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[硕士论文] 冯燚
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是一种原生动物寄生虫,也是常见的一种人畜共患病。根据流行病学调查我们普遍认为只感染温血动物。但是,从远离猫粪污染的草食动物和鸟类的流行病学调查也显示出高感染率。实验室前期研究显示,媒介节肢动物蜱可作为弓形虫在自然界的保存宿主。为全面了解自然条件下,蜱体感染弓形虫的情况,本研究开展不同地点、不同宿主来源和不同种类的蜱体携带弓形虫的分子检测,并对阳性样本中的弓形虫基因进行分型,以期为弓形虫流行病学研究提供资料。
  (1)本研究对1275份蜱DNA样品进行定量PCR分子检测,共发现88份为阳性样本,阳性率为6.90%。其中检测的吸血蜱样本总数为848份,阳性样本数为55份,阳性率为6.49%;检测的未吸血蜱样本总数为427份,阳性样本数为33份,阳性率为7.73%。
  (2)在吸血蜱中,成蜱携带弓形虫的阳性率为7.69%,若蜱携带弓形虫的阳性率为1.90%;幼蜱携带弓形虫的阳性率为0;在未吸血蜱中,成蜱携带弓形虫的阳性率为7.96%,若蜱携带弓形虫的阳性率为0;幼蜱携带弓形虫的阳性率为14.29%。
  (3)不同蜱种的阳性率差异并不大。在吸血蜱中,长角血蜱携带弓形虫的阳性率为8.05%;血红扇头蜱携带弓形虫的阳性率为7.50%;镰形扇头蜱携带弓形虫的阳性率为12.12%;微小牛蜱携带弓形虫的阳性率为0;草原革蜱携带弓形虫的阳性率为10%;褐黄血蜱携带弓形虫的阳性率为3.07%;血蜱属携带弓形虫的阳性率为20%;扇头属携带弓形虫的阳性率为5.22%以及未鉴定蜱种携带弓形虫的阳性率为0。在未吸血蜱中,长角血蜱携带弓形虫的阳性率为7.67%;血红扇头蜱携带弓形虫的阳性率为8.7%;镰形扇头蜱携带弓形虫的阳性率为8.33%;扇头属携带弓形虫的阳性率为6.25%以及未鉴定蜱种携带弓形虫的阳性率为0。
  (4)对所有通过定量PCR检测显示出携带弓形虫的阳性样本再用巢式PCR方法进行检测,均成功扩增出目的条带,将目的条带进行胶回收并送测序,测序所得结果与数据库标准序列进行比对,与弓形虫529-bp重复序列片段相似程度高达99%以上。说明所有阳性样本均携带弓形虫。
  (5)采用巢式PCR方法对所有使用定量PCR方法检测出携带弓形虫的阳性样本进行基因分型,结果显示所有阳性样本均为弓形虫ME49虫株,即弓形虫Ⅱ型弱毒株。
  (6)构建吸血蜱阳性样本与未吸血蜱阳性样本数据进化树,并对数据进行卡方检验分析其显著差异性。发现吸血蜱与未吸血蜱之间的差异不显著。
  综上所述,本研究发现自然界蜱感染弓形虫较为普遍,蜱总体感染阳性率为6.90%;在检测的6种硬蜱中,5种蜱均感染,不同蜱种的阳性率无显著差异;在蜱的三个不同发育阶段,相较而言成蜱感染率较高,吸血蜱与未吸血蜱之间的差异不显著。基因分型结果显示,所有阳性样本均为弓形虫Ⅱ型。根据实验结果我们可以发现蜱携带弓形虫在流行病学中具有重要意义,人类弓形虫感染需要高度重视。
[硕士论文] 仰彬
病原生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病,仍是我国主要的公共卫生问题之一。血吸虫感染免疫的一个基本特征是在成虫产卵后,宿主逐渐表现出免疫下调的状态,使感染呈现慢性化。以往的研究认为这种免疫负调节性与调节性T细胞(Tregs)、DC和Mψ等相关。调节性B细胞(Bregs)是一类具有调节功能的B细胞,在自身免疫病、慢性炎症、肿瘤、寄生虫感染等疾病中发挥着免疫负向调控作用。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-25个核苷酸的小RNA,不编码蛋白但其在细胞内具有多种重要的调节作用。近来研究发现,microRNA在B细胞的活化、分化和发挥功能过程中起着关键作用,但目前仍不清楚miRNA是否在B细胞发挥调节性功能中发挥重要作用。本课题组前期研究已经证实日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)在体内外均能诱导产生Bregs并分泌高水平的IL-10,并且在日本血吸虫感染过程中,可以诱导产生CD19+Tim-1+分泌IL-10的B细胞。那么,是否miRNA参与日本血吸虫感染诱导Bregs发育分化仍不清楚。日本血吸虫病主要病理改变为肝脏肉芽肿,在慢性期导致肝脏纤维化。研究表明在肝脏肉芽肿形成过程中,B细胞发挥了重要作用。但是,目前仍不清楚调节性B细胞是否参与了肝脏的病理改变。因此,我们对日本血吸虫感染小鼠后调节性B细胞的产生及其作用进行了初步研究。
  研究内容分为以下3个部分:
  1、miRNA-21在日本血吸虫诱导调节性B细胞分化过程中的作用
  目的:探索miRNA-21在日本血吸虫感染小鼠后调节性B细胞分化及体外SEA刺激后调节性B细胞的产生中的作用。
  方法:构建日本血吸虫感染C57BL/6小鼠模型,分别取感染13W和正常小鼠脾脏CD19+B细胞,qPCR检测miRNA-21和IL-10mRNA表达水平。体外用SEA、LPS分别刺激正常小鼠CD19+B细胞72h,荧光定量PCR检测CD19+B细胞miRNA-21和IL-10的mRNA水平。体外miRNA-21-Inhibitor转染正常小鼠CD19+B细胞后用SEA、LPS刺激72h,流式检测IL-10+B细胞的比例,ELISA检测上清中IL-10的水平。
  结果:日本血吸虫感染后,小鼠脾脏B细胞miRNA-21和IL-10的mRNA的表达水平较正常小鼠明显升高;体外SEA、LPS刺激CD19+B细胞后miRNA-21和IL-10的mRNA水平也明显升高;体外miRNA-21-Inhibitor转染正常小鼠CD19+B细胞后用SEA、LPS刺激72h,IL-10+B细胞比例及IL-10分泌量显著降低。
  结论:日本血吸虫感染后,miRNA-21参与了调节性B细胞的产生和IL-10分泌。
  2、日本血吸虫感染诱导肝脏肉芽肿形成过程中调节性B细胞的动态变化
  目的:通过体内实验观察日本血吸虫感染不同阶段CD19+Tim-1+IL-10+B细胞的动态变化。
  方法:构建日本血吸虫感染C57BL/6小鼠模型,分别在感染第0W,3W,6W,13W分离小鼠脾脏单个核细胞和肝脏淋巴细胞,流式检测CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例,同时取感染不同阶段的小鼠肝脏免疫组化分析CD19+Tim-1+细胞的变化。
  结果:小鼠日本血吸虫感染后第6W、13W脾脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例显著增加;感染后第3W、6W,小鼠肝脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例均显著增加;感染第13W,小鼠肝脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞显著减少。肝脏免疫组化分析发现,感染第6W小鼠肝脏有严重的虫卵肉芽肿,并伴随有大量CD19+Tim-1+细胞聚集在肉芽肿周围;感染第13W小鼠肉芽肿体积有所减小,肉芽肿周围CD19+Tim-1+细胞也明显减少。
  结论:日本血吸虫感染早期和急性期,CD19+Tim-1+IL-10+B细胞参与了日本血吸虫感染诱导的肝脏肉芽肿的发生与发展。
  3、SEA诱导产生的调节性B细胞对巨噬细胞的作用的初步研究
  目的:体外实验初步探讨调节性B细胞对巨噬细胞的作用。
  方法:磁珠分选正常小鼠CD19+B细胞,体外分别用LPS、SEA刺激培养后与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养,检测培养上清中NO和IL-10水平。荧光定量检测共培养后RAW264.7细胞iNOS和Arg-1的mRNA水平。
  结果:与阴性对照组相比,经SEA刺激后的B细胞与RAW264.7细胞共培养后,NO表达无明显变化,IL-10表达显著增加,iNOS的mRNA表达水平无明显变化,Arg-1的mRNA水平显著升高。
  结论:体外SEA刺激的B细胞能够诱导巨噬细胞分化成M2型的巨噬细胞。
[硕士论文] 于利利
兽医学;预防兽医学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)属于全球范围内的寄生虫。在亚洲、非洲、拉丁美洲每年大约2亿人感染贾第虫,并且表现出一定的临床症状。因为具有人畜共患性,现已列入全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。贾第虫主要是通过排出具有感染性的包囊,使得其他宿主经消化道引起感染,能引起腹泻、头晕、体重减轻。宿主范围广泛,感染人、猴子等灵长类,牛、羊、猪等家畜,鸽子、鹦鹉等鸟类,犬、猫等伴侣动物、狐狸、老虎等野生动物在内的多种脊椎动物,此外,贾第虫还可感染鱼、两栖动物、爬行动物、啮齿动物。经国内外报道,随着旅游业的发展,贾第虫也成为了旅行者腹泻的常见致病原。因此,作为重要的人畜共患病原体,贾第虫在受到越来越高的关注。细胞骨架是真核生物特有的特征之一,贾第虫作为最原始的真核生物,多种多样的细胞骨架蛋白是令人震惊的,贾第素就属于贾第虫中含量丰富的骨架蛋白,与贾第虫的吸附、入侵及感染有着密不可分的关系。同时,它也成为了人们研究真核生物的模型。
  贾第虫分为携病毒株和无病毒株滋养体,贾第虫病毒是专性存在于贾第虫体内的一种双链RNA病毒,贾第虫病毒能感染无病毒株,虽然国内外对于贾第虫的流行病学调查研究很多,但是对贾第虫病毒的研究却不多,其感染过程及对无病毒株的影响都研究甚少,具体机理都不清楚。贾第虫病毒具有感染性,感染5×105不会影响虫体的正常状态。因此,近年来,贾第虫病毒作为载体的用途越来越广泛。贾第虫病毒及他的外转录体都具有感染性。衣壳蛋白是主要的表达蛋白。贾第虫病毒感染无病毒株滋养体,引起虫体蛋白质的变化以及其他物质的变化都还不清楚。α贾第素作为贾第虫重要的骨架成分,在与贾第虫病毒之间应该会有某种关系。本研究根据GenBank中α-15-giardin序列设计引物,培养贾第虫至满瓶,进行收集虫体及提取了总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板扩增α-15-giardin基因,成功构建了大肠杆菌重组表达质粒pGEX-4T-α-15,将其转化到感受态细胞BL21。经IPTG诱导进行pGEX-4T-α-15融合蛋白的原核表达。通过SDS-PAGE实验分析其表达形式,利用切胶法获得较纯的融合蛋白。将纯化的蛋白进行免疫小鼠,制备了多克隆抗体,对α-15-贾第素蛋白在贾第虫中进行定位,然后在携病毒株与无病毒株滋养体进行α-15-贾第素蛋白的荧光相对定量PCR检测,以及将携病毒株和无病毒株滋养体进行总蛋白的提取,用制备的多抗作为一抗进行Western Blot试验。通过免疫小鼠,获得了效价高达1∶51200、特异性高的免疫血清。荧光定位试验结果发现其位于贾第虫的细胞质,靠近细胞质膜的部位多一些,腹吸盘的位置几乎没有分布。荧光相对定量PCR试验结果为α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中mRNA表达量是无病毒株的滋养体表达量的8-10倍。Western Blot试验结果与mRNA表达结果一致,α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中蛋白表达量高于无病毒株的滋养体表达量。此研究对于α-15-贾第素蛋白在贾第虫体内的作用及贾第虫病毒与贾第素之间的关系、对贾第虫新药靶点的开发和贾第虫的诊断预防具有重要意义。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[硕士论文] 孙煦苧
病原生物学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原代分离和鉴定人芽囊原虫(Blastocystis hominis,B.hominis);建立B.hominis感染大鼠模型并观察感染大鼠肠组织的病理变化、Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2和TLR4及相关细胞因子的表达,初步探索B.hominis的致病特性。
  方法:
  1.B.hominis原代分离与鉴定:从广西医科大学附属肿瘤医院门诊检验科处收取粪便样本187份,用LES培养法对样本进行培养后分离得到B.hominis虫株2株,对获得的B.hominis虫株采用细胞HE染色进行形态鉴定,提取B.hominis虫株DNA,采用PCR方法进行基因分型鉴定。
  2.B.hominis纯培养及大鼠感染模型的建立:用LES培养基进行带菌培养B.hominis,联合使用两性霉素B(2.5μg/ml)、青霉素(1000U/ml)、链霉素(1000μg/ml)、阿莫西林-克拉维酸钾混悬液(31.25μg/ml)、氯霉素(20μg/ml)磷霉素(20μg/ml)等6种抗生素进行纯培养建立。32只SD大鼠随机分4组,每组8只,设置感染前组和感染后7d、14d、21d3个实验组。全部大鼠经免疫抑制剂地塞米松免疫抑制处理后,实验组大鼠连续3天经口灌胃纯净B.hominis虫体1×108个,感染前组大鼠经口灌食等体积无菌PBS。感染期间取大鼠粪便进行B.hominis培养,所得虫体HE染色后观察其形态,并提取DNA进行基因分型。感染结束后第0天处死感染前组大鼠,结束后第7d、14d和21d分别处死三组实验组大鼠,并对所有大鼠的十二指肠、十二指肠派氏结、空肠、空肠派氏结、回肠、回肠派氏结、盲肠和结肠等组织进行取材,HE染色后观察各肠组织的病理损伤。
  3.TLR2/TLR4及相关细胞因子表达的检测与分析:采用荧光定量PCR检测上述肠组织中TLR2、TLR4的mRNA表达,并进一步检测相关细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA表达。
  结果:
  1.B.hominis原代分离与鉴定:检出B.hominis虫株2株,形态均为空泡型,两株虫株DNA经PCR基因分型鉴定均为3型。
  2.B.hominis感染大鼠动物模型的建立:分离获得的B.hominis虫株感染大鼠后,7d、14d、21d实验组大鼠的粪便均为稀软便,体外培养48h后均能检出B.hominis虫体,形态与感染前B.hominis形态保持一致;虫株DNA提取后PCR基因分型结果为3型,与从医院所取粪便样本中分离出的B.hominis基因分型结果一致。感染前组大鼠粪便正常,粪便中未检出B.hominis。
  3.肠组织病理检查:B.hominis虫株感染后14d组和21d组大鼠的盲肠经HE染色后可观察到散在的B.hominis虫体,肠组织结构完整,未观察到炎性细胞浸润、黏膜糜烂等病理性损伤。其余各段肠组织均无异常,未观察到虫体寄生。
  4.肠TLR2/TLR4及相关细胞因子荧光定量PCR检测:
  1)大鼠十二指肠:
  ①肠组织:各组间TLR2/TLR4及相关细胞因子的mRNA表达水平无统计学差异。
  ②派氏结:各组间TLR2/TLR4及相关细胞因子的mRNA表达水平无统计学差异。
  2)大鼠空肠:
  ①肠组织:各组间TLR2/TLR4及相关细胞因子的mRNA表达水平无统计学差异。
  ②派氏结:感染后7d组、14d组TLR2的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),感染后7d组TLR4的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后14d组、21d组IL-4的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后7d组IL-6的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后14d组IL-10的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),各组间TNF-α、IFN-γ的mRNA表达水平无统计学差异。
  3)大鼠回肠:
  ①肠组织:感染后7d组、21d组IFN-γ的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后7d组、21d组IL-4的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),各组间TLR2、TLR4、TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表达水平无统计学差异。
  ②派氏结:感染后21d组TLR2的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后14d组TNF-α的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),各组间TLR4、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10的mRNA表达水平无统计学差异。
  4)大鼠盲肠:感染后7d、14d、21d组TLR2的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后14d组、21d组TNF-α的mRNA表达水平显著上升(P<0.05),感染后21d组IL-6的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),各组间TLR4、IFN-γ、IL-4、IL-10的mRNA表达水平无统计学差异。
  5)大鼠结肠:感染后14d组、21d组IL-4的mRNA表达水平显著上升(P<0.05);各组间TLR2、TLR4、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的mRNA表达水平无统计学差异。
  结论:
  1.从人粪便中分离培养的3型B.hominis虫株经口感染可成功建立大鼠感染模型。
  2.B.hominis感染SD大鼠后各段肠组织病理检查未发现明显病变,但在盲肠组织发现散在的B.hominis虫体,提示盲肠可能是B.hominis适宜寄居的部位。
  3.B.hominis感染可引起空肠派氏结、回肠派氏结和盲肠中TLR2、TLR4及TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10等细胞因子的mRNA表达变化,该部分肠组织的固有免疫可对B.hominis感染有免疫应答产生炎症反应,提示此部分肠组织可能是B.hominis的寄居部位;十二指肠、十二指肠派氏结中各组间TLR2、TLR4及上述细胞因子的mRNA表达水平无统计学差异,这部分肠组织对B.hominis感染不产生炎症反应,提示其可能不是B.hominis的寄居部位。
[硕士论文] 嵇燕
应用数学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:疟疾是世界上最严重的蚊媒传染病之一,据世界卫生组织(WHO)统计,全球大约有34亿人都处于被疟疾感染的潜在风险中.对于疟疾等蚊媒传染病,医学上可以对染病原因和病毒特征进行研究,通过提高治疗水平、研究新疫苗等措施使被感染人群得以治疗,但这些研究和治疗往往滞后于疾病的蔓延和爆发.为了预测、控制、甚至消除这类传染病,我们需要了解疟疾的传播规律,需要知道疟疾是如何在人群中持续生存和如何将疾病发生率控制在一定水平.
  本文在传统的SIS v.s.SI疟疾模型的基础上研究了人群的自我防护因素对疟疾传播的影响.在模型的构建中,我们用蚊帐使用率这一指标来表示防护能力的大小,结合基本再生数,分析了疟疾病毒的传播动力学特征.本文包含五个章节.
  第一章主要介绍疟疾模型发展的历史背景、研究现状以及本文所要研究问题的来源,最后介绍了本文研究的主要内容.
  第二章研究了均质空间中具蚊帐使用率的疟疾模型,用下一代矩阵法得到模型的基本再生数,结合特征方程得到无病平衡点和地方病平衡点的局部稳定性,并分别通过构造Lyapunov函数和上下解的方法得到无病平衡点的全局稳定性和在一定条件下的地方病平衡点的全局稳定性.
  第三章研究了异质空间中具蚊帐使用率的扩散疟疾模型,利用相应的线性方程的特征问题给出基本再生数的定义,讨论了无病平衡点和地方病平衡点的局部稳定性和全局稳定性.
  第四章使用Matlab软件对均质空间中具蚊帐使用率的疟疾模型和异质空间中具蚊帐使用率的扩散疟疾模型进行了数值模拟,利用所绘制的图形验证所得的理论结果.
  第五章对前面所做的工作和本文的主要内容进行总结,对研究结果给出生物学解释,并对今后将要考虑的问题进行一定的探讨.
[硕士论文] 张丽敏
专门史 苏州科技学院;苏州科技大学 2018(学位年度)
摘要:血吸虫病是20世纪中国流行范围较广,对社会造成危害较大的地方性传染病之一,其传染的中介载体是水中的钉螺。河网密布的水乡苏州因之而成为血吸虫病的重灾区,并且对当地的人口数量和质量及经济的发展造成了严重威胁与破坏。
  本文通过梳理苏州地区1950-1990年间血吸虫病防治在不同历史时期的策略及成效的发展变化,进而分析苏州地区血吸虫病流行严重,血防成效可观的原因何在。以小见大的揭示出中国人民在探索中国特色的社会主义道路建设过程之中,是如何借助社会主义制度在有关国计民生的问题上发挥作用的。以前所未有的集中权力,达到决策迅速、动员迅速、发动广泛,以全党、全民动员、全社会投入的运动方式开展血防工作,而五十年代苏州血防迅速的取得成效,正反映了这一制度的特性所在。但不可讳言的是,这种以高度集中的行政权力,以运动与大会战的形式开展血防工作,固然有迅速决策、迅速动员、迅速集中,迅速见效的优越性,但也有着如果顶层设计失误,那么迅速决策的错误也会迅速扩大,造成严重损失的缺陷性,苏州血防工作在大跃进与文革中所走过的弯路,恰恰说明了这一点。由于其缺乏科学的论证,则往往无法持久,特别是政府的财力与人力都是有着一定的局限性的,在一个时期内,集中政府所有的资源重点治理某一个领域的突出问题,可以收到立竿见影的成效。但是政府不可能长时期的将所有的资源集中到某一个领域之中,政府在转移工作重点时如果缺乏细致的谋划与部署,就有可能造成这个领域已经取得的工作成效出现反复,甚至倒退。改革开放后,苏州的血防工作扬弃了运动大会战的形式,而采取了现代化、专业化、市场化的若干方法,取得了显著的成效,这也有力的说明了社会主义制度是有着自我改革、完善、发展的生命力的。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[硕士论文] 刘立元
预防兽医学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类和动物呼吸道或消化道上皮细胞刷状缘纳虫空泡中,以腹泻、脱水为主要临床症状的寄生性原虫病。隐孢子虫可感染多种动物,其中幼龄动物最易感,是新生动物腹泻的病因之一。隐孢子虫病已严重危害人类和动物健康,给畜牧业带来严重的经济损失,目前无有效的治疗药物,疫苗免疫是防控该病的新策略,因此,筛选免疫原性高的靶抗原具有相当重要的意义。目前保定地区对微小隐孢子虫相关研究较少,对重组蛋白CP23免疫特性进行研究,为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供了候选抗原,为隐孢子虫病的防控奠定了基础。
  本试验从河北保定地区分离得到奶牛源隐孢子虫卵囊,通过PCR扩增获得18SrRNA全基因1188bp的片段,构建pEASY-18SrRNA质粒并测序,对测序序列应用DNAStar软件进行分析,结果表明分离到的虫种为微小隐孢子虫。将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a-Cp23。并用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE结果显示,表达蛋白分子量为25kDa,且为包涵体蛋白。Western blotting结果表明,表达产物可被微小隐孢子虫阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。
  本试验将纯化的重组蛋白CP23免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫和体液免疫应答的检测。以建立的间接ELISA方法检测特异性IgG抗体,结果显示,试验组IgG水平随着免疫次数的增加也呈现明显上升趋势,并且特异性抗体效价可达到1∶12800;试验组的CD4+/CD8+T淋巴细胞数值与对照组相比均增加明显,其中CD4+T淋巴细胞数值更高;IL-12、IL-4、IL-10及IFN-γ浓度亦都增高,与对照组相比均有统计学意义(P<0.01)。由以上体液免疫和细胞免疫分析结果显示,河北保定地区微小隐孢子虫重组蛋白CP23免疫小鼠后诱导机体产生了Th1/Th2型混合免疫反应,能有效诱导机体产生特异性免疫应答,增强机体免疫功能,具有良好的免疫特性。
  将重组质粒pEASY-18SrRNA进行10倍梯度稀释,选用其中6个连续梯度的质粒,建立微小隐孢子虫荧光定量PCR标准曲线。对荧光定量PCR方法的条件进行优化,对荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性进行分析,对保定地区30份样品使用普通PCR与荧光定量PCR进行检测。结果显示,质粒模板拷贝数在3.5×106~3.5×101,均能扩增出曲线;敏感性可达到标准DNA质粒的35个拷贝数,特异性分析显示仅有微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫DNA出现扩增曲线,重复性分析显示变异系数均小于3%;临床样品检测结果为阳性率30%(9/30),并可检测到78个拷贝数。建立的荧光定光PCR方法,可满足临床检测隐孢子虫的需要,为流行病学调查提供快速灵敏的检测方法。
[硕士论文] 王学艳
数学 中北大学 2018(学位年度)
摘要:查加斯病对人类的身体有很大的危害,严重着可危及人类的生命,有效的防治和控制查加斯病已成为一个不可忽视的问题。因此,运用数学模型来研究查加斯病模型显得极为重要。通过分析模型中影响查加斯病传播的不同因数,进而为有效的控制查加斯病的传播提供了可靠的依据。主要研究内容为:
  本论文在前人研究查加斯病的基础上,基于该病在人类和媒介(锥蝽)之间传播主要通过锥蝽接触叮咬人类的皮肤并吮吸人体的血液,进而使得含有该病的病原体(克氏锥虫)的血液在人类和虫媒(锥蝽)的体内互相传播,最终使得该病在人类和动物之间传播开来,并结合实际可知,患有查加斯病的孕妇会以母婴传播(垂直传染)的方式将该病传染给婴儿。我们建立了一类宿主具有垂直传染的查加斯病动力学模型。分别在垂直传染率p=0和0<p≤1两种情况下对模型进行分析讨论。经计算得到:(1)当p=0时,系统始终存在一个无病平衡点且当R0<1时其局部渐近稳定,同时当R0>1时系统存在一个正平衡点且局部渐近稳定;(2)当0<p≤1时,系统始终存在一个正平衡点且局部渐近稳定。最后通过构造Lyapunov函数证明了平衡点的全局稳定性。经研究发现:在现实生活中查加斯病可以通过控制相关因数来有效减少该病的传播,例如对医院内血库的血液定期进行克氏锥虫血清检查以及孕妇在怀孕期间多次去医院进行血清检查等措施可减少该病的传播。
  其次,考虑了查加斯病的潜伏期以及疾病的垂直传染的动力学模型,基于疾病的传播机理以及多种传播途径。本章运用了不同的发生率,这样与实际更接近。通过对模型进行分析,分别讨论了垂直传染率p=0和0<p≤1时平衡点的存在性和稳定性。当垂直传染率p=0时,通过计算得到了基本再生数R0,此时系统始终存在无病平衡点且当R0<1时无病平衡点局部渐进稳定的。系统可能存在两个,一个或者零个正平衡点;当垂直传染率0<p≤1时,此时系统不存在无病平衡点,在不同条件下可能存在正平衡点。
[硕士论文] 潘垚
免疫学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过腹腔注射弓形虫(RH)速殖子及巨噬细胞、淋巴细胞体外共培养感染弓形虫速殖子构建急性弓形虫感染模型,分析IL-33-/-小鼠急性弓形虫感染时巨噬细胞对T细胞的趋化作用,探讨IL-33在小鼠弓形虫感染时的免疫功能。
  方法:
  1.基因型鉴定:应用PCR技术鉴定C57BL/6IL-33-/-小鼠基因型;
  2.生存率比较:C57BL/6野生型和IL-33-/-小鼠腹腔注射弓形虫RH株104个速殖子,1mL/只,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,绘制小鼠生存曲线;
  3.组织病理学变化:C57BL/6野生型和IL-33-/-小鼠腹腔注射弓形虫RH株速殖子104个,1mL/只,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,分别于感染后48h和96h分离肝、脾及脑组织进行HE染色比较各种组织病理变化;
  4.体内实验分析IL-33-/-对急性弓形虫感染小鼠脾脏Th1亚群分化和趋化因子受体表达的影响:腹腔注射弓形虫速殖子感染C57BL/6野生型和IL-33-/-小鼠,分别于感染后48h及96h,用流式细胞术检测感染组与未感染组脾脏Th细胞胞内IFN-γ及表面CD195(CCR5)表达情况;
  5.体外实验探讨IL-33-/-对弓形虫感染时巨噬细胞对T细胞趋化作用的影响:
  5.1.T细胞表面趋化因子受体表达分析:分离腹腔巨噬细胞与脾脏T细胞共培养,感染弓形虫,于感染后24h,流式细胞术检测感染组与未感染组脾脏T细胞表面CD69及CD195、CD183(CXCR3)、CD186(CXCR6)表达情况;
  5.2.共培养上清液中趋化因子浓度分析:脾脏T细胞与腹腔巨噬细胞体外共培养同时感染弓形虫24h,ELISA检测C57BL/6野生型和IL-33-/-小鼠感染前后共培养上清中CCL5、CXCL16、CXCL9浓度;
  5.3.T细胞趋化实验:提取C57BL/6野生型和IL-33-/-小鼠腹腔巨噬细胞与脾脏T细胞共培养于Transwell小室,于感染后12h、16h、20h及24h,分别计数感染102剂量组、104剂量组及未感染组进入下室的T细胞数目;
  6.统计分析方法:使用SPSS23.0进行统计分析,采用Kaplan-Meier法(K-M法)比较野生型和IL-33-/-型小鼠感染与未感染弓形虫时生存率的差异,描绘小鼠生存曲线,对于服从正态分布的资料,采用One-way ANOVA(单因素分析),分析比较流式细胞术的检测结果,P<0.05差异具有统计学意义。
  结果:
  1.鉴定出实验所用小鼠为C57BL/6野生型和IL-33基因敲除型;
  2.腹腔感染弓形虫,IL-33-/-小鼠生存时间长于野生型小鼠(P<0.05);
  3.感染小鼠肝组织呈慢性肝炎表现,野生型小鼠病理改变比IL-33-/-小鼠更严重;感染小鼠脾脏,脾窦破裂,脾索走行紊乱,野生型病理改变比IL-33-/-小鼠更严重;感染脑组织,表现为神经元急性坏死,IL-33-/-小鼠出现神经血管袖套样改变,较野生型病理改变更严重;
  4.弓形虫经腹腔感染野生型及IL-33-/-小鼠,IL-33-/-小鼠未感染组脾脏Th1细胞的比例高于野生型未感染组(84.33±3.11%比52.66±7.60%,P<0.01);IL-33-/-小鼠未感染组Th1表面CD195分子表达量高于感染组(194.50±9.52%比99.00±3.87%,P<0.01);IL-33-/-小鼠感染组与野生型感染组Th1细胞比例及CD195分子表达均无显著性差异;
  5.弓形虫感染巨噬细胞和T细胞体外共培养24小时,IL-33-/-小鼠未感染组T细胞表面CD69、Th1细胞表面CD195、CD183分子均高于野生型未感染组(分别为:409.85±11.38%比312.43±26.33%,P<0.05;180.14±26.53%比121.00±16.68%,P<0.05;166.14±14.42%比114.00±12.60%,P<0.05);野生型未感染组Th1细胞表面CD186分子表达量高于野生型感染组(207.00±19.35%比101.28±19.01%,P<0.05);
  6.巨噬细胞和T细胞体外共培养上清中,CCL5在IL-33-/-小鼠感染弓形虫后显著升高(1377.21±126.29%比1062.09±192.59%,P<0.05);CXCL9在野生型感染后较IL-33-/-小鼠感染后升高显著(280.66±84.62%比183.86±63.56%,P<0.05);CXCL16野生型感染组升高较IL-33-/-小鼠感染组更显著(8210.41±962.21%比3493.38±359.42%,P<0.01);
  7.体外巨噬细胞对T细胞趋化实验,未感染组及感染102剂量组各时间点比较差异不具有统计学意义,感染104剂量组,IL-33-/-小鼠感染24小时趋化T细胞的数目明显高于12小时(7.17±5.39%比2.43±1.53%,P<0.05)。
  结论:
  1.急性弓形虫感染,IL-33-/-小鼠较野生型小鼠生存率提高,提示IL-33基因敲除对小鼠弓形虫感染具有保护作用。
  2.体内及体外弓形虫感染实验,IL-33-/-小鼠弓形虫感染组与野生型感染组比较,巨噬细胞对Th1细胞亚群分化、活化及趋化效应均无明显差异,提示IL-33-/-发挥的保护作用可能不是通过促进Th1亚群细胞免疫功能发挥抗感染作用,具体机制需进一步讨论。
[硕士论文] 冯志红
数学 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本文运用时域和频域上的分支理论与数值模拟,分析了一类具有研究意义的血吸虫模型的复杂动态,包括transcritical分支,Hopf分支,以及由Hopf分支生成的周期轨的存在性和稳定性。明确了随着分支参数的变化,血吸虫模型中重要动态变量的变化规律,为血吸虫的预防与控制提供了一定的理论依据。本文由如下四章组成。
  第一章是绪论部分,简要阐述了非线性动力系统分支理论研究和血吸虫数学模型发展的背景知识,同时简要介绍了本文所用到非线性动力系统局部分支理论,研究目的与内容。
  第二章研究了以被感染的钉螺由潜伏期进入易传染期的几率δ为分支参数时,血吸虫模型中平衡点的存在性及稳定性,运用频域上的Hopf分支理论分析了Hopf分支的存在性,运用四阶调和平衡方法给出了由Hopf分支生成的周期轨的近似表达式、频率及振幅,同时判断了周期轨的稳定性。运用Auto软件数值模拟给出了对应的分支图,Matlab数值模拟给出了周期轨的相图和时间序列图,这些数值模拟的图像进一步验证了理论分析的结果。最后结合生物相关性,对模型中的动态变化给出了相应的解释。
  第三章继续以第二章中的血吸虫模型为研究对象,将分支参数变为钉螺的繁殖率v,运用时域和频域上的分支理论,对上述血吸虫模型进一步研究,得出了更加丰富的动态。运用中心流形定理和时域上的分支理论,严格证明随着分支参数钉螺的繁殖率v的变化,系统会先后发生两次transcritical分支;通过频域上的分支理论分析系统会发生两次Hopf分支,从而导致了周期震荡的产生与消失,分别给出了由这两次Hopf分支生成的周期轨的近似表达式、频率与振幅。同样对此分析进行了相应的数值模拟,对系统中的变化给出了生物相关的解释。
  第四章总结了全文的研究工作,指出了文中的不足,同时也确立了未来的研究方向。
[硕士论文] 郝珍
病原生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,在人和家畜等中间宿主体内可引发普遍的人畜共患弓形虫病。据报道,全球有多达20-30%的人感染弓形虫,且感染后没有有效的药物可以根治。考虑到目前还没有可使用的弓形虫疫苗,同时化学药物治疗将会给人体带来许多的副作用,故研制一种安全有效的弓形虫疫苗对控制人类和动物的弓形虫感染具有十分重要的意义。基于弓形虫MAPK1抗原良好的免疫原性和免疫反应性,本次研究我们选用了弓形虫MAPK1基因构建DNA疫苗。
  目的:构建弓形虫MAPK1抗原的真核表达质粒,制备弓形虫MAPK1的DNA疫苗,评价该疫苗所产生的免疫保护效应,同时也进一步探索MAPK1蛋白作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。
  方法:提取弓形虫RH株的RNA,通过RT-PCR技术逆转录形成cDNA,以cDNA作为PCR模板扩增出TgMAPK1基因。TgMAPK1基因的胶回收片段与TA克隆载体pEASY-T1连接构建重组质粒,之后进行PCR、双酶切鉴定并胶回收TgMAPK1基因片段。将上述胶回收产物与真核表达载体pEGFP-C1连接构建重组质粒pEGFP-MAPK1并进行PCR、双酶切及测序鉴定。重组质粒转染真核细胞HEK293T,观察细胞的荧光表达情况并通过Western blot检测细胞内目的蛋白的表达情况。大提质粒并稀释至特定浓度制备DNA疫苗。将BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)随机分成3组(13只/组),即:PBS对照组、pEGFP-C1对照组和pEGFP-MAPK1实验组。每次免疫小鼠的时间间隔为2周,每只小鼠每次免疫的剂量为100μg,共免疫三次。ELISA检测分析免疫前后血清抗体和脾细胞培养上清液中细胞因子的变化。最后以每组1×103个速殖子的量攻击感染小鼠,每天观察小鼠的生存状态并记录其存活时间。
  结果:PCR成功扩增出TgMAPK1基因片段,约1599bp。重组真核表达质粒经PCR鉴定出约1599bp的目的基因片段,经双酶切鉴定出约1599bp的目的基因片段和约4700bp的载体片段,测序结果比对GenBank数据库中该基因序列同源性为100%。重组质粒和空质粒转染的HEK293T细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,而空白对照组的细胞没有荧光现象。提取经重组质粒转染过的细胞总蛋白,Western blot检测到约58kD的目的蛋白条带。动物免疫实验中ELISA检测到实验组抗体IgG、IgG2a以及细胞因子IFN-γ在免疫后的水平明显高于对照组(P<0.05),而抗体IgG1和细胞因子IL-4、IL-10在实验组和对照组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,实验组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染后存活天数显著延长(P<0.05)。
  结论:本研究所构建的弓形虫MAPK1核酸疫苗诱导产生了高水平的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答,同时该疫苗也对受感染小鼠产生了一定的免疫保护作用,故弓形虫MAPK1抗原是一个优良的疫苗候选抗原。
[博士论文] 何成
传染病预防控制 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:磷酸化作为一种重要的转录后调控方式,其在蛋白功能调节、细胞信号转导等方面起着至关重要的作用。研究显示蛋白磷酸化在弓形虫感染宿主细胞过程中广泛存在,并发挥着重要的调节作用。而弓形虫作为一种专性细胞内寄生虫,其感染宿主细胞是一个复杂的、渐进的过程,但目前关于弓形虫感染不同时期的宿主细胞的磷酸化蛋白质组学分析却非常有限。
  宿主细胞蛋白vimentin是一种Ⅲ型中间丝骨架蛋白,其在细菌、病毒等病原体的入侵、增殖方面起着重要作用,但其在弓形虫感染宿主细胞过程中的作用目前仍未见报道。本研究进行了弓形虫感染不同时期宿主细胞磷酸化蛋白质组学分析,并探讨了宿主细胞蛋白vimentin在弓形虫感染宿主细胞过程中盼作用。
  方法:体外收集细胞培养RH株弓形虫速殖子,并感染HFF细胞(MOI=3)。收集未感染组(UI)、感染弓形虫30min组(EI)以及28h组(LI)细胞,并提取总蛋白,进而采用iTRAQ的方法对不同处理组进行磷酸化蛋白质组学分析,并对采用western blot(WB)方法对定量结果进行验证。
  弓形虫感染宿主细胞不同时间后,分别采用免疫荧光以及WB的方法对宿主细胞蛋白vimentin的分布、可溶性、磷酸化以及表达水平进行分析。进而用RH-GFP株弓形虫分别感染HBMEC和HBMECΔVim细胞,并统计分析不同感染组弓形虫入侵、增殖以及释放效率。采用FRET和Co-IP的方法验证vimentin与TgROP18的相互作用。进而采用CRISPR-Cas9的方法构建rop18缺陷虫株,并用其感染宿主细胞,应用同样的方法分析感染后细胞vimentin的可溶性、磷酸化以及表达水平的变化。同时,采用过表达以及体外磷酸化的方法评价TgROP18对vimentin可溶性、表达水平以及磷酸化的影响。
  结果:本次实验共鉴定出3962条肽段(1541个蛋白),1207条磷酸化肽段(665个磷酸化蛋白),1031个磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点880个,苏氨酸磷酸化位点138个,酪氨酸磷酸化位点13个)。将不同比较组磷酸化水平差异倍数大于或等于1.5倍且p value值小于0.05的磷酸化蛋白定义为显著差异蛋白。本次实验共鉴定出105个显著差异蛋白,其中EI/UI组有47个显著差异蛋白,U/UI组有67个显著差异蛋白,LI/EI组有40个显著差异蛋白。不同比较组显著变化磷酸化蛋白功能分析结果显示:在弓形虫感染宿主细胞早期可能通过磷酸化调节宿主细胞周期、凋亡、免疫、代谢从而促进其在宿主细胞内增殖,而在弓形虫感染宿主细胞早期,弓形虫可能利用宿主细胞内能量,细胞膜组分以及调节宿主细胞骨架,从而利于弓形虫入侵宿主细胞及其在宿主细胞内纳虫泡的形成。
  弓形虫感染宿主细胞会引起宿主细胞蛋白vimentin的重排及其可溶性、磷酸化、表达水平的改变。与正常组比较,Vimentin敲除以后,弓形虫的入侵宿主细胞效率显著提高(p<0.05),而弓形虫在宿主细胞内的增殖及释放效率没有显著变化(p>0.05)。宿主细胞蛋白vimentin与TgROP18存在相互作用,且其可溶性及磷酸化水平受TgROP18调节。
  结论:弓形虫感染的不同时期,磷酸化蛋白参与调节的宿主细胞进程呈现显著差异。弓形虫感染宿主细胞引起vimentin重排,及其可溶性、磷酸化、表达水平的变化,且其可溶性及磷酸化的变化受TgROP18调节。宿主细胞蛋白vimentin抑制弓形虫入侵宿主细胞,但对弓形虫的增殖和释放无显著影响。宿主细胞蛋白vimentin在小鼠脑组织中的表达水平相对较低。
[硕士论文] 王璐
兽医 河南农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种非常重要的具有人兽共患特性的寄生性肠道原虫,主要通过食源或者水源进行传播,可以导致水样腹泻,特别是免疫缺陷患者甚至可能导致死亡。地理信息系统(Geographic Information System,GIS)是一门结合地理学与地图学以及遥感和计算机科学的综合性学科,是一种利用计算机来处理和分析地理信息的工具。伴随着GIS技术的快速发展及在多领域的开发运用,该系统正逐步成为流行病学和公共卫生管理方面重要的技术手段。
  近些年来,针对隐孢子虫流行病学的调查数据呈指数性快速增长,然而如何有效利用这些数据进行分析成为当下的研究热点。
  本论文利用GIS技术结合隐孢子虫流行病学数据进行研究,从全球范围内分析单一宿主(奶牛)隐孢子虫感染情况,以及在中国范围内隐孢子虫感染多种宿主的统计分析,以期展现隐孢子虫感染在时间和空间上的分布规律。
  首先,从全球范围内分析单一宿主(奶牛)孢子虫感染情况。利用关键词“隐孢子虫”、“奶牛”在中国知网CNKI查询中文文献;通过“Cryptosporidium”与“cow”、“cattle”或“calves”作为关键词在PubMed和Web of Science搜索英文文献。查询结果是截止到2016年12月31日出版文献,共搜集到293篇有效文献,通过整理采样时间、采样地点、隐孢子虫感染率、隐孢子虫感染情况等信息利用GIS技术对数据进行可视化处理。结果显示,在全球范围内奶牛源隐孢子虫的平均感染率为17.55%(19278/109841);其中,美洲奶牛隐孢子虫感染率最高,感染率达到28.50% (3674/12892),其次是欧洲20.70%(5078/24535),亚洲的奶牛隐孢子虫感染率最低为13.86%(8009/57801)。奶牛源隐孢子虫种类分布方面,微小隐孢子虫(Cryptosporidium.parvum)在感染类型中占据绝对优势,且在各大洲均有分布且感染率也相对较高,其次是安氏隐孢子虫(C.andersoni)和牛隐孢子虫(C.bovis)在分布和感染率上占据优势。
  其次,在中国范围内对多种宿主的隐孢子虫的感染情况进行统计分析。同样利用关键词“隐孢子虫”在中国知网CNKI搜索中文文献,利用关键词“Cryptosporidium”、“China”在PubMed和Web of Science搜索英文文献。查询结果是截止到2017年12月31日出版文献,共搜集到592篇有效文献,通过整理采样时间、采样地点、隐孢子虫感染率、隐孢子虫感染情况等信息利用GIS技术对数据进行可视化处理。结果显示,我国隐孢子虫的采样地点涉及到除香港特别行政区之外的所有省级行政区。隐孢子虫的宿主统计显示隐孢子虫可以感染哺乳动物、禽类和爬行类等多种类型动物。通过对人、牛、猪和鸡隐孢子虫感染率的统计分析显示,人源隐孢子虫平均感染率为3.28% (6838/208194),人感染隐孢子虫较高的
  地区有新疆、广东、云南和浙江等地;牛源隐孢子虫的平均感染率为14.13% (8024/56795),牛感染隐孢子虫较高的地区主要有浙江、重庆、四川、青海等地;猪源隐孢子虫的平均感染率为17.94% (4971/27712),猪感染隐孢子虫较高的地区有黑龙江和北京;鸡源隐孢子虫的平均感染率为21.10%(2938/13921),鸡感染隐孢子虫较高的地区有四川和安徽等地。
  综上所述,通过本论文的研究发现隐孢子虫的分布基本上不受地理位置的限制,在全球范围内奶牛均有隐孢子虫的感染,在不同地区隐孢子虫的感染类型和感染程度有所不同;然而,在中国不同宿主的隐孢子虫感染种类与感染率各异,在不同地区的分布情况亦有不同。隐孢子虫作为一种重要的人兽共患肠道机会性致病原虫,新的宿主不断被检测,新的种类不断被建立,在全球范围内关于隐孢子虫感染的流行病学数据不断的被更新。目前,GIS空间分析与流行病学的交叉研究尚处于起步阶段,随着时间的推移,将会有越来越多的学者投入到隐孢子虫流行病学的空间分析中,建立更加全面和准确的隐孢子虫流行病学模型。
[硕士论文] 龚希
病原生物学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:土源性线虫病在我国尤其是农村地区广泛流行,是严重危害人民群众身体健康、影响社会经济发展的一类重要的寄生虫病。2005年原卫生部公布的全国人体重要寄生虫病现状调查结果显示,全国土源性线虫感染率为19.56%,推算感染土源性线虫的人数达1.29亿,表明我国土源性线虫的感染仍然处于较高的水平,且是全球感染人数最多的国家之一。通过健康教育干预措施,改善目标人群的生活、劳动方式,进而从根本上降低土源性线虫病感染率。本研究在四川省乐山市五通桥区实施,通过调查人群土源性线虫病感染率,开展常住人口健康教育问卷调查,了解卫生知识知晓及行为形成情况,并根据实际需求开展土源性线虫病相关的健康教育干预措施,研究干预措施对当地土源性线虫病健康教育的成效,为今后制定土源性线虫病相关健康教育防治策略提供科学的依据。
  方法:本研究的资料来源于四川省土源性线虫病健康教育示范基地项目。以中国疾病预防控制中心提供的土源性线虫病健康教育知识题库为基础,通过制作健康知识问卷作为调查工具,分别在2012年以及2015年进行现场问卷调查,并完成相应调查点的农村居民土源性线虫病感染率调查。通过收集农村居民土源性线虫感染率和问卷数据,分两次独立通过EpidataV3.1软件输入电脑,按要求核对无误并建立相应数据库。使用SPSS20.0软件对数据进行相应的统计描述和分析。运用卡方检验进行单因素指标率的分析比较,运用多元logistic回归进行多因素分析比较。检验水准均为双侧检验,其中a=0.05。
  结果:本研究共调查了2957人土源性线虫感染情况,获得1602份有效调查问卷。实施干预措施之前,两组人群土源性线虫感染情况基本一致,且土源性线虫相关卫生知识知晓率和正确行为形成率方面差异不明显;实施干预措施后,干预组土源性线虫感染率下降幅度大于对照组,干预组在卫生知识知晓率和正确行为形成率方面亦明显高于对照组;干预实施后,干预组在各单项知识和行为的正确率均有了显著的提高。分析土源性线虫病卫生健康知识和正确行为的危险因素,结果显示男性、年龄大、文化程度低在卫生健康知识的掌握以及正确行为的形成上是不利的因素。土源性线虫病卫生健康知识与正确行为形成成正相关,并且多项分析结果都表明,健康教育干预措施切实可行、实施有效。
  结论:通过实施健康教育干预,可以有效降低人群土源性线虫感染率,可以进一步提高土源性线虫相关的卫生知识知晓合格率和卫生行为形成合格率。鉴于常规的土源性线虫病健康教育模式较为单一,在人群中起到的健康促进作用不高,容易被人们忽视,因此,必须进一步加强土源性线虫病健康教育宣传力度,创新宣传方式、方法和途径,不断创新土源性线虫病的健康教育的方式,以人民群众喜闻乐见、易于接受的方式,充分发挥专业医疗预防保健机构作用,通过非人际传播途径开展土源性线虫健康教育。
[博士论文] 王艳歌
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本课题采用HSC细胞系模型,合成并转染虫源miRNA的mimics,大量筛选并初步鉴定能活化HSC细胞和上调纤维化相关标志基因表达的虫源miRNA。同时,我们分离感染血吸虫小鼠的原代HSC,通过高通量测序鉴定存在于HSC的虫源miRNA。基于体外激活HSC-T6筛选、宿主HSC内高通量测序鉴定虫源miRNA及其特异性方面,我们选取了既能参与宿主肝纤维化调控又能进入宿主HSC的虫源miRNA(即Sja-miR-2162)作为本课题的研究对象,研究其对宿主肝纤维化的调控作用及其分子机制,包括:在体外HSC中确定其活化HSC和促纤维化发生的作用;通过在正常小鼠中过表达虫源miRNA或在感染小鼠中对虫源miRNA进行干预,检测小鼠肝纤维化程度及HSC活化状态,从而确定虫源miRNA在血吸虫病肝纤维化中的功能;通过生物信息学预测虫源miRNA的宿主靶基因,并通过体内、体外实验验证两者的靶向关系及调控的信号通路,从而阐明虫源miRNA调控血吸虫病肝纤维化中的分子机制。本研究取得了以下结果:
  1.虫源miRNA的筛选与鉴定
  为从日本血吸虫miRNA中筛选和鉴定出能够活化HSC并促进纤维化相关基因表达的的虫源miRNA,本课题选取了本实验室及其他实验室鉴定的日本血吸虫miRNA共51条,合成其miRNA mimics,并采用HSC细胞系(HSC-T6)作为体外细胞模型进行筛选,虫源miRNA mimics转染HSC-T6,48小时后采用qPCR技术检测HSC活化标志基因(Col1α1、Col3α1和α-SMA)的表达水平。结果显示,Col1α1、Col3α1和α-SMA表达水平相比对照组,表达水平显著升高的有19条虫源miRNAs,表达水平显著下降的有4条虫源miRNAs。23条虫源miRNA中有15条为血吸虫特异性miRNA,8条为保守miRNA。这些结果表明了虫源miRNA可调控宿主HSC的激活。
  2.感染小鼠HSC分离及虫源miRNA的检测
  (1)原代HSC的分离和检测
  (2)二代测序分析感染小鼠HSC中的虫源miRNAs
  3.虫源Sja-miR-2162促进HSC的活化和肝纤维化的发生
  通过综合分析上述实验结果,本课题选取日本血吸虫Sja-miR-2162为研究对象,分析其在宿主肝纤维化中的作用及其分子机制。
  (1)Sja-pri-miR-2162过表达质粒的构建及其表达
  4.中和Sja-miR-2162抑制血吸虫病肝纤维化
  上述实验已经表明日本血吸虫产生的Sja-pri-miR-2162能分泌至体外,并进入宿主细胞,包括肝脏HSC。进入HSC的Sja-pri-miR-2162能够上调肝纤维化相关标志基因的表达,导致纤维化的发生。日本血吸虫感染的主要病理变化是肝纤维化的发生,以往的工作已经表明,血吸虫感染诱导宿主产生的一些因子,包括宿主miRNA和IL-13等,是导致宿主肝纤维化的主要因素。根据本课题上述结果,我们提出假设:在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性miRNA(Sja-miR-2162)起到促进肝纤维化的作用。对此,本课题设计了以下实验加以验证。
  (1)体外细胞模型验证:虫卵分泌的Sja-miR-2162进入HSC并调控肝纤维化相关基因表达
  (2)体外下调Sja-miR-2162可抑制HSC的活化
  (3)体内验证Sja-miR-2162能促进小鼠肝纤维化的作用
  为验证虫源Sja-miR-2162在体内能参与血吸虫病肝纤维化的过程,我们构建了能在肝脏中特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体(rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge)。将7周龄BALB/c雄性小鼠感染日本血吸虫后第24天注射1012v.g./只剂量的rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体,其中scramble组、PBS组以及正常小鼠组为对照组,在感染后第56天处死小鼠取肝脏检测其肝纤维化指标。结果显示,rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge组相比scramble组,羟脯氨酸含量显著下降(p<0.05),与肝纤维化相关的基因,如Col1α1、Col3α1、α-SMA、TIMP和Col4α1,其表达水平均显著下降(p<0.001),Masson三色染色显示肝组织中胶原蛋白沉积明显减少(p<0.05),HE染色显示虫卵肉芽肿面积显著减小(p<0.001)。分离各组小鼠的原代HSC并检测相关基因表达,在rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体感染组的HSC中,其Col1α1、Col3α1、α-SMA和TIMP表达水平均显著下降(p<0.001)。以上两部分结果验证了我们的假设,即血吸虫Sja-miR-2162可跨物种调控宿主肝纤维化。
  5.Sja-miR-2162的靶基因及其通路
  (1)靶基因的预测和验证:
  (2)上调Sja-miR-2162可抑制宿主TGFR3的表达
  (3)下调Sja-miR-2162促进靶基因TGFR3的表达
  在感染小鼠后第56天中分离的原代HSC中转染Sja-miR-2162抑制剂后,TGFR3的表达水平均显著升高(p<0.01);利用rAAV8载体在血吸虫感染小鼠肝脏中中和Sja-miR-2162后,肝组织和HSC中的TGFR3的表达水平则显著升高(p<0.01)。
  小结:本课题通过对日本血吸虫miRNA促纤维化功能的大量体外筛选以及对感染血吸虫小鼠HSC的深度测序,发现了血吸虫特异性虫源Sja-miR-2162在血吸虫感染过程中进入宿主HSC,并在体外细胞模型中显示出促纤维化作用。在此基础上,我们对Sja-miR-2162的促纤维化功能及其分子机制开展进一步的研究。通过体外原代HSC及HSC-T6细胞系研究显示,转染Sja-miR-2162mimics和过表达载体,均能促进HSC的活化。将表达Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染正常小鼠,后者的肝纤维化相关基因表达升高,同时,实验证实转入的Sj a-pre-miR-2162(前体)在宿主细胞能够加工为成熟的miRNA。在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性Sja-miR-2162是否能跨物种调控宿主的肝纤维化,这是本课题的重要科学问题。本课题从不同的角度阐明该科学问题:一是体外验证:采用Transwell小室将虫卵与原代HSC共培养,发现虫源性Sja-miR-2162进入HSC,并使HSC活化,但这种激活HSC作用可以被Sja-miR-2162抑制剂所阻断;二是体内外相结合的验证:分离和培养感染小鼠的原代HSC,并转染Sja-miR-2162抑制剂,发现转染抑制剂的原代HSC其肝纤维化相关基因表达下调;三是体内验证:将特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染感染小鼠,其肝纤维化相关基因表达下降。以上三方面的实验结果表明了虫源性Sja-miR-2162能跨物种调控宿主肝纤维化。本课题最后部分阐明了TGFR3是Sja-miR-2162靶基因,即:Sja-miR-2162是通过靶向TGFR3蛋白,继而上调TGF-β1/SMAD信号通路,提高肝纤维化相关基因的表达。本研究首次证实血吸虫的miRNA可进入宿主细胞并在宿主病理过程中发挥重要调控作用,从而丰富了我们对血吸虫病发病机制的认识,并为预防和治疗血吸虫病提供新的干预靶点和思路。
[硕士论文] 田守静
应用数学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:本论文主要基于实际问题和相关数据,对两类模型进行研究.首先进行探讨的是考虑多个避难所中的捕食-食饵快慢动力学分析,其次结合监测数据与Barbour模型对安徽、江西、湖北和江苏四省血吸虫病传播的研究.具体内容如下:
  1、基于实际生态现象,考虑被捕食者会有多个避难所的情形,建立了一个多个避难所的捕食-食饵模型.基于不同的时间尺度,运用奇异摄动理论分析慢系统的动力学行为.稳定性分析得出当阈值条件大于1时,会有Hopf分支现象出现.结果表明,避难所的添加可能会导致系统失去稳定性.另外,对被捕食者有一个避难所和多个避难所这两种情况进行了比较,发现被捕食者在公开区域和避难所之间的移动,以及避难所的大小也会影响捕食-食饵动力学性态.
  2、研究四省血吸虫病传播情况.通过安徽、江西、湖北以及江苏省2005-2010年的血吸虫病流行病学监测数据,根据Barbour模型有两种方法得到基本再生数和关键参数的值.通过这两种方法的比较,发现参数估计得到的结论更加符合实际.最后,对每个省的人群患病率和钉螺感染率进行了数值模拟.结果发现,只要保持和改善血吸虫病防治标准,四个省的血吸虫病将会灭绝.此外,四个省血吸虫病灭绝所需要的时间是不同的.
[硕士论文] 周俊宇
外科学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肝脏泡型包虫病(Hepatic alveolar echinococcosis,HAE)是一种由泡状棘球蚴(Echinococcus alveolaris,Ea)感染导致的人兽共患的寄生虫病,主要流行于我国西部牧区。泡状棘球蚴感染人体后能够诱导机体免疫调节系统,促进人体对其产生免疫耐受以利于虫体在人体内长期寄生。机体被诱导产生免疫耐受的机制是由辅助性T细胞(helper T cells,Th)和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)等多种效应细胞共同参与的复杂免疫调控系统,在宿主体内分别形成促进寄生虫死亡的炎症反应和促进宿主对寄生虫形成免疫耐受的免疫抑制的作用,两股力量互相牵制权衡,最终导致了肝脏泡型包虫病的慢性感染病程。这一机制中,Th17/Treg平衡在免疫反应的调节中具有重要的作用,Th17细胞主要以促进棘球蚴死亡的炎性反应为主,而Treg细胞能通过分泌相关具有抑制作用的细胞因子使机体免疫处于抑制状态。尤其白介素-35(Interleukin35,IL-35)是由Treg细胞分泌的一种新型细胞因子,它对Treg细胞的功能具有重要的调节作用,目前在关于泡型包虫病的研究领域还未见报道。
  本次研究通过对临床肝脏泡型包虫病患者和健康志愿者的外周血中的CD4+CD25+CD127low Treg细胞和IL-35的表达水平进行检测,初步探讨CD4+CD25+CD127low Treg细胞和相关细胞因子IL-35对于泡型包虫病发生发展过程的表达水平和意义。
  方法:在2017年01月-2017年09月期间于四川省人民医院收治的17例肝脏泡型包虫病患者和17例健康志愿者被纳入到本研究中。将其分为肝脏泡型包虫病患者组和健康志愿者对照组两组。采集受试者外周血检测CD4+CD25+CD127low Treg细胞和IL-35的水平,得到实验数据后用统计学方法对两组数据进行统计描述和分析,并以此来比较分析肝脏泡型包虫病患者和健康志愿者的外周血中CD4+CD25+CD127low Treg细胞和相关细胞因子IL-35的表达水平的差异。肝脏泡型包虫病患者接受手术后第7天再次采集外周血检测CD4+CD25+CD127low Treg细胞和IL-35的水平,比较与术前的变化。
  结果:在本次研究中发现肝脏泡型包虫病患者组的外周血中的CD4+CD25+CD127low Treg细胞占CD4+T细胞的比例为4.68/~10.30(7.97±1.47)%高于健康志愿者对照组外周血中CD4+CD25+CD127low Treg细胞占CD4+T细胞的比例5.09~9.25(6.65±0.99)%,且两组间差异有统计学意义(P<0.01)。在肝脏泡型包虫病患者组的外周血中测得IL-35的表达水平为66.24/~101.23(81.26±10.42)pg/ml高于健康志愿者对照组的外周血中IL-35的表达水平19.59~79.64(42.61±17.80)pg/ml,且两组间差异有统计学意义(P<0.001)。肝脏泡型包虫病患者外周血中的IL-35与CD4+CD25+CD127low Treg细胞的水平同步升高,并且使用线性相关分析的统计学方法进行分析后得出两者之间呈正相关关系(R=0.5667,P=0.0101)。肝脏泡型包虫病患者组在接受手术后第7天再次检测外周血中的CD4+CD25+CD127low Treg细胞占CD4+T细胞的比例为4.29~8.29(6.23±1.10)%,与术前和健康对照组相比,三者间的差异有统计学意义(F=9.65,P<0.001),术后与术前相比降低,且差异有统计学意义(t=3.05,P<0.001);术后与健康对照组间无统计学差异(t=1.19,P>0.05)。肝脏泡型包虫病患者组在接受手术后第7天再次检测外周血中的IL-35为29.24~71.24(51.90±11.78)pg/ml,与术前和健康对照组相比,三者间的差异有统计学意义(F=36.79,P<0.001),术后较术前有所降低,且差异有统计学意义(t=7.70,P<0.001);术后与健康对照组间无统计学差异(t=1.79,P>0.05)。
  结论:本研究首次发现肝脏泡型包虫病患者外周血中IL-35的表达水平较健康志愿者显著升高,且与CD4+CD25+CD127low Treg细胞的增加呈正性相关关系。手术切除包虫病灶后,患者外周血中CD4+CD25+CD127low Treg细胞和IL-35较术前均降低。这一现象提示CD4+CD25+CD127low Treg细胞和IL-35可能共同参与了肝脏泡型包虫病感染泡状棘球蚴后的免疫应答过程,并且CD4+CD25+CD127low Treg细胞的作用可能与IL-35有重要的关联,它们均可能与肝脏泡型包虫病的发生发展有关。
[硕士论文] 曹管
神经外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:总结近5年广西医科大学第一附属医院脑寄生虫病住院患者流行病学、临床特点、影像学特点、诊断治疗和随访的情况等经验。
  方法:回顾性分析2012年8月~2017年7月期间广西医科大学第一附属医院神经外科、感染性疾病科收治住院的95例具有完整资料的脑寄生虫病例。依据纳入标准及排除标准,分为脑囊虫病92例,脑裂头蚴病3例。记录95例脑寄生虫病的相关资料:年龄、性别、工作种类、流行病史、病程、临床表现、实验室检查、影像学资料、诊断、治疗和随访,分析其临床特点、流行病学特点、诊断、治疗及随访情况。应用x2检验分析脑囊虫病病灶数量、位置、分期、病程与手术干预的关联性。
  结果:年龄范围为12~75岁,平均年龄为45.2岁;男性78例(82.1%),女性17例(17.9%)。61例(66.3%)脑囊虫病患者曾食生猪肉、猪血。3例脑裂头蚴病患者中,2例曾用生蛙肉敷贴伤口,1例曾食生青蛙肉。病程3天~30年,其中1年以内的59例(62.1%),1~5年的26例(27.4%),6~10年的6例(6.3%),10年以上的4例(4.2%)。主要临床表现依次为癫痫发作(52.6%)、头痛(42.1%)、头晕(27.4%)、乏力(15.8%)。CT或MRI上可见囊泡样病灶、钙化灶、脑积水、斑片状影、环形强化影、隧道征象、串珠样征象及其他影像学表现。首次就诊被诊断为脑寄生虫病71例(74.7%),误诊率25.3%,分别被误诊为脑肿瘤12例(12.6%)、原发性癫痫7例(7.4%)、脑脓肿5例(占5.3%)。内科治疗66例(69.5%),外科手术治疗29例(30.5%)。
  结论:脑囊虫病多与食生猪肉、猪血有关,脑裂头蚴病主要与生吃蛙肉和使用蛙肉敷伤口相关。CT和MRI有助于上述两种疾病的诊断,但仍需仔细鉴别。如出现颅内占位效应和脑积水高颅压症状需手术干预。
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