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[硕士论文] 刘倩倩
病原生物学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  调查扬州6个地区白纹伊蚊感染Wolbachia的规律,分析扬州6个地区的白纹伊蚊线粒体DNA COI基因遗传多样性,初步探究内共生菌Wolbachia对白纹伊蚊线粒体DNA COI基因多样性的影响,为将来基于Wolbachia特性对蚊媒及蚊媒病的控制奠定基础。
  方法:
  1.2017年7月-10月,采集扬州6个地区的白纹伊蚊,提取单只蚊虫的DNA,利用Wolbachia wsp基因的通用型和分型引物分别进行PCR扩增,统计阳性样本的数量,分析其感染规律。
  2.利用线粒体DNA COI基因特异性引物对蚊虫DNA样本进行PCR反应,PCR产物经测序仪测序后,通过DnaSP5.1软件分析COI基因的遗传多样性。
  3.利用生物信息学分析方法,对感染Wolbachia和不感染Wolbachha的白纹伊蚊种群的线粒体DNA多样性进行分析比较。
  结果:
  利用Wolbachia wsp基因的通用型引物进行PCR扩增的结果显示,扬州市6个不同地区的白纹伊蚊种群的感染频率在27.5%~67.5%之间;利用A大组和B大组的特异性引物的检测结果为:只感染A组的频率为0~22.5%,只感染B组的频率为5%~17.5%,共同感染A和B的频率为0~35%。
  对白纹伊蚊COI基因进行PCR扩增,测序所获得的序列用MEGA6.0分析的结果为:A+T含量为67.93%,C+G含量为32.07%,核苷酸多样性(Pi)为0.28190,单倍型多样性(Hd)为0.933。
  基于COI基因序列构建的进化树表明,邗江区、江都区采样点的白纹伊蚊聚成一小分支后又与广陵区和仪征区聚成一类,高邮市与宝应县采集点的白纹伊蚊单独聚为一支,该结果说明扬州不同的白纹伊蚊种群之间存在一定水平的基因交流。
  除了广陵区种群以外,其他5个种群中不感染Wolbachia的白纹伊蚊线粒体COI基因的单倍型多样性数(Hd)、核苷酸多样性数(Pi)和核苷酸平均差异数(K)均比感染Wolbachia的要高。
  结论:
  1.扬州市白纹伊蚊种群体内感染Wolbachia表现出多样性,有Wolbachia双重感染现象。
  2.扬州6个白纹伊蚊种群的线粒体DNA COI基因有一定水平的交流。
  3.感染Wolbachia的白纹伊蚊种群的线粒体DNA COI基因核苷酸多样性和单倍型多样性均低于不感染Wolbachia的白纹伊蚊种群,Wolbachia对寄主的线粒体DNA的多样性具有一定的影响。
[硕士论文] 柴苗
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:瘿蜂科隶属于膜翅目(Hymenoptera)瘿蜂总科(Cynipoidea),是该总科中唯一植食性常见农林类害虫。随着线粒体基因组序列在系统发育研究中的广泛应用,使得通过线粒体基因组探究物种在不同分类阶元的系统发育关系成为可能。截止目前为止,NCBI中已经积累了113种膜翅目昆虫全线粒体基因组,主要集中于茧蜂、蜜蜂、姬蜂和叶蜂等个体较大的蜂类。由于瘿蜂科昆虫个体非常小,大多数个体均小于3mm,体长范围位于1-10mm,因此瘿蜂总科仅有1种枝跗瘿蜂Ibalia leucospoides(NCBI登录号:KJ814197)获取了全线粒体基因组。瘿蜂科所属细蜂类内部系统发育关系不明确,瘿蜂科的进化地位也存在争议。
  本研究采用二代测序Illumina HiSeq平台,对膜翅目瘿蜂总科瘿蜂科纹瘿蜂属黄纹瘿蜂Andricus flavus和Andricus sp.nov.、客瘿蜂属Synergus castaneus和栗瘿蜂属Dryocosmus kuriphilus四种瘿蜂昆虫线粒体进行了线粒体基因组序列测定,并进行了组装、注释和分析。利用比较基因组学与生物信息学结合的方法分析瘿蜂科线粒体基因组的特征,对瘿蜂科线粒体基因排列顺序与祖先昆虫进行了对比和说明。计算Ka、Ks、Ka/Ks比较瘿蜂科昆虫基因在进化中是否受选择压力。通过下载NCBI数据库中已收录的膜翅目细腰亚目细蜂类12种昆虫的线粒体基因组,基于线粒体13个蛋白质编码基因数据集,采用最大似然法(Maximum Likelihood)和贝叶斯算法(Bayesian)对细蜂类构建系统发育关系,对系统树结果进行合理分析。主要研究结果如下:
  1、通过高通量测序技术测得Andricus flavus、Andricus sp.nov.、Synergus castaneus和Dryocosmus kuriphilus的线粒体基因组。黄纹瘿蜂共获得11个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,12个tRNA基因;Andricus sp.nov.共获得12个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,10个tRNA基因;Synergus castaneus共获得13个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,21个tRNA基因;Dryocosmus kuriphilus共获得12个蛋白质编码基因,1个rRNA基因,16个tRNA基因。
  2、Andricus flavus、Andricus sp.nov.、Synergus castaneus和Dryocosmus kuriphilus基因组在碱基组成上均具有AT偏向性,A+T含量远高于G+C含量,通过计算AT和CG偏斜值发现,不同类型基因中碱基使用偏好性不同。此外,第三位密码子处A+T含量高于其他两个位点。所有蛋白质编码基因起始密码子均为ATN,包括ATA、ATT、ATC、ATG,ATT使用频率最高,以TAA或不完整的TA或T为终止密码子。大多数tRNA二级结构呈现典型的三叶草型,存在多处常见的G-U错配。使用次数最多的密码子为UUA(Leu1),密码子第三位为A或U的密码子相对同义密码子RSCU值均大于1。
  3、瘿蜂科线粒体基因排列顺序与祖先昆虫的排列顺序不同,多个基因发生了位置变化和方向变化,存在基因重排现象。
  4、通过计算四种瘿蜂蛋白质编码基因的Ka、Ks、Ka/Ks值,发现瘿蜂科昆虫在进化中受到纯化作用。
  5、采用12种细蜂类昆虫和本实验测得的四种瘿蜂昆虫线粒体基因的13个蛋白质编码基因核苷酸序列为数据集,用最大似然法和贝叶斯法分别构建系统发育树,综合分析可知:细蜂类在总科水平分类关系不明确,科内分类关系稳定。
[硕士论文] 蔡睿
自然地理学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:本研究以延吉市为例,沿城市生境梯度设置一条样带,从人为干扰较小的天然林绿地,沿生境梯度一直到人为干扰最强烈的城市中心金达莱公园绿地和文化宫公园绿地,共选取4个研究断面,6种生境类型,进行蝴蝶采样调查。其中,断面1选择延吉市生态核心的帽儿山天然次生林绿地1种生境类型;断面2选择帽儿山天然林与农耕荒野过渡区1种生境类型;断面3选择城市内部残留布尔哈通河上游天然荒草地生境和延吉市开发区荒草地2种生境类型;断面4选择城市建成区工人文化宫人工草地和金达莱公园人工次生林绿地2种生境类型进行调查研究。
  统计结果分析表明:获得蝴蝶总数为891只,隶属于3科25种,菜粉蝶(P.rapae)、豆粉蝶(C.fieldii)、蓝灰蝶(E.argiades)为研究区域的优势种,是最适应城市化环境的蝴蝶。其中菜粉蝶、蓝灰蝶是四个断面蝴蝶群落的共有种,其对生境的要求相对宽松、生态幅较宽,同时菜粉蝶和蓝灰蝶还是每年最早出现的蝴蝶。4个断面蝴蝶群落多样性指数为:断面1>断面2>断面断面3>断面4,断面1和断面2是一年中出现蝴蝶最早的两个断面,多样性指数一般在7、8月份出现极大值。随着生境质量的下降,蝴蝶群落多样性指数基本呈降低趋势。断面1除蝴蝶多样性指数最高外,还拥有四个断面中最多的物种数量;断面4多样性指数最低且无特有种分布。
  研究结果表明:天然林绿地蝴蝶多样性指数最高,是城市化环境下重点保护的生境类型绿地。同时,城市内部的金达莱公园绿地、文化宫公园绿地维持了一定的蝴蝶多样性,也应纳入城市生境保护的范围。城市化进程中导致的生境破碎化、环境污染和道路修建等都对城市中的蝴蝶数量和种类产生不利影响,对城市蝴蝶多样性保护迫在眉睫,保护的关键在于对蝴蝶生境的保护和建设,可根据蝴蝶的取食、访花、体温调节和领域行为等习性对生境的需求,针对性地进行生境网络建设和生境再造。
[硕士论文] 刘馨桧
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:亮斑扁角水虻(Hermetia illucens)因幼虫可以高效转化有机废弃物,且幼虫和预蛹的蛋白质和脂类含量高,是一种重要的昆虫资源。生产实践中促进成虫大量繁殖的技术尚未解决,阻碍了亮斑扁角水虻产业化发展的进程。因此本文研究了不同人工光源对其生殖的影响,检测了雌雄成虫身体各部位的反射光谱,测定了这些部位被涂布后对生殖的影响,鉴定了感光的视蛋白基因,以揭示视觉系统对亮斑扁角水虻生殖的调控作用,并为亮斑扁角水虻大量繁殖用人工光源的研发奠定基础。主要结果如下:
  1.不同光源对亮斑扁角水虻生殖的影响
  六种光源(375nm、420nm、465nm、505nm、600nm、645nm)处理下,除645nm光源外雌虫的产卵率都超过了60%,但不同光源间没有显著差异,645nm光源下雌虫产卵率显著低于其他处理组,所有处理中最高的卵孵化率也仅11%。
  2.雌雄成虫身体各部分的反射光谱不同
  雄虫的胸部背面、雌虫腹部腹面的前段和中段与对应的异性个体的相对反射率相差较大;且涂布后,雌虫产卵率和卵孵化率均有差异,涂布雌虫腹部腹面影响最大。复眼被涂布后,产卵率和卵孵化率均显著低于对照,且雄虫复眼被涂布后影响最大。
  3.新光源对亮斑扁角水虻生殖的影响
  发明了一种可以促进亮斑扁角水虻交配产卵的新光源,在室内仅提供该光源时,亮斑扁角水虻的雌虫产卵率可达80%,卵孵化率最高可达96.31%。
  4.视蛋白基因的鉴定
  从转录组数据库鉴定出7个视蛋白基因,4个为长波长视蛋白,1个为蓝色光敏感视蛋白,2个为紫外光敏感视蛋白。选取3个视蛋白基因进行了RNAi实验,但干扰效果较差。
  本研究明确了亮斑扁角水虻雌雄成虫身体各部位的反射光谱,结合不同光源对其生殖的影响,发明了一种可促进其成虫交配活动的新光源。研究结果对亮斑扁角水虻生产中成虫大量繁殖技术的解决具有重要意义。
[硕士论文] 周贵平
农业推广 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:由于多年来疏于对温江机场昆虫的防治,导致温江机场昆虫的大量发生,招引大量鸟类取食,直接或间接影响了飞行安全,对人的生命安全构成很大威胁。为减少机场环境鸟类的活动,防止鸟撞事故的发生,2016年4月-11月对成都温江机场范围内的昆虫种类和数量进行了系统调查及多样性分析,并对温江机场主要昆虫金龟子、蝉以及直翅目昆虫展开了药剂防治试验。主要结果如下:(1)温江机场及周边共10目57科104种昆虫,优势昆虫种类为金龟子类以及鳞翅目蛾类,其中优势种昆虫为华胸突鳃金龟。温江机场昆虫发生高峰期在6月中旬-7月下旬。(2)安装7盏不同波长的太阳能杀虫灯对机场昆虫进行诱杀结果表明,对金龟子及鳞翅目昆虫诱杀效果最好的分别为为波长375nm及波长405nm的杀虫灯。(3)6月中旬到9月上旬,采用5种不同比例配方的糖醋酒液对草坪昆虫进行诱杀结果表明,糖醋酒水比例为3∶1∶3∶10的糖醋酒液诱杀到的昆虫较多,但相对温江机场庞大的昆虫数量来说较少,不适用于温江机场害虫防治。(4)2016年4月,利用撒施和喷雾的方法,开展了5种农药对草坪蛴螬的田间药效评价得出,5%毒死蜱颗粒剂与3%辛硫磷颗粒剂对草坪蛴螬防效最好,与其它几种差异达到极显著水平,防效分别为92.57%和93.37%。(5)2016年9月,利用喷雾的方法,开展了5种农药对直翅目昆虫的田间药效评价得出,4.5%高效氯氰菊酯乳油在药后1天、3天及7天的防效都极显著高于其它几种药剂,表现了较好的速效性和持效性。(6)2016年6月21日-9月1日,利用5%毒死蜱颗粒剂、40%毒死蜱悬浮剂、40%杀扑磷悬浮剂并采用遮阳网罩土及树干绑粘虫板的方法展开对蝉的防治试验,结果得出,温江机场范围蝉的寄主植物为柳树、桑树、香樟、枇杷,其中以柳树为主。用于药效试验的3种杀虫剂中40%杀扑磷悬浮剂对蝉的防效最好,达到76.34%。(7)集成了一套针对温江机场的以灯光诱杀和药剂防治相结合的害虫防治技术。
[硕士论文] 滕悦
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:本文对内蒙古锡林郭勒退化典型草原围封样地——1983年围封禁牧区域(A样地)、1996年围封禁牧区域(B样地)和未围封的自由放牧区(C样地)的访花昆虫群落组成,多样性及时序变化、访花频率、访花行为及其影响因素进行了研究。结果表明:(1)在3个样地共采集到访花昆虫成虫标本2131头,隶属7目71科,共183种;其中,A样地有7目60科154种1133头,B样地有6目59科158种847头,C样地有3目13科21种151头;A样地访花昆虫的数量最多,B样地访花昆虫的种类最多,C样地访花昆虫的种类与数量均最少;
  (2)B样地7月份的访花昆虫Shannon多样性指数(3.12)、Pielou均匀度指数(0.86)和Margalef丰富度指数(7.16)均最高;C样地6月份的访花昆虫Berger-Parker优势度指数(0.15)最高。访花昆虫的Shannon多样性指数与Pielou均匀度指数随月份的变化趋势一致,而与Berger-Parker优势度指数相反;
  (3)通过Jaccard群落相似性系数计算可知,A样地与B样地的访花昆虫Jaccard群落相似性系数(0.25)最高;A样地与C样地的访花昆虫群落相似性系数(0.16)最低;
  (4)不同样地各月份主要开花植物的优势传粉昆虫不同,访花频率也不同。优势传粉昆虫的访花频率与驻留时间成反比。风速、温度、湿度以及光照强度都会影响访花昆虫的访花频率及驻留时间。
[硕士论文] 林子琦
生态学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:锹甲属(Lucanus Scopoli,1763)作为鞘翅目(Coleoptera)锹甲科(Lucanidae)的模式属,是锹甲科中极具代表性的一支。目前世界范围内已知约110种(含亚种),绝大多数分布在东洋界,仅有少数种分布于新北界和古北界。该属锹甲具有显著的雌雄二型和雄性多型现象,雄性的上颚尤其发达,自达尔文时代就是研究物种的形成与分化、性选择机制及表型演化的良好素材。正是由于该属的形态复杂,基于形态学数据的亚属、种团、亚种的系统发育关系、物种界定问题较为突出,还缺少从分子系统学角度来探讨和解决这些问题。本研究选取锹甲属的62个代表种(含亚种)及代表疑难种团(斑股锹甲种团L.maculifemoratus complex)的44个个体作为研究对象,以3个线粒体基因(COI、16SrDNA、Cytb)和3个核基因(Wingless、ITS2、EF-1α)为分子标记,对位点,碱基含量等进行了统计,基于分子系统学的方法和技术重建了该属的系统发育,估测了属的分化时间,相关结论如下:
  (1)通过总DNA提取、PCR扩增及测序后,所获得的基因数据有:COI基因序列123条、16S rDNA基因序列131条、Cytb基因序列84条,Wingless基因序列111条、EF-1α基因序列100条,ITS基因序列101条。
  (2)属水平的的系统发育分析显示:三个亚属Lucanus(Lucanus)Scopoli、Lucanus(Pseudolucanus)Hope&Westwood,Lucanus(Eolucanus)Kurosowa及凸锹甲属Noesolucanus Araya形成了一个单系。其中,L.(Lucanus)、L.(Eolucanus)、Noesolucanus的代表种分别聚为一支,各自呈显著的单系性;L.(Eolucanus)与Noesolucanus是姐妹群关系;L.(Pseudolucanus)则不是单系,其模式种L.P.)capreolus及另外5个代表种与L.(Lucanus)亚属的种呈镶嵌分布。但因该亚属的样本量有限,建议仍将其作为一个有效亚属,其分类地位还需进一步研究;而L.(Lucanus)、L.(Eolucanus)二者间的遗传距离均接近于属间的平均遗传距离,进一步支持了它们的单系性,且支持将它们提升到独立属的分类地位。
  (3)利用ABGD,GMYC和PTP3种方法对疑难种团斑股锹甲(L.maculifemoratus complex)中涉及的4个物种的44个个体进行了物种界定。其中,ABGD方法存在物种的严重过分,几乎每个地理种群都界定为一个种;PTP仅在L.m.boileaui的地理种群中存在轻度过分现象;而GMYC的界定结果则对不同地理种群进行了合理的划分。4个物种两两之间的遗传距离为0.068-0.163,低于锹甲属内种间的平均遗传距离,无法达到种的水平。
  综合3种方法及遗传距离的比较,建议它们之间为亚种关系,分别是:斑股锹甲指名亚种L.maculifemoratus maculifemoratus、斑股锹甲华北亚种L.maculifemoratus dybowskyi、斑股锹甲台湾亚种L.maculifemoratus taiwanus和斑股锹甲西南亚种L.maculifemoratus boileaui。此外,在日本分布的1个亚种L.m.adachii与指名亚种L.m.maculifemoratus的遗传距离仅有0.020,且二者在外部形态和生殖器的解剖结构上也极为相似,也没有显著的地理隔离,可以将L.m.adachii视为指名亚种L.m.maculifemoratus的异名。
  (4)基于Beast分析的分化时间显示((Lucanus+Eolucanus)+Pseudolucanus)+Noseolucanus与其他锹甲发生分歧的时间约在始新世早期(46.66Mya,95%置信区间:36.81~63.1Mya)。其中,Noseolucanus和Pseudolucanus首先分化出来,位于树的根部,较为原始。Eolucanus约在渐新世早期(36.34Mya)分化出来,并在33.08Mya(95%置信区间:16.44~39.45Mya)形成独立的一支。狭义的Lucanus在约35.75Mya(95%置信区间:33.76~37.68Mya)形成,而斑股锹甲种团的分化时间约为15.09Mya(95%置信区间:7.22~23.8Mya)。
[硕士论文] 李梦雅
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:亮斑扁角水虻Hermetia illucens是重要的腐食性昆虫之一,被广泛应用于分解禽畜粪便。兽用抗生素的过量使用,使禽畜粪便中残留有大量的抗生素。其中磺胺类抗生素是使用最广泛的抗生素之一,在禽畜粪便中暴露水平也最高。本研究旨在探讨磺胺类抗生素对亮斑扁角水虻的生发发育及生理的影响,以期为利用昆虫转化畜禽粪便并降低其抗生素污染提供科学依据。主要结果如下:
  1磺胺类抗生素对亮斑扁角水虻生长发育的影响
  磺胺浓度为100、1000μg/kg浓度时,幼虫的历期、存活率、预蛹重,蛹的历期、化蛹率、羽化率和蛹重均没有显著影响,但10000μg/kg时,幼虫的历期变长、存活率降低,预蛹重和蛹重增加,化蛹率降低,但蛹的历期和羽化率未受到显著影响。低龄幼虫体重受磺胺影响显著,并且浓度越高,体重越轻;随着幼虫日龄的增加,磺胺对体重的影响逐渐降低,至11日时不再有显著影响。
  2磺胺类抗生素对亮斑扁角水虻抗氧化酶酶活力的影响
  磺胺浓度为1000、10000μg/kg时,幼虫总抗氧化能力随日龄的增加而上升,到11日龄后与对照差异不显著。7日龄幼虫的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶的酶活力均受到显著影响,并且浓度越高抑制作用越强,到9日龄与11日龄时,与对照差异不显著。
  3亮斑扁角水虻的肠道pH及磺胺类抗性基因sulⅠsulⅡ、dfrA1的影响
  幼虫中肠呈现明显的酸性区段和碱性区段,可能与肠道消化吸收密切相关。不同浓度磺胺对幼虫各个发育阶段的肠道整体pH范围无影响,但会使肠道发育延迟,并且浓度越高延迟越久。磺胺浓度为100、1000μg/kg时,各日龄幼虫肠道的AGRs表达水平未受到显著影响;10000μg/kg时,不同日龄幼虫肠道的AGRs的表达水平呈现不同的特点,7日龄时sulⅠ、sulⅡ的表达增加,11日龄时AGRs的表达均降低。
  综上所述,亮斑扁角水虻幼虫能耐受一定浓度的磺胺类抗生素,且日龄越高的幼虫耐受力越强,抗氧化酶系及磺胺类抗性基因在亮斑扁角水虻响应抗生素胁迫中发挥了作用。
[硕士论文] 周琳
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫细胞培养对昆虫细胞-杆状病毒生物技术的应用以及对医学、农业、及生物学的各个领域的发展都起着重要作用。本文以鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)的棉铃虫(Helicoverpa armigera)卵为实验材料,建立了一个新的棉铃虫胚胎细胞系。本实验主要从棉铃虫胚胎细胞系的建立、培养、生物学特性以及昆虫细胞系利用等方面进行了研究。新棉铃虫胚胎细胞系的建立不但为离体条件下进行相关的分子生物学等实验研究提供了潜在材料,也为昆虫细胞系的培养等相关研究奠定了一定的基础。主要的研究结果如下:
  1.棉铃虫胚胎细胞系Ha168的建立
  使用含有10%的TNM-FH培养基对棉铃虫胚胎细胞体外培养,历时将近两年的培养,最终建立了一个生物学特性稳定且生长良好且可以稳定传代的细胞系,命名为Ha168。
  2.棉铃虫胚胎细胞系Ha168的鉴定
  (1)细胞形态特征:Ha168细胞系为贴壁生长型细胞,以圆形,梭形细胞为主,还有少量的巨型细胞,其中圆形细胞约占77%,大小为14.30±2.804μm,n=100;梭形细胞约占20%,大小为12.04±2.928×47.09±12.674μm,n=100。
  (2)细胞系来源的分子鉴定:对比Sf9细胞、棉铃虫卵与Ha168细胞系的细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)序列,结果表明:Ha168细胞与棉铃虫卵COI基因序列相似度为100%,与Sf9细胞的COI基因序列比对相似度仅为91%。
  DAF(DNA Amplification Fingerprinting)与RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)的扩增谱带中Ha168与棉铃虫卵较为相似,与Sf9明显不同。
  以上结果均表明Ha168细胞系来源于棉铃虫组织。
  (3)细胞增殖动力学特性:绘制了Ha168细胞系的增长曲线,算出Ha168细胞系25代时的群体倍增时间为56.8h。
  (4)核型分析:通过对比发现0.7%KCL低渗溶液对观察Ha168细胞系效果最好,在1000倍光学显微镜下观察发现,棉铃虫胚胎细胞的染色体呈点状聚集于核区其结果呈正态分布,染色体数目分布区间为20~210,平均为71条。
  (5)冻存与复苏特性:对在液氮中冻存了6个月的Ha168细胞系进行复苏,观察发现其可以正常贴壁生长,说明此细胞系可以在液氮中长期保存。
  (6)支原体检测:PCR检测Ha168细胞系,结果为无支原体污染。
  3.EGFP在Ha168细胞系中的表达水平研究
  (1)Ha168细胞系对AcMNPV-EGFP的敏感性:用重组病毒AcMNPV-EGFP感染Ha168细胞系,Sf9细胞系作为对照,使用有限稀释法,测定Ha168、Sf9细胞系对AcMNPV-EGFP的半数组织培养感染剂量(Median Tissue Culture Infectious Dose,TCID50),结果为:Ha168细胞系的病毒侵染速度比Sf9细胞系慢,Ha168细胞系的TCID50为10-2.78,Sf9细胞系的TCID50为10-6.1,说明重组病毒AcMNPV-EGFP对Ha168细胞系的敏感性小于Sf9细胞系。
  (2)EGFP在Ha168细胞系中的表达水平:Ha168细胞系的蛋白表达量约为Sf9的7/10。
  综上所述,我们用棉铃虫卵建立了棉铃虫细胞系,并对其进行基础生物学测定,病毒敏感性,以及对外源蛋白表达水平的测定,有进一步的研究价值。
[硕士论文] 任维宾
昆虫生态学 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:瘿蚜是能够刺激植物组织增生并形成虫瘿的一类蚜虫,是致瘿昆虫的重要类群。瘿蚜大部分是农林害虫,但也有一些种类对寄主植物没有明显为害,如五倍子蚜虫。沃尔巴克氏体Wolbachia是昆虫体内普遍存在的一种重要的次级共生菌,其主要功能是调节宿主的生殖,包括诱导杀雄、雌性化、细胞质不亲和和孤雌生殖等,除此之外,还能增强宿主抗性、调控宿主的其它生命活动并影响其物种形成与进化。前人对蚜虫Wolbachia的研究主要集中在自由生活的蚜虫中,对于生活于封闭环境的瘿蚜研究较少,因此,研究瘿蚜Wolbachia的种类及系统发育关系,有助于深入理解Wolbachia在不同宿主间的分布及其亲缘关系,为进一步研究其功能及其与宿主的协同进化等提供参考。
  本研究选取Wolbachia的16S rRNA、groEL、 gltA等9个基因引物序列,对五倍子蚜、杨树瘿蚜和黄连木瘿蚜等9种瘿蚜共14个种群的Wolbachia感染情况进行检测,进一步对感染的Wolbachia进行特定基因测序,联合其他蚜虫的Wolbachia相同基因序列构建系统发育树,分析瘿蚜与其他蚜虫感染Wolbachia的株系差异和亲缘关系。主要结果如下:
  1、Wolbachia在瘿蚜中的感染率较低
  通过特定基因检测发现,9种瘿蚜的14个种群中,共有3种瘿蚜各1个种群感染了Wolbachia,分别为:肚倍蚜(Kaburagia rhusicola)昆明种群、角倍蚜(Schlechtendaliachinensis)峨眉种群和滇叶瘿绵蚜(Pemphigusyunnanensis)昆明种群,Wolbachia在这3种瘿蚜中的感染率分别为:66.7%、11.1%和11.1%。表明与其他昆虫相比,Wolbachia在上述9种瘿蚜中的感染并不普遍,感染率较低。
  2、瘿蚜Wolbachia特定基因的测序
  选择感染Wolbachia的瘿蚜种群,对特定基因进行扩增和测序,在六个基因中获得了相应的基因序列,其中肚倍蚜(K.rhusicola)昆明种群、角倍蚜(S.chinensis)峨眉种群和滇叶瘿绵蚜(P.yunnanensis)昆明种群的16S rRNA基因片段序列长度分别为1077bp、1061bp、1054bp(采用16S281F/1372R引物)和440bp、440bp、442bp(采用WspecF/WspecR),gatB和fbpA基因的片段长度分别为:497bp、492bp、497bp和476bp、479bp、480bp。另外,在滇叶瘿绵蚜(P.yunnanensis)昆明种群还分别获得了coxA、hcpA和ftsZ的基因片段长度,分别为:488bp、509bp和518bp。通过NCBI-Blast比对,2种五倍子蚜的特定基因序列与其他自由生活的蚜虫相似度较低,而滇叶瘿绵蚜的特定基因序列与其他自由生活的蚜虫、粉虱等相似度很高,暗示这2类瘿蚜感染的Wolbachia可能具有不同的起源。
  3、五倍子蚜与杨树瘿蚜感染的Wolbachia分别属于不同的株系
  利用Wolbachia的16S rRNA基因序列和多位点序列分型MLST(multilocus sequencetyping)方法,联合NCBI中已有的Wolbachia各超群代表株系进行同源性比对并构建系统发育树。结果表明,滇叶瘿绵蚜(P.yunnanensis)昆明种群感染的Wolbachia与其他自由生活蚜虫中的感染的B超群株系且亲缘关系很近,并同属于B超群。而肚倍蚜(Krhusicola)昆明种群和角倍蚜(S.chinensis)峨眉种群感染的Wolbachia与自由生活蚜虫中的感染的Wolbachia亲缘关系较远,推测其属于O超群。暗示五倍子蚜感染的Wolbachia与滇叶瘿绵蚜和其他自由生长的蚜虫感染的Wolbachia可能具有不同的起源。
  4、本研究在2种五倍子蚜检测到的Wolbachia感染并初步确定其属于O超群,且肚倍蚜系首次检测到Wolbachia感染。表明蚜虫感染的Wolbachia株系除了前人已经发现的A、B、M和N4个超群外,还存在着其他超群。
[硕士论文] 吴家园
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:黑水虻Hermetia illucens是一种重要的昆虫资源,其幼虫在有机废弃物处理方面的应用已越来越受到人们的关注。实际生产中由于幼虫历期长,为避免食物发霉或板结,常采取多次补充食物的方式,补充不及时幼虫易饥饿;另外,长途运输过程中未提供食物幼虫也易饥饿。目前,饥饿对黑水虻的影响尚未见报道。本研究主要探讨了黑水虻幼虫在饥饿条件下的生理响应,以期为黑水虻的产业化发展提供基础资料。主要研究结果如下:
  1.不同大小幼虫的耐饥力
  正常取食时,幼虫在4-5日龄时体重日增长率最高;7-9日龄体重增长量最大;13日龄体重最大;14日龄出现预蛹,预蛹的头部形态可以作为主要的辨别依据。半数死亡时间(LT50)和日龄及体重呈正相关。
  2.饥饿幼虫恢复取食后的生物学特点
  7日龄幼虫经过不同时长饥饿处理后再喂食,从第7d起,所有处理都出现预蛹。饥饿30d的处理达到50%预蛹的时间比各处理晚1d。饥饿幼虫复食后的预蛹率均显著高于对照。饥饿10-30d显著提高了预蛹重,其中饥饿15d的预蛹重最大。幼虫饥饿经历对成虫产卵量无显著影响。饥饿10d对卵的孵化率无显著影响;幼虫饥饿经历30d、40d显著降低了其成虫所产卵的孵化率。
  3.饥饿对幼虫生理的影响
  幼虫饥饿初期主要消耗脂肪,后期主要消耗蛋白。保护酶的总抗氧化能力和过氧化物酶在饥饿中的变化趋势很相近,超氧化物歧化酶活性在饥饿5d后就处于一个下降的趋势,过氧化氢酶活性变化较剧烈。
  4.饥饿不同时长的幼虫及其复食后预蛹的数字基因表达谱共获得38782个基因。饥饿5、15、30d的幼虫和饥饿0d相比分别获得6879、8975、10190个差异表达基因。其对应的复食后的预蛹,分别获得3271、3178、1534个差异表达基因。
  综上所述,本研究明确了不同大小幼虫都具有较强耐饥力,发现饥饿幼虫复食后预蛹产量得到显著增加,可为黑水虻生产提供借鉴;对黑水虻幼虫饥饿的生理变化的探索及差异基因表达谱的研究可为进一步研究黑水虻的耐饥力提供数据支持。
[硕士论文] 周媛
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大部分昆虫可在滞育诱导期感受光周期信号的变化从而进入滞育,而昆虫在滞育诱导期对光周期信号的分子响应尚不明确。二化螟Chilo suppressalis是一种重要的水稻害虫,受短光照诱导后可以幼虫形式进入滞育,幼虫3龄期是滞育诱导敏感期。本研究以滞育诱导光周期(LD12:12h)和非滞育诱导光周期(LD16:8h)下的二化螟幼虫为材料,采用了转录组测序、qRT-PCR、基因克隆等技术探究了二化螟滞育诱导期对光周期信号的分子响应,主要结果如下:
  1、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄
  光周期转换试验结果表明,25℃条件下,二化螟幼虫响应光周期信号的敏感日龄为9-12日龄(幼虫3龄时期)。
  2、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异表达基因
  将25℃下,LD12:12h和LD16:8h光周期下的二化螟10日龄幼虫进行比较转录组分析,共得差异表达基因1260个,在滞育诱导条件下上调基因664个,下调基因596个。结果分析表明,差异基因富集到显著富集在Cardiac muscle contraction和Parkinson's disease通路上,同时也富集在ECM-receptor interaction、Calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、Phototransduction-fly等与光信号转导相关的通路上。研究结果为进一探讨二化螟滞育诱导期光信号转导过程提供了基础。
  3、二化螟滞育诱导期光信号转导基因的克隆与表达模式
  对inaD、myosin-Ⅲb(属“Phototransduction-fly”通路),PKG(属“cGMP-PKG signaling pathway”通路)和CBP E63-1这4个光信号转导相关基因进行克隆和表达模式分析。结果表明PKG、myosin-Ⅲb可能在滞育诱导期对光周期信号进行转导;CBP E63-1、inaD可能主要在滞育诱导后期对光周期信号进行转导。结果说明这4个基因可能参与二化螟滞育诱导期响应光周期信号的调控。
  本研究明确了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄,获得了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异基因,分析了与光信号转导相关基因在二化螟滞育诱导期的表达模式。研究结果为明确二化螟滞育诱导期对光周期信号的响应机制奠定了基础,同时可为昆虫滞育诱导期光信号转导机制的研究提供参考。
[硕士论文] 孙丹
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫体内保幼激素(JH)对成虫生殖和滞育具有重要的调控作用,JH缺乏则会引发成虫的生殖滞育。昆虫体内JH含量受JH合成和JH降解共同调节。有证据表明JH合成途径介导的JH合成受阻,是导致成虫体内JH缺乏进而引发生殖滞育的重要原因。然而JH降解途径介导的JH降解加剧是否是导致成虫体内JH缺乏,从而引发生殖滞育的原因之一,尚不明确。JH降解途径中,主要有3类酶参与并完成降解JH的过程,分别为:保幼激素酯酶(JHE)、保幼激素环氧水解酶(JHEH)和保幼激素二醇激酶(JHDK)。前期研究表明,Kr-h1作为响应JH信号的指示基因,在大猿叶虫Colaphellus bowringi滞育准备期表达持续较低,暗示注定滞育成虫中JH信号缺乏。本研究以大猿叶虫为材料,研究JH降解酶基因在滞育准备中的功能,主要结果如下:
  1.大猿叶虫JH降解酶基因克隆及序列分析
  在大猿叶虫中克隆获得3个JHE(JHEJ,JHE2,JHE3)、1个JHEH及1个JHDK的cDNA序列。序列比对及进化树分析表明,JHEs、JHEH及JHDK均含有相应的JH降解酶可降解JH的保守活性基序,暗示这3种酶可能参与大猿叶虫中JH的降解。
  2.JH信号对大猿叶虫JH降解酶基因的表达调控
  JH降解酶基因在注定滞育与注定非滞育成虫中的表达模式分析结果表明,JHEs在注定滞育成虫中表达水平更低,JHEH和JHDK则在注定滞育成虫中表达水平更高,这暗示在JH信号缺乏的注定滞育成虫中,主要由JHEH和JHDK介导JH的降解,而非JHEs。干扰JH受体Met(Methoprene-tolerant)及外源施加JH类似物实验结果表明,JH信号会诱导JHEs的表达水平上调,抑制JHEH及JHDK的转录。因此推测,JH信号与JH降解酶基因的表达存在反馈调控,JH信号可能是注定滞育和注定非滞育成虫体内JHE,JHEH和JHDK表达差异产生的原因之一。
  3.JH降解酶基因在大猿叶虫滞育准备中的功能
  在注定滞育成虫中,干扰JHEH或JHDK后,Kr-h1表达水平上调,脂质积累及抗逆基因表达降低;同时,干扰JHEH后Vg1表达水平上调。无论干扰JHEH或JHDK均未能逆转注定生殖滞育成虫的滞育表型。
  综上所述,在大猿叶虫中,JHEH和JHDK介导的JH降解途径促进生殖滞育准备,但不决定滞育发生,结果为揭示昆虫生殖滞育发生的分子调控机制提供了线索。
[硕士论文] 张俊英
生物化学与分子生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫是地球上数量最多、分布最广的动物群落。昆虫的生长发育主要由保幼激素和蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮,20E)协同调控。在昆虫取食生长时期,虫体内保幼激素滴度高,而在昆虫蜕皮变态时期,保幼激素逐渐降低直至零,蜕皮激素滴度逐渐增加。两种激素存在相互作用,既拮抗又统一,协同调控昆虫的蜕皮与变态过程。研究已证明20E存在着经典的基因组信号通路,20E通过自由扩散,或在细胞膜受体介导下,跨越细胞膜进入细胞内,与核受体EcR结合起始基因的转录表达。近些年,科学研究陆续发现了20E的非基因组途径。例如胞内蛋白的快速磷酸化及移位,胞内钙离子动员等。也有研究发现G蛋白偶联受体(GPCR)参与蜕皮激素的非基因组信号途径,而不同的GPCR的作用机制各异。因此GPCR参与20E的非基因组信号通路的问题成为人们的关注热点。本实验室已证明ErGPCR1、ErGPCR2参与20E的非基因组信号通路。在果蝇中发现多巴胺受体(DmDopEcR)也可以结合20E的类似物[3H]PonA,但是多巴胺受体在20E信号通路中的作用机制尚不清楚。本论文以棉铃虫为实验材料开展了相关研究,探究DopEcR在20E信号通路中的作用及机制。
  结果发现DopEcR在棉铃虫幼虫的不同组织均有表达,包括表皮、中肠、脂肪体和脑,且在脑中的表达量最高,在蜕皮及变态期的脑和中肠中有升高的趋势。20E促进DopEcR的表达。DopEcR参与调控20E诱导的胞内钙离子水平的快速增加、基因表达及昆虫的变态过程。DopEcR定位于细胞膜,且20E诱导下不发生内吞。RNA干扰DopEcR后降低了20E与细胞膜的结合水平,过表达DopEcR后增加了20E与细胞膜的结合水平,纯化后的DopEcR能与20E发生结合,但是其结合位点突变体与20E的结合能力显著降低。我们的研究表明20E上调DopEcR的表达,DopEcR通过结合20E调控昆虫的变态发育。
  本论文以生化与分子生物学的技术方法进行研究,针对GPCR动态结合20E的特性,设计建立了新的方法,首次在鳞翅目昆虫中证明了DopEcR可以结合20E,为鉴定GPCR结合其它配体提供了借鉴。该研究阐明了DopEcR主要分布在脑,说明了组织分布不同可能是多个GPCR参与20E信号途径的机制之一。本研究首次报道类固醇激素20E可以促进神经系统的分子DopEcR表达,而DopEcR又参与20E途径调控昆虫取食及发育,说明20E与多巴胺系统存在正反馈调控关系,共同调控昆虫生长发育。该研究丰富和完善了蜕皮激素调控昆虫生长发育的理论知识,为20E的非基因组信号途径提供了新的实验证据,为害虫防治提供了新的靶标基因。
[硕士论文] 刘娟娟
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:Latrophlin(lph)是蛛毒素受体,先前的研究显示其具有药物敏感性。lph下游基因囊泡转运蛋白(vacht)、乙醛脱氢酶3家族B1成员(aldh3b1)和葡萄糖醛酸酶(gusb)广泛存在昆虫中,并且vacht其功能涉及神经递质胞内转运、可作为药物开发靶点。Aldh3b1功能涉及乙醇代谢和解毒代谢。Gusb其功能涉及哺乳动物体内的异源物质代谢和化学农药降解。但在昆虫中关于这三个基因本身生物学功能、与昆虫杀虫剂敏感性的关系和如何参与lph下游功能调控等暂时都还未有相关阐述。因此,研究vacht、aldh3b1和gusb的功能不仅能揭示这三个基因的本身功能也为昆虫对杀虫剂抗性机制的研究提供理论依据,还能为lph下游解毒信号通路阐述奠定基础。
  本文通过实时荧光定量PCR鉴定了lph下游vacht、aldh3b1和gusb三个基因在lph敲除后的表达量,发现vacht、aldh3b1和gusb在拗缺失后都显著下调表达。为了探究lph调控下游这三个基因药物应激过程。我们选取这三个显著下调表达的基因进一步探究他们在药物敌敌畏和克百威处理下7个时间点的表达模式。结果显示,敌敌畏和克百威处理后都会诱导vacht、aldh3b1和gusb上调表达,表明lph下游的这三个基因都能参与药物应答。但这三个基因的对药物应达模式不一致,暗示这三个基因在参与药物应答方面有自己的单独机制。并且干扰这三个基因后用半致死浓度药物处理,比起对照组,干扰组幼虫死亡率明显上升,表明vacht、aldh3b1和gusb具有药物敏感性和杀虫剂抗性。为了探究这三个基因如何参与lph下游杀虫剂抵抗性,我们用半致死浓度药物处理抑制lph表达的幼虫,后定量ds-lph组中vacht、aldh3b1和gusb表达量,结果显示vacht上调表达,aldh3b1和gusb下调表达。暗示虽然这三个基因都在lph下游,但vacht仅在lph通路中起作用,aldh3b1和gusb在lph缺失后还能上调表达,表明Aldh3b1和gusb可能还在别的信号通路中参与调控杀虫剂抵抗性,该通路很可能对lph起补偿作用。我们对vacht、aldh3b1和gusb做进一步生理功能分析。首先,这三个基因的时空表达模式分析显示他们在不同的发育时期和组织中都可表达。对幼虫期vacht干扰导致产卵量下降30%,所有后代都不能孵化且ACh和vg表达量与对照组相比发生降低。表明vacht降低后通过降低ACh含量进一步阻碍昆虫羽化和生殖。且vacht降低会影响营养信号通路中乙酰辅酶A的胞外摄取,进而影响VG合成,进而影响生殖。aldh3b1和gusb干扰后对生长发育没有影响但vg表达量与对照组相比发生降低。猜测有其它生殖信号通路参与调控aldh3b1和gusb对生殖的影响来恢复二者降低对生殖的影响。总之,本文鉴定了lph下游基因vacht、aldh3b1和gusb本身杀虫剂抵抗性和生理功能,还为lph信号通路的鉴定提供了基础。
[博士论文] 宋晓雯
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:DNA甲基化胞嘧啶作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于绝大多数真核生物中,可参与调节多种重要的生物学过程,包括胚胎发育,X染色体失活,基因印迹,基因选择性拼接及癌症发生等等。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),越来越多物种单碱基分辨率全基因组甲基化图谱得到破译,了解甲基化胞嘧啶位点在生物体基因组的具体分布规律及特点将有助于进一步探究其生物学功能。赤拟谷盗作为一种重要的模式生物,其全基因组序列已于2008年获得破译,由于其具备高效RNAi效率,被广泛用于生命科学研究的各个领域,是研究基因功能的良好材料。由于赤拟谷盗基因组仅含有两种甲基化转移酶DNMT1,DNMT2,缺失从头甲基化转移酶DNMT3,因此关于其基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点,至今尚未定论,那么赤拟谷盗基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点?若有,其具体分布规律及特点是怎样的?它的具体形成机制及作用机制是什么?最重要的是,它在赤拟谷盗正常生命发育过程中发挥怎样的生物学功能?针对以上问题,本研究首先利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),获得了赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实了甲基化胞嘧啶位点的存在,分析了其在基因组具体分布规律,同时结合RNA-seq,探究赤拟谷盗甲基化位点对基因表达调控作用。随后鉴定赤拟谷盗体内甲基化转移酶,利用RNAi技术,电泳凝胶迁移率实验及BSP技术,阐明赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点具体形成机制及其生物学功能,最后鉴定赤拟谷盗甲基DNA结合蛋白,利用RNAi,体外重组蛋白表达及电泳凝胶迁移率实验探究了赤拟谷盗DNA甲基化发挥作用的具体机制。
  研究结果表明赤拟谷盗不同生命发育时期包括卵,幼虫,蛹及成虫,均含有甲基化胞嘧啶位点,但数量较少,约占基因组胞嘧啶位点总数0.1%-0.2%,且随着生命发育的成熟,基因组甲基化水平呈上升趋势。赤拟谷盗基因组中含有两种类型甲基化胞嘧啶位点:大量的非CpG甲基化位点及少量的对称分布的CpG甲基化位点。非CpG甲基化位点在基因组中占主导地位,其中又以CpA甲基化位点居多,集中分布在基因间区,内含子区域,重复子序列远离基因主体区域分布,基因主体区域非CpG位点甲基化水平对于基因表达起负调控作用。而少量的对称分布CpG甲基化位点,其分布规律遵循真核生物甲基化组一般特点,甲基化CpG位点集中分布在基因主体区域,对基因表达起正调控作用。赤拟谷盗不同发育时期甲基化图谱高度相关,仅存在少量不同甲基化区域(DMR),对DMR区域基因进行功能注释,结果显示与生殖,发育,转录等相关众多的关键基因均存在于DMR区域,暗示赤拟谷盗DNA甲基化对于其生命周期转换起着十分重要的调控作用。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何建立的呢?本研究随后鉴定并克隆赤拟谷盗甲基化转移酶基因并探究其具体作用机制,结果发现赤拟谷盗体内含有两种甲基化转移酶基因Tcdnmt1,Tcdnmt2,Tcdnmt1含有两种选择性拼接本,Tcdnmt1a,Tcdnmt1b,缺失从头甲基化转移酶基因dnmt3,保守功能结构域分析结果表明Tcdnmt1a含有与其他物种一致功能结构域包括N端调节结构域及C端催化结构域,而Tcdnmt1b缺失了C端催化结构域,该功能域主要负责催化甲基化胞嘧啶位点的形成,这一区域缺失暗示TcDNMT1b可能丧失催化甲基化胞嘧啶形成的能力。Tcdnmt2含有与其他物种一致保守功能结构域,暗示其可能具备与其他物种一致保守的生物学功能。与此相一致,甲基化转移酶体外催化活力检测实验发现,TcDNMT1a,TcDNMT1b均能够特异性结合CpG位点,但仅有TcDNMT1a能够特异性催化半甲基化CpG位点的甲基化,说明其具备维持甲基化转移酶功能,而TcDNMT1b丧失了催化甲基化CpG位点形成的能力。TcDNMT2不能结合DNA底物,暗示其不能参与赤拟谷盗DNA甲基化形成,可能负责基因组tRNA甲基化,当然这有待于进一步探究。利用RNAi技术,敲减甲基化转移酶基因在体内表达,发现Tcdnmt1a缺失造成赤拟谷盗变态发育缺陷及胚胎致死,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2缺失对赤拟谷盗正常生命发育无明显影响,暗示DNA甲基化对于赤拟谷盗变态发育及早期胚胎发育具有十分重要的调控作用,此外,Tcdnmt1a敲减后,赤拟谷盗体内CpG甲基化位点甲基化水平发生明显降低,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2敲减后对此无影响,体内证据进一步支持赤拟谷盗TcDNMT1a负责CpG位点的甲基化。而对于其体内广泛存在的非CpG甲基化位点,可能存在一种新颖甲基化转移酶负责该类型甲基化位点的形成。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何发挥生物学功能的呢?甲基DNA结合蛋白作为表观遗传系统重要调控因子,其能够特异性结合CpG甲基化位点,同时结合下游组蛋白复合物,通过改变染色质构像,基因印迹,激活或者抑制基因表达,从而将DNA甲基化编码遗传信息转化为相应的生物学功能。本研究鉴定赤拟谷盗编码甲基DNA结合蛋白基因Tcmbd2/3,该基因与人类mbd2,mbd3高度同源,保守功能结构域分析结果表明,该蛋白含有MBD_a,MBD_c功能结构域,这两个功能结构域主要负责与核小体重塑及组蛋白脱乙酰化酶复合物(NuRD)互作,而缺失部分甲基DNA结合功能域(MBD),这一功能域主要负责与甲基化CpG位点结合,该区域缺失,暗示TcMBD2/3丧失结合甲基化CpG位点的能力,利用RNAi技术敲减该基因在赤拟谷盗体内表达发现,Tcmbd2/3缺失造成了一系列致死表型,包括中期幼虫蜕皮停滞,晚期幼虫变态失败,蛹形态异常,不能羽化为成虫,最有趣发现是Tcmbd2/3缺失成虫表现出严重神经缺陷包括自主运动能力逐渐丧失,下降的食量及体重等等,此外,Tcmbd2/3缺失雌虫丧失了产卵能力。利用电泳凝胶迁移率实验检测TcMBD2/3蛋白对CpG及非CpG甲基化位点结合能力,结果发现,TcMBD2/3与两者均无结合,说明赤拟谷盗仅存少量的对称分布CpG甲基化位点不需要通过TcMBD2/3发挥生物学功能,而大量非CpG甲基化位点可能通过其他蛋白因子发挥生物学功能,这有待于进一步研究。
  本研究首次鉴定赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实赤拟谷盗基因组甲基化胞嘧啶位点的存在,并阐明其具体分布规律及特点,同时鉴定其体内甲基化转移酶及甲基DNA结合蛋白,通过探究其具体生物学功能,揭示了赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点形成机制,作用机制及生物学功能。
[硕士论文] 熊文峰
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:Latrophilin(LPH)属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族中一个独特的分支,并且被称之为粘附性的GPCR,其首次鉴定作为黑寡妇蜘蛛毒液中有效成分神经毒素(α-latrotoxin,α-LTX)的潜在靶标。作为一种经典的GPCR,LPH在不同生物(人、小鼠和果蝇)体内参与调控多动症、躁郁症以及精神分裂症等多种精神疾病的发生。我们实验室最近研究显示在赤拟谷盗中通过RNAi技术对Tclph基因进行干扰不仅导致了部分幼虫形态缺陷,并且伴随生殖能力显著降低,这与其他小组的研究结果相一致。有趣地是,我们还首次发现在赤拟谷盗幼虫阶段敲减Tclph增加了其对抗胆碱杀虫剂(敌敌畏和克百威)的敏感性,暗示Tclph参与了杀虫剂的抵抗过程。然而,关于Tclph的下游分子调节机制目前还不清楚。因此,我们进一步利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选Tclph下游抗性相关基因以阐明其信号转导通路,并且在赤拟谷盗体内对这些相关基因进行了功能分析并得到了以下结果。
  首先,RNA-seq结果显示在赤拟谷盗中干扰Tclph分别导致了两个杀虫剂转运相关基因(TcCSP7、TcOBPC01)以及两个杀虫剂代谢相关基因(TcCYP4BN1、TcCYP6BQ11)的差异表达,并且这个结果已使用荧光定量PCR实验(qRT-PCR)得到了验证,暗示Tclph可能通过调控这四个基因的表达参与赤拟谷盗的某种生理功能。随后,对干扰Tclph基因的幼虫分别采用两种不同杀虫剂敌敌畏和克百威进行刺激,我们发现在处理过后的12-72小时内Tclph基因表达显然被抑制,并且导致TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因表达显著下降,而TcOBPC01基因表达则被显著上调。这个结果进一步揭示了Tclph在转录水平上可能通过直接调控TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6Q11基因的表达参与杀虫剂抗性,而过度表达的TcOBPC01则可能是当赤拟谷盗幼虫体内缺乏Tclph时对其杀虫剂抗性进行补偿。
  此外,我们对TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因在赤拟谷盗生长发育、杀虫剂抗性过程的影响进行了功能分析。时空表达模式显示这四个基因在不同发育时期和组织中均有所表达,但各自又有其特点:TcCSP7在早期蛹阶段以及在头部和触角组织表达量较高;TcOBPC01主要在晚期幼虫以及在头部、脂肪体和触角高表达;TcCYP4BN1在早期蛹阶段以及在头部和马氏管组织表达量较高;而TcCYP6BQ11主要在蛹期(早期蛹、晚期蛹)以及在肠和马氏管高表达。另外,将赤拟谷盗幼虫暴露在敌敌畏和克百威之下,发现与丙酮对照组相比,TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因都能不同程度地被诱导表达,暗示这四个基因可能参与杀虫剂抗性。因此,我们对这四个基因进行了RNAi分析,干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11特定地抑制了相应的基因表达,尤其是在第五天抑制效率达到最大。有趣地是,在赤拟谷盗体内干扰这四个基因并不影响其存活,暗示对其生长发育没有任何影响。接下来,在幼虫阶段干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因后的第五天,分别采用敌敌畏和克百威进行处理,我们发现与对照组相比,干扰组死亡率明显增加,进一步证实了这四个基因的确参与杀虫剂抗性。这些结果为阐明Tclph基因通过平衡调控杀虫剂转运基因以及杀虫剂代谢解毒基因的表达参与杀虫剂抗性提供了必要的证据。
[硕士论文] 潘静
生物化学与分子生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:胰岛素与蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)是调控昆虫生长发育及变态的重要激素。胰岛素在生物进化过程中高度保守,广泛参与到昆虫的生长发育和细胞的生长增殖当中。胰岛素通过胰岛素信号途径起作用,在胰岛素信号途径中,3-磷酸肌醇依赖激酶-1(PDK1)起到十分重要的中介作用。在受到胰岛素刺激时,胰岛素首先会与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合,使胰岛素受体发生自体磷酸化,进而激活下游的胰岛素受体底物(insulin receptor structure,IRS)使其与携带SH2结构域的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)结合,催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate,PIP2)形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)。PIP3能够招募带有PH结构域的PDK1和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)上膜,PDK1能够将AKT磷酸化进而磷酸化下游的叉头框蛋白O(forkhead box,FoxO)。磷酸化的FoxO不能够入核,失去了对靶基因的负调控功能,起到促进细胞生长,抑制细胞凋亡的作用。有研究发现抑制胰岛素信号通路能抑制昆虫的化蛹,例如在果蝇中抑制胰岛素信号途径能够抑制幼虫生长,延迟化蛹时间。在果蝇中过表达PDK1能够通过活化AKT增大细胞或器官的体积。
  昆虫化蛹时发生组织重建,中肠重建包括幼虫中肠的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)以及成虫中肠的形成过程。中肠重建发生在完全变态昆虫的变态阶段,受到蜕皮激素20E的调控。20E的主要功能是促进昆虫幼虫蜕皮和变态,包括促进幼虫组织的凋亡和成虫组织形成,从而拮抗胰岛素的功能。20E是一种类固醇激素,通过与其核受体EcR(Ecdysone recepter)结合,然后形成EcR/USP(Ultraspiracle)复合体,从而激活下游相关基因的表达。此外,20E还能够通过抑制FoxO磷酸化促进其入核与DNA结合元件(FoxO binding element,FoxOBE)结合,促进促皮层溶离蛋白酶(carboxypeptidase A,CPA)的表达进而在昆虫蜕皮时促进皮层溶离。蜕皮激素在前胸腺中产生,在组织中加工成20-羟基蜕皮激素。胰岛素能够促进全身细胞的增殖和生长,促进昆虫生长达到临界体重。前胸腺在胰岛素的刺激下也生长到一定大小从而为变态过程产生更多的20E。因此,胰岛素和20E之间存在复杂的相互调控关系,但其中的分子机理尚不完全清楚。由于PDK1是胰岛素信号通路中的关键蛋白,推测胰岛素能够通过PDK1促进前胸腺生长和20E合成,从而促进昆虫的变态发育,因此,本论文选择PDK1为靶标,研究PDK1在昆虫变态发育中的功能,研究胰岛素和20E对PDK1表达的调控,揭示20E拮抗胰岛素途径的分子机制,从而了解昆虫变态发育的激素调控机理。
  以鳞翅目昆虫棉铃虫为实验材料,发现PDK1和FoxO参与了昆虫化蛹这一过程。发现,PDK1在棉铃虫幼虫取食期转录水平上高表达。胰岛素能够促进PDK1在转录水平的表达,而20E能够抑制PDK1在转录水平的表达。在棉铃虫幼虫敲降PDK1能够延长幼虫化蛹的时间,同时使幼虫化成了小蛹。检测胰岛素途径下游基因在转录水平的表达发现,敲降PDK1导致下游蛋白激酶AKT/PKB表达量下降,但是FoxO的表达量上调。此外,敲降PDK1了阻断棉铃虫中肠重建过程,20E滴度降低。在虫体上回补20E能够恢复敲降PDK1所带来的影响,中肠重建也得以恢复。在棉铃虫表皮细胞系上过表达FoxO够促进自噬,抑制凋亡,抑制细胞增殖。
  以上研究结果表明,PDK1在幼虫的取食期高表达,能够在胰岛素的调控下通过抑制FoxO的表达促进细胞增殖和幼虫生长,促进20E水平的升高。高浓度的20E抑制PDK1的表达,从而解除对FoxO的抑制,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。其中充足的20E是起始变态和中肠凋亡的关键因子。
  通过一系列实验证明了PDK1是昆虫化蛹的关键基因,受胰岛素和20E拮抗调控。20E是引起昆虫起始变态及凋亡发生的关键因子,阐明了一种胰岛素和20E调控昆虫变态的分子机理。
[硕士论文] 蒋宇
生态学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫肠道微生物在宿主的营养供给、消化吸收、生长发育、免疫防御等方面都起着重要作用,并有助于拓宽其生态位。锹甲科昆虫(Lucanidae)因其显著的雌雄二型(Sexual dimorphyism)和雄性三型(Male trimorphism)及性选择行为而成为鞘翅目(Coleoptera)中比较独特的一支,也是昆虫纲(Insecta)中备受关注的热点类群。多数锹甲的成虫以树汁或腐烂的果实为食,幼虫则通过分解朽木或腐殖质获取营养。因此,它们在森林生态系统的碳循环中占据独特的生态位,在生物质能源的分解利用中也具有重要价值。但目前基于高通量测序有关这类昆虫肠道微生物的研究较少。
  本研究选取锹甲科昆虫中的典型代表物种华美奥锹甲(Odontolabis fallaciosa)为研究对象,首次对其成虫中后肠微生物细菌群落的16S rDNA V3-V4区进行了高通量测序,研究了该物种不同性别之间、不同颚型雄性间的肠道微生物多样性,分析其肠道微生物组成和差异,并探讨它们在华美奥锹甲能量需求中所起的作用,以期为进一步研究锹甲肠道微生物的功能及其在表型演化中的作用提供理论参考。相关研究结果如下:
  (1)测序结果共获得3255个OTUs,注释到的主要分类阶元隶属于42个门、118个纲、361个科、585个属。
  (2)华美奥锹甲肠道细菌群落中门类水平上丰度最高的主是变形菌门Proteobaeteria、拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、柔膜菌门Tenericutes、梭杆菌门Fusobacteria、Euryarchaeota和硝化螺旋菌门Nitrospirae。丰度大于1%的优势属有15个,分别隶属于变形菌门,拟杆菌门和厚壁菌门。具体包括:不动杆菌属Acinetobacter、Dysgonomonas属、巴尔通氏体属Bartonella、金黄杆菌属Chryseobacterium、肠球菌属Enterococcus、卟啉单胞菌属Porphyromonas、喜热菌属Caloramator、苍白杆菌属Ochrobactrum、摩根菌属Morganella、沙雷氏菌属Serratia、Telmatospirillum属、黄质菌属Flavobacterium、克雷白氏杆菌属Klebsiella、丛毛单胞菌属Comamonas、脱硫弧菌属Desulfovibrio。
  (3)在不同性别(雌雄二型)的2个分组中,细菌群落的相对丰度有差异:大颚型雄性、雌性、中颚型雄性的优势门类数量较多,而小颚型雄性最少。厚壁菌门在大颚型雄性、雌性肠道中含量较高,厚壁菌门对于食物营养吸收有重要作用,可能对大颚型雄性、雌性的营养利用产生有益影响。属类水平上,雌性的优势属数量最多,其次是大颚型雄性,小颚型雄性中最少。在不同颚型的雄性(雄性三型)3个分组中,细菌群落的相对丰度也有差异:中颚型的优势门类数量高于大颚型、中颚型,属类水平上,大颚型雄性的优势属数量高于中颚型和小颚型。
  (4)多样性分析显示:α多样性指数中,雌性的测定物种指数(Observed species)和香农指数(Shannon)均与大颚型、中颚型、小颚型雄性存在显著差异;β多样性中,PCA分析结果显示雌性个体样本之间的距离较近,说明群落组成更稳定;相似性检验(ANO SIM)发现雌性的肠道细菌群落组成与三个颚型雄性间都有显著差异,大颚型与中颚型雄性之间的差异显著。
  (5)PICRUST代谢功能预测结果显示,所有样本潜在功能基因组成是相似的,但影响食物降解和营养吸收的碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能基因在雌性和雄性中的丰度最高。
  这些结果显示在华美奥锹甲成虫的肠道微生物中:雌性的肠道微生物群落组成和丰度与雄性有显著差异;大颚型、中颚型雄性之间也有差异。这样的差异可能与不同性别、不同颚型雄性的营养需求存在关联,也为进一步探讨锹甲肠道微生物的功能及其在表型演化中可能起到的作用提供一定的理论参考。
[硕士论文] 薛圣杰
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:自噬(Autophagy)是真核生物中用于物质周转的一个高度保守的过程,以应答外界胁迫条件,保障生命体生存。在该过程中,一些需要被降解的蛋白或细胞器会被具有双层膜结构的自噬小体包裹并运输至溶酶体。这一过程需要许多自噬相关蛋白(Autophagy-related protein,Atg)的参与。Atg8蛋白(Autophagy-related8protein)作为两种泛素样蛋白之一参与了细胞自噬过程,它可与脂质磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylathanolamine,PE)结合,随后转移至自噬膜上,并且Atg8的蛋白修饰会影响其行为,这些分子机制在哺乳动物中已经被研究地较为透彻,但其在昆虫细胞中的自噬调控机制报道很少,尤其是蛋白的翻译后修饰的调控作用。家蚕作为鳞翅目的模式生物,其完全变态发育的过程受到营养及蜕皮激素等因子影响,而这些因子又能参与自噬的调控,因此,深入研究家蚕Atg8蛋白对细胞自噬及凋亡的调控机制具有重要意义。
  我们前期的家蚕蛋白乙酰化修饰组学分析结果显示,Atg8的K13位点可发生乙酰化修饰,由于蛋白的乙酰化修饰是对蛋白功能起调控作用的最主要翻译后修饰之一,在生命体中具有十分重要的作用,因此,在本研究中,为了深入了解家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬过程和细胞凋亡的分子调控机制,我们利用原核表达系统大量表达了家蚕Atg8蛋白并制备了多克隆抗体,并利用定点突变技术深入研究了该蛋白乙酰化修饰对细胞自噬和细胞凋亡调控的分子机制。首先,提取家蚕细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了atg8基因,构建原核表达载体pET28a-atg8,诱导表达目的蛋白并进行纯化,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。然后利用EBSS(Earle's Balanced Salt Solution)刺激家蚕BmN细胞以建立细胞的自噬模型,研究饥饿时间对家蚕Atg8蛋白表达水平的影响。结果显示:细胞自噬在诱导后极短时间内即可发生,并且Atg8-PE/Atg8的比例在饥饿2-4h后达到顶峰。然后利用重叠PCR技术分别构建了模拟乙酰化和去乙酰化的突变体,并插入瞬时表达载体pIEX-1中,转染家蚕BmN细胞进行过表达,Western blot检测结果显示:Atg8乙酰化修饰抑制了细胞自噬的发生。进一步利用荧光蛋白mCherry作为标记,以pIEX-1作为载体,在家蚕细胞中进行融合表达,观察Atg8发生修饰前后细胞自噬的水平差异,结果显示:Atg8乙酰化后的细胞自噬水平较低,而去乙酰化的Atg8自噬水平升高。最后,利用DNA片段化检测试剂和细胞流式细胞术分析家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞凋亡的影响,结果显示:发生了乙酰化修饰的Atg8蛋白,其所在的细胞凋亡比率更高。
  综上所述可知,家蚕自噬相关蛋白Atg8的K13乙酰化修饰对细胞自噬的发生具有抑制作用,并且去乙酰化会一定程度的抑制细胞凋亡的发生。本结果将为深入研究家蚕细胞自噬调控的分子机制奠定基础。
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