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[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[硕士论文] 郭玉
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症的定义为感染引发的宿主免疫系统失调导致的器官功能障碍,致死率高;脓毒性休克为脓毒症伴随严重的循环系统和细胞代谢功能障碍。脓毒症以高发病率和致命性受到广泛关注,根据最近的数据,美国的脓毒症病例数从1996年的3873301例上升到2011年的110万,预计2020年将达到200万,脓毒症导致的死亡率接近心脏病发作的死亡率,超过了中风死亡率;所以早期的干预治疗是非常必要的。尽管脓毒症治疗策略经过近二十多年的发展,液体复苏、抗生素治疗以及血液透析等技术已取得了巨大的进步,脓毒症预后改善仍不明显。
  中性粒细胞是数量最多的参与固有免疫应答的细胞。脓毒症早期即宿主受到病原体攻击时,骨髓内的中性粒细胞迅速动员,大量中性粒细胞在趋化因子的作用下迁移至病灶部位通过吞噬、脱颗粒作用以及形成胞外诱捕网发挥清除病原体作用。虽然中性粒细胞对病原体清除非常重要,但研究已证实中性粒细胞与器官功能损伤密切相关。脓毒症过程中中性粒细胞的凋亡延迟以及其激活后释放的大量炎症因子引发的级联反应可导致组织缺氧和器官功能障碍。
  程序性死亡蛋白-配体1(programmed cell death protein-ligand1,PD-L1)是免疫激活的标志,其与程序性死亡受体-1的相互作用可抑制抗原特异性免疫反应,导致T淋巴细胞功能障碍、活化的免疫细胞耗竭及免疫耐受。肿瘤或炎症环境可诱导PD-L1在抗原递呈细胞、肿瘤细胞上表达。有研究证实脓毒症时PD-L1也可表达于中性粒细胞上,并且PD-L1阳性的中性粒细胞可诱导淋巴细胞凋亡;同时有研究表明PD-L1与B7-1分子互为配体,可发挥抑制淋巴细胞增殖的作用。那么PD-L1作为传统的配体,是否可发挥类似于受体的胞内信号激活作用?此外利用丹麦科技大学(DTU)的NetPhos2.0Server程序做磷酸化位点分析发现PD-L1的蛋白序列分析具有类似YXXM结构域,而YXXM序列可与PI3K结合并活化p85亚基,PI3K/Akt信号通路在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。那么PD-L1是否参与脓毒症时中性粒细胞凋亡延迟的调控?由此在本课题中着重探讨脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达与PI3K/Akt信号通路及自身凋亡的相关性。
  第一部分 脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的作用
  目的:
  探索脓毒症时中性粒细胞上PD-L1的表达水平与其凋亡的关系。
  方法:
  1、分离纯化健康志愿者静脉血的中性粒细胞,并将其分为3组:对照组(Con)、IFN-γ刺激组、IFN-γ+LPS共刺激组,刺激21小时后免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)具有诱导分化成类中性粒细胞的特性并且其表达PD-L1,将其分为对照组(Control)和维甲酸刺激组(RA组)进行刺激,21小时后流式检测免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式检测HL-60细胞的凋亡率。
  2、分离纯化脓毒症患者的中性粒细胞,流式技术检测培养24h后的凋亡率,同时收集细胞用免疫印迹法检测PD-L1的表达。
  3、siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21h后免疫印迹法检测siRNA的转染效率以及流式检测其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒细胞PD-L1的表达,并利用siRNA干扰PD-L1的表达,21h后免疫蛋白印迹法检测PD-L1以及流式检测中性粒细胞的凋亡率。
  结果:
  1.共采集6例健康志愿者的中性粒细胞,经IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒细胞PD-L1表达上调,且培养21小时后凋亡率明显降低(P<0.01);RA刺激HL-60细胞系分化成中性粒细胞,与对照组相比,RA刺激组PD-L1表达下调,且其凋亡率明显增加(P<0.01);
  2.共收集了14例脓毒症患者中性粒细胞,培养24小时后的其凋亡率与PD-L1的表达水平呈负性线性关系(R2=0.4417,P=0.01)。
  3.siRNA转染脓毒症中性粒细胞,其凋亡率明显升高(P<0.01);PD-L1siRNA转染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒细胞的凋亡率与单纯IFNγ+LPS处理组相比,其凋亡率明显升高(P<0.01)。
  结论:
  PD-L1在中性粒细胞上的表达增加,而中性粒细胞的凋亡率下降,说明脓毒症时中性粒细胞PD-L1参与自身凋亡作用的调控。
  第二部分 PD-L1调控中性粒细胞凋亡作用的机制
  目的:探讨脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的可能机制
  方法:
  1.腺癌人肺泡基底上皮细胞细胞系(A549)具有易转染特性,常作为转染宿主;PD-L1全长质粒(PD-L1FL/GFP)转染A549细胞系,免疫荧光法检测已转染的A549细胞系内PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光的结合情况。
  2.人胚肾细胞系293 (HEK293)极少表达细胞外配体所需的内生受体,且易转染;利用PD-L1全长序列(PD-L1FL/GFP)和胞内段敲除(PD-L1TD/GFP)质粒转染HEK293细胞,免疫共沉淀检测PD-L1与p85的存在相互作用。
  3.利用siRNA干扰HL-60细胞系PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT的蛋白水平。
  4.利用siRNA干扰分离纯化的脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT蛋白水平。
  结果:
  1.携带GFP的PD-L1全长质粒和胞内段敲除质粒构建成功。免疫荧光双染法发现PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光可重合。
  2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP转染HEK294细胞系行免疫共沉淀后发现PD-L1可与P85相互作用,且与PD-L1胞内段无关。
  3.PD-L1 siRNA转染HL-60细胞后,其pAKT水平降低。
  4.PD-L1 siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞后,其pAK水平下调
  结论:
  脓毒症时PD-L1可调控中性粒细胞的凋亡作用,其调控机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。
[硕士论文] 周利萍
护理学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨腔镜食管癌根治手术患者术中压疮预防的三时段护理干预方案。
  方法:
  本研究为类实验性研究。收集河南省某三甲肿瘤专科医院2017年2月至2017年9月在胸外科因食管癌行腔镜食管癌根治手术并符合纳入标准的患者132例,随机分组法将患者分为干预组和对照组,干预组在胸外一病区,对照组在胸外二病区。其中对照组66例,干预组66例。对照组使用常规预防术中压疮的方法,干预组在常规护理的基础上使用三时段护理干预,包括:①成立压疮防护小组,对压疮知识、NRS评分、手术床的使用、体位安置、手术流程等进行培训。②在术前、术中、术后三时段对患者进行皮肤评估及护理并填写《手术患者皮肤护理单》:术前对患者进行NRS评分,确定其营养状况;术中皮肤护理干预(规范手术操作和体位安置流程、使用充气式保温毯等);术后即刻评估压疮并及时采取护理措施;在术后6h、术后24h对产生压疮的患者进行随访。收集两组手术患者的一般资料、体位安置时间、手术总时间及出血量、术中低体温发生率、24h内压疮发生情况、护理配合满意度。资料收集整理后录入数据库,采用SPSS19.0软件进行统计,运用t检验和卡方检验等方法精细分析,从而评价手术室护士三时段的护理干预对于预防腔镜食管癌根治手术患者术中压疮的效果,得出预防腔镜食管癌根治术手术患者术中压疮的三时段护理干预方案。
  结果:
  1、术后24内压疮发生率采用卡方检验。对照组24内压疮发生率为25.76%,干预组24h内压疮发生率为10.61%,经过卡方检验,差异具有统计学意义(P=0.024);干预组和对照组发生的术中压疮分期经过卡方检验,差异不具有统计学意义,Ⅰ期压疮(P=0.118),Ⅱ期压疮(P=0.090)。
  2、术中体位安置时间和手术总时间和术中出血量采用t检验。干预组和对照组术中体位安置时间和手术总时间经过t检验,差异具有统计学意义,术中体位安置时间(P=0.034),手术总时间(P=0.021);对照组术中出血量为36.32±9.42(ml),干预组术中出血量为33.85±8.25(ml),经过t检验,差异不具有统计学意义(P=0.111)。
  3、使用充气式保温毯后患者术中体温的比较,采用t检验。两组患者在麻醉时和切开皮肤时的口咽温度进行了t检验,差异无统计学意义(P>0.05),可以进行比较;手术结束后对干预组和对照组的口咽温度进行了t检验,差异有统计学意义(P=0.000);干预组和对照组两组患者术中低体温发生情况进行卡方检验,差异具有统计学意义(P=0.032)。
  4、压疮预防小组护士专业能力的比较,手术室护理配合的满意度调查,采用t检验和卡方检验。对照组和干预组对预防压疮的专业知识和操作技能进行t检验、手术室护理配合满意度经卡方检验,差异均具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1、手术室护士三时段护理干预方案可以降低腔镜食管癌根治手术患者术中压疮的发生率。
  2、成立压疮防护小组可以提高手术室护士的专业能力和手术室护理配合满意度,减少影响手术时间的不良因素,提高护理质量。
  3、术中使用充气式保温毯可以有效的改善患者的体温状况,减少术中低体温的发生。
  4、手术患者皮肤管理记录单将手术室护士对患者的术前、术中、术后进行的评估及操作措施以表格形式写出,可以进一步的提醒和监督护士做好预防术中压疮的工作,并方便病房护士了解术中患者皮肤情况。
[硕士论文] 张敏
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.探讨经皮氧分压(TcPO2)和经皮二氧化碳分压(TcPCO2)监测在急诊留观患者压疮早期预警中的应用价值。
  2.分析急诊留观患者压疮高危风险早期预警的相关因素,探讨胸骶经皮氧分压变异率(TcPO2 CV)这一新型指标预测压疮高危风险的可行性。
  方法:
  连续性纳入山东大学齐鲁医院急诊医学科自2017年3月1日至2017年6月30日的急诊留观患者。纳入标准:①年龄≥18岁;②进入急诊科留观且未发生压疮患者;③签署知情同意书。排除标准:①急、慢性皮肤病或烧伤患者;②留观2小时内发生压疮的患者。设计病例报告表,收集患者基线资料,包括年龄、BMI、性别、吸烟史、留观时间、Braden评分、Norton评分、Waterlow评分、体温(℃)、脉搏(次/分)、呼吸(次/分)、收缩压(mmHg)、舒张压(mmHg)、平均压(mmHg)、脉搏氧饱和度(%)、血糖(mmol/L)、pH值、血乳酸(mmol/L)、pCO2(mmHg)、pO2(mmHg)、血红蛋白(g/L)、血清白蛋白(g/L)、WBC(*109/L)、NEU(%)、LYM(%)、K+(mmol/L)、Na+(mmol/L)、Cl-(mmol/L)、ALT(IU/L)、AST(IU/L)、BUN(mmol/L)、Cr(μmol/L)。患者急诊留观后即刻使用经皮氧分压/二氧化碳分压监测仪(丹麦雷度公司TCM4)。操作前首先进行标准气体校正。严格按照操作规范,选择监测位点:前胸部肋间隙及骶尾部皮肤,安装经皮氧/二氧化碳分压监测传感器,待TcPO2和TcPCO2读数稳定后(10-15min)记为转入时数值。并于同一时刻进行患者的血常规、血生化、血气分析等检验,记录对应点患者生命体征、血氧饱和度及血流动力学等结果。设置监测电极温度为42-44℃。持续监测时4小时需更换监测部位,防止温度的变化引起皮肤的损伤。本研究经过山东大学齐鲁医院伦理委员会审查同意后实行。SPSS19.0软件进行数据处理,以均数±标准差表示计量资料,以频数表示计数资料,两组间计量资料的比较采用t检验,分类变量的比较采用x2检验。对两个变量间的直线关系采用线性相关分析进行分析。采用Logistic回归分析校正混杂因素,计算比值比(odds ratio,OR)及其95%置信区间(95% Confidence Interval,95% CI)。由受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC曲线)计算曲线下面积(area and curve,AUC)以及约登指数(Youden's index),确定cut-off值,以p值小于0.05为差异具有统计学意义。
  结果:
  1.本研究共纳入186例急诊留观患者,其中男性101例(54.3%),女性85例(45.7%);留观时间24小时以内者157例(84.4%),24-72小时者22例(11.8%),超过72小时者7例(3.8%)。发生I期压疮者11例(5.91%)。通过单因素分析,我们发现,Braden评分(p=0.002)、Norton评分(p<0.001)以及waterlow评分(p=0.008)在两组中的差异具有统计学意义。
  2.Braden评分分别与Norton评分和waterlow评分具有线性相关关系;TcPO2及TcPCO2与动脉血气分析PO2和PCO2亦呈线性相关。
  3.将所有患者根据Braden评分中高危(<15分)与低危(≥15分)分为两组,单因素分析二组患者年龄(66.50±17.23 vs.58.07±18.63,p=0.014)、体温(37.02±0.80 vs.36.72±0.65,p=0.023)、收缩压(122.28±22.79 vs.131.09±22.90,p=0.039)、平均压(89.31±17.61 vs.95.51±16.01,p=0.042)、氧分压(106.58±43.67 vs.84.52±36.12,p=0.018)、血清白蛋白(43.09±16.20vs.51.13±16.76,p=0.023)、TcPO2胸(89.39±24.43 vs.71.32±19.68,p<0.001)、TcPO2骶尾(59.61±21.59 vs.75.26±21.61,p<0.001)、TcPO2 CV(34.08±14.74 vs.15.92±18.86,p<0.001)差异具有统计学意义。
  4.将TcPO2 CV、年龄、体温、收缩压、动脉血氧分压、血清白蛋白六个指标进入Logistic回归分析,可以发现TcPO2 CV(OR=64.073,95%CI=1.171~3505.881,p=0.042)及动脉血氧分压(OR=1.027,95%CI=1.008~1.048,p=0.006)分别是患者Braden评分高危的独立危险因素。
  5.采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线),计算AUC=0.883,根据约登指数(Youden's index)最大值对应值确定TcPO2 CV的cut-off值为20%。
  结论:
  1.Braden评分、Norton评分与waterlow评分对于急诊患者留观期间发生Ⅰ期压疮具有较好的相关性,且Braden评分分别与Norton评分与waterlow评分具有良好的线性相关。
  2.胸骶经皮氧分压变异率(TcPO2 CV)是急诊留观患者压疮发生高风险的独立危险因素,TcPO2 CV≥20%者对于Braden评分高危预测性强,发生压疮潜在可能性大,应注意加强防压疮护理。
[博士论文] 尹梅
老年医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
  论文Ⅰ 缺血修饰白蛋白对严重脓毒症患者短期预后的评估价值
  目的:
  已有研究证实,在脓毒症患者中,血清IMA水平可用于量化患者的缺血及氧化应激程度。由于脓毒症的缺血和氧化应激程度往往和患者的预后相关,因此,血清IMA水平也可能是严重脓毒症患者不良预后的生物标志物。然而,血清IMA水平是否对严重脓毒症患者的预后有指示的意义,尚不得而知。在我们的研究中,我们收集入住ICU病房的严重脓毒症患者的相关临床和实验室数据,并试图从以下几个方面探讨问题:
  1.研究血清IMA水平是否可以预测患者的短期(28天)病死率;
  2.探讨血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期病死率的最佳截断值;
  3.比较IMA和白蛋白校正后的IMA水平对于短期病死率的诊断效能。
  方法:
  1、研究对象
  本研究为前瞻观察队列研究。本研究中,我们纳入山东大学齐鲁医院重症监护病房的严重脓毒症住院患者156例,纳入时间范围为2014年4月至2014年10月。严重脓毒症根据“拯救脓毒症运动”国际指南进行定义。患者的排除标准如下:(1)患者存在其他缺血性疾病,如急性冠状动脉综合征、急性缺血性脑血管疾病、急性肺栓塞或急性下肢动脉或静脉栓塞、主动脉夹层等;(2)患者此前存在恶性的心律失常,或者心脏骤停;(3)患者存在未经充分引流的外科感染;(4)患者年龄小于18岁、患有艾滋病或为妊娠状态;(5)患者血清白蛋白水平极低或极高(<20 g/L或>55 g/L)[31,32];(6)在24h内死亡,或者住院时间<72h,或者放弃进一步治疗的患者。所有患者均参照“拯救脓毒症运动”国际指南的建议接受适当的治疗。记录患者在严重脓毒症发生24h内的一般情况、严重脓毒症原发感染源、实验室结果和基础疾病等数据,对于多部位感染的患者,只记录1个最重要的原发感染源。根据采集的相关数据,计算急性生理与慢性健康状态Ⅱ(APACHEⅡ)评分和脓毒症相关性器官功能衰竭评分(SOFA)评分等两个危重病患者病情状态的评分。本研究主要的观察终点是病人在28天的病死率。
  2、检测指标
  在严重脓毒症发生的早期(24小时内),抽取外周静脉血约5mL。在1620g下离心15分钟,分离血清并且即刻应用IMA测定试剂盒检测患者血清中IMA水平。由于极低的血清白蛋白水平(<20g/L)时,血清IMA的测定水平可能会受到影响,而使用如下校正公式能够消除此影响,校正公式:校正IMA值=(个体血清白蛋白水平/群体的血清白蛋白水平中位数)×所测定IMA值。其中,每组人群中,血清白蛋白的中位数水平分别进行独立的统计。血清IMA水平的高低不影响临床医生的治疗决策或患者的治疗效果。
  结果:
  1、严重脓毒症患者一般情况及感染来源
  共计117例严重脓毒症患者纳入到该研究,61.5%患者为男性,平均年龄为57.7±18.4岁。患者在发生严重脓毒症后28天时死亡29例,病死率为24.8%。严重脓毒症的两大感染源分别为肺脏和腹/盆腔。
  2、严重脓毒症患者的血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对28天病死率的预测价值
  我们通过ROC曲线,评估了血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对严重脓毒症患者28天病死率的预测价值。血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平都是28天病死率的有效预测因子,AUC分别为0.742(P<0.001)和0.627(P=0.040),95%CI分别为0.638-0.847和0.497-0.757。IMA预测严重脓毒症患者28天病死率的最佳截断值为110U/mL,对应的灵敏度和特异度分别为0.517和0.886。
  3、严重脓毒症患者出现死亡的单因素分析和死亡的多因素Logistic回归分析
  单因素分析发现,与存活组相比,死亡组患者的感染性休克和急性肾损伤发生率、使用有创机械通气和肾脏替代治疗的比例均明显升高(均P<0.01),IMA水平、血糖水平、格拉斯哥昏迷评分、APACHEⅡ评分和SOFA评分均明显升高(均P<0.05),白蛋白水平显著降低(P<0.05)。
  多因素分析发现,与严重脓毒症患者28天病死率相关的独立危险因素仅为血清IMA水平(OR,2.104;95%CI,1.032-4.288; P=0.041)和APACHEⅡ评分(OR,1.166;95%CI,1.078-1.261;P<0.001)。血清IMA水平和APACHEⅡ评分无统计学相关关系(r=0.064,P=0.495)。
  结论:
  1、严重脓毒症的患者血清中IMA水平升高。血清IMA水平能够预测严重脓毒症患者的短期(28天)病死率。通过ROC曲线和多因素Logistic回归分析,我们证实了血清IMA水平不仅是严重脓毒症患者28天病死率的有效预测因子,而且是患者28天死亡的独立危险因素;
  2、血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期(28天)病死率的最佳截断值为110U/ml,通过Kaplan-Meier生存分析进一步证实,血清IMA水平高于110U/ml的患者累计生存率较低。对于血清IMA水平高于110U/ml的严重脓毒症患者,应及时采取积极干预措施,改善患者预后。
  3、白蛋白校正的IMA水平对于短期病死率的诊断效能并不优于IMA水平,因此,使用白蛋白水平来校正血清IMA水平并非必要。
  论文Ⅱ 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制对脓毒症肝脏线粒体损伤的保护作用研究
  目的:
  1、探讨PARP-1抑制能否改善脓毒症肝脏线粒体损伤;
  2、研究脓毒症中PARP-1抑制对肝脏线粒体发挥有益作用的潜在分子机制,探讨线粒体生物合成、氧化应激和炎症反应等调控通路在上述机制中的作用。
  方法:
  1、动物实验:采用内毒素(LPS)腹腔注射法建立脓毒症模型。10周龄C57BL/6小鼠称重后,给予腹腔注射LPS10mg/kg(PBS稀释为2mg/ml浓度)诱导脓毒症动物模型,该组小鼠为脓毒症组(Sepsis,n=10)。对照组小鼠(Control,n=10)则接受腹腔注射同等剂量的PBS。为保证小鼠出现显著的PARP-1抑制及后续效应,PARP-1抑制组(Sepsis+P J34,n=10)小鼠在脓毒症造模前3h和造模后8h,各腹腔注射一次PARP-1抑制剂PJ34(10mg/kg,生理盐水稀释)。在相同的时间点,对照组以及脓毒症组的动物给予腹腔注射等剂量的生理盐水。脓毒症造模24h后,麻醉动物取材进行后续实验;
  2、小鼠麻醉后行心脏左心室穿刺取血,检测相关指标:血气分析仪检测血气分析和乳酸水平,商品化试剂盒测定血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平;
  3、即刻肝脏线粒体复合体呼吸容量测定:取新鲜肝脏组织提取肝脏线粒体后,使用能量代谢测定仪检测即刻线粒体电子传递链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的呼吸容量;
  结果:
  一、LPS诱导的脓毒症小鼠模型
  1、脓毒症组小鼠出现严重的代谢性酸中毒、高乳酸血症、电解质紊乱和肝功能损伤
  与对照组相比,脓毒症组小鼠出现明显的高乳酸血症、酸中毒、低HCO3-血症、高钾血症、低钙血症及血AST、ALT水平升高(均P<0.05),但血钠水平和血细胞比容等指标并无显著变化(均P>0.05)。对照组小鼠均存活(死亡率0%),脓毒症组小鼠有3只死亡(死亡率30%)。
  2、脓毒症组小鼠出现明显的肝脏线粒体呼吸容量降低、线粒体ATP水平下降和线粒体膜电位水平下降
  与对照组相比,脓毒症组的小鼠肝脏线粒体复合体Ⅰ、肝脏线粒体复合体Ⅱ及肝脏线粒体复合体Ⅳ的呼吸容量均显著降低,线粒体ATP水平下降,线粒体膜电位的水平明显降低(均P<0.05)。
  二、PARP-1抑制剂PJ-34对脓毒症组小鼠的有益作用
  1、PARP-1抑制显著减轻脓毒症导致的乳酸酸中毒、高钾血症、低HCO3-血症,并降低AST和ALT水平
  与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠的乳酸产量减少、酸中毒改善,低HCO3-血症及高钾血症显著改善,血AST和ALT水平均明显降低(均P<0.05)。PARP-1抑制组小鼠1只死亡(死亡率10%),较脓毒症组小鼠死亡率(30%)有所下降,但无统计学差异(P>0.05)。
  2、PARP-1抑制明显改善脓毒症导致的肝脏线粒体损伤
  与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠肝脏线粒体复合体Ⅰ、肝脏线粒体复合体Ⅱ及肝脏线粒体复合体Ⅳ的呼吸容量均显著升高,线粒体ATP水平和线粒体膜电位水平均明显升高(均P<0.05)。
  结论:
  1、LPS诱导的脓毒症小鼠出现明显的肝脏线粒体功能障碍和结构损伤。同时,脓毒症小鼠肝脏线粒体合成上游因子表达水平显著降低,并出现明显的氧化应激损伤和炎症反应。
  2、PARP-1抑制可以有效缓解脓毒症肝脏线粒体功能障碍和结构损伤,改善线粒体呼吸复合体的呼吸容量,提高线粒体ATP产量,增加线粒体膜电位水平,减少线粒体肿胀和线粒体自噬。
  3、PARP-1抑制可能通过对肝脏线粒体生物合成通路、氧化应激通路和炎症反应通路的正向调控作用而对线粒体发挥靶向调节作用,从而改善脓毒症继发的肝脏线粒体的损伤。
[博士论文] 陶小根
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  脓毒症是一种由严重感染引起的过度炎症反应的临床综合征。可引起多器官功能障碍综合征(MODS),最终可引起器官衰竭,临床预后差,死亡率高。在脓毒症过程中,肝脏对清除细菌的防御反应和产生炎症介质起着重要的作用。此外,脓毒症引起的多器官损伤和衰竭可能是由于线粒体功能恶化和细胞能量代谢衰竭引起的。线粒体通过提供能量,利用大约98%的全身氧来维持正常的细胞功能。因此,线粒体在维持正常的器官功能中起着重要的作用。另一方面,保持线粒体结构的完整性是正常的线粒体功能及能量代谢必不可少的。脓毒症状态下,主要表现为细胞病理性缺氧,氧利用障碍,导致能量产生下降,而线粒体功能降低是细胞氧利用障碍的根本原因。脓毒症时会出现线粒体结构损伤与功能障碍,线粒体损伤的同时会诱发促炎介质的释放,加重炎症反应,同时线粒体功能障碍导致组织细胞产生能量不足,引起严重的微循环障碍,直至多器官功能衰竭。可见线粒体功能障碍往往与失调的全身炎症反应引起的多器官功能衰竭相关;然而,线粒体功能障碍的确切机制尚不完全清楚。
  川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中药川芎的一种活性提取物,广泛应用于抗炎和治疗心血管疾病。TMP可抑制脂质过氧化,作为灭活活性氧、保护酶的抗氧化剂。TMP还具有抗炎和器官保护作用,并在细胞水平上改善线粒体功能。然而,这些影响作用的分子机制仍然不清。水通道蛋白8(Aquaporin-8,AQP8)位于肝细胞内线粒体膜,主要介导水和其他代谢底物的运输,对维持线粒体的正常结构十分必要。AQP8还通过诱导细胞快速肿胀,促进IL-1β释放而介导炎症。另一方面,线粒体敲除AQP8基因能导致氧化剂诱导的线粒体功能障碍和导致人肝肿瘤细胞坏死性死亡。在肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的脓毒症实验动物模型中,肝细胞AQP8的表达可能通过其转录后抑制的机制而被下调,导致AQP8介导的水向线粒体外的转运功能下降,线粒体体积的快速膨胀,线粒体破裂。这些证据表明AQP8可能在维持正常的线粒体功能中起重要的作用。以往的研究表明,川芎嗪可能通过增加AQP8表达保护脓毒症大鼠肝细胞线粒体的结构。然而,TMP能否通过改善线粒体功能保护肝脏免受炎症损害,在脓毒症大鼠模型中AQP8和炎症反应之间是否存在相互影响仍不清楚。在当前的研究中,试图进一步探讨TMP对线粒体功能的影响,阐明TMP在治疗脓毒症致急性肝损伤中对线粒体保护作用的潜在机制。
  方法:
  选用96只SD大鼠,随机分为正常对照组、脓毒症组、TMP治疗组和TMP预防组,每组24只。使用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法制备脓毒症实验动物模型,对照组实验动物仅接受假手术处理;脓毒症组进行CLP手术;治疗组在CLP手术完成后,立即从大鼠尾静脉注射盐酸川芎嗪注射液,剂量为60mg/kg;预防组在CLP手术处理前7天开始每天从大鼠尾静脉注射60mg/kg盐酸川芎嗪注射液。
  造模18小时后,在四组大鼠中随机抽取12只处死,留取肝脏和血清标本,部分肝脏组织固定、包埋后保存,余肝脏组织及血清保存在零下80℃冰箱中。每组剩余12只大鼠观察至出现明显脓毒症症状及至死亡的时间,并绘制生存曲线。
  生化分析仪直接检测大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平。双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平。提取部分肝脏组织标本,采用ATP检测试剂盒,测定组织中ATP含量。
  取包埋后的大鼠肝脏制备50nm厚度的电镜切片,使用4%的醋酸铀酰和0.5%的醋酸铅染色后,电镜下观察肝细胞线粒体的超微结构;按照Flameng分级方法对肝脏线粒体进行半定量分析。
  差速离心法提取肝细胞线粒体,JC-1对线粒体进行染色,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测荧光强度,通过绿色荧光/红色荧光的比值,间接反映线粒体膜电位变化。
  取肝细胞线粒体,采用分光光度法,测定线粒体膜Na+-K-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
  裂解肝细胞线粒体,分离出线粒体内膜蛋白,采用Western blot法检测AQP8蛋白,采用实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测肝组织AQP8mRNA的表达。
  使用SPSS14.0统计学软件包进行统计学分析。各组大鼠实验结束至出现脓毒症症状的时间、大鼠存活时间,大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平,血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平,大鼠肝细胞ATP含量,肝细胞线粒体膜ATP酶活性,AQP8mRNA表达、AQP8蛋白表达使用均数±标准差((x)±s)表示,组间比较采用方差分析(ANOVA)进行处理;AQP8蛋白表达与血清ALT、AST、m-AST,肝细胞ATP含量,血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平的相关性分析使直线相关性检验。
  结果:
  1.大鼠手术结束至出现脓毒症症状的时间和存活时间
  脓毒症组大鼠手术结束至出现症状的时间较治疗组和预防组短(P<0.01);治疗组和预防组的大鼠存活时间较脓毒症组长(P<0.01);治疗组和预防组两组大鼠出现脓毒症症状的时间和存活时间均无显著差异(P>0.05)。
  2.肝脏组织中ATP含量及血清ALT、AST、m-AST的水平
  与正常对照组相比,脓毒症组大鼠肝脏组织中ATP含量明显减低(P<0.01);与脓毒症组比较,治疗组和预防组肝脏组织中ATP含量升高(P<0.01)。
  与正常对照组比较,脓毒症组血清ALT、AST、m-AST的水平明显升高(P<0.01);与脓毒症组相比,治疗组和预防组血清ALT、AST、m-AST的水平降低(P<0.01)。
  3.肝细胞线粒体结构的变化
  电镜观察大鼠肝细胞线粒体发现脓毒症组线粒体体积增大,嵴明显肿胀、并有空泡样变,外膜破裂,线粒体内出现脂肪变性。而在治疗组和预防组,大鼠肝细胞线粒体上述变化,如肿胀、空泡样改变等均较脓毒症组减轻。脓毒症组肝脏线粒体电镜半定量评分较对照组明显增加(P<0.01);TMP治疗组和预防组肝脏线粒体电镜半定量评分较脓毒症组明显降低(P<0.01)。
  4.肝脏细胞线粒体膜电位
  激光共聚焦及流式细胞仪检测肝脏线粒体膜电位结果表明:脓毒症组大鼠肝脏线粒体膜电位明显低于对照组(P<0.01),而治疗组和预防组大鼠肝细胞线粒体膜电位高于脓毒症组(P<0.01)。
  5.肝脏细胞线粒体ATP酶活性
  与对照组比较,脓毒症组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性水平明显下降(P<0.01),与脓毒症组相比,治疗组和预防组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显升高(P<0.01)。而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  6.肝细胞线粒体AQP8mRNA的表达
  与对照组比较,脓毒症组大鼠肝细胞线粒体AQP8mRNA的表达降低(P<0.01);脓毒症组线粒体AQP8mRNA的表达低于治疗组和预防组的(P<0.01);而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  7.肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达
  与对照组比较,肝细胞线粒体AQP8蛋白的相对表达量在脓毒症组明显减少(P<0.01);治疗组和预防组的AQP8蛋白相对表达量较脓毒症组升高(P<0.01),在治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  8.血清炎症因子水平
  与对照组比较,脓毒症组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平显著增加(P<0.01),而TMP治疗组及预防组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平低于脓毒症组(P<0.01)。
  9.相关性分析
  大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清ALT、AST、m-AST的水平呈负相关(P<0.01),大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达量与肝细胞ATP含量、线粒体膜电位水平呈正相关(P<0.01)。大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清NO、TNF-α水平负相关(P<0.01)。
  结论:
  1.川芎嗪可以延缓大鼠CLP手术后出现脓毒症症状的时间,延长脓毒症大鼠的生存时间。
  2.脓毒症大鼠血清炎症因子释放增加,肝细胞线粒体AQP8、AQP8mRNA表达下降、并出现肝细胞ATP含量下降、线粒体ATP酶活性下降、线粒体膜电位下降等线粒体功能障碍,同时线粒体结构变化,还出现肝功能损害。而线粒体AQP8蛋白的表达与肝脏酶学指标的呈负相关,与肝细胞ATP含量及线粒体膜电位呈正相关,与血清TNF-α、NO水平呈负相关。
  3.川芎嗪能改善脓毒症大鼠的肝功能,保护肝细胞线粒体功能,其机制可能包括:
  (1)川芎嗪可以通过上调线粒体AQP8蛋白的表达、保护线粒体ATP酶活性,稳定线粒体膜电位来发挥对脓毒症大鼠肝线粒体损伤的保护作用。
  (2)川芎嗪可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6、HGMB1、NO等多种炎症介质的过量释放,从而抑制脓毒症发生时失控的炎症反应。
[博士论文] 耿立霞
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  脓毒症(sepsis)是宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍,是由于感染引起的全身过度炎症反应、免疫失衡、内皮损伤等因素致使细胞和组织受损,而产生多脏器功能不全的危重症。其发病率高、住院费用高、死亡率高,是一种全球性疾病负担。
  在脓毒症的炎症反应、免疫失衡过程中巨噬细胞起关键作用,巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本环节。巨噬细胞可分化为具有不同生物学特征的M1型和M2型两类。其中M1型巨噬细胞由干扰素γ(IFN-γ)和或脂多糖(LPS)诱导,表现为低表达甚至不表达白介素(IL)-10,并且分泌大量的促炎因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及趋化因子配体2(CCL-2),参与急性促炎反应,清除入侵病原体和肿瘤细胞。M1表型巨噬细胞主要发挥针对病原微生物的炎症反应和发挥宿主的免疫防御功能,也会造成机体损伤。M2型巨噬细胞由IL-4或IL-13诱导,表现为IL-10高表达,并分泌大量的抑炎因子如精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体(CD206)、症区分子1(FIZZ-1)、几丁质酶3样分3(Ym1),参与杀伤细胞外病原体、碎片清除、组织修复和伤口愈合。M2型巨噬细胞表现出很强的抗炎活性,对于修复和重塑炎症后期由病原微生物造成的组织损伤以及重建组织稳态中作用重大。
  巨噬细胞的分化可以根据环境因素发生逆转。接受不同的刺激,不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化,而且能使已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化,能使激活的M1型转化成M2型巨噬细胞,也能使M2型转化成M1型巨噬细胞,这取决于M1型和M2型标志蛋白表达量的可逆性转化。M1型巨噬绌胞标志蛋白包括表达CCL-2、IL-6和TNF-α等,而M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10、Ym-1、FIZZ-1等。M1型巨噬细胞主要参与炎症产生的起始和维持,M2型巨噬细胞主要参与炎症控制,M2型巨噬细胞数量的增加有利于炎症的消除。巨噬细胞向何种表型极化决定了炎症的最终转归。
  间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)具有免疫调节、抗炎作用和旁分泌特性,被广泛用于免疫调节失衡导致的炎症性相关疾病的治疗。并且大量的研究主要围绕在与T淋巴细胞的相互作用及免疫机制方面的探讨。近年来有研究表明MSCs可改善内毒素注射及盲肠结扎穿孔导致的脓毒症动物模型损伤。我们既往研究“骨髓间充质干细胞对盲肠结扎穿孔所致脓毒痘动物模型治疗作用的研究”中也同样发现脓毒症动物模型TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平增高,IL-10mRNA表达水平降低;血清中炎症因子TNF-α、IL-6和CCL-2水平增高,抗炎因子IL-10水平降低,肺组织水肿,肺间质血管扩张、充血,肺泡间隔内可见中性粒细胞,肺泡结构破坏,在小气管、细支气管周围可见大量淋巴细胞浸润,肺组织炎症损伤重。经MSCs治疗后TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平降低,IL-10mRNA表达水平增高,血清中TNF-α、IL-6和CCL-2水平下降,IL-10升高,肺组织结构尚可,肺泡结构无明显破坏,小气管、细支气管周围可见少量淋巴细胞浸润,肺组织的炎症损伤明显减轻,72h存活率明显提高。提示MSCs对脓毒症动物模型有保护作用,并且可能是通过影响巨噬细胞起作用。
  因此我们基于这些认识:1.脓毒症中巨噬细胞起关键作用。巨噬细胞可以分化为M1/M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞标志蛋白包括CCL-2、IL-6和TNF-α等,M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10等。发生脓毒症时M1型巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6水平升高,M2巨噬细胞分泌的抑炎因子IL-10等水平下降。2.巨噬细胞具有可塑性,接受不同的刺激不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化,而且已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化,能使激活的M1型巨噬细胞转化成M2型巨噬细胞,也能使M2型巨噬细胞转化成M1型巨噬细胞,这取决于M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞标志蛋白表达量的可逆性转化。3.MSCs对脓毒症动物模型有保护作用,可以降低全血中TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平,同时也可以降低血清中促炎因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平,增加抗炎因子IL-10 mRNA表达水平,提高血清IL-10蛋白水平,此外,MSCs还可以减轻组织的炎症反应、保护脏器功能,从而提高动物存活率。因此我们推测MSCs可能对巨噬细胞极化有影响,通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平,从而减轻组织的炎症反应,保护脏器功能。
  MSCs对巨噬细胞的作用的相关研究不多。有研究发现MSCs在体外与未极化巨噬细胞共培养后可使其具有M2型巨噬细胞的特点,M2型巨噬细胞比例上调,CD206表达上调,IL-10表达增加,TNF-α明显降低,提示MSCs调控巨噬细胞表型向M2型巨噬细胞转化,由组织促炎反应向抗炎反应调节,进而改善失控性炎症反应。然而MSCs对已经极化的巨噬细胞(M1/M2型巨噬细胞)是否有影响,是否可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,对M2型巨噬细胞是否有影响,这方面的相关研究尚未发现。骨髓间充质干细胞(BMSCs)相比其他类型的干细胞在培养中更容易获得并且能够迅速增殖。鉴于此,本研究利用TranswellTM培养体系,探讨BMSCs对M1/M2型巨噬细胞极化的影响。
  方法:
  第一部分 探索M1/M2型巨噬细胞极化体系:用不同剂量脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M1型巨噬细胞;白细胞介素-4(IL-4)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M2型巨噬细胞。
  第二部分
  1.提取SPF级C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、鉴定BMSCs表面标记物及成骨成脂诱导鉴定。
  2.将已经提取的BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养24h后,收集巨噬细胞和上清液,用实时定量PCR和ELISA检测巨噬细胞白细胞介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、趋化因子配体2(CCL2)、CD86、精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体/CD206(MR/CD206)、IL-10、炎症区分子1(found in inflammatoryzone1,FIZZ1)、几丁质酶3样分子3(chitinase3-like3,Ym-1)的变化。
  结果:
  第一部分
  1.M1型巨噬细胞诱导极化的体系为100ng/mL LPS+30ng/mL IFN-γ,100ng/mL lL-4为M2型巨噬细胞诱导极化的最适体系。
  2.M1型巨噬细胞细胞表面标记为CD86,M2型巨噬细胞表面标记为CD206。
  3.M1型巨噬细胞表达的特异因子有IL-6、iNOS、TNF-α、CCL-2和CD86,M2型巨噬细胞特异表达的因子有Arg-1、CD206、FIZZ-1、Ym1和IL-10。
  4.经LPS和IFN-γ刺激诱导的M1型巨噬细胞形态为:巨噬细胞伸出伪足增多,呈树突状、梭状及放射状,表现为炎症性巨噬细胞形态;而经IL-4刺激诱导的M2型巨噬细胞形态为:大部分巨噬细胞细胞体积略变大呈椭圆形,细胞黏附性增强,呈聚集或集落样生长,且胞质丰富。
  第二部分
  1.第3代BMSCs贴壁生长,形态类似成纤维细胞,细胞表面标记物流式鉴定,结果为CD44、CD90阳性;CD45、CD34阴性,符合国际上对BMSCs的流式标记物认定标准。并且将第3代BMSCs成脂诱导3天后可见明显增多的脂滴,7天时出现大量脂滴,油红O染色成亮红色。将第3代BMSCs成骨诱导后细胞局部出现聚集现象,诱导第7天细胞呈铺路石状汇集现象,碱性磷酸酶染色呈阳性,诱导21天细胞周围有钙沉积,茜素红染色,可见红色钙结节。表明培养的BMSCs分化能力很强。
  2.BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养后发现棒状、放射状以及树枝状形态的巨噬细胞明显减少,细胞变圆,细胞黏附性增强,胞内颗粒增多,且流式鉴定巨噬细胞表面标记CD86为阴性。
  3.BMSCs使M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α、iNOS、CCL2、-CD86mRNA水平明显减少,Arg1、CD206、IL-10 mRNA水平明显增加,且上清液中IL-6和TNF-α含量明显减少,CD206明显增加。
  4.BMSCs使M2型巨噬细胞分泌的Arg1、CD206、FIZZ-1、Ym-1、IL-10mRNA水平明显增加,CD206明显增加。
  结论:
  BMSCs不仅抑制M1型巨噬细胞活性,还能诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,使M2型巨噬细胞功能进一步活化,抗炎因子生成增多,促炎因子生成减少,由组织促炎反应向抗炎反应调节,进而改善失控性炎症反应。
  意义:
  本实验证实了我们的设想:MSCs对巨噬细胞极化有影响,不仅对未极化巨噬细胞有影响,而且对已经极化的巨噬细胞(M1/M2型巨噬细胞)有影响,通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平,从而减轻组织的炎症反应,保护脏器功能。本实验为研究BMSCs对脓毒症等炎症相关疾病的治疗在细胞水平上提供了理论支持。
[博士论文] 王大伟
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:天然CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对于维持适度的免疫耐受和免疫稳态至关重要。CD4+CD25+ Treg细胞结构性表达叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4。上述关键的免疫调节性分子缺陷时,小鼠表现为致死性淋巴细胞增殖表型。CD4+CD25+Treg表达Toll样受体4(TLR4),后者可以被脂多糖(LPS)激活,Treg细胞抑制活性随之增强。Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子,如转化生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10,发挥免疫抑制效应,抑制效应T细胞。Treg细胞自身增殖活性低下,它在体外可以抑制IL-2的产生,进而抑制T细胞活化。Treg细胞还可以通过细胞表面的IL-2受体,消耗效应T细胞赖以生存的IL-2,进而导致效应T细胞凋亡。Treg细胞可以控制Th1和Th2细胞转录因子表达,进而控制Th1和Th2型免疫反应。Treg细胞对于控制脓毒症早期的炎症反应有利。但是Treg细胞增多可以导致淋巴细胞增殖受抑制,进而导致脓毒症免疫麻痹。
  IL-37(IL-1F7)在人类细胞表达,在小鼠中不表达。但是人重组IL-37对小鼠细胞的效应和人类细胞的效应相似,均表现为下调固有免疫和获得性免疫反应。体内研究显示,IL-37在多种炎症疾病中发挥抗炎效应。IL-37转基因小鼠研究显示,IL-37对内毒素血症、刀豆素A诱导的肝炎、葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎、缺血再灌注损伤均有抗炎保护效应。新近研究显示,IL-37在人Treg细胞表达,基因敲减IL-37可以减弱Treg细胞的抑制活性。
  研究目的:
  1.研究IL-37对正常小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响;
  2.体外模拟脓毒症环境,研究IL-37对LPS环境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响;
  3.研究IL-37对脓毒症小鼠的生存保护效应。
  研究方法:
  1.按照说明书要求,用美天妮磁性分离仪从C57BL/6J小鼠脾脏细胞中分选CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg纯度;
  2.用重组人IL-37(rhIL-37)(0~250ng/ml)刺激Treg细胞12~48h。收集细胞上清液,EHSA分析Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1变化;部分预处理的Treg细胞,进行免疫荧光染色,流式细胞术分析Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达变化;部分预处理的Treg细胞用于抑制活性分析。IL-37预处理的Treg细胞与CFSE标记的CD4+CD25-T细胞共培养,96小时后收集上清液,ELISA检测CD4+CD25-T细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ浓度。同时收集细胞,上流式细胞仪检测CFSE稀释度,检测发生CFSE稀释的CD4+CD25-T细胞百分比,借此分析CD4+CD25-T淋巴细胞增殖程度。通过检测上述指标,分析IL-37刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的关系,
  3.LPS(5μg/ml)预处理Treg细胞3天,预处理结束前24h向培养基中加入不同浓度IL-37(0~250ng/ml)。预处理完毕后分析Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达,IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培养,收集细胞上流式细胞仪,检测Treg对效应T细胞增殖活性的抑制程度;收集共培养上清液,检测IL-2、IL-4和IFN-γ分泌。通过分析上述指标,明确LPS环境中,IL-37能否影响Treg细胞免疫抑制活性。
  4.建立小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型,假手术组只分离盲肠,但不予结扎穿刺。给小鼠腹腔注射IL-37(1μg)。IL-37腹腔注射分三种方式:CLP术前2h注射、CLP术后立即注射和CLP术后2h注射。在三个相应时间点腹腔注射PBS(200μl)作为对照组处理方式。处理完毕后,观察CLP小鼠8天生存率。
  5.统计学分析:应用SPSS软件统计分析。连续性变量首先进行正态性检验和方差齐性检验。数据用均数±标准差(SD)表示。每个实验重复三次。多组比较应用单因素方差分析和Bonferroni检验。生存率应用Kaplan-Meier生存曲线分析和log rank检验。P<0.05认为有统计学差异。
  研究结果:
  1.IL-37对CD4+CD25+Treg抑制活性的影响:IL-37预处理增强了CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞的免疫抑制活性,100 ng/ml处理组和24h处理组效应最明显。LPS可以活化小鼠Treg细胞,加强Treg细胞免疫抑制活性。IL-37预处理,可以进一步上调LPS环境中的Treg细胞的免疫抑制活性。
  2.IL-37对Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达的影响:IL-37(40~250ng/ml)预处理Treg细胞24h,可以显著增强Foxp3表达;IL-37(100~250ng/ml)预处理Treg细胞24h,可以显著增强CTLA-4表达。100 ng/mlIL-37预处理Treg细胞不同时间,24h组Treg细胞的Foxp3/CTLA-4表达上调最明显。LPS刺激上调Foxp3表达,但是对CTLA-4表达无影响。IL-37联合LPS刺激,可以上调Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达。
  3.IL-37对Treg细胞IL-10/TGF-β分泌的影响:IL-37促进Treg细胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加强TGF-β1分泌。LPS环境中,IL-37刺激可以进一步促进Treg细胞分泌TGF-β。IL-37和LPS单独刺激,或IL-37/LPS联合刺激,对Treg细胞IL-10分泌均无影响。
  4.IL-37对共培养试验中CD4+CD25-T细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影响:Treg细胞可以抑制IL-2,但是IL-37预处理不影响Treg对IL-2的抑制效应。LPS预处理加强Treg细胞对IL-2的抑制效应,LPS联合IL-37刺激,不能进一步上调Treg细胞对IL-2的抑制效应。Treg细胞有效诱导Th2细胞极化,共培养试验中上清液IL-4/IFN-γ比例增加,提示Th2细胞增多。IL-37刺激或IL-37联合LPS刺激,加强了Treg细胞极化Th2细胞的效应。
  5.IL-37对脓毒症动物生存率的影响:IL-37预处理或IL-37术后立即给药,均可以改善动物生存率。然而,IL-37术后2h给药对脓毒症动物没有生存保护效应。
  研究结论:
  rhIL-37增强CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制活性,这为脓毒症免疫调节治疗提供了新思路。
[硕士论文] 张玲玲
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:压疮,又称压力性损伤,是发生在皮肤和/或潜在皮下软组织的局限性损伤,通常发生在骨隆突处或与医疗或其他医疗设备有关的损伤。压疮是临床常见的护理并发症,美国每年有大约100万的患者发生压疮,每年用于治疗压疮的医疗费用高达16亿美金,美国近10年的调查研究显示压疮的患病率在综合性医院为10%-18%,一旦患者发生压疮,不但给患者带来了痛苦,而且增加了社会、家庭的经济负担,同时给护理和治疗带来了极大的困难。压疮多发于年老虚弱或者长期卧床的患者,各个医疗机构将患者压疮的现患率,特别是医院内获得性压疮的发生率作为评价护理质量的指标,为此美国、荷兰、澳大利亚等国家相继开展了全国的现患率调研。
  目的:
  获得综合性医院住院成人患者的压疮现患率和医院获得性压疮的发生率,为临床医护人员制定下一步的预防策略提供依据。
  方法:
  经培训合格后分配到各个科室进行调查的压疮联络员在统一的时间,采用相同的流程、方法及压疮分期判定标准,对样本医院的成人住院患者进行横断面调查,严格按照护理部制定的统一标准填写调查表及统计数据;①调研对象为年龄≥18岁的所有住院患者,性别、病种不限;②排除标准:血液动力学不稳定,无法现场检查皮肤的患者以及儿科、门诊的患者;拒绝参与调研者;③数据库建立:所有调查表经核对后,剔除有缺失值的调查表;④统计学处理:使用SPSS18.0中文版进行统计分析,现患率统计采用描述性分析,使用率、百分比、均数和标准差。
  结果:
  2016年4次调研共入组患者17066位,调研共筛选出327例压疮患者,其中医院获得性压疮的患者有13位,压疮患者的压疮总数共计587处,压疮患者人均患有1.79处压疮。①压疮现患率及医院获得性压疮发生率:样本医院的压疮现患率为1.92%,医院获得性压疮的发生率为0.07%;②不同年龄段压疮现患率为:18岁-40岁压疮现患率0.42%、41岁-60岁压疮现患率0.82%、61岁-80岁压疮现患率3.02%、>80岁压疮现患率为7.61%;③压疮分期分布为:Ⅰ期压疮占比36.80%,Ⅱ期压疮占比40.89%,ⅢⅡ期压疮占6.30%,Ⅳ期压疮占0.85%,可疑深部组织创伤占6.81%,不可分期占8.35%;④压疮的首发部位是骶尾部;⑤不同科室现患率:压疮现患率在监护室最高为18.13%,内科患者的现患率为2.38%,外科患者的现患率为1.40%,综合科患者的现患率为0.97%,综合科患者的现患率是最低的;⑥在327例压疮患者中,使用压疮敷料的患者占比70.03%;每2小时一次的翻身措施落实率为94.80%。⑦医院新发生压疮的患者为13例,所患有压疮的总数量为22处,新发生压疮的患者人均患有1.68处压疮。其中Ⅰ期压疮7处,Ⅱ期压疮15处;患有3处压疮的患者有2位,患有2处压疮的患者有5位,患有1处压疮的患者有6位;男性患者8位,女性患者5位。
  结论:
  ①2016年4次调研结果显示样本医院的压疮现患率为1.92%,医院获得性压疮的发生率为0.07%;压疮患者的现患率随着住院患者年龄的增大而逐步升高;最常见的压疮分期为Ⅱ期;骶尾部是压疮重点防护部位;监护室的压疮现患率最高;②2016年度的4次调研结果可以指导医院压疮预防措施的制订与实施,并且能够为其他相关研究提供初步的基线数据。
[硕士论文] 杨玉环
急诊医学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)主要收治病种之一,具有发病率高、病情严重程度高、病死率高等特点;急性肾损伤(Acute kidney Injury,AKI)是脓毒症患者常见及最严重并发症,尤其是在老年患者中,约超过50%的重症患者并发AKI。AKI诊断存在滞后性,诊断的延迟导致治疗的不及时,错失了脓毒症AKI在早期损伤可逆阶段的最佳治疗时机。本研究的目的在于评估血浆中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Plasma neutrophilgelatinase-associated lipocaliin,血NGAL)、尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocaliin,尿NGAL)、尿肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,KIM-1)和尿金属蛋白酶抑制物-2(Tissue inhibitorof metalloproteinase-2,TIMP-2)对脓毒症AKI的早期诊断价值。
  方法:收集2015年6月至2016年1月期间入住江苏省苏北人民医院ICU的脓毒症患者,连续观察72小时,观察是否出现AKI,根据观察结果分组,即脓毒症AKI组及脓毒症非AKI组,收集各组患者的一般临床资料,并收集脓毒症患者入ICU时(0h)以及入ICU后6h、12h、24h、48h、72h时患者外周静脉血及尿液样本,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血肌酐、血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的表达水平,比较各组患者各时刻血肌酐、血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的表达水平,并用血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2并与血肌酐、SOFA(Sequential organ failureassessment SOFA)评分及APACHEⅡ(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ)评分进行相关性分析。绘制受试者工作特征曲线(ROC),计算曲线下面积(AUC),评价血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2对脓毒症AKI的早期诊断价值。
  结果:研究期间共有522名患者入住我院ICU,最终纳入符合研究标准的脓毒症患者共90名,其中38例发生AKI,占脓毒症患者的42.22%。AKI组患者血NGAL、尿NGAL水平在T-18h时开始升高(P<0.05),在T-12h时明显升高,T0h时达到峰值,在T-18h、T-12h、T0h、T24h、T48h时血NGAL、尿NGAL浓度明显高于同时刻非AKI组患者(P<0.05)。AKI组患者尿KIM-1水平在T-18h时开始升高(P均<0.05),在T-12h时达到峰值,在T-18h、T-12h、T0h、T24h、T48h时尿KIM-1水平明显高于同时刻非AKI组患者(P均<0.05)。AKI组患者尿TIMP-2水平在T-18h时开始升高(P均<0.05),在T-12h时达到峰值,在T-18h、T12h、T0h、T24h、T48h时尿KIM-1水平明显高于同时刻非AKI组患者(P均<0.05)。整体样本的ROC曲线结果显示血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的ROC-AUC分别为0.861,0.858,0.787,0.771,其诊断截断值分别为119.30ng/L,120.36 ng/L,90.07 ng/L,3299.50 ng/L。各时间点绘制ROC曲线显示,在T-18h时,血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1及尿TIMP-2的ROC-AUC分别为0.84、0.95、0.76、0.87;在T-12h时,血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1及尿TIMP-2的ROC-AUC分别为1、1、0.95、0.92。血NGAL、尿NGAL在T-12h时的阳性预测值及阴性预测值分别为95.47%、100.00%;93.25%、100.00%。尿KIM-1和尿TIMP-2在T-12h时的阳性预测值及阴性预测值分别为95.84%、90.34%;90.84%、83.52%。尿TIMP-2与APACHEⅡ评分呈正相关性,其相关系数为r=0.547,P<0.01。
  结论:血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-1可以早于临床诊断诊断脓毒症急性肾损伤。尿TIMP-2与APACHEⅡ评分呈正相关性,可能反映患者病情严重程度。
[硕士论文] 王文递
生理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1、通过建立大鼠代谢性内毒素血症及肝胰岛素抵抗模型,探讨代谢性内毒素血症对肝线粒体结构与能量代谢的影响;
  2、通过体外实验,探讨内毒素(LPS)对大鼠正常肝细胞线粒体结构及能量代谢的直接影响。
  方法:
  在体实验:30只雄性SD大鼠随机分三组(每组10只):正常对照组(NC组)、高果糖组(HFD组,10%果糖水喂养)、LPS组(皮下注射LPS300μg.kg-1.d-1)。每周检测并记录大鼠体重,8周末,禁食12 h以上,腹腔注射糖耐量实验结束后,经乙醚麻醉腹主动脉采血,4℃3500 r/min离心10 min,取血浆分装后置于-40℃保存。分离肝脏组织,部分置于4%多聚甲醛溶液中固定12~24 h,冲洗修整,经常规石蜡包埋切片,行苏木素伊红染色(H&E染色);剩余样本置液氮速冻后转-80℃保存。
  1、腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)
  每周检测大鼠体重变化,8周末,空腹腹腔注射50%葡萄糖溶液(2 g/kg)。尾静脉采血,采用快速血糖仪(罗氏活力型)分别检测注射前(0 min)与注射后(15 min、30 min、120 min)血糖水平。
  2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估
  采用酶法测定血糖、血浆 AST及 ALT;鲎试剂法检测血浆 LPS水平;ELISA法检测胰岛素变化,计算胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR),公式为:HOMA-IR=空腹血糖(FPG, mmol/L)×空腹胰岛素(FINS, EU/ml)/22.5。
  3、氧化损伤产物及能量代谢指标检测
  采用酶法检测并计算血浆中 GSH-PX的水平;ELISA法检测血浆中氧化损伤产物(8-OhdG、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。
  4、肝脏组织病理学检测
  于4%多聚甲醛固定液中取出肝脏组织,冲洗修整后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋切片,厚度5μm,行H&E染色,光镜下观察肝组织病理学变化。
  5、Western blot分析
  采用 Western blot检测肝组织胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)及线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。
  离体实验:采用改良胶原酶二步灌流法,体外分离培养大鼠肝细胞并随机分为四组:正常对照组(NC组,DMEM培养液培养)、高果糖组(HFD组,培养液+4.5 g/L果糖水)、LPS组(培养液+10 mg/L LPS)、果糖并LPS干预组(H+L组,培养液+4.5 g/L果糖水+10 mg/L LPS)。20 h后,吸取并分装细胞上清液,胰酶(含EDTA)消化,2000 r/min离心3 min后弃上清,收取肝细胞于-40℃冷冻保存。
  1、氧化损伤产物及能量代谢指标检测
  采用ELISA法检测细胞上清液中氧化损伤产物(8-OhdG、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。
  2、Western blot分析
  采用Western blot检测肝细胞中胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)、线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。
  结果:
  在体实验:
  1、体重变化及糖耐量结果
  实验期间,各组大鼠总体状态良好。与NC组相比,HFD组与LPS组大鼠体重在2~8周显著增高(P<0.01,P<0.05)。HFD组与LPS组各时间点血糖均显著高于NC组(P<0.01,P<0.05),表明HFD组与LPS组大鼠发生糖耐量异常。
  2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估结果
  HFD组与LPS组的肝酶、FINS、FPG、LPS水平及HOMA-IR显著高于NC组(P<0.01),HFD组与LPS组无统计学差异(P>0.05)。
  3、氧化损伤产物及能量代谢指标变化
  HFD组与LPS组8-OhdG、MDA、4-HNE及GSH-PX显著高于NC组(P<0.01), HFD组与LPS组差异无统计学意义。能量代谢指标,HFD组与 LPS组ADP、ATP与NC组相比显著降低(P<0.01),HFD组与LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。
  4、肝组织病理学变化
  NC组肝脏呈暗红色,无油腻感,H&E染色后光镜下可见肝索呈放射状排列。HFD组与LPS组肝脏有明显油腻感;镜下可见肝细胞包浆内出现脂滴空泡并伴有气球样变。
  5、Western blot结果
  与NC组相比,HFD组与LPS组肝组织IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和 p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01),UCP2表达显著升高(P<0.01), HFD组与LPS组相比无统计学意义(P>0.05)。
  离体实验:
  1、氧化损伤产物及能量代谢指标变化
  HFD组、LPS组及H+L组8-OhdG、MDA及4-HNE显著高于NC组(P<0.01, P<0.05),能量代谢指标与NC组比较,HFD组、LPS组及H+L组ADP、ATP显著降低(P<0.05)。HFD组、LPS组及HFD+LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。
  2、Western blot结果
  与NC组相比, HFD组、LPS组及H+L组肝细胞IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01,P<0.05),UCP2表达显著升高(P<0.01),HFD组、LPS组及H+L组相比无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、高果糖饮食及皮下注射LPS可诱发大鼠胰岛素抵抗和代谢性内毒素血症,并伴有氧化应激和肝细胞线粒体功能障碍。
  2、LPS可诱导氧化中间产物生成增多,清除减少,致使肝脏处于氧化应激状态,进而破坏肝细胞线粒体结构,影响其能量代谢,加速胰岛素抵抗及代谢性疾病的发生发展。
[硕士论文] 舒畅
急诊医学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:感染性休克是临床常见的危重症,尽管治疗水平不断提高,但病死率仍居高不下。感染导致有效循环血量不足,组织器官灌注减少,是感染性休克的病理生理学机制,积极液体复苏改善组织灌注是感染性休克的主要治疗手段之一。右美托咪定是临床重症患者常用的镇痛镇静药物,近年有研究显示右美托咪定可改善感染性休克患者的组织灌注,本文对此进行了探讨。
  目的:
  探讨右美托咪定对早期感染性休克患者血流动力学和微循环的影响。
  方法:
  (1)研究设计:单中心、前瞻随机、对照、双盲研究;
  (2)研究对象:2016年2月~2017年3月期间东南大学附属中大医院重症医学科收治的进行液体复苏且平均动脉压(MAP≥65mmHg)的早期(≤24小时)感染性休克患者;
  (3)试验分组:患者纳入后根据随机数字表随机分为试验组和对照组,试验组给予右美托咪定0.7ug/kg/hr持续静脉泵入治疗,对照组给予生理盐水0.7ug/kg/hr持续静脉泵入治疗;
  (4)试验监测方法:纳入研究的患者采用脉搏指示连续心排出量(PiCCO)行血流动力学监测,采用血气分析仪进行氧代谢监测,通过旁流暗视野成像(SDFimaging)技术监测患者的微循环灌注水平;
  (5)试验观察和临床数据收集:分别于患者入组时,试验用药1小时后收集以下临床资料:
  ①血流动力学指标:一般指标,如心率(HR)等;压力指标,如平均动脉压(MAP)、中心静脉压(CVP)等;容积指标,如每搏输出量(SV)、每搏指数(SVI)、心输出量(CO)等;阻力指标,如体循环阻力(SVR)、体循环阻力指数(SVRI)等;
  ②氧代谢指标:动脉氧分压(PaO2)、动脉血氧饱和度(SvO2)、静脉血氧饱和度(PvO2)、静脉血氧饱和度(SvO2)、乳酸(Lac)等;
  ③微循环指标:总血管密度(Total Vascular Density,TVD)、灌注血管密度(Perfused Vessel Density,PVD)、灌注血管比例(Proportion of PerfusedVessels,PPV)、微血管流动指数(Microvascular Flow Index,MFI)等;
  (6)试验条件:试验过程中两组患者均处于镇痛状态,给予瑞芬太尼、吗啡等镇痛药物持续静脉泵入治疗,维持重症监护患者疼痛评估(Critical carePatient Observation Tool,CPOT)评分0~1分。研究期间输液速度、补液量处于相同水平,血管活性药物剂量随血压调整并维持平均动脉压(MAP)≥65mmHg。患者氧饱和度(SpO2)维持在95%以上。
  (7)盲法的实施与揭盲;研究用药按照随机数字表随机分组,保持外观和形状上一致性。保管者与使用者均不明确药物具体内容,全部病例数据收集完成后予以揭盲,完成试验。
  结果:
  (1)患者入组情况:2016年2月1日至2017年3月31日期间入住东南大学附属中大医院重症医学科的感染性休克患者共283例,依入排标准共排除235例:其中脑血管意外、痴呆37例;肝功能异常22例;入组时平均动脉压<65mmHg79例;未放置PiCCO导管56例;年龄因素41例。符合纳入标准48例。试验过程中2例患者使用药物后出现明显心率减慢,被迫终止研究;7例患者微循环图像质量不佳脱落,最终入组39例。其中对照组17例,试验组22例。
  (2)两组患者的基本资料比较:在纳入研究的39例患者中,试验组22例,对照组17例。对照组和试验组的平均年龄为(72.5±10.8) vs.(71±11.0)岁,P=0.850;男女性别比例为13/4 vs.17/5,P=0.623,两组相比无统计学差异。两组患者的疾病严重程度方面,患者APACHEⅡ评分(P=0.092)、SOFA评分(P=0.798),也无统计学差异。对照组和试验组主要的基础疾病为高血压(P=0.270),主要感染部位为肺部(P=0.074),同样无显著差异。
  两组患者入组时血流动力学参数比较,对照组和试验组患者心率(HR)、平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)以及其他压力、阻力、容量指标P值均>0.05,无统计学差异。诸如静脉血氧饱和度(SvO2)、乳酸(Lac)等氧代谢指标也无统计学差异。同样两组患者基础微循环数据如灌注血管密度(PVD)(21.46±13.78 vs.14.40±13.86 mm/mm2)等指标,P值均>0.05,均无显著差异。
  (3)右美托咪定对感染性休克患者血流动力学的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者心率(HR)无统计学差异(94.82 bpm vs.96.86 bpm,P=0.758),平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)[(83.65 mmHg vs.81.08 mmHg, P=0.417);(6.18L/min vs.6.66L/min,P=0.480)]以及其他压力、阻力等血流动力学指标均无显著差异。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者相应的血流动力学压力、阻力、容积指标同样无显著差异;
  (4)右美托咪定对感染性休克患者氧代谢的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者中心静脉血氧饱和度(ScvO2)、乳酸(Lac)等氧代谢指标无明显统计学差异(79.52% vs.75.81%,P=0.229;2.26mmol/L vs.2.50 mmol/L,P=0.356)。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者ScvO2、Lac指标(78.86% vs.76.46%,P=0.401;3.53 mmol/L vs.4.02 mmol/L,P=0.779)同样无显著差异;
  (5)右美托咪定对感染性休克患者微循环的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者灌注血管密度(PVD)、微血管流动指数(MFI)指标(22.59 mm/mm2 vs.16.75 mm/mm2,P=0.586;2.49 vs.2.43,P=0.670)无统计学差异。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者PVD、MFI指标(10.76 mm/mm2 vs.14.27 mm/mm2,P=0.401;2.39 vs.2.46,P=0.889)仍无统计学差异。
  结论:
  右美托咪定对感染性休克患者的血流动力学和微循环无显著影响。
[博士论文] 王旭
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:背景:脓毒症是指宿主对感染的反应失调,产生危及生命的器官功能障碍,是严重创伤、烧伤、休克后常见的并发症。近年来,尽管在严重脓毒症及脓毒性休克的抗感染、液体复苏、创面处理、器官支持治疗等方面已取得进展,但其病死率仍居高不下,是重症监护室(intensive care unit,ICU)病人的首要死亡原因。脓毒症患者免疫功能受到抑制,自身清除感染的能力降低,是患者感染难以控制的重要原因。抗生素的使用提高了脓毒症患者的救治成功率,但随着抗生素的长期应用,不敏感菌株大量繁殖,抗生素不能完全解决脓毒症时的感染问题。因此,如何改善脓毒症时患者自身的免疫功能从而有效地控制感染,是脓毒症防治的重要课题。脓毒症时,在多种细菌毒素及细胞因子的刺激下,中性粒细胞功能失调,趋化方向性受损,到达病原感染部位的中性粒细胞数量减少,不能有效抑制病原增殖,导致机体抵御感染的能力降低,影响重要脏器的功能,是脓毒症患者死亡的重要原因之一。进一步阐明脓毒症时中性粒细胞方向性受损的机制,寻找针对性的干预措施,使中性粒细胞向感染部位的趋化增强,可为脓毒症的抗感染治疗提供理论基础。
  内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁表面的主要组成成分,过量的LPS可导致天然免疫细胞的过度活化,释放过多的炎症介质,通过自分泌、旁分泌和体循环作用于全身组织器官,是引起脓毒症时全身炎症反应综合征的重要原因。ATP是细胞内重要的能量分子,近年来,Junger等人发现中性粒细胞也可通过自分泌ATP途径对自身的趋化产生影响。中性粒细胞趋化时前端片足分泌的ATP通过自分泌途径激活自身局部的P2Y2受体,增强了细胞的运动功能,但当细胞整体都接受ATP的刺激时,中性粒细胞的趋化功能反而受到抑制,这提示胞外ATP亦可能是中性粒细胞趋化的抑制分子,但其具体分子机制目前并不明确。P2X1受体是ATP门控阳离子通道受体,与ATP结合后能迅速诱导细胞的Ca+内流,是细胞重要的Ca2+内流通道。近年来的研究证实P2X1受体也表达于外周血中性粒细胞中,ATP可通过活化P2X1受体增强中性粒细胞的随机运动,但随机运动的中性粒细胞不具有方向性,损伤了其向趋化物的定向运动能力,减弱了中性粒细胞向感染部位的特异性趋化能力。Ca+是细胞内重要的信号分子,参与调控了中性粒细胞的多种生物学功能,但过度的Ca2+内流对中性粒细胞的趋化则具有抑制作用,但其是否与P2X1受体的活化有关目前尚不明确。
  方法:体内实验采用致死剂量和非致死剂量的大肠埃希菌腹腔注射,制作脓毒症感染小鼠模型和轻度局部感染小鼠模型,观察小鼠生存率,血细胞自动分析仪检测腹腔灌洗液、血液中性粒细胞数量,平板菌落计数法检测腹腔灌洗液、血液细菌含量。病理切片HE染色观察小鼠脓毒症后肝、肺损伤,ELISA试剂盒检测肝、肺IL-1β、IL-6细胞因子水平,MDA试剂盒检测肝、肺MDA含量,转录谱基因芯片检测中性粒细胞基因表达的差异。
  体外实验采用LPS刺激原代中性粒细胞模型,琼脂糖趋化实验检测中性粒细胞趋化距离,流式细胞仪检测中性粒细胞趋化分子受体表达及凋亡,高效液相色谱仪检测ATP释放,Western Blot检测Cx43蛋白磷酸化,激光共聚焦显微镜检测P2X1受体分布、Ca2+内流,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白肌球蛋白轻链(myosin lightchain,MLC)磷酸化、极性化。
  采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒细胞株P2X1受体,1.3%二甲基亚砜处理HL-60细胞6d后分化成类中性粒细胞,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白MLC磷酸化、极性化。
  结果:体内研究发现脓毒症时中性粒细胞趋化功能受到抑制、清除感染能力受损,肝、肺组织病理损伤明显、炎症反应增强,进一步的基因芯片检测发现脓毒症时中性粒细胞TLR信号通路活化,LPS通过TLR4对中性粒细胞多种的趋化分子受体的表达产生调控作用。
  体外研究发现在脓毒症时重要的炎症刺激分子中LPS对中性粒细胞趋化的抑制作用最为明显,LPS通过促进Cx43通道开放分泌ATP,ATP作用于自身P2X1受体后引起过量的Ca2+内流,使中性粒细胞钙调蛋白MLCK活化,导致MLC异常磷酸化及极性化,抑制了中性粒细胞的趋化。P2X1受体敲除后,LPS对中性粒细胞的抑制作用被削弱,MLC磷酸化、极性化恢复正常。
  结论:本研究通过体内、体外研究发现了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信号通路对中性粒细胞趋化的抑制作用,并揭示其对中性粒细胞骨架蛋白MLC异常极性化的作用及机制,这可能是脓毒症时中性粒细胞趋化受损的重要原因之一。
[硕士论文] 李菁
中医内科学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察脓毒症中医证型与乳酸(Lactic acid,LAC)值、SIRS分值的相关性,为脓毒症中医辨证分型提供临床依据,使中医辨证客观化,指导疾病的治疗,帮助判断预后。
  方法:
  本研究选择符合纳入标准的120例脓毒症患者,2位副高以上的中医师参照《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》进行中医辨证分型,对采集的病例行LAC值、SIRS分值检测,制定统一的调查表,运用SPSS20.0软件进行统计学分析。
  结果:
  1.本研究收集了120例脓毒症患者,其中毒热证36例(占30.0%),血瘀证33例(占27.5%),腑气不通证26例(占21.7%),急性虚证25例(占20.8%)。
  2.本研究收集的120例患者中,中医各证型在性别、年龄方面均无统计学差异(P>0.05),脓毒症各分级在性别、年龄方面均无统计学差异(P>0.05)。
  3.在LAC值与脓毒症中医证型的研究中,发现急性虚证>毒热证>腑气不通证>血瘀证。除去毒热证与腑气不通证无统计学差异(P>0.05),其余各证型之间均有统计学差异(P<0.05),中医证型与LAC值之间存在相关性。
  4.在SIRS分值与脓毒症中医证型的研究中,发现毒热证>腑气不通证>急性虚证>血瘀证。除去毒热证与血瘀证、毒热证与腑气不通证、毒热证与急性虚证有统计学差异(P<0.05),其余各证型之间均无统计学差异(P>0.05),中医证型与SIRS分值之间存在相关性。
  5.在LAC值与脓毒症分级的研究中,发现严重脓毒症>脓毒症,两组之间具有统计学差异(P<0.05),脓毒症分级与LAC值之间存在相关性。
  6.在SIRS分值与脓毒症分级的研究中,发现严重脓毒症>脓毒症,两组之间具有统计学差异(P<0.05),脓毒症分级与SIRS分值之间存在相关性。
  7.在脓毒症中医证型与病情严重程度的等级资料多样本比较的秩和检验中,发现除去毒热证与腑气不通证无统计学差异(P>0.05),其余证型之间均具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  1.中医证型与LAC值之间存在相关性,脓毒症患者的LAC值随中医证型的变化而逐渐升高,血瘀证<毒热证或腑气不通证<急性虚证。
  2.研究脓毒症患者的SIRS分值与中医证型的相关性,结果为毒热证与其余三个证型之间均具有统计学差异(P<0.05),且毒热证的SIRS分值高于其余三个证型,中医证型与SIRS分值之间存在相关性。
  3.脓毒症分级与LAC值之间存在相关性,脓毒症患者的LAC值随着脓毒症分级的变化而逐渐升高,脓毒症<严重脓毒症。
  4.脓毒症分级与SIRS分值之间存在相关性,脓毒症患者的SIRS分值随着脓毒症分级的变化而逐渐升高,脓毒症<严重脓毒症。
  5.LAC值、SIRS分值可提示病情的严重程度,为脓毒症中医辨证分型提供参考价值。
[硕士论文] 张市会
生物化学与分子生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:脓毒症是临床常见的全身性炎症反应综合症,感染、创伤、烧伤、休克等均是其诱因,且死亡率高,是临床常见的并发症之一。研究表明,脓毒症早期机体会产生过度、过多的促炎因子,虽然促炎反应有利于清除病原菌,但过度的炎症反应会导致细胞过度焦亡,增加机体的免疫损伤。
  炎症小体在炎症反应中具有重要作用,它是由模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)检测病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)后,直接或者通过ASC接头蛋白同Pro-Caspase-1蛋白形成的复合物,随即使Caspase-1活化,剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18,并释放IL-1β和IL-18,这也称为经典炎症小体。2011年Kayagaki研究发现Caspase-11是小鼠革兰氏阴性菌脓毒症死亡的主要原因,并由此提出了非经典炎症小体。
  非经典炎症小体以Caspase-11为核心,Caspase-11作为胞内模式识别受体识别胞内革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),与LPS结合后发生寡聚化而活化,继而使细胞发生炎性焦亡,以抵御革兰氏阴性菌感染,但是非经典炎症小体的调控机制一旦失调,则可能会引起非经典炎症小体的过度激活,最终导致脓毒症死亡,所以亟需对非经典炎症小体的调控机制进行研究。
  研究发现,泛素化在经典炎症小体中具有重要的调控作用,ASC的线性泛素化是NLRP3经典炎症小体激活所必须的,泛素化编辑酶A20亦可通过阻断NF-κB通路下调NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL18的表达,从而负调控NLRP3经典炎症小体。我们实验室成员在国外博士后研究期间发现E3泛素化连接酶Cbl-b通过泛素化修饰NLRP3蛋白负调控炎症小体的激活,但是到目前为止关于泛素化对非经典炎症小体的调控作用仍未见报道。
  Nedd4是一种重要的HECT型E3泛素连接酶,在多种细胞中表达,且具有多种底物分子,参与着众多生理过程,研究发现,Nedd4可通过泛素化Cbl-b促进Th细胞活化,在B细胞中Nedd4可通过对TRAF3 K63形式的泛素化调节CD40介导的AKT通路,参与着免疫球蛋白类型的转换。说明Nedd4在获得性免疫的调控中具有重要作用,但是在天然免疫中的作用,尤其是对非经典炎症小体的调控作用及机制需进一步探讨,因此本研究将探讨 Nedd4对非经典炎症小体的调控作用及机制,为以后干预由革兰氏阴性菌所引起的脓毒症提供理论依据。
  第一部分:Nedd4对非经典炎症小体调控作用的研究
  本部分研究旨在探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。首先利用Nedd4+/-小鼠在小鼠水平探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。利用低剂量LPS(400ng/kg)腹腔注射Nedd4+/-和野生型小鼠进行引发(Priming)7小时,然后使用高剂量LPS(10mg/kg)刺激小鼠(activation),建立非经典炎症小体激活模型,观察小鼠24小时内存活率,检测血清中IL-1β含量,HE染色观察脏器炎性损伤。
  随后在细胞水平探讨 Nedd4对非经典炎症小体的调控作用。利用CRISPR/Cas9技术建立Nedd4敲除的BMDM细胞系。使用LPS(500ng/ml)引发Nedd4敲除及其对照细胞4小时,然后按照1×106/ug LPS进行电转,建立非经典炎症小体激活模型,2.5小时后收集细胞培养上清,检测LDH释放。此外使用LPS(500ng/ml)引发Nedd4敲除及其对照细胞7小时,将LPS浓度调整为2ug/ml同时使用8(16)ug/ml CTB介导LPS进入细胞内部,16小时后收集细胞培养上清检测LDH释放,对电转实验结果进行验证。
  结果表明,相对于野生型小鼠,Nedd4+/-小鼠生存率显著降低,血清中IL-1β含量显著升高,心肝具有较严重的炎性损伤;细胞实验结果显示,相对于对照组,Nedd4敲除后细胞死亡率显著升高,且呈现CTB剂量依赖效应。本部分实验结果提示,Nedd4对非经典炎症小体具有抑制作用,这为下一步研究调控的分子机制奠定了基础。
  第二部分:Nedd4对非经典炎症小体调控作用的机制研究
  本部分研究在第一部分研究结果的基础上,以非经典炎症小体的核心分子Caspase-11为切入点,在mRNA水平和蛋白水平初步探讨Nedd4调控非经典炎症小体的分子机制,
  一、Nedd4对Caspase-11蛋白mRNA水平调控的研究
  本章节探究Nedd4对Caspase-11蛋白mRNA水平调控作用,通过序列分析,Caspase-11的上游分子p38αVariant2具有Nedd4所特异性识别的结构域,推测p38α可能为Nedd4的底物分子,Nedd4通过调控p38MAPK通路调控Caspase-11 mRNA水平。首先利用Real-time PCR的方法探讨Nedd4对Caspase-11 mRNA的调控作用,然后利用LPS刺激Nedd4稳定敲低(敲除)及其对照细胞,293T细胞共转,MG132和氯喹阻断等实验手段,通过ELISA、双荧光素酶报告系统、Western blot技术、免疫共沉淀、Ni-NTA纯化、质谱分析等方法进一步进行研究。
  与对照组相比,Nedd4稳定敲低(敲除)组Caspase-11的mRNA水平显著升高;TNF-α的分泌显著增加;p-p38(p38)的蛋白水平显著升高;双荧光素酶报告实验发现Nedd4抑制转录因子AP-1活性;p-p38(p38)蛋白经泛素化由蛋白酶体和溶酶体途径进行降解;Co-IP实验结果显示,磷酸化影响Nedd4与p38αV1的相互作用,但对Nedd4与p38αV2的相互作用没有影响;泛素化实验结果表明,Nedd4参与着p38αK48和K63两种形式的泛素化,磷酸化显著增强Nedd4对p38αV1/2的K48形式的泛素化;质谱分析发现,p38αV1在K45、K53(K54)和K152位点具有泛素化修饰,p38αV2的K53(K54)、K287和K295位点具有泛素化修饰,K53(K54)位点是共有的泛素化位点。该实验结果提示:Nedd4可通过对p38α直接泛素化使其进行降解,起到对p38MAPK通路的负调控作用,从而实现对Caspase-11 mRNA的负调控。
  二、Nedd4对Caspase-11蛋白水平调控的研究
  本章主要研究 Nedd4在蛋白水平对 Caspase-11的调控作用,并初步探讨其分子机制。如第一章所述方法,使用LPS刺激、293T细胞共转,mg132和氯喹阻断等实验手段,通过Real-time PCR、Western blot技术、免疫共沉淀、Ni-NTA纯化等检测方法进行探讨。
  与对照组相比,Nedd4稳定敲低(敲除)组的Caspase-11蛋白水平显著升高;Caspase-11蛋白经泛素化由蛋白酶体途径进行降解;Co-IP实验发现,Nedd4可与Caspase-11蛋白发生直接的相互作用;泛素化实验表明,Nedd4对Caspase-11蛋白具有直接的泛素化作用。该结果提示Nedd4可通过与Caspase-11蛋白的直接相互作用对其进行泛素化,使其进入蛋白酶体进行降解,说明Nedd4可直接在蛋白水平调控Caspase-11。
  综上所述:本研究通过一系列实验探讨Nedd4对非经典炎症小体的调控作用,并对其调控机制进行初步研究。结果表明,Nedd4对非经典炎症小体具有负调控作用。Nedd4可通过负调控p38αMAPK通路实现对非经典炎症小体的核心分子Caspase-11 mRNA水平的调控作用,同时Nedd4可直接泛素化Caspase-11使其进行降解,从而实现对Caspase-11蛋白水平的调控。Nedd4在mRNA水平和蛋白水平对Caspase-11蛋白进行调控,从而实现对非经典炎症小体的调控,这为后期临床干预革兰氏阴性菌脓毒症奠定了理论基础。
[硕士论文] 刘超
重症医学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景:随着人口老龄化日趋严重,老年人群中脓毒症患者在逐年增加,发病率及死亡率也随着年龄的升高显著上升。尽管做了大量的临床试验和基础研究,但目前仍没有有效治疗老年严重脓毒症患者的方法。临床与基础研究的分歧主要在于用于基础研究的试验动物过于年轻不能真实反映老年脓毒症患者的特点。近年来,利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)制备的亚急性衰老模型已应用于多种老年性疾病的研究当中并且取得了良好的效果,但关于其相关的老年脓毒症模型研究较少。因此,利用D-gal诱导的衰老大鼠建立脓毒症模型将为老年脓毒症的基础与临床研究提供新的思路。
  目的:1、观察D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型死亡率、炎症细胞因子、器官功能及生命体征的变化;2、探讨在老年脓毒症研究中的应用价值。
  方法:本研究由两部分组成。第一部分采用D-gal皮下注射的方法建立大鼠衰老模型,将12周雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为低剂量(low-dose)诱导组(LD-galgroup,诱导剂量125mg/kg/d)、高剂量(high-dose)诱导组(H D-galgroup,诱导剂量500mg/kg/d)和对照组(controlgroup,皮下注射同等剂量0.9%NaCl),6周后测量血清丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量并观察肾功能及生命体征变化。第二部分采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法在已建立的大鼠衰老模型的基础上建立脓毒症模型。实验分组同前,观察各组间CLP术后12h及24h死亡率、炎症因子、肾功能、MicroRNA-155及生命体征的变化。
  结果:1、D-半乳糖皮下注射6周后,大鼠血清MDA含量升高SOD活性下降(HD-galvs.control, P<0.01 for MDA and SOD;L D-gal vs.control, P<0.01 for MDA and SOD;HD-gal vs.L D-gal,P=0.017 for MDA,P=0.034 for SOD);2、CLP术后1周的死亡率分别是73.3%(HD-gal)、40%(L D-gal)和33.3%(control);3、与对照组相比,高剂量诱导组在CLP术后的血清肌酐、尿素氮、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、白介素-6、白介素-10、肿瘤坏死因子-α以及MicroRNA-155水平明显升高(P<0.05);4、根据肾损伤RIFLE分级,CLP术后24小时发生严重急性肾损伤(RIFLE-F)的可能分别是80%(HD-gal)、43%(L D-gal)和43%(control);5、高剂量诱导组在CLP术后更易出现心率、收缩压和体温的降低。
  结论:与青年SD大鼠脓毒症模型相比,在高剂量D-gal诱导的衰老大鼠上建立的脓毒症模型死亡率高,这可能与炎症反应的增加和严重的急性肾损伤相关。并且高剂量诱导组更易出现严重的感染性休克和低体温。因此,使用高剂量D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型进行临床前研究可以为老年患者的脓毒症治疗提供更有价值的信息。
[博士论文] 黄爱蓉
儿科学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  选择最合适盲肠结扎部位行盲肠结扎穿刺法(cecal ligation and puncture,CLP),建立本实验最适脓毒症模型,首次探讨脓毒症对小鼠心肌线粒体生物合成的影响;给予不同浓度硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)干预,首次探讨NaHS对脓毒症小鼠心肌线粒体的保护作用、最佳浓度及相关机制,为脓毒症动物实验研究及临床诊治提供理论基础。
  方法:
  1.取40只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)和CLP1、CLP2、CLP3组(分别结扎盲肠远端1/4、1/2、3/4),比较小鼠生存情况,选择最佳模型和取材时间点。
  2.另取50只C57BL/6小鼠随机分为CLP、CLP+NaHS(4亚组,NaHS浓度分别为25、50、100、200μmol/L)5组,比较小鼠生存情况。
  3.另取70只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(Control)、Sham、CLP、CLP+NaHS(4亚组,NaHS浓度同前)7组,检测和比较以下指标:
  (1)小鼠脓毒症表现。
  (2)血浆内毒素水平
  (3)心肌损伤:HE染色观察心肌细胞形态、ELISA检测血清肌钙蛋白(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)水平。
  (4)心肌线粒体损伤:透射电镜观察线粒体形态学,分光光度法检测线粒体肿胀程度,生物发光法检测ATP水平。
  (5)氧化应激:TBA法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。
  (6)抗氧化物:比色定量法检测谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;Western Blot法检测锰超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,MnSOD)、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白水平;RT-qPCR法检测MnSOD、HO-1mRNA水平。
  (7)线粒体生物合成相关因子:RT-qPCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)、核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid-2-related factor2,Nrf2)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factorA,Tfam)mRNA水平。
  结果:
  1.CLP1、CLP2、CLP3组小鼠建模后开始死亡时间分别是12h、11h、8h,CLP1组小鼠48h存活率高于CLP2、CLP3组,故选择CLP1为本研究实验模型,建模后12h为取材时间点。
  2.NaHS干预组小鼠48h存活率高于CLP组,100μmol/L组最高。
  3.CLP组小鼠建模后6小时出现脓毒症表现,逐渐加重;NaHS干预组脓毒症表现减轻,NaHS浓度越高,症状越轻。
  4.CLP组内毒素水平升高。
  5.CLP组可见HE染色心肌细胞形态异常、cTnⅠ水平升高;NaHS干预组心肌细胞形态异常减轻、cTnⅠ水平下降,NaHS浓度越高作用越明显。
  6.CLP组心肌线粒体形态异常、肿胀程度增加、ATP水平下降;NaHS干预后线粒体形态异常及肿胀程度减轻,ATP水平升高,NaHS浓度越高作用越明显。
  7.CLP组ROS、MDA水平升高;与CLP组比较,各浓度NaHS组MDA水平均下降,但100、200μmol/L组间无显著性差异,ROS水平仅100、200μmol/L组下降。
  8.CLP组GSH水平下降、MnSOD、HO-1蛋白及mRNA水平上升;NaHS干预组其水平均较CLP组上升,且呈NaHS浓度依赖性,200μmol/L组MnSOD、HO-1蛋白水平低于100μmol/L组。
  9.CLP组PGC-1α、Nrf2、Tfam mRNA水平均上升;NaHS干预组较CLP组继续上升,NaHS浓度越高,上升越明显。
  10.CLP组和NaHS干预组cTnⅠ水平、线粒体肿胀程度均与ROS、MDA水平呈正相关,ATP水平与ROS、MDA水平呈负相关;NaHS干预组ROS、MDA水平与GSH水平、MnSOD及HO-1mRNA水平呈负相关,ATP、GSH水平及MnSOD、HO-1、Tfam mRNA水平均与PGC-1α、Nrf2mRNA水平呈正相关。
  结论:
  1.脓毒症可造成心肌线粒体氧化应激损伤。
  2.NaHS呈浓度依赖性减轻脓毒症时心肌线粒体损伤,100μmol/L为最佳浓度。
  3.NaHS可通过PGC-1α、Nrf2上调脓毒症时抗氧化物水平、促进线粒体生物合成,从而保护心肌线粒体。
[博士论文] 朱静
外科学(烧伤) 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:脓毒症时高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为晚期炎症介质和损伤相关分子模式(DAMPs)的重要成员能诱导树突状细胞(DCs)免疫功能紊乱,但其分子调控机制仍不清楚。微小RNA(miRNAs,miR)对mRNA发挥着转录后精细调控作用。本研究拟从miRNAs的角度探讨HMGB1诱导DCs成熟活化的分子调控机制,旨在为进一步探索严重烧(创)伤后脓毒症的免疫调控途径提供新线索。
  方法:第一部分,外源性HMGB1对小鼠脾脏DCs细胞免疫功能的影响。参考本实验室前期对大鼠脾脏DCs研究的基础,用0、100、1000ng/ml三个浓度的重组HMGB1刺激正常小鼠脾脏DCs,48h后分别应用流式细胞术检测DCs表面标志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHCⅡ)的表达情况;应用ELISA技术检测DCs分泌细胞因子IL-12、TNF-α的水平;将HMGB1刺激48h后的DCs与脾脏T淋巴细胞按1∶100的比例共培养,于3天(d)后采用CCK-8试剂盒观察T淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应,用ELISA技术检测培养液中干扰素(IFN-γ)(判断Th1/Th2功能分化)和IL-2(反映T细胞的分泌功能)的表达水平,最终确定HMGB1诱导DCs成熟活化的适合剂量。第二部分,HMGB1诱导小鼠脾脏DCs成熟活化后miRNA表达谱的研究。采用miRNAs芯片检测经HMGB1刺激活化后DCs中miRNAs表达谱的变化。结合芯片结果和文献报道,锁定可能发挥作用的差异表达miR:miR-181a-5p,通过RT-PCR方法验证该miR的表达量变化情况。第三部分,miR-181a-5p靶基因预测以及体外功能验证实验。运用计算机预测miR-181a-5p的靶mRNA,采用双荧光素酶报告系统证实这一假设,转染miR-181a-5p的mimics或inhibitor上调或下调细胞内该miR表达量,用RT-PCR方法检测其靶mRNA的表达量,从功能上验证miR-181a-5p对靶mRNA的调控作用。
  结果:第一部分,与正常对照组(HMGB1浓度0ng/ml组)相比,HMGB1(100ng/ml和1000ng/ml)作用48h后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达以及DCs分泌IL-12、TNF-α的水平均呈现双向调控现象,即在HMGB1浓度为100ng/ml时上调显著(P<0.05或P<0.001),而HMGB1浓度为1000ng/ml时各指标反而有所下降,尤其是IL-12,分泌水平反而低于HMGB1(0ng/ml)组(P<0.01);DCs与脾脏T淋巴细胞共培养后,经HMGB1刺激的DCs能显著增强T淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应(P<0.01),促进T细胞向Th1细胞极化[IFN-γ表达水平显著增加(P<0.01)]以及T细胞分泌功能增加[IL-2表达水平显著升高(P<0.01)],且符合上述双向调控现象,各指标在HMGB1(100ng/ml)组表达水平最高。通过本部分实验我们确定了100ng/ml为诱导DCs成熟活化的适合剂量。第二部分,100ng/mlHMGB1刺激DCs后用miRNAs芯片筛选出14个差异表达miRNAs,结合文献推测上调的miR-181a-5p(P<0.05)可能与HMGB1诱导的DCs免疫功能紊乱密切相关。运用RT-PCR技术验证了其上调趋势(P<0.01)和芯片结果一致,且也存在HMGB1的双向调控现象。第三部分,通过计算机预测TNF-α3'untranslated region(UTR)可能存在miR-181a-5p的靶基因位点,于是构建包含预测靶位点的TNF-α野生型(WT)和TNF-α突变型(MUT)载体进行荧光素酶实验,结果显示:与对照组相比较,miR-181a-5p能使WT组载体的荧光强度显著下降(P<0.001)。此外,我们对DCs转染miR-181a-5p mimics后,发现DCs内TNF-αmRNA的表达量下调显著(P<0.01),而转染miR-181a-5p inhibitors后则显著增强其TNF-αmRNA的表达(P<0.001)。
  结论:通过本项研究,我们证实了外源性HMGB1对小鼠脾脏DCs免疫功能及细胞内的miR-181a-5p均具有双向调控作用。合适剂量的HMGB1刺激小鼠脾脏DCs后,能诱导DCs成熟活化,并通过上调miR-181a-5p对细胞内的TNF-αmRNA发挥负性调控作用。这一调控机制可能和脓毒症时机体从最初的高炎症反应状态转变为晚期的免疫抑制状态密切相关。
[硕士论文] 牟子君
急诊医学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:目的:脓毒症是急危重症领域常见的重要课题,此类病人常存在血小板减低的情况,严重者包括脓毒症休克的患者甚至会出现出凝血障碍及血小板计数极低的情况,进而需要包括输血制品在内的升血小板相关治疗。然而,在输血的同时,除了纠正出凝血的障碍,也会同时伴随着并发症、不良反应等情况的出现。但至今并未有明确文献提示在脓毒症休克伴有血小板减低的患者进行输血治疗是否对死亡率、生存率的有影响。本次研究,着重探讨对于脓毒症休克相关的血小板减低症患者影响预后的相关因素。
  方法:收集2015年5月至2017年5月北京市协和医院EICU(急诊科重症监护病房)的脓毒症休克合并血小板减少症并符合筛选标准的35例患者进行回顾分析,记录患者治疗情况,根据出室转归分为死亡组、存活组。观察入室第一次血小板计数、最低血小板计数,各项凝血因子、血细胞计数、出凝血情况的变化及血液制品的使用情况进行分析。比较两组初始及治疗后的各项参数的变化。通过使用SPSS计算t检验、Pearson相关性分析比较死亡组、存活组的各类指标的差异性及组内数据的相关性,并且按照血小板减低程度将患者分为重度减低组、轻度减低组,在验证差异性、相关性的同时,通过计算两组数据的卡方检验来验证输入血小板的治疗意义。
  结果:1.整体的脓毒症休克伴有血小板减低症的患者总体上看死亡率、存活率与白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板及其相关参数指标、凝血指标、输入血小板、出血情况无明确差异性。(P>0.05)2.在脓毒症休克的患者出现严重的血小板减低时,死亡率和生存率与入室血小板计数、是否输血小板、PCT(血小板压积)存在明显差异性。(P<0.05)3.在重度血小板减低的感染性休克患者中,患者的死亡或存活的转归与入室血小板、输血小板治疗、PCT(血小板压积)有相关性。(P>0.05)而住ICU时间和治疗过程中的出血事件的发生于以上各类指标及输血治疗均无明显相关性。(P>0.05)4.在重度血小板减低的感染性休克患者中,输入血小板与死亡率有明显相关性。(P<0.05)
  结论:血小板轻度减低的程度对于单纯感染性休克的患者没有预后提示的意义,但是重度血小板减低时,治疗过程中出现的最低的血小板的数值对于死亡有预示意义。对于任意血小板减低程度的患者PCT都有预后提示意义。2.输入血小板并不能改善住ICU时间和出血情况。但是可能对于重度血小板减低的感染性休克患者改善存活率、降低死亡率存在积极意义。
[硕士论文] 姜琴
外科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨抗CD14单克隆抗体(Anti-CD14 monoclonal antibody,Anti-CD14McAb)治疗大鼠脓毒症急性肺损伤的保护机制。
  方法:
  在体部分:18只雄性Wistar大鼠(200g-250g)随机均分为3组,脓毒症组(CLP组)、假手术组(Sham组)、抗CD14治疗组(Anti-CD14组)。CLP组和Anti-CD14组,采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症急性肺损伤模型,Sham组作为对照组,开腹后只翻动盲肠,不进行结扎穿孔。Anti-CD14组术后经股静脉注射Anti-CD14McAb0.2ml(1ug/ml),Sham组、CLP组术后经股静脉注射等量生理盐水0.2ml,6小时后经腹主动脉抽血,测定3组大鼠血浆中KC、sICAM-1表达水平,右肺下叶HE染色,观察肺组织病理结构的改变。离体部分:将培养的NR8383一部分接种于24孔培养板,分为3组,对照组(Ⅰ组)、脓毒症模型组(Ⅱ组)和Anti-CD14干预组(Ⅲ组)。Ⅰ组加入正常血浆,Ⅱ组加入脓毒症血浆,Ⅲ组加入脓毒症血浆和抗CD14单克隆抗体共同干预,37℃、5%CO2培养箱孵育1小时,刮取NR8383,采用Western blot测定NR8383内NF-κB(p65)蛋白的表达水平;另一部分接种在预先放入适当大小灭菌消毒的盖玻片的24孔板上,分组及干预措施同上,采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)检测NR8383内NF-κB(p65)蛋白入核情况。
  结果:
  在体实验提示:与Sham组[KC(pg/ml):72.645±19.860,sICAM-1(pg/ml):252.766±19.921]相比,CLP组血浆KC、sICAM-1水平[KC(pg/ml):490.316±43.403,sICAM-1(pg/ml):686.952±36.411]和Anti-CD14组血浆KC、sICAM-1水平[KC(pg/ml):348.150±20.924,sICAM-1(pg/ml):411.050±47.170]明显升高,而Anti-CD14组KC、sICAM-1水平明显低于CLP组,认为有统计学差异(P<0.05);肺组织病理结果提示CLP组肺间质明显增厚、肺间质及肺泡腔内有大量炎症细胞浸润,Anti-CD14组症状较CLP组明显减轻,但较Sham组有所增加;细胞实验Western blot检测显示:Ⅱ组(2.1903±0.1199)和Ⅲ组(1.3658±0.1018)NR8383的NF-κB(p65)入核量高于Ⅰ组(1.0122±0.0780),Ⅲ组的NF-κB(p65)入核量低于Ⅱ组,差别有统计学意义(P<0.05)。细胞实验CLSM检测结果提示:与Ⅰ组(0.131±0.009)相比,Ⅱ组(0.685±0.037)和Ⅲ组(0.210±0.008)NR8383NF-κB p65蛋白入核明显升高,而Ⅲ组NR8383NF-κB p65蛋白入核低于Ⅱ组(0.685±0.037),差别有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  Anti-CD14McAb在脓毒症急性肺损伤时可能调控肺泡巨噬细胞NF-κB(p65)蛋白入核,使其趋化因子KC表达减少,进而减少中性粒细胞浸润,起到肺保护作用;同时Anti-CD14McAb能抑制内皮细胞表达sICAM-1,减少中性粒细胞对内皮细胞的粘附作用,起到肺保护作用。
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