椎后弓板。
  2、建立了寰枢椎失稳的三维有限元模型,共包含53346个单元,62348个节点,较真实地模拟了相关材料特性,并进行了有效性验证。
  3、应用已建立的三维有限元模型,分别模拟了后弓板内固定与后路椎弓根钉棒内固定,并进行了应力分布测试及前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM测量。
  4、有限元分析结果显示寰椎后弓板应力分布均匀,未出现明显应力集中情况;失稳模型组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著高于完整模型组;后弓板内固定组与后路椎弓根钉棒内固定组在上述各运动方向的C1-C2节段ROM值均显著低于完整模型组;后弓板内固定组在各运动方向的C1-C2节段ROM值与后路椎弓根钉棒内固定组在相应运动方向的C1-C2节段ROM值相比均未见明显统计学差异。
  5、建立了寰枢椎体外模型,分别测量了完整状态组、失稳状态组、后路椎弓根钉棒内固定组、后弓板固定组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个方向的C1-C2节段ROM并进行了组间差异性比较。
  6、体外生物力学试验结果显示失稳模型组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著高于完整模型组;后弓板内固定组与后路椎弓根钉棒内固定组在6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著低于完整模型组及失稳模型组;后弓板内固定组在各运动方向的C1-C2节段ROM值与后路椎弓根钉棒内固定组在相应运动方向的C1-C2节段ROM值相比均未见明显统计学差异。
  结论:
  1、解剖学研究提示寰椎后弓板适用于90%以上人群,具有较高的可行性。
  2、三维有限元分析提示寰椎后弓板应力分布均匀,设计科学。
  3、生物力学研究表明寰椎后弓板内固定与传统后路椎弓根钉棒内固定生物力学稳定性相当,有望成为现有后路钉棒内固定技术的良好补充。
[硕士论文] 刘智慧
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  本研究旨在呈现首发缺血性脑卒中患者自急性发病住院至出院后6个月内的心理弹性水平及变化情况,分析影响心理弹性水平及变化的因素。同时探究首发缺血性脑卒中患者心理弹性水平对卒中后抑郁、生活质量的影响。
  研究方法:
  采用纵向研究设计,于2017年2月到2018年1月通过便利抽样法从上海市两所三甲医院神经内科病房取样。共纳入符合纳入与排除标准的首发缺血性脑卒中患者228例。在患者及家属充分知情同意后开始问卷调查。采用电话随访与上门随访相结合方式,调查时间点:急性住院期、出院后1个月、出院后3个月、出院后6个月。
  调查工具:一般资料调查表、改良Rankin量表(mRS)、功能独立性评测(FIM)、心理弹性量表(CD-RISC)、医学应对问卷(MCMQ)、一般自我效能感量表(GSES)、综合性医院焦虑抑郁量表(HAD)、脑卒中专用生活质量量表(SS-QoL),分别用于测量患者的人口社会学资料、疾病相关资料、心理弹性水平、应对方式、自我效能感、情绪、生活质量。
  统计分析方法:使用SPSS22.0软件包对数据进行描述性分析及预测作用的logistic回归分析;运用增长混合模型(Grouth Mixed Model,GMM)对首发缺血性脑卒中患者人群心理弹性的进行异质性检验;使用MIXED程序分析不同时期患者心理弹性水平变化及其影响因素、心理弹性水平对抑郁情绪及生活质量的影响。
  研究结果:
  随访完成情况:共纳入228例患者,其中204例全程参与4次调查,217例完整参与了2次及以上随访,失访率8.9%。研究过程中复发9例,复发率4.15%,死亡1例,死亡率0.46%。
  不同时期心理弹性水平及变化趋势:研究对象急性住院期心理弹性均分62.19±14.03分,并在发病至出院后6个月内整体呈下降趋势,平均每个月下降3.0783分(p=0.0003)。研究对象的心理弹性变化过程具有群体异质性,获得四个潜类别轨迹组:高弹下降组(9.3%)、低弹成长组(4.9%)、临界平稳组(55.9%)、中弹降低组(29.9%)。各组在人口学、疾病相关资料以及心理因素方面具有差异性。
  心理弹性影响因素分析:首发缺血性脑卒中患者的心理弹性水平及变化趋势受宗教信仰、工作状态、居住状况、吞咽功能、住院天数、照顾类型、自我效能感、应对方式的影响。在控制了其他因素后:有宗教信仰比没有宗教信仰的患者的心理弹性水平高(p=0.0003);患病前在职比非在职的患者的心理弹性水平低(p=0.0274);患病前独居的患者比与家人合住的患者的心理弹性水平高(p=0.0147);发病入院洼田饮水试验阳性患者比试验阴性的患者的心理弹性水平低(p=0.0446);急性住院期时在三甲医院住院时间长的患者比住院时间较短的患者心理弹性水平高(p=0.0309);由亲属照顾的患者比无人照顾的患者的心理弹性水平高(p=0.0096);自我效能感越高,患者的心理弹性水平越高(p<0.0001);发病后采用面对应对策略越多,心理弹性水平下降速度越慢(p<.0.0001);对疾病采取屈服应对策略越多,心理弹性水平越低(p<0.0001)且心理弹性水平下降速度越快(p=0.0188)。
  心理弹性水平与抑郁的关系:不同时期心理弹性水平与抑郁有较大的负相关关系(ρxy=-0.7620),在控制了人口社会学因素、疾病相关因素、焦虑情绪因素后,心理弹性(CD-RISC评分)每增加1分,抑郁(HDAd评分)水平得分降低0.1027分(p<0.0001)。首发缺血性脑卒中患者在急性发病住院时的心理弹性水平对卒中后抑郁的发生具有一定预测作用:心理弹性低分组(得分低于65.4分)患者在出院后1个月、3个月、6个月发生抑郁风险较心理弹性高分组(65.4分以上)高3.46、2.31、32.33倍。
  心理弹性水平与生活质量的关系:剔除重复测量水平间相关性后,患者心理弹性与生活质量具有较大正相关关系(ρxy=0.6541);在控制了其他因素后,患者心理弹性(CD-RISC)每增加1分,生活质量得分(SS-QoL)水平得分提高0.2623分(p<0.001)。
  心理弹性、抑郁、生活质量的关系:在患者急性发病住院至出院后6个月的不同时期,心理弹性始终对抑郁情绪发挥缓冲作用,且随着时间的推移,心理弹性对抑郁的负向作用逐渐增大;心理弹性始终对生活质量发挥正向作用,心理弹性既可以直接影响生活质量,又可以通过改善抑郁间接提高生活质量,总效应达0.33以上。
  研究结论:
  心理弹性是首发缺血性脑卒中患者的重要积极心理学因素,对抑郁具有缓冲作用,并可通过直接、间接作用正向影响患者的生活质量。医护人员可通过患者在急性住院期的心理弹性水平间接预测患者出院后不同时期的抑郁发生风险,以便尽早对高危人群实施干预从而预防卒中后抑郁的发生;首发缺血性脑卒中患者的心理弹性在发病半年内呈较低水平并有随时间下降趋势,其水平及变化趋势受到宗教信仰、工作状态、居住状况、吞咽功能情况、住院天数、照顾类型、自我效能感、应对方式的影响,医护人员可通过干预以上影响因素提高患者的心理弹性水平,进而减少抑郁的发生,提高患者的生活质量。
[硕士论文] 陈翔
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  上颌第三磨牙萌出时间较晚,而且位于上颌牙弓最末端,往往由于萌出空间不足而埋伏或阻生,常引起一系列的并发症。在临床上处理其根管时多面临视野不佳、操作难度大、根管形态结构变化大及牙根存在弯曲等因素而影响治疗效果,故一般建议拔除。上颌第三磨牙拔除术虽相对简单,但由于其解剖结构变异性大,仍有可能发生严重的并发症。同时随着口腔技术的提高与器械材料的发展,将上颌第三磨牙作为自体牙移植供牙、作为基牙修复邻近牙缺失,甚至纳入正畸范畴的技术广泛应用于临床,对上颌第三磨牙进行根管治疗也成为常规操作。无论是上颌第三磨牙拔除术或是对其进行根管治疗都需要医师对上颌第三磨牙的解剖学结构熟悉掌握。锥形束CT(cone beam computed tomagraphy,CBCT)可构建高精度的三维影像,且属于非侵袭性操作,近年来在阻生牙拔除术术前检查及根管系统研究中应用较多。本研究通过CBCT对上颌第三磨牙解剖学结构进行观测及分析,以期为各种临床操作尤其是以上颌第三磨牙为供体的自体牙移植术提供参考依据,以达到提高诊疗效果的目的。
  方法:
  回顾性分析本院口腔种植门诊2016年2月~2017年2月收治的620例患者的第三磨牙(708颗)CBCT的影像学资料。数据经由计算机软件导入,观察第三磨牙两侧牙根数目、根管形态分类、根管类型分布等数据,并分析上颌第三磨牙根管数目与性别的关系、牙根与上颌窦窦底的关系(A类:牙根根尖和上颌窦窦底处于同一水平;B类:牙根根尖水平比上颌窦窦底高;C类:牙根根尖水平比上颌窦窦底低)。采取SPSS21.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。通过本次研究结果作为解剖学的依据,来指导临床进行以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植手术。
  结果:
  708颗上颌第三磨牙牙根数目方面,三根牙占40.40%,其次依次是融合根牙占39.26%,双根牙占18.36%,四根牙占1.98%;按照左右位置的不同可分为:三根牙(左侧占40.11%,右侧占40.69%)最多,融合根牙(左侧占38.44%,右侧占40.11%)次之,后面依次是双根牙(左侧占18.94%,右侧占17.77%)与四根牙(左侧占2.51%,右侧占1.43%),左右两侧牙根数目比较差异无统计学意义(P>0.05);
  708颗上颌第三磨牙根管形态分布方面,三根管占48.73%,其次依次为单根管占27.12%,双根管占17.09%,四根管占7.06%;单根管的男性占26.94%,女性占27.30%;双根管的男性占17.22%,女性占16.95%;三根管的男性占48.33%,女性占49.14%;四根管的男性占7.50%,女性占6.61%,男、女上颌第三磨牙根管形态比较差异无统计学意义(P>0.05);
  低位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占15.29%、4.55%、80.16%,中位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占33.19%、10.21%、56.60%,高位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占55.84%、14.72%、29.44%。
  上颌第三磨牙萌出方向为垂直位关系的数量最多,占72.04%,其中腭向倾斜位较为少见,仅为2.41%;萌出方向为远中位关系的牙齿数量其次,占22.88%;萌出方向为近中位关系的数量最少,占5.08%。
  上颌第三磨牙各侧骨壁中腭侧的厚型骨壁的数量最多,占55.80%;远中骨壁的厚型骨壁数量最少,占15.12%。
  在以CBCT提供的上颌第三磨牙的解剖学资料的指导下,将其作为供牙的自体牙移植术成功率较高。
  结论:
  上颌第三磨牙的解剖形态与位置复杂多样且变异较大,运用CBCT可明确了解其牙体形态和与相邻解剖结构之间的关系,能为阻生牙拔除术提供重要的指导并减少并发症的发生;同时通过CBCT对上颌第三磨牙根管形态的研究,能指导临床医师了解上颌第三磨牙根管形态的类型,明显提高对其根管治疗的成功率。因此能提高以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植术及其他临床治疗的成功率。
[硕士论文] 陈梦佳
神经生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:嗅觉是动物重要的感官之一。哺乳动物的嗅觉系统主要由位于中枢的嗅球、嗅皮质和位于外周的嗅粘膜组成。嗅粘膜又分为嗅上皮层和固有层。嗅上皮层主要包含基底细胞,嗅受体神经元和支持细胞。其中,基底细胞位于嗅上皮的基底层,紧贴固有层,是嗅上皮的干细胞。嗅受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)是嗅觉系统的一级神经元,它位于嗅上皮基底层的上方,由基底细胞分化而来。伴随着ORNs分化成熟的过程,其胞体从上皮基底层向顶端迁移,使得不同分化程度的ORNs位于不同的细胞层面,其中未成熟ORNs的胞体靠近基底层,而成熟ORNs的胞体位于未成熟ORNs上方接近上皮顶端。嗅上皮的发育对于维持动物正常嗅觉功能至关重要。嗅神经元的发生是一个极其复杂的过程,包括嗅上皮干细胞的增殖、分化和成熟等几个阶段,每个阶段都受到严格的调控,但是人们目前对其调控机制了解十分有限。
  血红素结合蛋白Hemopexin是一种血浆糖蛋白,属于炎症相关的急性期蛋白家族。有趣的是,hemopexin在外周神经系统中也有表达,并且在神经轴突变性的过程中表达上调,提示hemopexin可能参与了神经损伤的再生过程。Hemopexin分子和基质金属蛋白酶和玻连蛋白都有一个由两个四叶β-螺旋组成的相同结构域,称为血红素结合蛋白样结构域。研究表明,后两者可通过其参与调节多种细胞的增殖和分化并能调节神经发生过程等。目前尚没有Hemo、exin参与了神经发生的相关报道。为了深入认识Hemopexin在神经系统发育中的作用,本研究运用基因敲除小鼠模型,分析了Hemopexin在嗅上皮神经发生过程中的作用及机制。
  取得的主要结果如下:
  1、对hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮形态学分析显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮变薄、上皮的细胞总数减少;嗅上皮的成熟ORNs减少,而未成熟ORNs增加,并且未成熟的ORNs结构层次产生异常。
  2、运用免疫组化等方法,进一步发现hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮增殖细胞数量无明显改变,而凋亡细胞增多;嗅上皮的干细胞HBCs无明显异常。
  3、嗅觉功能检测显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅觉识别能力仍然存在,但是区别结构相似气味的精细嗅觉功能丧失。
  综上所述,我们发现hemopexin在嗅上皮的神经发生过程中发挥了重要作用,具有促进ORNs的成熟,抑制其凋亡以及维持精细嗅觉的功能。本研究不仅助于揭示嗅上皮神经发生调控过程的新机制,有助于深入认识神经发育的机理,而且为hemopexin蛋白对嗅觉功能障碍相关疾病的潜在治疗价值提供理论依据。
[硕士论文] 蔡晓敏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  由于上颈椎周围的神经血管结构复杂,上颈椎前外侧入路手术在技术上要求很高。临床上可以采取高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)处理上颈椎病变。上颈椎前外侧入路的解剖结构对于进行安全的上颈椎手术至关重要,通过以上两种入路显露上颈椎,记录入路中遇到的重要解剖结构,并对比两种入路区别。
  研究方法:
  使用经10%福尔马林充分固定的颅颈完整的成人湿性尸体标本10具,对左右侧均先进行高位颈前咽后入路解剖,显露上颈椎,而后模拟标准颈前路显露上颈椎,获得共20组数据。在解剖过程中,记录所有解剖标志、重要的神经血管结构,特别是限制暴露的结构。测量神经血管结构出动脉鞘和入内脏鞘点至喉结的垂直距离、直接距离等解剖数据,分析他们与颈椎体、椎间盘解剖关系,并对比两种入路中区别。最后将数据进行统计学分析。
  研究结果:
  1、上颈椎前外侧入路中的重要神经血管结构,不存在左右侧显著性差异;舌下神经、喉上神经等是限制暴露的主要结构。2、有4例喉结相当于C5水平。3、舌下神经和舌动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,鞘膜之间走行部分大多位于枢椎水平。喉上神经内支与喉上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C3,入内脏鞘点大多位于C4。喉上神经内支和舌下神经伴行的垂直距离及直接距离具有显著性差异。喉上神经外支与甲状腺上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C4,入内脏鞘点大多位于C5,与喉结相当靠近,且13/20位于喉结下方。喉上神经内外支入内脏鞘点的垂直距离、直接距离及椎体水平具有显著性差异。
  研究结论:
  1、在上颈椎前外侧入路中,二腹肌为寻找舌下神经的重要标志。2、舌下神经和喉上神经是妨碍上颈椎前外侧入路的重要解剖结构。3、在前外侧入路中,喉结是定位神经血管结构、椎体水平及选择手术切口的重要参考。4、高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)均是处理上颈椎病变的有效方法。高位颈前咽后入路能够更好地显露,可提供C2/3椎间盘处的垂直视角,向上可显露至斜坡下1/3,但需将喉上神经、喉上动脉及舌下神经、舌动脉完全解剖游离,并分别向下、向上牵拉。5、标准颈前路无需特意将血管、神经解剖游离,选择距喉结上方垂直距离约13~21.8mm的切口,从靠内脏鞘一侧进入,一般上从喉上神经外支和甲状腺上动脉上方及舌下神经和舌动脉下方,显露上颈椎,损伤血管神经的概率较低,较为安全。但标准颈前路只能提供C2/3椎间盘处的斜视角,且显露寰枢椎及斜坡困难,易损伤神经血管。所以当病变局限于枢椎体或C2/3椎间盘病变时可考虑采用标准颈前路。
[博士论文] 沈奇骢
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:表观转录组学(Epitranscriptome)是生命科学领域新兴的前沿研究热点,主要关注各种RNA水平的修饰,及其在细胞转录组中的分布和表观调控作用,如近年来被广泛研究的6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)修饰在生理状态下存在于包括mRNA的多种RNA中。然而作为一种可逆的化学修饰,其动态调控机制还不清楚,特别是还没有发现其特异性的去甲基化酶。另外,作为一种在哺乳动物RNA中普遍存在的修饰方式,其生理和病理功能尚不清楚,特别是其在基因表达调控中的功能尚有待于深入研究。研究mRNA中5-mC的调控及其功能是表观转录组的一个重要方向。Tet蛋白(Ten-eleven Translocation,Tet)作为DNA甲基化的氧化酶,也能够在体外氧化RNA中5-mC。Tet蛋白是否在哺乳动物细胞中调控mRNA中的5-mC修饰,其在不同的生理过程中发挥着怎样的调控作用?这些科学问题有待进一步研究。
  天然免疫是抵御病原体的第一道防线,如何快速高效的识别和清除病原体,并维持免疫稳态,是天然免疫的根本科学问题。病原体感染激活免疫系统,诱导炎症反应,产生各种细胞因子进一步动员造血干细胞向髓系细胞分化,放大天然免疫应答效应是机体快速清除病原体的重要手段。髓系发生(Myelopoiesis)是急性或慢性感染的关键应答反应,其表观遗传学机制尚未见报道,值得探究。Tet2不仅在造血干细胞的自我更新和分化中发挥着重要的调控作用,多项研究也发现Tet2在造血系统多种恶性肿瘤中存在多位点突变,且Tet2基因突变导致的催化功能缺失与造血系统恶性肿瘤的发生发展密切相关,特别是在髓系恶性肿瘤中,表明Tet2可能是一种重要的抑癌基因。此外,Tet2在炎症消退过程中也发挥着重要的调控作用。Tet2是否也参与病原体感染诱导的髓系免疫细胞分化还有待研究。
  本课题围绕Tet2是否参与感染诱导的髓系发生及其表观调控机制展开研究。发现,Tet2能够通过抑制Socs3的mRNA水平而促进脓毒症感染和寄生虫感染诱导的髓系免疫细胞的分化扩增。Tet2通过Adar1抑制Socs3的表达,Adar1通过结合双链RNA并以RNA编辑非依赖的方式降低Socs3mRNA的稳定性。进一步机制研究发现Tet2抑制了mRNA上5-mC的水平,Tet2缺失导致Socs3mRNA3'-UTR区域5-mC水平上升,可能通过5-mC特异性的结合蛋白影响该区域RNA双链的形成,从而减少Adar1的结合。本研究揭示了DNA甲基化氧化酶Tet2分子能够促进感染诱导的髓系天然免疫细胞的发生,从而促进机体对病原体的抵抗能力,为机体抵抗病原体感染的效应机制提出了新观点,也为有效防治感染性疾病提供了新思路和潜在药物研发靶标。同时,Tet2一直被认为是通过调控染色质状态来介导基因转录水平的调控,而本研究首次提出了Tet2作为RNA结合蛋白能够在mRNA修饰水平参与转录后调控的全新功能,为进一步研究Tet2的生理病理功能开辟了新的研究方向。
  第一部分 Tet2通过抑制Socs3的表达而促进感染诱导的髓系免疫细胞分化
  在病原体感染过程中,机体需要从骨髓大量动员免疫细胞到外周血,以快速高效地清除入侵的病原体。同时,刺激造血的细胞因子以及炎性细胞因子促进了更多髓系细胞的发生。为了观察Tet2在此过程中的作用,首先构建了盲肠结扎穿孔诱导脓毒症的小鼠模型,发现Tet2缺失显著降低小鼠脓毒症CLP模型的死亡率和临床评分,其原因主要是Tet2缺失使得髓系终末细胞的动员显著降低而避免了炎症因子风暴导致的组织器官损伤;另外还构建了血吸虫感染(慢性感染模型)诱导肥大细胞分化扩增的模型,发现Tet2缺失也能够抑制寄生虫感染诱导的肥大细胞的分化。说明Tet2在病原体感染诱导的髓系细胞分化中起着关键作用。为了进一步探究Tet2促进髓系发生的分子机制,对野生型和Tet2敲除的骨髓来源的肥大细胞进行了表达谱分析,发现PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路的多个基因在Tet2缺失细胞中表达有显著变化,其中包括JAK-STAT信号通路的关键抑制分子Socs3。进一步检测发现Tet2敲除的造血祖/干细胞和肥大细胞中IL-3诱导的Socs3mRNA和蛋白水平显著增高,并且Tet2敲除细胞中,IL-3信号通路活化障碍,STAT5和AKT的磷酸化水平降低。而在Tet2敲除的细胞中通过siRNA沉默Socs3的表达后,IL-3信号通路活化水平有所恢复。这些结果提示Tet2通过抑制Socs3的表达,从而促进IL-3等细胞因子信号通路的活化,这可能是Tet2促进病原体感染诱导髓系免疫细胞发生的关键机制。
  第二部分 Tet2通过Adar1在转录后水平抑制Socs3的表达
  进一步研究Tet2抑制Socs3表达的分子机制,发现Tet2抑制Socs3的表达并不是通过调控Socs3基因区的DNA甲基化水平,而是在转录后水平。这一结果提示了Tet2作为一种RNA结合蛋白可能具有广泛的转录后调控功能。通过构建紫外交联免疫共沉淀结合高通量测序体系,在全基因组范围内寻找Tet2结合的靶RNA分子。结果发现Tet2结合的RNA种类中,80%属于已知基因转录的mRNA,其中包括Socs3的3'-UTR区域。同时在RNA-seq数据中,发现野生型对照组中A-to-G突变的数目显著高于Tet2敲除组,且更多富集于mRNA的3'-UTR区。Socs3mRNA的3'-UTR区域也包含A-to-G突变位点。Adar1结合双链RNA并介导A-to-I编辑,提示Adar1可能参与这些位点的编辑。在野生型细胞中干扰Adar1后Socs3表达上升,但报告基因结果显示Adar1对Socs3的调控不依赖其酶催化活性。有文献报道Adar1能够其他RNA结合蛋白在转录后水平调控基因表达,而不依赖其RNA编辑功能。通过免疫共沉淀联合质谱检测发现,Adar1能够与调控mRNA稳定性的RNA结合蛋白结合,可能通过这些蛋白发挥抑制Socs3的功能。通过进一步探究Tet2在Adar1介导的Socs3抑制功能中的作用,发现在Tet2敲除细胞中干扰Adar1不能升高Socs3的表达,结合过表达实验发现,Tet2以酶活性依赖的方式促进Adar1对Socs3表达的抑制作用,而同时又不依赖于其DNA结合功能。
  第三部分 Tet2通过抑制mRNA中5-mC的水平而参与Socs3的转录后抑制
  Tet2能将DNA上的5-mC催化氧化成为5-hmC,同时,RNA上的5-mC修饰也被发现存在果蝇和人类细胞系中。为了研究Tet2能否通过氧化的方式降低mRNA中5-mC,构建了Tet2体外催化体系,通过质谱和点杂交检测发现Tet2能够在体外和体内以底物依赖的方式降低mRNA上的甲基化修饰水平,并且在Tet2敲除细胞中,发现mRNA上的5-mC修饰水平升高。而野生型细胞中胞嘧啶上的其他甲基化氧化修饰5-hmC、5-fC和5-caC的含量则很低。通过建立RNA甲基化组分析,发现在mRNA上存在5-mC修饰,且在Tet2敲除细胞中5-mC水平显著升高。以上结果说明Tet2能够以氧化依赖的方式抑制mRNA上5-mC的水平。进一步实验发现5-mC的存在能够抑制Adar1与其靶RNA的结合。DNA或者RNA的修饰能够招募特异性蛋白发挥表观调控功能,通过RNA5-mC结合蛋白实验分析,发现5-mC能够结合一些ATP依赖的RNA解旋酶,这些蛋白跟RNA二级结构的改变和双链解旋有关,而Adar1结合双链RNA。以上结果说明mRNA上的5-mC修饰能够抑制Adar1功能,可能是通过抑制双链RNA的形成使Adar1结合减少的原因。
  综上所述,Tet2能够通过氧化依赖的方式降低mRNA上5-mC修饰的水平,Tet2的缺失使mRNA上5-mC修饰的水平升高,从而抑制Adar1的功能。发现Tet2可能通过抑制5-mC水平促进双链RNA的形成,而双链RNA是Adar1结合所必需的。结合野生型和Tet2敲除细胞中转录组突变位点的对比分析,也揭示了Tet2和Adar1功能上的广泛联系。此外,还发现,内源性mRNA上5-hmC的数量远远少于5-mC,说明从5-hmC如何转换为未甲基化的胞嘧啶需要其他的酶或者更多催化步骤。Tet2在转录后水平降低JAK-STAT信号通路的关键负调控分子Socs3的mRNA的稳定性,维持了细胞因子如IL-3信号通路的持续活化,促进了病原体感染诱导的髓系天然免疫细胞的分化,为抗感染免疫的表观调控提供了新的机制。
[硕士论文] 刘清桂
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞衰老是指在DNA损伤、端粒酶活性丢失等内在因素和细胞间通讯改变、体液循环因子改变等外在条件的刺激下,细胞发生一系列形态结构的改变,导致细胞永久性退出分裂周期,无法发挥正常生理功能。而衰老细胞的累积会导致组织器官的衰老,进而引发组织器官衰老问题,如机体的结构和功能异常和各种衰老相关疾病的发生。
  肝脏是一个以代谢为核心功能的器官,而肝细胞是肝脏组织中最主要的实质细胞。胆汁合成、肝糖贮存、脂质代谢等多种肝功能都是由肝细胞来承担的。随着年龄增长,老年肝脏肝细胞的形态、结构和功能发生了一系变化,比如肝细胞体积变大,数量减少、增殖能力降低、肝细胞核出现空泡,胞质出现脂褐素沉积、DNA含量异常,巨核肝细胞比例升高等。然而,由于衰老肝细胞的结构改变和功能异常,导致老年个体更容易发生各种肝脏疾病。比如老年个体容易出现肝脏脂肪性病变,老年小鼠中应对CCl4等化学药物的能力下降,肝脏的炎症水平升高,加速肝脏纤维化病症的发生发展。由此可见,肝细胞衰老与肝脏疾病发生发展紧密相关。因此,探寻肝细胞衰老逆转的途径是老年肝脏疾病治疗的必然要求。然而由于肝脏衰老模型小鼠缺乏等各种困难,目前仍无法获得肝细胞衰老逆转的深入研究。
  本项目研究中,基于联体共生模型,使得联体的两只小鼠可以共享彼此的血液微环境途径而用来探讨微环境对肝细胞衰老逆转的作用。首先,分别建立了2月龄和24月龄小鼠间联体(联体的2月龄为Het-Y,联体的24月龄小鼠为Het-O)、相同月龄的年轻小鼠间联体(联体的同月龄小鼠都称为Iso-Y)和相同月龄的老年小鼠间联体(联体的老年小鼠都称为Iso-O)3种联体共生模型。通过流式分析结果显示联体小鼠间血液交换率接近50%。成功构建联体共生模型后,使得联体小鼠共同生活5周,然后分别对不同组联体小鼠肝脏肝细胞进行生物学特征和肝细胞功能的分析,评价年轻微环境对衰老肝细胞逆转的作用。细胞衰老相关指标的检测结果显示,在年轻血液微环境的作用下,与Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal阳性率从38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X阳性率从53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指标细胞周期抑制因子P53、P21和P16的表达明显降低(p<0.01);炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平也降低(p<0.01)。其次,老年小鼠肝脏多倍体肝细胞数量增加,而多倍体肝细胞发生衰老的可能性增加。通过肝细胞比例分析发现,在年轻微环境的作用下,与Iso-O相比,老年小鼠八倍体肝细胞比例从33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍体肝细胞比例从7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。进一步对肝细胞数目和大小进行分析,结果显示,在年轻微环境作用下,相同视野范围内,老年肝脏肝细胞数目从402±18个增加到617±42个,细胞面积也从645.99±32.72μm2减小至356.93±22.33μm2。前期的研究表明随着年龄的增加肝细胞增殖能力降低,体现在小鼠肝脏肝切后肝脏再生能力减弱和衰老肝细胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年轻小鼠血液的影响下,其增殖能力发生了明显变化。原位肝组织增殖能力检测和原代肝细胞体外短期培养结果都显示,年轻微环境作用下,衰老肝细胞增殖能力得到恢复,增殖水平与年轻小鼠相类似。上述结果证实:在年轻微环境作用下,衰老肝细胞的衰老指标消失了,衰老肝细胞的形态、结构发生了衰老逆转,且重新获得了类似年轻肝细胞的增殖潜能。
  衰老肝细胞发生系列形态结构和功能的改变,导致其对外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病在老年个体中发生机会增加。随着年龄的增长,衰老肝细胞出现脂质代谢障碍,肝脏内脂肪累积的水平提高,老年肝脏脂肪病变的发生几率明显增加。在联体共生模型中,发现老年小鼠在年轻血液微环境的调控下,老年肝脏脂肪累积程度得到明显的缓解。肝脏脂滴原位染色结果显示,年轻微环境的作用下,于Iso-O相比较,油红O的阳性面积从24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼罗红的阳性面积也降低4倍。血清学指标也显示老年小鼠TG、胆固醇和LDL-c水平明显降低(p<0.01),且肝损伤指标ALT和AST的表达水平也降低(p<0.01)。
  综合上述实验结果,可以得出结论:在年轻血液微环境的作用下,老年衰老肝细胞的衰老表型发生逆转,多倍体肝细胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年轻血液微环境促进了衰老肝细胞脂肪累积水平的降低,不仅提高了肝细胞的脂质代谢能力,也改善了衰老肝脏的肝功能水平。这一重要发现,为解决衰老肝细胞增殖缓慢和老年个体肝衰竭相关疾病高频病发而难治愈问题提供新的思路,也为理解衰老和微环境的关系、衰老肝细胞发生“返老还童”机制和延缓或有效控制肝细胞衰老提供了理论基础。
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