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[硕士论文] 修磊
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)具有多种生物活性,对其研究与开发具有重要的实际意义与良好的应用前景。本研究以实验室保存鉴定的乳酸菌为出发菌株,筛选能够增强细胞免疫活性的乳酸菌EPS,随后将其进行分离纯化及结构初步鉴定,在此基础上探讨其对免疫细胞活性及机体特异性免疫应答的影响。
  本研究主要内容包括:⑴对实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定,筛选10株高产EPS乳酸杆菌,其中Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS可以增强巨噬细胞增殖、吞噬以及NO释放能力。⑵将上述Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS经过DEAE-Sepharose Fast Flow和SepharoseCL-6B色谱柱进行分离纯化后获得主要均一组分:TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS。紫外光谱和红外光谱扫描发现三种EPS均不含核酸和蛋白质,且均具有多糖的特征吸收峰,存在α型吡喃糖环构型;多角度激光光散射仪检测其分子量分别为4.908×104 Da、3.423×104 Da和3.737×104 Da;离子色谱检测单糖组成发现,三种EPS均由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及葡萄糖醛酸等7种单糖组成,其中TCP086 EPS各主要组分摩尔比氨基葡萄糖∶氨基半乳糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸约为2.6∶1.6∶1.2∶1; SXJ29 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基半乳糖∶氨基葡萄糖约为3.1∶1∶1;SXJ30 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基葡萄糖∶甘露糖约为1.4∶1.1∶1。⑶以纯化的TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS刺激巨噬细胞,对其增殖能力、吞噬中性红能力、NO释放能力、细胞因子分泌以及表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达进行检测后发现,巨噬细胞的免疫增强活性与EPS的浓度呈正相关,且SXJ30 EPS对巨噬细胞的免疫增强活性最强。⑷在体外成功利用IL-4和GM-CSF诱导获得小鼠骨髓来源树突状细胞,显微镜下观察SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后,细胞突起增多,体积增大;流式细胞术和ELISA法检测后发现,SXJ30 EPS能显著增强小鼠BMDCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达以及细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)的分泌。⑸将SXJ30 EPS与OVA抗原免疫小鼠,发现SXJ30 EPS可以显著提高小鼠脾脏DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达量;与铝盐(Alum)佐剂相比,SXJ30 EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度;此外,SXJ30 EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌;显著提高脾脏IL-4+ CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+ CD8+T细胞的比例,与Alum佐剂相比差异显著。
[硕士论文] 郭玮
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:为开发和利用细菌资源,本研究从张家界天门山表层土中分离到23株细菌,其中以不动杆菌和金黄杆菌为主要菌属。其中一株革兰氏阴性、短杆状细菌WG4T为金黄杆菌属新种。16S rRNA基因序列分析显示菌株WG4T与金黄杆菌Chryseobacterium anthropi NF1366T和Chryseobacterium haifense H38T的进化关系最近,相似性分别为97.39%和97.05%,WG4T与这两株菌株的DNA-DNA杂交结果分别为63.3%和62.7%。通过对菌株WG4T进行多相分类学分析,鉴定了该菌株生长温度范围为4-40℃,主要脂肪酸为iso-C15∶0(32.4%)、anteiso-C15∶0(21.8%)和iso-C17∶03-OH(17.2%),主要呼吸醌类型是MK-6,主要极性脂是磷脂酰乙醇胺(PE),基因组G+C含量为37.7mol%,以上特性均与金黄杆菌属特性相吻合。但基于16S rRNA基因同源性、DNA-DNA杂交结果,及特殊生理生化表型(不可水解明胶、可分解纤维二糖产酸等)结果,表明菌株WG4T为金黄杆菌属的一个新种,将其命名为高山金黄杆菌,即Chryseobacterium montanum sp.nov.。
  此外,本研究组前期鉴定了一株铁矿类芽胞杆菌新种Paenibacillus ferrariusCY1T,该菌可产生H2S气体,可与重金属反应生成沉淀等性质在重(类)金属污染修复方面具有一定作用。本研究发现CY1T具有六种重(类)金属抗性,代谢产生的H2S可与Cd(Ⅱ)发生共沉淀作用,以及该菌具有还原Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)的能力。通过全基因组测序得到CY1T的基因组草图,包含了75个contigs,8,260个编码基因,81个RNA基因。该基因组具有完整的SO42-还原通路,可将SO42-还原成S2-,生成H2S或可与Cd(Ⅱ)发生反应,生成CdS沉淀。同时,在基因组内还可以找到与Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)还原相关的蛋白,可能参与Se(Ⅳ)和Cr(Ⅵ)的还原反应。体现了菌种CY1T在重(类)金属抗性与转化等方面的基因型和表型的一致性,为重金属污染的治理提供了菌种资源和理论基础。
  除以上内容外,本人还参与了细菌中锑(Sb)氧化调控机制研究,主要涉及到氧化还原酶AnoA对锑氧化的作用,进行了包括蛋白质表达体系的构建、蛋白质的诱导表达及纯化、酶反应动力学实验,基因的同框敲除等工作(未展示)。
[硕士论文] 李金猛
化学工程与技术;生物化工 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:微生物发酵产物(微生物次生代谢产物)研究在天然产物研究中占据举足轻重的地位。微生物具有形态小;种类多元;繁殖速度快;生长周期短,适应在不同的环境中生存等特点。基于这些特点微生物在产业化上具有巨大的优势,成为发现新的具有活性化合物的主要来源。
  本研究通过研究微生物的次生代谢产物,对次生代谢产物进行结构鉴定、活性测试、应用探究以及来源分析,逆向研究微生物发酵菌株在人类获取天然产物的意义。从两份不同采集地的土壤中,通过活性追踪和文献调研,选取了两株链霉菌:Streptomyces maoxianensis和Streptomyces sp.HS-NF-1178,并对这两株链霉菌的次生代谢产物进行分离提取研究。对两株链霉菌进行发酵,发酵液通过树脂吸附、硅胶柱层析、HPLC等一系列分离手段(或技术)和核磁共振、红外光谱、高分辨质谱等化合物鉴定手段,共获得9个化合物,其中6个为新化合物。从Streptomyces maoxianensis共分离得到3个化合物,包括两个新的不饱和脂肪酸酰胺类化合物Maoxianamides A和B,两者为同分异构体;已知化合物与1(10)E,5E-germacradiene-2,11-diol的结构一致。从Streptomyces sp.HS-NF-1178中共分离得到4个新化合物和2个已知化合物,两个已知化合物分别与Lankacidinol和Lankacyclinol的结构相一致,根据化学命名法将4个新化合物分别命名为:N-((3R,4E,6E,8S,10E,12E,14S,16S)-8,14-dihydroxy-5,11,19,20-tetramethyl-18-oxo-2,17-dioxa-b icyc lo[14.3.1]icosa-1(19),4,6,10,12-pentaen-3-yl)-2-hydroxyprop anamide(5);(6S)-4-hydroxy-3,5-dimethyl-6-((2S,3E,5E,8S,9E,11E)-2,8,13-trihydroxy-5,11-dimethyltrideca-3,5,9,11-tetraenyl)-5,6-dihydropyran-2-one;(4E,7S,8E,10E,13S,14E,16E)-7,13,18-trihydroxy-4,10,16-trimethyloctadeca-4,8,10,14,16-pentaen-3-one(8);2-((1E,3E,5S,7E,9E,11S,13E)-5,11-dihydroxy-2,8,14-trimethyl-15-oxoheptadeca-1,3,7,9,13-pentaenyl)-5-methyloxazolidin-4-one(9)。对除化合物3(样品量太少)之外的其余8个化合物进行活性测试,结果显示:Maoxianamides A和B对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和白血病K562细胞表现出一定的细胞毒性;同时化合物5、化学物6、化合物8和化合物9对人类前列腺癌细胞PC-3和人肺癌细胞A549表现出一定的细胞毒性,其中化合物9活性相对较好,对两个癌细胞的IC50值分别为30.3和27.3μg/mL; Maoxianamides A和B对大豆菌核具有抑制效应,两者的MIC均在0.08-0.4mg/mL之间;化合物4对藤黄球菌和耐药金黄色葡萄球菌MIC范围分别在0.08-0.4 mg/mL和0.4-2 mg/mL之间;化合物5对藤黄球菌的MIC范围在0.4-2 mg/mL之间。化合物7对枯草杆菌和耐药金黄色葡萄球菌的MIC范围均在2-10mg/mL。
[硕士论文] 黄建蓉
水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:运城盐湖是一个古老而又典型的内陆咸水湖,富含丰富的芒硝(主要成分硫酸钠)资源,是研究嗜盐细菌多样性的理想对象。嗜盐细菌作为一类极具基础研究价值和应用前景的微生物资源,凭借其特殊的生理结构、代谢机制、种群类群、遗传基因和独特的代谢产物受到国内外学者的广泛关注。本研究通过免培养和纯培养技术相结合的方式,探究适合运城盐湖嗜盐细菌的分离技术,系统地开展该生境嗜盐细菌的分离鉴定、物种多样性研究,并从中筛选出具有纤维素酶和木聚糖酶活性的功能菌株。Biolog ECO法是一种以微孔板碳源利用为基础的定量分析方法,可简单、快速地描述微生物群落代谢特征。通过AWCD曲线、底物代谢差异、多样性指数以及主成分分析,对运城盐湖环境10个代表性样点微生物群落多样性和代谢特征进行了研究。结果表明,运城盐湖10个样点微生物群落可分为三种代谢类型。同时也预测出用于运城盐湖环境微生物分离的“有效分离底物类型”:糖类和酯类为底物碳源的分离培养基;氨基酸类和胺类为底物碳源的分离培养基。
  本研究采用高通量测序技术对运城盐湖嗜盐细菌多样性进行了分析,24个样品共得到原始序列705,689条,注释到16,877个OTU,平均长度在396 bp左右。通过QIIME平台分析可注释得到30个门,其中主要包括:厚壁菌门(Firmicutes,47.6%),变形菌门(Proteobacteria,35.6%),拟杆菌门(Bacteroidetes,3.7%),放线菌门(Actinobacteria,3.6%)和Bacteria Other(2.9%)。PCoA分析、CCA分析结果表明,这24个样品中的嗜盐细菌可分为3大类群,其中影响微生物类群差异的理化因子主要是Ca2+和Fe2+。比较同一个盐湖不同盐浓度样点的嗜盐细菌群落组成变化,发现靠近盐湖中心的两个样点中存在的嗜盐细菌群落组成较为相似,而远离盐湖中心的两个样点的嗜盐细菌群落组成较为相似。同时在运城盐湖中也检测到了大量的经典嗜盐类群、极端微生物类群和具有特定功能的微生物类群信息。综合群落代谢特征、理化参数等结果,设计出五类10种分离培养基用于分离运城盐湖10个样点环境中的嗜盐细菌。结果表明,共分离出1,033株嗜盐细菌,形态去重复后,测序得到605株嗜盐细菌信息。经鉴定这些菌株分属于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的7个纲,18个目,41个科,82个属以及52个潜在新分类单元。分析表明,分离培养基的营养成分、添加的盐浓度以及不同的样点对微生物的分离有着显著的影响。通过形态学、生理生化特征、化学组成和系统发育分析等研究,对2个新物种(Halomonas haloduranssp.nov.和Paracoccus halotolerans sp.nov.)开展多相分类鉴定,确定了这2株候选新物种的分类地位。纤维素类和半纤维素类物质是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。通过刚果红染色法对分离得到的1,033株嗜盐细菌进行纤维素酶和木聚糖酶活性菌株筛选,分别获得32株具有纤维素酶活性和49株具有木聚糖酶活性的菌株,活性菌株筛选阳性率为3.1%和4.7%,其中12株菌兼具纤维素酶活性和木聚糖酶活性。在分离培养基中添加功能底物可以增加功能菌株的获得。
[硕士论文] 潘通
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:现如今我们所接触到的抗生素、酶制剂以及一些胞外聚合物,大部分都是由放线菌所产生。由于已知产物的大量重复筛选以及病原菌耐药性的不断加强,人们对发现新构型和高活性天然药物给予极高希望。然而,常规生态环境的放线菌由于反复开发利用,阻遏了人们发现新药的脚步。在极端环境下,微生物的适应过程使其存在不同寻常的生理机制,因此对极端微生物的代谢产物、代谢途径以及功能性分已成为国际热门的研究领域。
  由于缺乏盐碱环境下微生物分离、培养方法的系统研究,人们对于盐碱环境下微生物资源的认识仍处于初级阶段。在本次实验中,我们选择了特殊生境中的盐碱土壤作为分离源,目的在于了解盐碱土壤中放线菌优势类群以及在该环境下筛选得到拮抗活性较好的菌株,为日后研究嗜盐碱放线菌的生理、遗传机制打下基础。大庆市位于黑龙江省西部,众多因素叠加造成其土地荒漠盐碱化严重,具有代表性。因此,本研究选取黑龙江省大庆市的盐碱土作为分离对象,对其进行放线菌的分离、耐盐碱特性以及拮抗菌株活性的研究。研究结果如下:
  (1)本实验对大庆盐碱土的放线菌进行了筛选,共从HV、高氏一号、改良CMKA培养基、甜醇培养基和XXA培养基上分离得到232株放线菌,通过菌落纯化形态对比合并为85株。发现烬灰类群和白孢类群为优势类群,这些菌株中的大多数属于链霉菌菌科(Streptomycetaceae),其次为黄色类群的小单孢菌菌科(Micromonosporaceae),稀有菌属占比很小。
  (2)对分离得到的放线菌进行了耐盐碱测试,有21株菌可耐受10%的NaCl,39株菌可耐受5%的NaCl,71.8%的菌株属于轻度耐盐菌。有65株菌可耐受pH10,27株菌可耐受pH11,说明大部分供试菌都具有耐碱特性。
  (3)对分离得到的放线菌进行活性实验,其中有36株放线菌可以抑制1种以上的植物病原真菌,其中的3株(S4HV2,S4GS38,S7GS2)对3种以上的植物病原真菌具有较强的活性,对其余植物病原真菌均具有较强或较弱的抑制作用。菌株S7GS2对4种病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum,Rhizoctonia solani,Phytophthora sojae,Phytophthora capsici)的抑制率超过80%。其中菌株S4HV2和S4GS38的发酵浸提液对部分植物病原菌及两种指示细菌均具有较强的抑制作用。
  (4)对一株形态较为少见、耐盐碱且有微弱活性的菌株NEAU-ZJC8进行了系统的分类学地位鉴定。然后通过对该菌株与相似菌株在培养特征、生理生化实验、化学组分以及分子水平的同源性等方面的比较,确定NEAU-ZJC8属于链霉菌属的一个新种,并命名为Streptomyces daqingensis。
  (5)在放线菌的分离过程中,得到一株细菌cbsb5。16S测序和系统进化建树分析后,对其进行了分类学鉴定实验,结果表明该菌株为芽孢杆菌属,并且各项实验数据均表明其可能为潜在新种。
[硕士论文] 张辉
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:银纳米粒子(silver nanoparticles,AgNPs)具有许多独特的物理化学特性,使其在光学、电子、催化以及医药领域等有着非常广泛的应用。过去的数十年,许多制备技术已经能够控制合成的银纳米粒子的粒径、形状和表面形貌。与传统的物理化学方法相比,生物合成法利用细菌、真菌和植物等合成银纳米粒子,避免有毒化学试剂的使用,具有对环境无污染、成本低等优点,吸引了众多研究者的关注。本文以海洋沉积物样品作为实验对象,通过传统的富集方法结合点种法分离拮抗菌,并筛选出一株拮抗菌,利用其产生的抑菌物质合成银纳米粒子。利用紫外-可见分光光度法(UV-Visible spectrometry,UV-Vis)、扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy,SEM)和X射线衍射分析(X-ray diffraction,XRD)的方法对银纳米粒子进行表征;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为抑菌对象,对银纳米粒子的抑菌性能进行检测。
  本实验以威海小石岛自然海域(37°31′2″N122°1′19″E)采集的底泥样品作为实验对象,通过富集、稀释涂布平板后,以大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC29213)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC19606)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticusATCC17802T)四株病原菌作为指示菌株,以点种法筛选出242株细菌,其中有177株细菌具有抑菌性。基于16S rDNA基因测序对拮抗菌进行鉴定,发现绝大多数菌株属于厚壁菌门。
  从分离到的拮抗菌中,挑选出一株拮抗性强的细菌DXFD1,经克隆测序得到其完整的16S rDNA序列(1474 bp),经比对分析,发现菌株DXFD1与枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB3610T)的16S rDNA相似性最高(99.59%)。利用菌株DXFD1产生的抗菌物质溶液与AgNO3溶液混合,置于磁力搅拌器上合成银纳米粒子,并对合成的银纳米粒子进行UV-Vis光谱、SEM和XRD表征。结果显示:银纳米粒子多为球形或近球形,粒径分布在30-70 nm,含银纳米粒子的混合液的UV-Vis光谱显示在480 nm处有吸收峰。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为检测菌株,对银纳米粒子的抑菌性能进行检测。结果表明:银纳米粒子在实验中表现出明显的抑菌效果,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为5μg/mL,最小杀菌浓度为10μg/mL。检测去除表面附着物质的银纳米粒子的抑菌活性,发现抑菌效果降低,结果表明抑菌物质在合成银纳米粒子的过程中结合到粒子表面,提高银纳米粒子的抑菌性能。
  本文对从威海附近海域、文登盐场、肥城精致盐场样品中分离到的编号为P131T、N62T、X7T、WDS2C4T与JZ3A21五株新菌进行了多相分类学鉴定。
  菌株P131T分离自威海近海沉积物,为革兰氏阴性菌、好氧、无滑动性、细胞呈杆状。菌株P131T的最适生长温度为28-30℃,最适pH为7.0-7.5,可耐受的盐度最为2.0-3.0%(w/v) NaCl。基于16S rDNA序列的分析表明,菌株P131T属于比齐奥氏菌属,与属内物种的16S rDNA相似性范围为94.6-97.0%。菌株P131T主要脂肪酸组分为iso-C15∶0、 iso-C15∶oG、iso-C17∶03-OH和iso-C171ω9c。主要的极性脂成分包括磷脂酰乙醇胺、两种氨脂质、氨磷脂、磷脂和其他的脂质。主要呼吸醌类型为MK-6。基因组DNA的G+C含量是36.7 mol%。根据遗传学和表型特征证据,菌株P131T(=KCTC42587T=MCCC1H00124T)代表比齐奥氏菌属的一个新物种,命名为沉积物比齐奥氏菌(Bizionia sediminis sp.nov.)。
  菌株N62T分离自自威海近海沉积物,为革兰氏阴性、兼性厌氧、无运动性和细胞短杆状。2216E固体培养基28℃培养2天,形成圆形、光滑、橘色和直径约为0.6-1.5 mm的单菌落。菌株N62T最适生长温度为28-30℃,最适pH为7.0-7.5和最适盐度2.0-3.0%(w/v) NaCl。菌株N62T主要的脂肪酸组分是iso-C15∶0、iso-C15∶0G、iso-C17∶03-OH和C17∶13-OH。主要的呼吸醌类型是MK-6。菌株N62T基因组DNA的G+C含量是35.3 mol%。主要的极性脂是磷脂酰乙醇胺、两种氨脂质、糖脂和三种其他的脂质。基于16S rDNA序列的分析表明,菌株N62T属于藏红花黄色线菌科(Crocinitomicaceae),与寒冷微菌属的物种的16S rDNA序列相似性范围为95.8-97.2%。根据遗传学和表型特征证据,菌株N62T(=KCTC42589T=MCCC1H00117T),代表寒冷微菌属的一个新物种,命名为橙色寒冷微菌(Brumimicrobium aurantiacum sp.nov.)。
  菌株X7T分离自自威海近海沉积物,细胞革兰氏阴性、无滑动性、兼性厌氧和短杆状。最适生长温度为28-30℃,最适pH为7.0和最适盐度2.0-3.0%(w/v)NaCl。基于16S rDNA序列的分析表明,菌株X7T属于盐坑微菌属,与Salinimicrobium gaetbulicola有着最高的16S rDNA序列相似性(96.3%)。主要脂肪酸为anteiso-C15∶0、iso-C15∶0、 anteiso-C17∶1ω9c、iso-C17∶1ω9c、 C17∶02-OH和iso-C17∶03-OH。主要极性脂是一种磷脂酰乙醇胺、一种磷脂、两种氨脂质和五种其他未确定的脂质。主要呼吸醌类型是MK-6。基因组DNA的G+C含量是46.7mol%。遗传学、表型特征以及化学组分结果表明,菌株X7T(=KCTC42585T=MCCC1H00115T)代表盐坑微菌属的一个新物种,命名为黄色盐坑微菌(Salinimicrobium flavum sp.nov.)。
  菌株WDS2C4T和JZ3A21分别从文登盐场、肥城精致盐场的样品分离到,细胞为革兰氏阴性、长杆状和无滑动性。生长范围:可耐受盐度1.0-20.0%(w/v)NaCl(最适6.0-10.0%),温度20-50℃(最适37-40℃)和pH6.5-9.5(最适7.0-8.0)。菌株WDS2C4T和菌株JZ3A21主要脂肪酸组分均是cyclo-C19∶0ω8c、summedfeatures8(C18∶1ω7cand/or C18∶1ω6c)、C18∶0、 C17∶0、C16∶0和11-methyl C18∶1ω7c。菌株WDS2C4T和JZ3A21主要的呼吸醌类型是Q-10。菌株WDS2C4T的基因组DNA的G+C含量为67.7 mol%,菌株JZ3A21的基因组DNA的G+C含量为67.3mol%。菌株WDS2C4T主要极性脂成分是两种磷脂、氨脂质、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和两种糖脂。菌株WDS2C4T与Rhodovulum marinum JCM13300T的16SrDNA序列相似性最高为95.11%。与物种Albidovulum xiamenense、Paracoccusaestuarii、Rhodobacter vinaykumarii和Roseiviv ax pacificus的模式菌株的相似性分别为94.75%、94.00%、93.88%和93.85%。根据16S rDNA序列建立的三个系统发育树(Neighbour-joining,maximum-likelihood和maximum-parsimony)表明,菌株WDS2C4T和JZ3A21位于Rhodobacteraceae科的单独分支上。根据遗传学和表型特征证据,菌株WDS2C4T(=KCTC52227T=NBRC112331T=MCCC1H00148T)代表红细菌科的一个新属新种,命名为嗜盐白色盐杆菌(Albihalobacter halophilus gen.nov.sp.nov.)。
[硕士论文] 李倩
环境工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:环境中的微生物会经历各种环境变化造成的胁迫作用,导致微生物自身产生一系列表现型与基因型的变化来响应外界环境压力。目前大多数研究旨在揭示环境胁迫对微生物的作用机理以及微生物的响应机制,很少有研究从应用的角度对微生物的胁迫响应机制进行探讨。鉴于环境生物技术主要依赖微生物的表面性质或代谢功能来进行污染物的处理,且微生物这些性质会被外界环境胁迫诱导发生改变,因此我们假设微生物的胁迫响应机制可以作为一种开发新型环境生物技术的新策略。
  本研究以环境微生物细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)以及模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)为研究对象,通过外源施加环境胁迫和合成生物学手段的利用,探究了微生物胁迫响应机制在环境生物技术中的应用。主要内容包括:⑴通过外加高盐胁迫诱导蓝细菌胁迫响应机制的产生,可以增强其吸附性能。吸附性能的提高是由于表面EPS中PS分泌的增多和碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase)活性的提高共同引起的。Sigma70因子转录水平的提高证实了这一作用是由外界环境胁迫诱导的全局转录因子控制的。本章研究证明了环境胁迫诱导可以用于提高环境生物技术中微生物的性能。⑵通过合成生物学手段,构建了含有四环素降解基因tetX的四环素降解模块,并将其转化到E.coli中,构建出具有四环素降解能力的工程菌株。所构建的功能菌株可以通过羟基化作用有效转化四环素。结果表明,24h时对四环素的降解效率即达到了98%以上。本章研究证明了将具有环境功能的基因模块整合到模式菌中的可行性,并将其应用于生物技术的开发。
[硕士论文] 许振兴
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:能源、资源、环境问题是21世纪制约社会经济可持续发展的主要瓶颈。为进一步解决能源紧缺问题,从海洋中寻找新的生物能源途径越来越引起科研人员的重视。海洋面积占地球总面积的70%以上,其中蕴藏丰富自然生物资源,并且含有大量可进行生物质转化的藻类。琼胶作为一种海洋功能多糖,是海洋红藻细胞壁的主要成分,总量巨大,是生物质能转化的重要来源之一。另外,琼胶经水解后的寡糖也由于水溶性好,易被机体吸收的特点,在食品,医药,化妆品等领域有着巨大应用前景。微生物作为降解琼胶的初级消费者,是研究琼胶生物质转化以及制备琼胶寡糖的主要物种来源。因此,本文以细菌的琼胶降解为研究主线,开展了一系列研究工作。
  首先,本文完成了包括两株琼胶降解菌在内的四株海洋新菌的分类鉴定工作。分离自青岛养殖池海水并且具有琼胶降解能力的菌株QM50T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白、DNA以及吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,基因组分析以及16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为科尔韦尔氏菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶科尔韦尔氏菌(Colwellia agarivorans sp.nov.)。分离自条斑紫菜表面并且具有琼胶降解能力的菌株HZ1T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白以及吐温80,呼吸醌类型为MK-6,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和三个未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征以及16S rRNA序列的系统发育分析,菌株HZ1T为黏着杆菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶黏着杆菌(Tenacibaculum agarivorans sp.nov.)。分离自鲨鱼腮的中度嗜盐菌SS9T,革兰氏阴性菌,最适生长盐度为6%,能够积累PHA,呼吸醌类型为Q-9,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,16S rRNA序列的系统发育分析以及MLSA分析,该菌为是盐单胞菌科的一个新属新种,建议将其命名为橙色鲨鱼球菌(Pistricoccus aurantiacusgen.nov,sp.nov.)。分离自威海近海沉积物的菌株N211T,革兰氏阴性菌,可以水解明胶和吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和一种未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征和16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为深海杆菌属的一个新物种,建议将其命名为沉积物深海杆菌(Thalassotalea sediminis sp.nov.)。另外,还对鉴定的两株琼胶降解菌进行了基因组测序,结果显示菌株QM50T的基因组大小为4.7 Mb,GC含量为35.8%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌株存在5条β-琼胶酶基因,4条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。菌株HZ1T的基因组大小为5.6 Mb,GC含量为30.9%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌存在11条β-琼胶酶基因,1条α-琼胶酶基因,2条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。并且这两株菌还注释出不完全相同的半乳糖代谢通路。
  然后,本文对来源于本实验室之前鉴定的两株琼胶降解菌HQM9T和QIT的11条琼胶酶基因和6条新琼二糖水解酶基因进行了外源表达分析。利用生物信息学分析,除琼胶酶AgaAJ属于GH86家族,琼胶酶Q1B2属于GH118家族外,其余9条琼胶酶基因都属于GH16家族,6条新琼二糖水解酶基因属于GH117家族。并且经过对琼胶降解酶基因的外源表达过程,我们成功构建了11条琼胶酶的基因工程菌,经表达检测及酶活分析,9条琼胶酶进行了重组蛋白表达并显示出一定活性。而6条新琼二糖水解酶基因中只有四条基因被成功表达,除了NABH1表达可见的可溶性重组蛋白外,其余3条基因均表达包涵体,经底物水解检测,这四条重组的新琼二糖水解酶没有显示出降解底物的能力。对多个重组酶进行纯化,最后利用亲和层析结合包涵体复性的方式成功纯化出重组琼胶酶Q1B1,对其进行生理生化特征鉴定,重组酶Q1B1在底物为1%时的比酶活为222.84U/mg,并且具有琼胶底物专一性,它的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为1.6%,最适反应的pH值为8,DTT对酶活的促进有很大影响。纯化后的重组酶以琼脂糖为底物时的最终降解产物为新琼四糖和新琼六糖,它的最小降解底物为纯的新琼六糖。
  最后,本文还从基因转录水平分析了菌株Q1T在琼脂糖诱导条件下,在不同时间琼胶降解相关基因的表达差异。结果显示琼胶降解酶基因的表达集中于菌株诱导生长的前期,并随着菌株生长持续减弱,至菌株生长至稳定期后期时,琼胶降解基因基本停止表达。另外,根据琼胶降解基因在基因组上的分布,菌株Q1T中的琼胶降解酶基因大部分可能属于单独调控型,虽集中表达,但表达量只与诱导条件有关,而与基因所处位置无关。
[硕士论文] 穆广亚
渔业 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannanmann-ohydrolase,EC3.2.1.78),是一类能水解含β-1,4-D-甘露糖糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前已有大量微生物产生β-甘露聚糖酶的相关报道,不过这些已经被报道的菌株大多是从海洋和土壤中分离得到的。自从邱德有等学者从云南红豆杉中分离出能够合成抗癌药物紫杉醇的内生真菌后,内生细菌的相关研究持续升温,但是主要集中在其药用价值和拮抗菌的筛选,关于内生细菌产酶的相关报道相对较少本研究尝试从海南特色植物椰果中筛选1-2株高产β-甘露聚糖酶内生细菌,并对其酶学性质、培养条件进行研究,为应用于水产动物饲料奠定理论基础。
  本研究共从椰果中分离得到56株植物内生细菌。所分离得到的内生细菌分布于5个目,5个科,9个属,19个种。在分离得到的56株菌中,芽孢芽孢杆菌属(Bacillus sp.)共34株,占总菌株数的60.71%,属于椰果内生细菌中的优势种群,其次是勒克菌属(Leclercia sp.)共8株,占总菌株数的14.29%,第三是嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)共5株,占总菌株数的8.93%。对分离的56株菌进行刚果红初筛和摇瓶发酵复筛发现菌株YZ-21酶活最高,可以达到20.67 U/mL,确定菌株YZ-21作为研究对象。经过测定胞外与胞内酶活比为37.97,证明该酶属于胞外酶。将YZ-21的16S rDNA测序结果通过NCBI进行BLAST,与Bacillussubtilis subsp.inaquosorum KCTC13429T相似度为99.93%。YZ-21的形态特征、培养特征及生理生化指标测定等表型鉴定结果与东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》对枯草芽孢杆菌的描述基本符合,结合YZ-21的16S rDNA序列比对的结果,初步将YZ-21菌株鉴定为芽孢杆菌属细菌(Paenibacillus sp.)。对菌株YZ-21发酵条件进行优化,得出最优培养基为2%瓜豆胶、0.25%蛋白胨、0.2%K2HPO4、0.05% MgSO4、0.5%NaCl。最佳的培养条件为40℃,初始pH值7.0,200 r/min,发酵72h,接种量为5%。优化过后的产酶水平能达到126.45 U/mL,约为初始酶活的5倍。采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法和双水相三种方法对YZ-21所产酶进行分离纯化,最终确定双水相的最优盐种类为硫酸铵盐,16% PEG2000和18%(NH4)2SO4双水相体系酶萃取率最高,能达到98.80%,之后添加不同浓度的NaCl,发现2% NaCl添加量能够使该酶萃取率上升至99.26%。对该酶的最适温度、pH进行测定,结果表明该酶的最适作用温度为40℃,最适pH为7.0。该酶在55℃条件下保温2h之后,相对酶活依然能达到65.7%,在pH5.0-8.0的条件下,保温30 min后,相对酶活依然可以保持在80%以上。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+这五种离子对于该酶具有激活作用,而酶激活作用最强的则是Ca2+,它能够使酶活相对于CK组提高了接近63.2%,Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Na+和EDTA均表现出了对该酶的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+、Mn2+对该酶表现出明显的抑制作用。对菌株YZ-21基因组DNA进行PCR扩增,得到产β-甘露聚糖酶基因ManA,序列分析表明,该基因全长1127bp,该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露聚糖苷酶同源性最高能够达到97.56%,具有ManA保守结构域,属于糖苷水解酶家族GH26的一员。之后构建重组表达质粒pET-manA,将转入大肠杆菌BL21(DE),经过诱导获得了此酶的高效表达。对重组β-甘露聚糖酶酶活进行初步检测,结果显示,酶活力为372.86 U/mL。表达产物经过SDS-PAGE凝胶电泳分析,蛋白图谱显示一条大约为56.07KDa的特异性条带。对重组酶酶学性质进行实验发现最适反应温度和pH分别为40℃和pH7.0,对重组β-甘露聚糖酶底物特异性进行实验,重组β-甘露聚糖酶最佳底物种类是瓜豆胶,其酶活能够达到392.54U/mL。重组β-甘露聚糖酶酶学性质研究表明,该菌所产的重组β-甘露聚糖酶最适反应温度和pH分别为40℃和7.0。该酶在35-55℃范围内酶活力较为稳定,55℃保温120 min后,酶活仍保留69.8%; pH4.0-9.0保温30 min酶活均可保留60%以上,Ca2+、Co2+对重组β-甘露聚糖酶有明显的激活作用。
[硕士论文] 杨金芳
轻工技术与工程 陕西科技大学 2017(学位年度)
摘要:溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种革兰氏阴性海洋细菌,广泛分布于世界范围的海水环境中,是多种经济鱼类、虾类和贝类的重要致病菌,其感染引发的病害使得水产养殖业蒙受巨大经济损失。溶藻弧菌还是一种典型的人-畜-鱼共患的致病微生物,会引起人的中耳炎、创伤性感染等疾病,直接对人类健康造成严重威胁。Hfq是一类广泛存在于细菌体内、具有较高保守性的sRNA分子伴侣蛋白,具有转录后全局调控因子的功能,参与细菌多种生理功能的调控。前期研究发现,Hfq对溶藻弧菌的多种生理功能有着不同程度的影响,而作为sRNA分子伴侣蛋白,Hfq主要通过各种sRNA分子对不同靶标mRNA的影响来发挥其功能。本论文对前期在溶藻弧菌体内筛查的5个sRNA,Qrr1-5进行了分子克隆,根据同源交换的原理,利用自杀质粒pDM4,通过无标记基因缺失手段构建了Δqrr1、Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4、Δqrr5突变株;同时利用回补质粒pBAD33成功构建了其相应的回补株qrr1+、qrr2+、qrr3+、qrr4+、qrr5+;并初步鉴定其在溶藻弧菌不同生理功能中所发挥的作用。主要结果如下:
  以野生型溶藻弧菌EPGS020401的基因组为模板,扩增获得大小分别为121bp,133bp,134bp,133bp,134bp5个sRNA序列,即Qrr1,Qrr2, Qrr3,Qrr4,Qrr5。对测序后的序列进行生物信息学分析发现,该5个sRNA分子与其它弧菌中相关序列具有较高的同源性,同时溶藻弧菌体内5个qrr基因序列自身碱基组成具有一定的保守性,在其转录起始位点上游-12到-24均含有σ54结合位点序列,在3’端均含有Rho非依赖型的终止子,其二级结构均含有4个茎环结构,4段互补序列。通过对靶标基因的预测分析发现,Qrr1-5与溶藻弧菌体内多个靶基因存在潜在作用,影响其多种不同生理功能。
  成功构建缺失qrr1基因开放阅读框内115bp,qrr2内120bp、qrr3内139bp、qrr4内128bp、qrr5内129bp的突变株Δqrr1、Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4、Δqrr5及其回补菌株qrr1+、qrr2+、qrr3+、qrr4+、qrr5+。通过比较其与野生型菌株不同表型的变化,初步鉴定了Qrr1-5对溶藻弧菌不同生理功能的调控作用。Qrr1-5基因缺失后,溶藻弧菌生长速度和最大菌体浓度均明显下降,即Qrr1-5在溶藻弧菌的整个生长周期都发挥着重要的正调控作用,尤其是在对数生长期。Δqrr1-5突变株的爬动能力基本丧失,游动能力则出现不同程度的损失,Δqrr1菌株的游动能力几乎完全丧失,Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4菌株的游动能力有所下降,而Δqrr5菌株游动能力损失最小。Qrr3对溶藻弧菌生物被膜形成具有非常显著的抑制作用,而Qrr2则具有显著的抑制作用,Qrr1、Qrr4、Qrr5则对其影响不大。Qrr5对溶藻弧菌胞外蛋白酶的产生具有非常重要的促进作用,而Qrr1-4则对其产生较小的影响。Qrr1-5对其响应温度(15℃和43℃)、30%蔗糖、限铁环境等应激能力影响不甚明显。Qrr1-4对溶藻弧菌在10%乙醇压力下的生长没有明显的影响,其生长状况与野生型基本相同,而Qrr5对溶藻弧菌响应10%乙醇应激能力具有一定的调控作用。SDS对溶藻弧菌的生长抑制作用明显,而其中Qrr2对溶藻弧菌响应SDS应激的能力具有一定的负调控作用。
  通过本论文的研究,初步明确了Qrr1-5对溶藻弧菌致病性相关表型和其他生理功能的作用,使人们对溶藻弧菌毒力调控机制的认识更加全面,而且为弧菌病的诊断和预防手段的开发提供一定的理论依据。
[硕士论文] 何树祥
物理学 广西师范大学 2017(学位年度)
摘要:芽孢(spore)是一些芽孢杆菌或球菌在恶劣环境下经过复杂过程而在体内形成的一个休眠体。芽孢结构十分特殊,核内富含的吡啶二羧酸钙(Ca2+-DPA)成分让芽孢能生存在极端的环境中,对高温、高压、强酸强碱等具有很强的抵抗能力,只要外界条件好转就会萌发进入营养生长成为一个营养态细胞,这会让芽孢丧失抗逆性。研究芽孢萌发机理,分析理化因子对芽孢萌发的影响,在抑制和杀灭对食物、医药、工业方面有害的芽孢杆菌等方面有着重要意义。
  苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是当今世界研究最多,应用范围最为广泛的微生物农药。Bt杀虫剂具有易大规模生产,杀虫效率好,对坏境无害,人畜安全的特点。研究Bt芽孢萌发机制和一些影响因子对芽孢及其萌发的影响,有助于了解试剂对芽孢的杀灭机理,提高生物农药使用效率。
  介绍一种图像分析工具——SporeTracker(孢子追踪器),并将其运用在实验数据处理上,与人工统计实验数据方法作对比,分析两种数据处理方法的差异和SporeTracker的特点。SporeTracker的创新运用优化了数据处理方法。
  利用微分干涉差显微成像技术(Differential interference contrast,DIC)和光镊拉曼显微镜技术联合动态监测单个Bt芽孢在戊二醛处理后的萌发过程,使用不同萌发剂和不同菌株,结合两者实验数据分析戊二醛对Bt芽孢和芽孢萌发的影响。从而为分析如高温、高压、强酸强碱等其他理化因素对芽孢的影响提供了基础方案,也在认识芽孢萌发机理及其异质性发挥了极其重要的作用。
  为此,本论文主要研究内容包括以下几点:
  (1)利用DIC显微镜术联合光镊拉曼显微镜术在单细胞水平研究中的运用,高通量监测Bt芽孢萌发动态过程,在认识芽孢萌发机理及其异质性发挥了极其重要的作用。通过实验数据分析,结果发现同一Bt芽孢不同菌株之间存在很大的差异,同一菌株在不同的萌发剂触发下的萌发过程不同,同一萌发剂触发不同菌株的萌发过程也有很大不同。
  (2)通过Bt芽孢萌发的相差图像,将SporeTracker运用于实验的数据处理。结果发现,SporeTracker作为自动化的图像分析工具,在我们实验图像的处理上的运用是完全可行的。SporeTracker可以快速标记出相差图像内的芽孢,绘制出亮度随时间变化的曲线,并识别出亮度开始下降和下降完成的时间点。SporeTracke虽然可以优化实验数据处理方法,但在智能识别方面还有待改进。
  (3)利用DIC显微镜术和光镊拉曼显微镜术联合分析戊二醛处理后Bt芽孢萌发动态过程。结果得到,戊二醛处理对Bt芽孢的萌发影响很大,不同萌发剂触发下的萌发过程有很大区别。戊二醛处理后Bt芽孢的内膜和蛋白质二级结构变化不明显,但损坏了芽孢萌发相关的蛋白质,影响最显著的是萌发剂受体,其次是DPA释放通道的相关蛋白,而对皮层水解酶的影响较小。
[硕士论文] 李军辉
高电压与绝缘技术 哈尔滨理工大学 2017(学位年度)
摘要:脉冲电场灭菌技术目前已经被广泛的研究,因为脉冲电场灭菌技术不仅有良好的灭菌效果,而且极大的保护了液体食品中的营养物质,维持了液体食品原有的风味,同时灭菌过程中所消耗的能量也很小。但是脉冲电场灭菌技术并没有被大规模的推广。脉冲电场灭菌过程中,施加在处理室上的电压较高,处于其中的液体食品会在该电压的作用下被击穿,对灭菌设备造成极大的损害,同时污染了液体食品。液体食品的击穿问题制约了脉冲电场灭菌技术的发展。研究液体食品在脉冲电场作用下的击穿特性,掌握液体食品的击穿机理,是突破这一瓶颈最优途径。本文搭建了实验研究的平台,并在此平台上完成了击穿实验和观察实验。
  本文首先研究了不同液体食品、电压作用时间、流速、压强、电场不均匀程度以及脱气对于击穿场强的影响特性,实验结果表明:击穿场强与液体食品的电导率基本无关,脱气后击穿场强有微弱的提高,随着液体食品流速的提高击穿场强稍有升高,随压强增加击穿场强提高幅度较大,同时在不同压强下,各液体食品的击穿场强大小规律发生变化,液体食品击穿场强随电压作用时间减少而明显提高,击穿场强随电场不均匀程度提高而显著降低。其次本文光学仪器,观察了针板电极处理室内自来水的气泡行为和自来水及啤酒的击穿过程,气泡行为观察实验结果表明:处理室在击穿前就已经有气泡存在,针尖附近的自来水在较高电场作用下会产生气团,并向板电极移动。自来水被击穿后针板电极之间有大气泡出现,在放电结束后大气泡会分解为气团。击穿过程观察实验结果表明:处理室内液体食品在出现贯穿两电极之间的放电(击穿)前,液体食品中有大量的微小的局部放电光斑,这些放电光斑应该是液体食品中原来存在的微气泡内出现了局部击穿现象,随着时间的推进和电压的升高,局部击穿的微气泡数量有明显增多的趋势,微气泡内局部击穿也有逐渐增强的趋势。正是这些微气泡的局部击穿和积累,最终造成了液体食品出现贯穿两电极之间的电弧性放电(击穿)。通过击穿实验和观察实验可得出:液体食品中气泡行为是使击穿场强发生变化的根本原因,各因素通过影响气泡行为,进而改变液体食品的击穿场强。电场不均匀程度对击穿场强影响作用最强,其次是电压作用时间和压强,流速和是否经脱气处理对击穿场强影响较小。因此,为解决脉冲电场灭菌技术中处理室击穿问题,要着重考虑电场不均匀程度、压强以及电压作用时间这三个方面的作用。
[硕士论文] 王浩然
高电压与绝缘技术 哈尔滨理工大学 2017(学位年度)
摘要:食品灭菌技术一直是各项食品处理技术之中的重点,传统的食品灭菌技术可分为热力灭菌技术与非热力灭菌技术两类,其中热力杀菌技术应用最为广泛。但是热力灭菌技术往往会造成食品中营养物质的损失,并且会影响食品原有的风味。高压脉冲电场灭菌技术凭借其灭菌效果好,速度快,能最大限度上保留食品的原有风味等特点得到了广泛的重视,成为最受追捧的非热力杀菌技术。国内外学者对这项杀菌技术进行了大量的研究,但是此种技术仍只能停留于实验阶段,并没有被广泛的应用于工业化生产中。因此研究一套适合工业化生产的高压脉冲灭菌装置,使这项技术尽快的应用到生产中是十分有意义的。高压电场灭菌设备主要面临如下几点问题,首先,目前的高压脉冲灭菌设备的电源大多价格昂贵,输出电压波形不佳很难满足工业化灭菌需求。其次,当前设计的灭菌处理室大多存在结构上的问题,处理室在内部电场分布或处理量上不能满足工业,商业化的需求。
  本研究主要内容包括:⑴阐述了高压脉冲灭菌技术在国内外的发展现状,对高压电场灭菌的机理进行了详细的阐述并对影响电场灭菌的关键因素进行了总结,并分析了限制高压脉冲灭菌技术工业化的主要原因。⑵通过Comsol软件对国内外主流电场灭菌处理室的内部电场进行了分析,并结合实验室多年的研究成果,设计了一种适合工业生产的实用化灭菌处理室,通过对其内部电场以及处理量的分析证明了新型处理室完全能够满足工业化应用需求。⑶对当今的高压脉冲电源进行分类分析,对传统的Marx型脉冲电源进行改进,设计一套使用IGBT作为高压开关的,适用于高压脉冲灭菌的高压脉冲电源。利用Orcad对新型电源的电路特点和各项参数进行了详细的仿真分析,根据分析结果完成了对电源中各元件的选择与制作,最后完成高压脉冲电源的脉冲形成回路搭建。⑷利用现代控制技术以及PLC技术,对整套设备进行整合,实现其自动化控制,使此设备能够满足工业化生产的需要。
[硕士论文] 刘宇慧
环境工程 南昌大学 2016(学位年度)
摘要:随着现代医学技术的不断进步,在经济持续发展的背景下,人们越来越重视个人健康,每年至少一次体检成为了人们的生活常态。同时,由于生活条件和环境变化的影响,导致患乙型肝炎、丙型肝炎、糖尿病以及生殖系统疾病等慢性病的人越来越多,对于这类疾病,医学检验伴随着长期的治疗过程。因此,无论是综合性医院还是专科医院,检验科的检验标本数量都越来越多,而且病原体的类型也越来越复杂。在我国的城市规划建设中,具有医学检验功能的医院一般都集中在城市中心区或者人口聚集区,而专门的医疗废物处置中心位置都较偏远,且处理量有限,因此,这些携带大量有害病原体的检验科废弃标本在储存与运输过程造成的环境安全问题已经逐渐凸显。
  本文专门针对综合性医院检验科废弃标本的预处理方法作了详细研究,对不同类型的病原体采用含氯消毒液浸泡和高压蒸汽灭菌法两种方式的预处理,然后进行荧光定量PCR(即Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)检测,发现对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、DNA(即Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)病毒和RNA(即Ribonucleic acid,核糖核酸)病毒五种不同类型微生物致病菌来说,两种预处理方法均有有效的灭活作用,但高压蒸汽灭菌法在操作、消耗时间、成本、安全性方面都比化学消毒预处理法更有优势。
  由于含氯消毒液对于操作人员的身心健康及环境都有一定的危害,且操作时间长,导致很多医院都不对检验科废弃标本作专门的预处理。本文探讨分析用简便易行的高压蒸汽灭菌法作为检验科废弃标本预处理的方式可行性。针对不同医院检验科废弃标本量,测算高压蒸汽灭菌法操作成本,同时还应该开展更深入的研究,达到推广高压蒸汽灭菌法作为医院检验科废弃标本预处理的目的。
  通过本次实验研究得出以下结果:
  1、高压蒸汽灭菌法对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、DNA病毒和RNA病毒的灭活效果均能达到100%。
  2、高压蒸汽灭菌法对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、DNA病毒和RNA病毒的灭活率达到100%时所需的时间为1~1.5小时,比用湿式化学消毒预处理法进行灭菌所用时间缩短了50%以上。
  3、高压蒸汽灭菌法对检验科废弃标本预处理的成本极低,为3元/千份标本,比湿式化学消毒预处理法经济性高。
[硕士论文] 郭肖杰
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:微流控技术是在微米尺度下对生物、化学等样品进行精确操控的一门科学技术,液滴微流控技术作为微流控技术领域的一个重要分支,可以实现高度均一液滴、乳化、双乳化、气泡等发生和操控,同时利用该技术,我们能够以高通量、自动化的方式在微液滴中进行生物、化学反应。目前,液滴微流控技术已广泛应用于药物筛选、蛋白结晶、数字PCR(digitalPCR,dPCR)以及单细胞分析等领域。
  微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)作为一种新型核酸检测方法,在稀有碱基突变检测和核酸绝对定量方面比传统的实时荧光定量PCR更有优势。在第二章中,我们介绍了一种新的ddPCR微流控芯片,该芯片由两片刻蚀有微通道结构的玻璃板组装而成,它集成了微液滴发生、液滴阵列化存贮以及扩增后液滴成像等多种功能模块,我们计划将它用于饮用水中病原微生物的检测。该方法提供了一种高溶剂兼容性、简单清洗后可复用的ddPCR装置。
  基于细胞代谢产物活性的单细胞分选技术是一种用于微生物培养的有效方法。在第三章中,我们介绍了一种基于pH响应水凝胶微液滴的高通量乳酸菌分选微流控芯片。我们首先制作出大量包含海藻酸钠、碳酸钙、乳酸菌的微液滴,并将这些微液滴置于38℃条件下进行孵育。孵育过程中微液滴内包含的乳酸菌会产生乳酸并与碳酸钙反应释放钙离子,钙离子会与海藻酸钠发生交联,引发微液滴凝胶化,之后利用我们开发的基于不同硬度进行分选微流控芯片进行分选。这种基于pH响应的单细胞分选系统或许可以在工业微生物育种中获得广泛应用。
[博士论文] 陈翔宇
仪器科学与技术 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:人类社会即将面临能源危机和环境污染等困境,希瓦氏菌污染治理和绿色能源方面表现出巨大的潜力,因而获得到了广泛关注并掀起了研究热潮。然而,过去的研究主要集中于群体水平至生物膜水平,不易探究精确的机理。直至2010年,基于单细菌或若干细菌(下文简称为细菌层次)的多项精彩工作发表,希瓦氏菌的两种电子传递机制获得证明,这些工作的成功基于微纳技术的引入。因此,希瓦氏菌细菌层次上的深入探究及定量检测也需依赖于微纳技术和微流控技术。
  微流体技术因其众多优势已经被广泛应用于分析化学、生命科学、药学及环境科学中,然而在微流体平台上进行的原核细胞研究还处于起步阶段,因原核细胞形状差异大、尺寸较小(亚微米级别)、无规则自由运动等特点使得相关研究进展困难。本文将研究对象聚焦于原核生物中具有特色的电化学活性菌的代表希瓦氏菌,目标是实现希瓦氏菌在细菌层次的快速有效且无标记的定量检测,以支持后续进一步地探究。实现希瓦氏菌在细菌层次的检测前提是制备细菌层次的样品,而这种样品制备也只能借助于微纳技术及微流体相关技术。考虑到微流体芯片具有微型化与集成化两大特征,本文的思路是先开发微型化的单元模块,主要为细菌层次样品制备的操控模块及相关的检测模块,然后借助于开发这些单元模块的经验,制作集成化的微流体芯片,实现希瓦氏菌细菌层次的操控及检测。
  希瓦氏菌操控模块的章节中,先后研制了三种操控基底,分别为被动操控的微结构阵列、侧壁微电极的介电泳主动操控及非接触式微电极的主动操控。这些操控模块均能实现快速高通量无标记的希瓦氏菌操控,其中被动微结构阵列无法提供稳定的固定。本章也同时提出了希瓦氏菌的介电泳操控模型,建立了完整的操控体系。三种操控模块的研制为后续微流体中操控模块的开发与集成提供了基础及经验。
  希瓦氏菌检测模块的章节中,针对研究对象希瓦氏菌,开发了微流体中的光及电信号相关的检测模块。光学模块以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)膜为核心,以内锁结构的接口为配件,开发了一体成型工艺制作PDMS微流体,支持在线监测微流体通道并提升了通道中获取希瓦氏菌精确信息的可能性。电学模块中为下游的希瓦氏菌检测制作了大面积的双层电极基底,采用了测量电极-聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate,PMMA)绝缘层-介电泳操控电极三层结构的设计。同时也提出了微流体漏液模型和解决方案。
  最后,以单元模块开发积累的经验,设计制造了集成了介电泳捕获、荧光检测、拉曼检测的微流体平台,用于希瓦氏菌在细菌层次上样品制备和检测,实现了快速有效无标记可计数的希瓦氏菌的定量捕获及检测。借助于模拟分析,我们对介电泳操控电极进行优化,设计了有微阱结构的钝化层,能够与微流体平台的其它部分协同,实现三点功能,即重排电场分布、确定捕获区及测量区。微阱中被捕获固定的希瓦氏菌可进行精确的数目统计,结果表明捕获的希瓦氏菌数目及尺寸与微阱尺寸相关。最后对捕获的希瓦氏菌进行了初步的拉曼光谱检测,验证了微流体芯片同时具有样品检测的功能。
[硕士论文] 康嘉兴
生物科学与医学工程;生物医学工程 东南大学 2016(学位年度)
摘要:希瓦氏菌MR-1是一种非常重要的模式产电细菌,它具有胞外电子传递的功能,能够将呼吸链产生的电子传递到环境中的固态铁等电子受体上,因此这种细菌在微生物燃料电池体系中得到了广泛的应用。人们对希瓦氏菌MR-1的产电代谢通路已经做了很多研究,目前主流认为有两条主要的代谢路径:在铁氧代谢中,CymA将电子通过延胡索酸还原酶FccA传递给金属还原蛋白MtrA,或者将电子直接传递给MtrA,并通过MtrA、B、C一系列金属还原蛋白将电子从细胞质内通过细胞膜表面的脂质体传递到细胞外膜;而在铁硫代谢中,传递到细胞质中的电子通过PsrA、PsrB、PsrC等蛋白传递到细胞的外表面。当电子被传递到细胞的外表面之后,希瓦氏菌MR-1通过细胞色素C介导、微生物纳米导线等机制将电子进一步传递到胞外的电子受体上。
  人们通过研究发现,一定条件下细菌的共培养可以提高微生物燃料电池装置的产电效率,因而共培养过程中的产电机制也开始为研究人员所重视。然而,共培养对希瓦氏菌MR-1代谢路径的影响还没有人做过详细研究。本论文以希瓦氏菌MR-1为研究目标,构建了双室的微生物燃料电池(MFC)体系,用相关的电化学分析方法和16sRNA基因测序等分析手段,讨论了不同培养环境下MFC装置的电化学特征的变化,研究了菌群中希瓦氏菌与其他菌的相互作用;利用real time PCR技术对MtrA、MtrB、MtrC、OmcA等与希瓦氏菌MR-1产电代谢通路有关的基因进行了相对定量分析,研究了阳极室内双菌株共培养和菌群共培养过程中希瓦氏菌产电通路的变化规律。
  我们对每个MFC装置至少经过3个工作周期的观测和记录,绘制不同体系下MFC装置的极化曲线、循环伏安曲线(C-V曲线)、开路电压曲线、功率密度曲线等,根据获得的数据对不同体系下MFC装置的内阻、电容量、开路电压、工作功率密度、最大理论产电效率、库伦效率等电化学数据进行表征。数据证明,混合菌培养确实能够提高产电效率,优化MFC体系的电化学性能。同时,混合菌培养有助于MFC装置内阻的降低和库伦效率的提高。
  我们在希瓦氏菌MR-1 MFC装置的阳极电极上监测到了MtrA、MtrB、MtrC、OmcA基因随着培养时间增长,表达量均有不同程度的提高,这说明这些基因与MFC装置中希瓦氏菌的电子代谢通路有关;在双菌株共培养MFC体系中,OmcA基因的相对表达量有了显著的提高,这可能是双菌培养在电子从胞外转移到电子受体的过程起到了一定作用;而在加入柠檬酸铁的菌群共培养MFC体系中,MtrA、MtrB、MtrC基因的相对表达量均有显著的提高,一方面,这说明了铁氧化物和MtrA、MtrB、MtrC基因的表达密切相关,另一方面,这说明多培养MFC体系中希瓦氏菌的电子代谢通路确实发生了变化,这些变化正向促进了希瓦氏菌在MFC体系中的电子传递,从而对混合菌株在土环境中的电子传递造成了影响。
[硕士论文] 王凯
微生物学 兰州交通大学 2016(学位年度)
摘要:植酸酶是一类催化植酸盐水解为无机磷酸盐和肌醇的酶类,作为一种新型饲料添加剂,在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。在单胃动物饲料中加入微生物源植酸酶不仅能有效提高磷的利用率,降低磷对环境污染,而且可解除植酸对饲料中营养因子螯合作用,提升饲料的营养价值,因而在国内外受到广泛关注。
  本研究对青藏高原地区土壤中产植酸酶微生物进行分离筛选,诱变选育,获得高产植酸酶菌株,并对其产植酸酶的性质进行了研究,取得了如下主要研究结果。
  1、从青藏高原土壤中共分离得到18株产植酸酶菌株,分别来自三种不同的生境,其中柴达木盆地灌丛沙丘根际分离得到10株(占55.5%),青藏高原沙化草原分离得到3株(占16.7%),青藏高原铁路沿线5株(27.8%),其它沙化地且植被较少的取样地未分离得到植酸降解菌。
  通过16s/18s rRNA基因序列分析方法对18株菌进行鉴定,其中Erwinia persicina AT1-1, Fusarium tricinctum BLH-2,Talaromyces pinophilus NMH2-1-1,Cladosporium cladosporioides NMH3-3-2菌株是首次发现植酸降解菌。对18株菌酶活的研究发现Penicillium glabrum NMH2-3-1产植酸酶活性最高(2695.3U/mL)。
  2、在28℃、160r/min条件下对菌株Penicillium glabrum NMH2-3-1进行摇瓶培养,培养6d后,对所产植酸酶进行了纯化和酶学性质研究,结果表明该酶在pH4.0~8.0和20~60℃性质稳定,最适反应温度为55℃,60℃保温1h,酶活保持在75%,具有较好的热稳定性。Mn2+、Cu2+、Al3+对该酶活具显著抑制作用,Ca2+、Mg2+显著提高该酶的活性。该酶具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力。
  3、对Penicillium glabrum strain NMH2-3-1进行了紫外线诱变选育,得到4株高产植酸酶的菌株,分别命名为P.glabrum U1、P.glabrum U2、P.glabrum U3、P.glabrum U4,其中P.glabrum U3产植酸酶酶活最高,达到3611.3U/mL,较出发菌株提高34%。通过甲基磺酸乙酯(EMS)对P.glabrum U3株菌进行再次诱变,通过复筛,最终得到4株高产菌株,其中P.glabrum E1酶活比P.glabrum U3提高8.9%,达到4014.9U/mL,较原始出发菌株提高了近49%。对P.glabrum E1连续传代培养,产酶性能基本稳定。
  4、通过Plackett-Burman实验设计对发酵条件进行优化。结果表明,培养液中NH4NO3、MnSO4、FeSO4的浓度是影响植酸酶酶活的显著因素。利用Box-Behnken设计进行了3因子优化设计,优化得到的培养基组成及发酵条件为:淀粉1.5%、NH4NO30.375%、MgSO4·7H2O0.05%、KCl0.05%、MnSO40.008%、FeSO40.0078%,pH6.0,接种量2%,30℃,摇床转速160r/min。酶活达4197.15U/mL,较优化前菌株,植酸酶酶活提高了4.9%。
  5、在37℃条件下,用P.glabrum E1产植酸酶粗提液对麸皮、豆粕、棉粕、玉米粉四种饲料原料植酸磷降解率进行了测定,结果表明,4种原料的植酸磷含量分别为69.64%、62.82%、61.24%、44.00%,加入酶液3h后,该植酸酶粗提液对4种饲料原料中植酸磷降解率分别为47.08%、59.95%、62.48%、65.74%,表明该植酸酶对四种原料中的麸皮植酸磷降解效率最好,然后依次是豆粕>棉粕>玉米粉,对麸皮的降解率要分别比豆粕、棉粕、玉米粉高出8.82%、4.96%、28.38%。
[硕士论文] 徐华
生物工程 湘潭大学 2016(学位年度)
摘要:为了在提高微藻生物量的同时促进藻细胞油脂积累,从而最终提高油脂产量,本研究考察了异养-稀释-光诱导模式下小球藻细胞生物量和油脂含量变化规律,并对其藻细胞内油脂富集调控机制进行了探索。其研究结果如下:
  (1)在异养培养阶段,小球藻生长优势显著,其最高生物量达12.28±0.06g/L,且胞内组分叶绿素、淀粉及蛋白质等含量也较低,分别为细胞干重的1.18%,6.92%,31.20%,而油脂含量仅为细胞干重的15.08%,不饱和脂肪酸(UFAs)所占比例达到82.47%;收集高密度藻细胞进行1:6稀释后进入光诱导阶段。在光诱导12 h内,生物量呈下降趋势,由12.28g/L降至9.05g/L,而淀粉、叶绿素及蛋白质的含量积累显著,分别由细胞干重的31.20%增至42.25%,1.18%增至3.80%,31.20%增至35.17%,尤其淀粉含量比异养培养末期增长了6.11倍,而油脂积累效果并不显著。进入光诱导48h时后,生物量降至6.23±0.11g/L,淀粉、叶绿素及蛋白质的含量急剧下降,而油脂含量得到大量富集,达到细胞干重的50.50%,油脂产率达到623 mg/L/d,在脂肪酸成分方面,UFAs的比例下降至52.44%,其中主要的不饱和脂肪酸(占总脂肪酸的28%)是被认为制生物柴油主要原料的十八烯酸,除此之外,光诱导阶段后棕榈酸大量合成,从5.85%增至34.30%,最终导致饱和脂肪酸(SFA)所占比例上升,因此,本研究中16碳和18碳的脂肪酸所占比例超过90%。
  (2)应用蛋白质组学对异养-稀释-光诱导模式下藻细胞内油脂合成的调控机制进行考察发现,胞内38个蛋白质显示差异表达,其中,24个表达下调蛋白质,14个表达上调蛋白质,分别参与到11个类别的代谢过程。光合作用相关的叶绿素a/b绑定蛋白下调及叶绿素含量降低,证实高光诱导对藻细胞产生了光损伤作用;核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的下调表明RuBisCO并不是油脂积累所需高能量分子合成途径调控的主要贡献者,油脂合成中间物可能来自于能量物质(叶绿素、蛋白质及淀粉)的分解代谢产物,因此导致此类能量物质含量的急剧下降;与ATP合成相关的9个下调蛋白质中有7个隶属于ATP合成酶家族,其中包括3个定位于叶绿体ATP合成酶的蛋白质,由于ATP合成酶是胞内能量交换的关键酶,因此该酶的下调会导致胞内能量供应不足,致使小球藻生物量及胞内能量物质(叶绿素、蛋白质及淀粉)积累的下降;果糖-1,6-二磷酸-醛缩酶(FBA)和葡萄糖-1-磷酸转移酶(SAT)的上调驱动碳流进入糖酵解途径,为油脂合成积累提供了重要的前驱物(如丙酮酸和乙酰CoA);参与到TCA循环中的琥珀酸脱氢酶(SQR)和苹果酸脱氢酶(MDH)的上调预示着在光诱导条件下TCA循环作用的加强和大量FADH2的积累,而FADH2进入氧化磷酸化途径生成大量ATP为油脂合成积累提供所需能量;脂肪酸β-氧化过程中,作为关键酶之一的乙酰CoA脱氢酶的下调预示着脂肪酸β-氧化的弱化和脂肪酸合成的增加;60s核糖体蛋白L5发生下调,致使内质网合成蛋白质的功能下降,而蛋白质作为生命活动的执行者,这可能会直接抑制细胞的生长和增殖,最终导致光诱导后微藻生物量下降;除此之外,还有参与到防御机制中的热休克蛋白70的上调对维持细胞内代谢平衡有着重要的意义,为藻细胞富集油脂提供了一个相对稳定的环境。
[硕士论文] 谢长校
环境工程 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物,同时也是自然界最丰富的芳香族化合物,其分解与陆地上碳循环密切相关。提取木质纤维素中的纤维素使其转化成乙醇,是生产第二代生物质能源的关键步骤。但是由于木质素是一种非常稳定的化合物,难以降解是实现生物乙醇转化的主要屏障,因此关于木质素的微生物降解研究具有非常重要的意义。此外,木质素是自然界中含量第二丰富的生物质,主要来源于纤维素乙醇和制浆造纸工业中的副产物或者农林废弃物,如果能对木质素的生物降解过程进行有效的控制,那么木质素具有生产芳香族化工原料的潜力。真菌降解木质素的研究已经深入的进行了多年,并取得丰富的成果,但是仍然未开发出一种能商业化应用的木质素生物转化技术,而关于细菌降解木质素的研究还处在初级阶段。由于丰富的生物多样性和良好的环境适应能力,细菌在木质素降解方面深受研究人员的关注,越来越多研究表明细菌在木质素的生物降解过程中起到重要的作用。
  本论文从实验室保藏的细菌中筛选到能够利用木质素为唯一碳源生长的菌株Bacillus ligniniphilus L1,表明其具有降解木质素的潜力。为了进一步确定Bacillus ligniniphilus L1降解木质素的能力及其在木质素生物转化过程中的应用前景,对其降解木质素特性、代谢产物及木质素降解基因进行了系统的研究。主要研究成果如下:
  1.以木质素为唯一碳源培养Bacillus ligniniphilus L1,发现该菌在碱性条件下的生长态势较好。在pH9的木质素培养基中,7天内使培养液色度下降了30%。Bacillus ligniniphilus L1通过分泌木质素降解酶修饰/降解木质素,其分泌的漆酶和锰过氧化物酶活性分别达到147U/L和273.6U/L。综合数据表明,Bacillus ligniniphilus L1具有降解木质素的潜力。
  2.通过GC-MS分析Bacillus ligniniphilus L1降解木质素过程产生的代谢产物,发现有多种苯化合物,由此推断Bacillus ligniniphilus L1首先将木质素大分子解聚成小分子苯化合物,然后进一步将小分子苯化合物降解直至进入三羧酸循环。在Bacillus ligniniphilus L1的木质素降解产物中,有许多具有工业价值的苯化合物(如香草醛)。
  3.分别以葡萄糖培养基和木质素培养基培养Bacillus ligniniphilus L1,提取总RNA进行转录组测序。对测序结果进行生物信息学分析发现,以木质素为碳源培养Bacillus ligniniphilus L1时,差异表达的基因共有1689个,其中上调表达的基因为1168个,下调表达表达的基因为521个。对差异表的基因进行GO功能分析,发现有254个基因归入细胞组分,860个基因归入生物学过程,1221个基因归入分子功能。对差异表达的基因进行pathway富集分析,发现参与Metabolism通路的基因最多。
  4.对Bacillus ligniniphilus L1的转录组测序序列分析,发现其含有丰富的编码木质素降解酶的基因,包括攻击木质素主体结构的漆酶和过氧化物酶的编码基因以及使苯环开环的原儿茶酸-2,3-双加氧酶、儿茶酚-2,3-双加氧酶等蛋白的编码基因。对Bacillus ligniniphilus L1降解木质素的代谢途径作初步推断,发现Bacillus ligniniphilus L1可能通过儿茶酚间位裂解途径和原儿茶酸开环途径降解木质素。
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