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[硕士论文] 刘娟娟
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:Latrophlin(lph)是蛛毒素受体,先前的研究显示其具有药物敏感性。lph下游基因囊泡转运蛋白(vacht)、乙醛脱氢酶3家族B1成员(aldh3b1)和葡萄糖醛酸酶(gusb)广泛存在昆虫中,并且vacht其功能涉及神经递质胞内转运、可作为药物开发靶点。Aldh3b1功能涉及乙醇代谢和解毒代谢。Gusb其功能涉及哺乳动物体内的异源物质代谢和化学农药降解。但在昆虫中关于这三个基因本身生物学功能、与昆虫杀虫剂敏感性的关系和如何参与lph下游功能调控等暂时都还未有相关阐述。因此,研究vacht、aldh3b1和gusb的功能不仅能揭示这三个基因的本身功能也为昆虫对杀虫剂抗性机制的研究提供理论依据,还能为lph下游解毒信号通路阐述奠定基础。
  本文通过实时荧光定量PCR鉴定了lph下游vacht、aldh3b1和gusb三个基因在lph敲除后的表达量,发现vacht、aldh3b1和gusb在拗缺失后都显著下调表达。为了探究lph调控下游这三个基因药物应激过程。我们选取这三个显著下调表达的基因进一步探究他们在药物敌敌畏和克百威处理下7个时间点的表达模式。结果显示,敌敌畏和克百威处理后都会诱导vacht、aldh3b1和gusb上调表达,表明lph下游的这三个基因都能参与药物应答。但这三个基因的对药物应达模式不一致,暗示这三个基因在参与药物应答方面有自己的单独机制。并且干扰这三个基因后用半致死浓度药物处理,比起对照组,干扰组幼虫死亡率明显上升,表明vacht、aldh3b1和gusb具有药物敏感性和杀虫剂抗性。为了探究这三个基因如何参与lph下游杀虫剂抵抗性,我们用半致死浓度药物处理抑制lph表达的幼虫,后定量ds-lph组中vacht、aldh3b1和gusb表达量,结果显示vacht上调表达,aldh3b1和gusb下调表达。暗示虽然这三个基因都在lph下游,但vacht仅在lph通路中起作用,aldh3b1和gusb在lph缺失后还能上调表达,表明Aldh3b1和gusb可能还在别的信号通路中参与调控杀虫剂抵抗性,该通路很可能对lph起补偿作用。我们对vacht、aldh3b1和gusb做进一步生理功能分析。首先,这三个基因的时空表达模式分析显示他们在不同的发育时期和组织中都可表达。对幼虫期vacht干扰导致产卵量下降30%,所有后代都不能孵化且ACh和vg表达量与对照组相比发生降低。表明vacht降低后通过降低ACh含量进一步阻碍昆虫羽化和生殖。且vacht降低会影响营养信号通路中乙酰辅酶A的胞外摄取,进而影响VG合成,进而影响生殖。aldh3b1和gusb干扰后对生长发育没有影响但vg表达量与对照组相比发生降低。猜测有其它生殖信号通路参与调控aldh3b1和gusb对生殖的影响来恢复二者降低对生殖的影响。总之,本文鉴定了lph下游基因vacht、aldh3b1和gusb本身杀虫剂抵抗性和生理功能,还为lph信号通路的鉴定提供了基础。
[硕士论文] 熊文峰
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:Latrophilin(LPH)属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族中一个独特的分支,并且被称之为粘附性的GPCR,其首次鉴定作为黑寡妇蜘蛛毒液中有效成分神经毒素(α-latrotoxin,α-LTX)的潜在靶标。作为一种经典的GPCR,LPH在不同生物(人、小鼠和果蝇)体内参与调控多动症、躁郁症以及精神分裂症等多种精神疾病的发生。我们实验室最近研究显示在赤拟谷盗中通过RNAi技术对Tclph基因进行干扰不仅导致了部分幼虫形态缺陷,并且伴随生殖能力显著降低,这与其他小组的研究结果相一致。有趣地是,我们还首次发现在赤拟谷盗幼虫阶段敲减Tclph增加了其对抗胆碱杀虫剂(敌敌畏和克百威)的敏感性,暗示Tclph参与了杀虫剂的抵抗过程。然而,关于Tclph的下游分子调节机制目前还不清楚。因此,我们进一步利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选Tclph下游抗性相关基因以阐明其信号转导通路,并且在赤拟谷盗体内对这些相关基因进行了功能分析并得到了以下结果。
  首先,RNA-seq结果显示在赤拟谷盗中干扰Tclph分别导致了两个杀虫剂转运相关基因(TcCSP7、TcOBPC01)以及两个杀虫剂代谢相关基因(TcCYP4BN1、TcCYP6BQ11)的差异表达,并且这个结果已使用荧光定量PCR实验(qRT-PCR)得到了验证,暗示Tclph可能通过调控这四个基因的表达参与赤拟谷盗的某种生理功能。随后,对干扰Tclph基因的幼虫分别采用两种不同杀虫剂敌敌畏和克百威进行刺激,我们发现在处理过后的12-72小时内Tclph基因表达显然被抑制,并且导致TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因表达显著下降,而TcOBPC01基因表达则被显著上调。这个结果进一步揭示了Tclph在转录水平上可能通过直接调控TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6Q11基因的表达参与杀虫剂抗性,而过度表达的TcOBPC01则可能是当赤拟谷盗幼虫体内缺乏Tclph时对其杀虫剂抗性进行补偿。
  此外,我们对TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因在赤拟谷盗生长发育、杀虫剂抗性过程的影响进行了功能分析。时空表达模式显示这四个基因在不同发育时期和组织中均有所表达,但各自又有其特点:TcCSP7在早期蛹阶段以及在头部和触角组织表达量较高;TcOBPC01主要在晚期幼虫以及在头部、脂肪体和触角高表达;TcCYP4BN1在早期蛹阶段以及在头部和马氏管组织表达量较高;而TcCYP6BQ11主要在蛹期(早期蛹、晚期蛹)以及在肠和马氏管高表达。另外,将赤拟谷盗幼虫暴露在敌敌畏和克百威之下,发现与丙酮对照组相比,TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因都能不同程度地被诱导表达,暗示这四个基因可能参与杀虫剂抗性。因此,我们对这四个基因进行了RNAi分析,干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11特定地抑制了相应的基因表达,尤其是在第五天抑制效率达到最大。有趣地是,在赤拟谷盗体内干扰这四个基因并不影响其存活,暗示对其生长发育没有任何影响。接下来,在幼虫阶段干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因后的第五天,分别采用敌敌畏和克百威进行处理,我们发现与对照组相比,干扰组死亡率明显增加,进一步证实了这四个基因的确参与杀虫剂抗性。这些结果为阐明Tclph基因通过平衡调控杀虫剂转运基因以及杀虫剂代谢解毒基因的表达参与杀虫剂抗性提供了必要的证据。
[硕士论文] 李玉娟
免疫学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:将黑腹果蝇肠道中的醋酸杆菌分离出,并研究醋酸杆菌对果蝇宿主的促生长发育的作用。
  方法:利用醋酸杆菌选择性培养基分离果蝇肠道醋酸杆菌;通过革兰氏染色和16S rRNA基因比对鉴定菌种;观察东方醋酸杆菌12小时内利用4种碳源情况,检测该菌株体外发酵特性;涂板计数不同生长周期果蝇肠道的菌落数,检测该菌的定植情况;将果蝇随机分为混合菌、无菌、单株菌果蝇三个组别,通过计数蛹和成虫出现的平均时间,检测该菌对果蝇发育作用;通过观察果蝇产卵后0天至蛹形成时的体表面积变化,检测果蝇的生长速率;解剖以上三种组别的果蝇成虫解剖肠道后,用PH3染色方法计数肠细胞分裂增殖数。提取以上三种组别的果蝇RNA,做RT- PCR,检测该菌对果蝇体内激素的影响。
  结果:⑴该菌株经鉴定为东方醋酸杆菌,属于醋酸杆菌属,革兰氏阴性杆菌。⑵东方醋酸杆菌12 h生长OD值高达1.25,pH降低至3.8。⑶东方醋酸杆菌在果蝇不同的生长阶段的肠道定植数量达104、105。世代传递结果发现东方醋酸杆菌可在子代果蝇肠道定植数量达103。⑷东方醋酸杆菌组在2%酵母丰富培养基条件下,蛹和成虫羽化时间分别为6.2 d和10.1 d和CR组比较无统计学意义(P>0.05);与GF(7.8 d和12.1 d)相比差别有统计学意义(P<0.05),在营养条件匮乏情况下,东方醋酸杆菌组果蝇蛹和成虫羽化时间分别为9 d和13.3 d,和CR果蝇相比无统计学意义(P>0.05);与GF组(7.8 d和22 d)相比差别有统计学意义(P<0.001),东方醋酸杆菌组显著地缩短果蝇发育历期,甚至可以代替CR组的作用。东方醋酸杆菌组较无菌组比明显增加果蝇的生长速率,并且与CR组结果类似。⑸PH3染色实验发现东方醋酸杆菌组较无菌组促进果蝇肠道细胞分裂增殖,尤其在最长的中肠间差异有统计学意义(P<0.001),并增加肠道细胞分裂增殖数量,数量甚至高于CR组,与CR组比较有统计学意义(P<0.05)。⑹东方醋酸杆菌组较GF组使果蝇促前胸腺激素分泌的时间较早,分泌的量较高,两组分泌量的高峰值比较有统计学意义(P<0.01),与CR组比较其表达时间类似。⑺东方醋酸杆菌组较GF组的胰岛素水平表达时间早、表达量高差异有统计学意义(P<0.001),并且与CR组结果类似(P>0.05)。
  结论:从果蝇肠道分离出一株东方醋酸杆菌,东方醋酸杆菌是果蝇一种益生菌、共生菌。东方醋酸杆菌在组织学水平增加果蝇的生长速率和缩短发育历期并在细胞学水平促进肠细胞分裂增殖,同时在体内激素水平也可激活胰岛素信号通路,维持机体稳定的血糖水平及促进果蝇关键生理期(幼虫期至蛹期)蜕变,从而促进果蝇生长发育。
[硕士论文] 张倩
林业 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:黑肾卷裙夜蛾 Plecoptera oculata Moore隶属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是一种食叶害虫,严重为害降香黄檀 Dalbergia odorifera。近年来,该虫在我国海南、广东、广西、云南等地陆续发生,且有逐年加重趋势。本文通过对黑肾卷裙夜蛾生殖生物学进行观察,了解求偶、交配行为及性信息素释放时辰节律。采取溶剂提取法提取雌蛾性信息素,并对粗提液进行触角电位测定、GC-EAD(气相色谱-触角电位联用仪)和GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)分析,获得一种引发黑肾卷裙夜蛾触角产生电生理反应的性信息素活性成分。
  本研究主要内容包括:⑴黑肾卷裙夜蛾生殖生物学:经室内观察,成虫羽化现象全天可见,其雌、雄成虫的羽化性比在1.17~1.26之间波动。黑肾卷裙夜蛾羽化第2日才开始交配,暗化后2~8h可观察到求偶和交配行为。3日龄雌蛾求偶率最高,而性信息素分泌量也以3日龄居多。雌蛾求偶高峰期发生于暗化后4~6 h,交配行为主要发生于暗化后3.5~7.5 h,较高日龄的成虫交配率降低,交配持续时间最长约为230 min,且较高日龄及较低日龄成虫的交配时间均长于中间日龄。⑵通过对黑肾卷裙夜蛾饲喂不同营养源试验发现,以10%蜂蜜水饲喂的雌蛾产卵量最高,平均为(116.29±8.41)粒,显著高于饲喂纯水的成虫产卵量,说明高营养物质有助于雌蛾卵巢的充分发育,增加产卵量。而从雌、雄成虫平均寿命来看,饲喂10%白糖水的雌蛾平均寿命最长,长达(11.50±0.43) d,而提供10%蜂蜜水的雄蛾的平均寿命最长。对同一营养源,雌蛾的寿命普遍长于雄蛾。⑶采取溶剂提取法,对黑肾卷裙夜蛾雌蛾性信息素粗提液的触角电位显示:粗提液中含有使其雄蛾触角产生电生理反应的性信息素活性组分。经GC-EAD分析,其中有一种化学物质可刺激黑肾卷裙夜蛾雄蛾触角产生反应,再进一步用GC-MS分析粗提液,显示有53个物质峰,其中E8,E10-12:OH被初步确定为引发黑肾卷裙夜蛾雄蛾触角反应的物质与E8, E10-12:O H标准品的GC-MS检测结果比较,两者具有相同的保留时间以及特征离子碎片,因此推测这种活性组分为E8,E10-12:OH。对不同稀释倍数的性信息素标样,黑肾卷裙夜蛾3日龄雄蛾触角电位反应值测定结果显示,在一定范围内,雄蛾触角电位反应与标样浓度呈正相关。据此推测黑肾卷裙夜蛾性信息素活性组分之一为 E8, E10-12:O H。
[硕士论文] 高亚曼
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:限制或适当减少食物摄入对健康和寿命延长有好处的认识自古就有。在这一百年的研究历史中,到底是减少食物总量,还是减少食物中的蛋白质含量,还是减少食物中的总热量更有利于人或动物的健康和寿命延长在学术届一直存在争论。上世纪中期McCay等人用只限制动物摄入的食物总量而不减少其摄入的蛋白质质量的方法得出了同样能够延长动物寿命的结果,进而推论出是由于动物摄入的热量减少而不是蛋白质量减少而延长了动物的寿命。此后,热量限制(CR)一词几乎完全代表了所有的限制饮食(DR)。然而,在上世纪的中后期就有人用实验证明不用限制动物的取食量,而只减少动物食物中某种必需氨基酸(如色氨酸或甲硫氨酸)的摄入就可以延长动物的寿命同时,人们还发现,不限制动物的饮食,只把食物中的蛋白质含量从20%左右降低到4%,同样可以明显地延长动物的寿命。我们发现在这一百年的研究中,有几个课题组的人曾报道降低食物中的蛋白质与碳水化合物的比例,即使不限制动物摄取食物,也可以延长动物的寿命。
  本研究选用直接以植物成分为食的黄粉虫为实验对象,设计了不同碳水化合物与蛋白质比例的食物饲养黄粉虫,证明了不同碳水化合物与蛋白质比例的食物确实影响黄粉虫的生长和一些生理生化指标的改变。以不含蛋白质的地瓜淀粉、含蛋白质比例较低的地瓜粉及蛋白质含量适中的普通食物玉米粉分别作为基础食物成分,对食物中分别添加2%及20%的动物蛋白或植物蛋白,对黄粉虫的生长情况、体重增加情况、消化道淀粉酶活性和纤维素酶活性等进行了比较研究,得出结论:高蛋白含量的食物促进黄粉虫快速生长、快速衰老,低蛋白则使黄粉虫生长较慢、衰老较慢;动物蛋白较植物蛋白能更快促进生长和衰老;用组织学技术对黄粉虫消化道组织结构进行了研究。我们的实验也填补了本领域内在无脊椎动物类似实验研究中某些生物学表观指标和生理生化指标的空白,也避免了之前本领域所报道的类似实验采用酵母、线虫或果蝇这些非理想实验动物的困扰。另外,在实验中我们还对黄粉虫消化道的显微结构进行了观察研究。
[硕士论文] 费荻程
动物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:棉蚜(Aphis gossypii)俗称腻虫,属半翅目蚜科,是我国常见的棉花农业害虫,在我国几乎分布在各个棉花种植区。棉蚜根据其生物学形态差异,分有翅与无翅两种表型。根据其生殖特点,分为无性孤雌生殖棉蚜:孤雌蚜虫、产性母蚜虫、蚜虫性母;有性生殖棉蚜:性雌和性雄。在自然条件下,棉蚜以卵越冬,当温度升高日照变长时,卵便孵化为干母,干母营孤雌生殖产生有翅棉蚜,迁飞到夏寄主上营孤雌生殖繁殖后代;当日照长度变短,温度降低开始进入秋冬季节时,棉蚜中逐渐出现产性母的蚜虫,而产生的性母则继续进行孤雌生殖产生性雌,经过约两周性母接着产生性雄,雄蚜接着与性雌棉蚜交配产生卵。因此可以发现,性母是棉蚜从无性生殖向有性生殖转换非常关键的存在。经过我们长时间观察,发现性母有三个主要的表型特点,有翅,卵小管退化,体色深且体壁硬。棉蚜的生殖多样性是一个典型的由蚜虫产生的高水平的表型可塑性,我们也可以认为是一组相同的基因发展成为了不同表型。但是其生殖可塑性的分子机制目前还并不清晰。
  本研究主要内容包括:⑴比较棉蚜在孤雌、产性母蚜虫、性母和性雌这几种时期的胰岛素受体表达模式,发现与孤雌相比棉蚜性母的胰岛素表达模式显著升高。在对棉蚜性母的表达模式探究中发现,棉蚜性母在二龄三龄时期胰岛素受体的表达显著降低,InR2的表达模式与 InR1相似。而InR1在产性母棉蚜当中的表达模式从三龄开始逐渐升高,但并没有显著性。⑵用带有T7接头的引物通过PCR合成双链RNA模板,经体外转录合成特定长度双链RNA。在棉蚜性母当中,用水和穿膜蛋白分别对双链RNA稀释到浓度为3.3ng/μl,在棉蚜产性母蚜虫的成虫和性母三龄时期分别注射一次,使棉蚜通过注射法产生RNAi。经过荧光定量 PCR检测,用水直接稀释双链的方法比用穿膜蛋白稀释双链的方法更有效的抑制了InR1基因的表达。其中在棉蚜四龄和成虫时期InR1的表达量最低,下降了70%。并且干扰后的棉蚜有翅的比例降低了84%,但是在卵巢解剖当中,并没有发现显著非正常表型。证明通过两次注射用水稀释的双链RNA可以在棉蚜成虫时期引起棉蚜胰岛素受体基因RNAi,但并不能影响其卵巢发育。⑶在棉蚜产性母蚜虫当中尝试运用体内转染试剂与双链RNA混合的方式引起棉蚜G1产生RNAi。当转染试剂和双链RNA的比例分别为1:4和1:8,时,由于转染试剂本身的毒性,导致实验组和对照组棉蚜几乎全部死亡。更改实验条件,选择比例为1:15,在棉蚜G1三龄和四龄时期进行两次注射和三次注射。进过荧光定量PCR检测结果显示,棉蚜G1在进行两次注射时,成虫时期胰岛素受体的表达量下降,并在第三次注射后的第一天显著下降了约40%。而对G1进行三次注射时,成虫时期G1的胰岛素受体的表达量也显示下降,并在第11天显著下降了70%。说明三次注射比两次注射的干扰效率高。在三次注射后的棉蚜G1卵巢受到了抑制,实验组中次胚几乎不发育,且这种表型所占比例为75%。证明转染试剂混合双链通过三次注射法对棉蚜G1进行干扰,抑制了G1的卵巢发育,进而抑制了棉蚜性母的产生。⑷实验结果不仅印证了前人实验中胰岛素受体影响昆虫翅形发育的结论,同时也发现干扰胰岛素受体会抑制棉蚜性母的产生。棉蚜个体小,体液多,干扰实验难度大,但是通过我们在实验当中的摸索,确定了注射法这一稳定的技术手段,探索不同双链RNA呈递方式,以及注射时间点的选择,为未来对棉蚜的基因干扰提供了实验依据和技术手段。实验过程中干扰技术的成熟也填补了棉蚜基因干扰方式的技术空白。
[硕士论文] 谭慧军
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:白蚁是一种社会性昆虫。因为它们对于木质纤维素强大的降解能力,所以在生态圈的碳循环中发挥重要的作用。根据肠道共生物中是否包含原生动物,可将白蚁分成低等白蚁和高等白蚁。高等白蚁中与真菌共生的白蚁为培菌白蚁。培菌白蚁的食物中包含真菌孢子,而孢子的细胞壁主要成分是几丁质,故培菌白蚁肠道中可能存在几丁质酶来起着降解真菌孢子细胞壁的作用。
  黄翅大白蚁是培菌白蚁的一种,目前对培菌白蚁来源昆虫几丁质酶的研究是非常有限的。分析黄翅大白蚁肠道转录组测序结果后,我们从中筛选出功能注释为几丁质酶的基因,对它们进行生物信息学分析。本研究主要对其中可能参与代谢的几丁质酶基因进行了基因克隆和功能性表达,具体内容如下:
  1.本文先对黄翅大白蚁转录组测序结果进行分析,通过关键词“chitinase”搜索,发现有40个功能注释为几丁质酶的unigenes。将这40个几丁质酶基因进行一系列生物信息学分析,并对其中三个基因进行进一步功能的探索。
  2.Unigene基因comp133624_c0的在前肠中相对表达量最高,为277.21。该片段进行生物信息学分析之后,设计引物,通过PCR得到cDNA全长,在大肠杆菌JM109中表达;unigene基因comp174658_c0的中肠相对表达量最高,523.34。对该片段进行生物信息学分析之后,设计引物,通过PCR得到cDNA全长,然后将该基因在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)以及毕赤酵母中异源表达;unigene基因comp182537_c0在中肠和后肠的相对表达量都相对较高,分别为750.43和1638.2。该片段编码一个含有CBM-14(结合域)的几丁质酶,并且设计引物,通过PCR得到cDNA全长并克隆到在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)表达。
  3.为了进步一确认上述三个基因的优势表达部位,我们还对上述基因进行了qPCR和RT-PCR验证,证实是否与转录组测序结果的优势表达位点相吻合。
  总之,本研究成功克隆得到三个几丁质酶基因,而且在大肠杆菌异源表达。它们的重组蛋白均能检测到几丁质酶活性,但是几丁质酶活性不高。这种现象可能是因为昆虫来源蛋白在大肠杆菌中表达时,重组蛋白没得到很好的修饰和折叠,导致大多数重组蛋白都形成了包涵体。另外,unigene基因comp174658_c0在毕赤酵母中异源表达且表达产物具有降解几丁质的能力。最后,qPCR和RT-PCR的结果显示:除了基因comp174658_c0外,另外两个基因在各个部位的表达水平趋势与转录组测序结果相符合。
  关键词:黄翅大白蚁;几丁质酶基因;克隆;功能性表达
[硕士论文] 王爽
动物学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa)对于全球人们来说是一种重要的粮食作物,目前已经有有超过1/2的人是以大米为食。但是,我国的水稻产量并不丰富,究其主要原因是虫害。在我国威害水稻的害虫已知的有350多种,常见的有30多种,主要包括食叶类、钻蛀类、吸汁类、食根类这4大类害虫,其中稻纵卷叶螟危害较为严重。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae),俗称卷叶虫,刮青虫、苞叶虫等。海藻糖酶是昆虫体内海藻糖代谢的一个要害酶,同时,海藻糖也是昆虫重要的血糖物质,因而其在昆虫能量的调节以及昆虫的发育过程中具有不能漠视的作用,尤其在昆虫飞行的过程中,是昆虫飞行的主要能量储存物质。因而海藻糖酶也就天然的成为了害虫管制的理想靶标。截至目前,科研工作者发现海藻糖酶基因的类型有两种,分别属于可溶性海藻糖酶基因(Tre1)和膜结合型海藻糖酶基因(Tre2)。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA( double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA在进化过程中高度保守的、高效特异性降解的现象。本文通过体外注射dsRNA的方法来导致RNAi的现象,从而实现降低稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的表达以及利用转基因 RNAi技术,以取得对稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因具有缄默作用的转基因水稻植株,从而达到控制稻纵卷叶螟危害的目的,为稻纵卷叶螟的生物防治奠定根底。
  本研究主要内容包括:⑴以稻纵卷叶螟膜两种藻糖酶基因(膜结合型海藻糖酶基因和可溶型海藻糖酶基因)为靶标,设计两个靶位点以实现对稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因和海藻糖酶基因的RNAi效应,并将两个靶位点分别命名为 CmTreⅡ*和 CmTre*。采用 RNAi技术,在体外合成两个 dsRNA(CmTreⅡ-dsRNA和 CmTre-dsRNA)。通过显微注射的方法分别将 CmTreⅡ-dsRNA和 CmTre-dsRNA导入稻纵卷叶螟3龄幼虫体内。观察发现,在注射 CmTreⅡ-dsRNA和 CmTre-dsRNA后稻纵卷叶螟幼虫对水稻的取食情况有较为显著的下降,生长发育情况也出现了明显的滞后,有的出现蜕皮受阻等现象。而且注射 CmTreⅡ-dsRNA和 CmTre-dsRNA的稻纵卷叶螟的虫体明显相较于对照组又小又黑,有的甚至出现了畸形的虫体,更甚者出现死亡等情况。⑵以CmTreⅡ和 CmTre两个基因片段为靶位点,分别在其两端添加 Spe I和 BamH I酶切位点,进行人工合成,然后经双酶切后与植物表达载体p1301连接,构建 p1301-CmTreⅡ*和 p1301-CmTre*两个重组植物表达载体。通过 PCR、双酶切及测序鉴定的方法验证重组表达载体 p1301-CmTreⅡ*和p1301-CmTre*已构建成功,并采用液氮冻融的方法将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。⑶转基因水稻的获得。使中花11号粳稻的愈伤组织被分别含有 p1301-CmTreⅡ*和 p1301-CmTre*质粒的农杆菌 LBA4404浸染,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,总共获得17株转基因再生植株。通过靶标位点的RT-PCR检测,其结果表明:7株是含有 CmTreⅡ的阳性转基因植株,9株是含有 CmTre的阳性转基因植株。1株转基因失败,舍去。⑷将取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟设置为对照组,观察发现取食了转基因水稻的稻纵卷叶螟的取食情况以及生命活性都有了不同程度的下降现象,同时稻纵卷叶螟的生长发育情况也出现了不同程度的滞后,有的甚至出现了蜕皮受阻等现象。而且取食转基因水稻的稻纵卷叶螟的虫体明显相较于对照组又小又黑,有的甚至出现了畸形的虫体,更甚者出现死亡等情况。取食转基因水稻的稻纵卷叶螟体内海藻糖酶基因的mRNA的表达水平通过实时荧光定量 PCR方法(RT–PCR)来测定,并统计稻纵卷叶螟的死亡情况。结果显示:相较于取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟,取食转入目的基因片段 CmTreⅡ的水稻的稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因平均相对表达量下降了29%;取食转入目的基因片段 CmTre水稻的稻纵卷叶螟的海藻糖酶基因平均相对表达量下降了55%,死亡率也分别增加了46.67%(取食转 CmTreⅡ基因的水稻)和66.67%(取食转 CmTre基因的水稻),校正死亡率分别为51.85%和74.67%。结果表明:稻纵卷叶螟对两种转基因水稻的取食量都有显著下降,表现为转 CmTreⅡ基因水稻的卷叶率和白叶率分别为13.40%和12.47%,转 CmTre基因水稻的卷叶率和白叶率分别为12.61%和11.84%,相比对照组(即取食非转基因水稻)卷叶率分别下降了11.32%和12.11%;白叶率分别下降了10.10%和10.73%。
[硕士论文] 于洋
生物工程 济南大学 2016(学位年度)
摘要:酚氧化酶,作为一种广泛存在于各种生物体的重要蛋白,在昆虫体液免疫和细胞免疫中均起到了极其重要的免疫作用,在生物体其一般以酚氧化酶酶原的形式存在。虽然对昆虫酚氧化酶及酶原的研究已经一个多世纪了,但在家蝇方面却没有其功能的相关报道,为探究家蝇体内酚氧化酶的功能,并制备家蝇酚氧化酶原免疫制剂,本文利用家蝇这一常见的生物,将家蝇酚氧化酶原基因与已发表并探明功能的部分昆虫酚氧化酶原基因进行比对与分析,预测家蝇酚氧化酶具有酚氧化酶的一般功能,本文将家蝇酚氧化酶原基因1的ORF克隆出来、装入pET-30a中进行了原核表达,建立了原核表达的家蝇酚氧化酶原包涵体变性复性为可溶性蛋白的有效方法,并对获得的可溶性蛋白的酶活性进行了检测。另外,利用原核表达的家蝇酚氧化酶原制备了多克隆抗体,并通过抗体封闭、RNAi实验,研究了家蝇三龄幼虫中的酚氧化酶原的免疫功能,结果显示,家蝇体内的酚氧化酶原蛋白及基因分别在抗体封闭和dsRNA干扰后,家蝇酚氧化酶的活性显著降低,家蝇死亡率显著升高,说明家蝇酚氧化酶原在家蝇的免疫反应中有重要作用。实验中,初步制备了家蝇酚氧化酶原的免疫制剂,并初步探究了其功能,为之后进行免疫制剂的更深入研究提供了理论基础。
[硕士论文] 马全兵
生物学 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:家蚕(Bombyx mori)是一种重要的鳞翅目模式昆虫,是研究变态发育的理想材料。脂肪体是体内的一种重要组织器官,它既是代谢中心,又是激素作用的靶组织,在家蚕生长发育和变态过程中发挥着极其重要的作用。我们进行了家蚕脂肪体在变态发育过程中的蛋白质组学研究,以期找到与变态发育密切相关的蛋白。另外昆虫翅的发育是一个典型的变态过程,我们对在翅原基中表达的Hemolin蛋白和Yippee蛋白进行了相互作用研究,为今后研究两者在发育过程的作用提供依据。本研究得到如下一些结果:
  1.从家蚕五龄幼虫期和蛹期不同发育阶段提取脂肪体总蛋白,利用双向电泳技术进行分离和鉴定,找出不同时期的27个差异蛋白点;对这些蛋白进行质谱分析及数据库检索,检索到相匹配的候选蛋白质,这些蛋白与物质和能量代谢、细胞骨架、蛋白质代谢与合成、生长发育、信号转导等生理活动紧密相关,在家蚕生长发育与变态发育的过程中可能发挥着重要的功能和作用。
  2.从27个差异蛋白点中选取了9个蛋白相对应的基因进行荧光定量分析,其中有70K热休克蛋白、脯氨酰羟化酶、延伸因子、谷胱甘肽硫解转移酶、琥珀酰辅酶 A、胰凝乳蛋白酶抑制剂、胞质甲酰四氢叶酸脱氢酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶等等,并对它们在变态发育中的可能作用进行了分析。
  3.通过制备抗体来研究Hemolin蛋白与Yippee蛋白之间的相互作用。我们用新西兰大白兔制备了家蚕Yippee蛋白的多克隆抗血清,Western Blotting结果显示出我们制备的家蚕Yippee蛋白兔多克隆抗血清具有较好的特异性。
  4.利用本实验室之前制备的家蚕Hemolin鼠多克隆抗血清和Yippee蛋白兔多克隆抗血清对Hemolin和Yippee蛋白进行了免疫共沉淀和杂交实验,结果证明了Hemolin和Yippee蛋白在家蚕翅原基中有相互作用。
  通过上述研究我们找到了一些与变态发育有关的重要蛋白,对变态发育的研究有着一定的参考价值。我们提出了一个关于Hemolin与Yippee蛋白的相互作用的一个假设,对揭示翅原基的发育提供了一个新的线索。
[硕士论文] 喻广强
微生物学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:嗅觉系统能够感知外界环境中瞬息万变的气味信号,对于生命体的觅食、求偶、避险、繁殖和警戒等各种生命活动都有重要意义。在气味的识别和结合过程中,气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)首先探测、结合、区分并转运气味小分子,然后呈递至气味受体(Olfactory receptors,ORs)等下游蛋白并最终产生嗅觉。因此研究气味结合蛋白和常见气味物质间的相互作用机理对于理解气味的本质具有重要意义。
  本研究首先对花绒寄甲气味结合蛋白DhelOBP21进行了同源模建,获得了其三维结构。发现它符合Minus-C类OBPs的特征:具有4个保守的半胱氨酸并形成2个二硫键用于稳定蛋白的三维结构;结合腔相对疏水,利于结合疏水性气味小分子。其后的分子对接则初步获得了蛋白DhelOBP21与18个小分子的结合构象,用于后续的动力学模拟。
  随后的常规动力学和恒定pH动力学模拟则首次观测到了气味结合蛋白的N端在无规卷曲和Alpha螺旋之间的转变,我们据此提出了新的理论假设:对于Minus-C类的OBP,它们的构象同时受环境pH和小分子的调节。当pH由酸性增高到中性时,蛋白的远离结合腔并且为无规卷曲的N端逐渐向结合腔靠近,并转变成规则的Alpha螺旋,利于小分子的结合和转运;而当pH由中性降低为酸性时,蛋白的N端由Alpha螺旋逐渐解旋为无规卷曲并逐渐远离结合腔,利于小分子的释放。
  此外,蛋白结合腔内部的部分氨基酸残基对18个小分子(17个常见挥发物和荧光探针1NPN)的结合活性都很高,它们为“基础性氨基酸”,可能决定蛋白结合小分子的杂泛性;而另外一些氨基酸残基对于18个小分子的结合活性各不相同,它们为“选择性氨基酸”,可能决定了蛋白结合小分子的选择性。
  本研究对Minus-C类的气味结合蛋白和小分子的相互作用机制提出了新的理论假设,并从蛋白的角度解释了气味结合蛋白结合小分子的杂泛性和选择性的原因,为昆虫的气味识别和宿主定位等难题提供了新的洞察和理解。
[硕士论文] 高倩
植物保护 山西大学 2016(学位年度)
摘要:草履蚧Drosicha corpulenta(Kuwana)(半翅目:蚧总科:绵蚧科),是一种聚集在枝芽处刺吸汁液取食的植食性昆虫,当虫口密度过大时往往会造成枝芽枯死。由于草履蚧体表分泌蜡质形成保护层,人工清除和化学防治难以对其进行有效控制,而大量化学杀虫剂的使用不仅会灭杀天敌,还会对果实和环境造成污染。因此本文从昆虫化学通讯对害虫防治的角度出发,对草履蚧触角中参与嗅觉形成过程的相关蛋白进行研究,发现嗅觉基因在蚧虫中的作用,为今后的生物防治提供新的视角及理论依据。本文的研究内容包括:(1)对草履蚧雌成虫触角转录组进行测序,并进行组装、注释和同源性分析;从Unigenes中预测草履蚧嗅觉基因并归纳基因信息;对草履蚧的气味结合蛋白(OBPs)及化学感受蛋白(CSPs)序列进行比对,并构建系统发育树;(2)在转录组测序和分析的基础上,得到气味结合蛋白 OBP(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列;利用生物信息学方法分析其序列信息,并构建三维结构。
  本研究主要内容包括:⑴对草履蚧雌成虫触角转录组进行高通量测序。在转录组中,共获得33,741,845条序列标签 reads,其中16,334条非重复序列 unigenes被组装。这些unigenes通过 GO分析和 eggNOG分析进行基因功能的分类统计。草履蚧触角中unigenes与其他物种相似性比较发现,与豌豆蚜相似的数量最多,达到18.31%。⑵从unigenes中预测到16条编码气味结合蛋白OBPs的基因、2条编码化学感受蛋白CSPs的基因、1条编码感觉神经元膜蛋白SNMP的基因、21条气味受体基因ORs和7条编码味觉受体GRs的基因,并总结归纳了47条嗅觉基因信息。此外,对草履蚧触角中预测的气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs序列与蚜虫、盲蝽和扶桑绵粉蚧相关序列构建系统发育树。结果显示,8条气味结合蛋白与蚜虫聚在一起,3条草履蚧气味结合蛋白OBPs聚在一起。2条化学感受蛋白与扶桑绵粉蚧的2条化学感受蛋白分别聚类在一起。根据聚在一起且已知其功能的蚜虫和盲蝽的物种,可以对草履蚧的OBPs功能进行预测。草履蚧嗅觉基因的发现对认识其在蚧虫行为反应中的作用提供新的视角,同时提高蚧虫的生物防治策略。⑶在草履蚧雌成虫触角转录组测序和分析的基础上,通过RT-PCR技术得到的气味结合蛋白OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列,利用生物信息学的方法对草履蚧这些蛋白的理化性质、信号肽、亲疏水性等进行预测分析。分析表明,这些蛋白均有完整的开放阅读框ORF,N端带有19~29个氨基酸的信号肽,等电点在4.12~9.30之间,相对分子质量为15.6~17.0KDa,这些蛋白均为亲水性蛋白。OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)含有六个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白家族的特征。化学感受蛋白DcorCSP2包含有四个保守的半胱氨酸位点,符合化学感受蛋白家族的特征。草履蚧典型的气味结合蛋白(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2通过同源建模后发现,三维结构都是由六个α螺旋组成。DcorOBP4,6,7,8这四个气味结合蛋白的六个保守半胱氨酸形成了三对二硫键,与典型的气味结合蛋白特征相符。化学感受蛋白DcorCSP2也构建出两对二硫键,这些二硫键均起到稳定蛋白质结构的作用。以上6条OBPs均由α1,α2,α4,α5,α6这5个α螺旋形成疏水口袋,α3在口袋的一端不参与疏水口袋的形成。此外,这些蛋白的 C-末端均折合进入蛋白质的口袋内部,使得口袋结构变得更加稳固。
[硕士论文] 杨婷
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:昆虫要经历蜕皮(molting)和变态(metamorphosis)两个阶段才可以完成从幼虫向成虫的转变。在幼虫变态时期,昆虫的内部结构发生巨大变化,变化最为明显的就是中肠,表现为幼虫中肠的消失与成虫中肠的形成。幼虫中肠的消亡是由程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)介导的,PCD主要包括凋亡与自噬。蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)对变态和PCD都有一定的促进作用。自噬是一个将自身废旧的细胞器如内质网、高尔基体以及一些细胞蛋白吞噬,并送往溶酶体,将其消化掉的过程,为自身代谢的需要以及某些细胞器的更新提供能量。细胞凋亡是指细胞在一定的情境下,受内部遗传机制的调控来自动结束生命的过程。细胞凋亡是机体为适应环境而做出的主动的行为,其过程涉及到一系列相关基因的激活、表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,对机体产生损伤的一种现象,是为更好地适应生存条件而自发进行的一种死亡过程。在棉铃虫中肠的组织重建过程中,自噬和凋亡均会发生。自噬的发生以及自噬体形成都依赖于一系列ATG蛋白及两个类泛素样蛋白偶联结合系统的相互协作才能顺利进行。ATG5与ATG12作为自噬膜延伸过程中的“核心”蛋白,为自噬体形成所必须。在昆虫的生长发育过程中,PCD对消化多余的细胞、增加受限细胞的数量及维持体内的动态平衡都是必不可少的。有研究表明在果蝇的生长发育过程中,已经有两种PCD被发现,一个是自噬,;另外一个是凋亡。有报道称在果蝇中肠PCD过程中是自噬在起决定作用,而在家蚕中的报道发现自噬早于凋亡的发生。本文主要研究自噬相关基因ATG12在棉铃虫中肠PCD过程中的功能,并在棉铃虫表皮细胞系上做进一步的验证,为害虫的防治提供靶标基因。
  我们以棉铃幼虫与表皮细胞系为实验对象,研究自噬相关蛋白ATG12在棉铃虫中肠变态发育过程中的作用及激素调控功能。得到以下实验结果:ATG12在棉铃虫表皮、中肠和脂肪体中均有表达,在6-72 h表达量上调持续至6-120 h,到蛹期表达量明显下降;20E上调ATG12的表达,并且促进与ATG5的结合;变态时期,ATG12在中肠中发挥着重要的作用,虫体上干扰掉ATG12,导致棉铃虫的化蛹时间延迟及中肠PCD的延缓;棉铃虫表皮细胞系上干扰掉ATG12,减弱了经20E诱导后的LC3-Ⅱ的形成及caspase3、caspase5的片段化。
  基于上述研究,我们得出ATG12在自噬与凋亡中的作用及与20E之间的关系。20E能够上调ATG12的表达及ATG12与ATG5的结合,ATG12对棉铃虫中肠PCD是必须的,在棉铃虫中肠PCD过程中自噬与凋亡均有发生。
  发现20E可以上调ATG12与ATG5的结合,ATG12在中肠的组织重建过程中发挥着至关重要的作用;在中肠PCD过程中自噬受阻,凋亡也会受到影响。这些结果对研究棉铃虫中肠的组织重建过程有一定的参考及借鉴作用。
[硕士论文] 朱明
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:细胞色素 P450(P450)是多功能氧化酶的核心酶系,参与昆虫杀虫剂的代谢以及蜕皮激素、保幼激素等激素的合成,与昆虫的生长、发育和防御密切相关。另外,这些酶与过氧化物酶有类似的活性,因此可能在保护生物体免受活性氧损伤的过程中发挥作用。本研究以我国特色种质资源中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,根据意大利蜜蜂(Apis mellifera)的同源序列,利用RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中首次克隆得到了P450家族CYP3分支和CYP2分支的CYP336A1和CYP18A1两个基因,并且分别命名为AccCYP336A1和AccCYP18A1。然后进一步对它们进行了序列比对、表达特性分析以及功能预测。具体的结果如下:
  (1)AccCYP336A1开放阅读框全长1491bp,编码一个含有496个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为57kDa,等电点为8.8。AccCYP18A1开放阅读框全长1620bp,编码一个含有539个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为60.7kDa,等电点为8.42。氨基酸序列比对发现,AccCYP336A1、AccCYP18A1与其他物种中P450家族基因的同源性较高,且具有该家族保守的功能区域。进化树分析发现,AccCYP336A1和AccCYP18A1分别属于CYP3分支和CYP2分支。
  (2)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在中华蜜蜂不同发育时期和不同组织部位中的表达特性进行了分析。qRT-PCR结果表明,AccCYP336A1和AccCYP18A1在整个中华蜜蜂的变态发育过程中均有表达,AccCYP336A1在卵期的表达量最高,而AccCYP18A1在变态发育的两个重要发育节点:5日龄幼虫(L5)及1日龄成蜂(A1)时期表达量最高。以上结果表明,AccCYP336A1及 AccCYP18A1可能与中华蜜蜂的变态发育有关。另外,中华蜜蜂不同组织部位中的表达特性显示,AccCYP336A1在表皮中表达量最高,而AccCYP18A1在中肠中表达量最高。这些结果初步表明了两个基因的组织特异性。
  (3)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在不同非生物应激中的表达模式进行了研究。结果表明,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个基因的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物应激的诱导。这些结果表明,这两个基因在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (4)采用Western-blot的方法分别对两个基因所编码蛋白在不同非生物应激中的表达特性进行了研究。结果显示,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个蛋白的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物氧化胁迫的诱导,此结果与两个基因转录水平表达特性相一致,进一步暗示了AccCYP336A1和AccCYP18A1在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (5)在大肠杆菌菌株中利用纸片扩散实验检测体外AccCYP336A1蛋白的功能。研究发现表达AccCYP336A1蛋白的大肠杆菌对百草枯的抗性显著增强。
[硕士论文] 陈晓
遗传学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:青凤蝶属(Graphium)隶属于鳞翅目(Lepidoptera),凤蝶科(Papilionoidea),凤蝶亚科(Papilioninae),青凤蝶族(Leptocircini)。可分为五个亚属:青凤蝶亚属(Graphium)、纹凤蝶亚属(Paranticopsis)、绿凤蝶亚属(Pathysa)、剑凤蝶亚属(Pazala)及奥利斯比亚属(Arisbe)。世界范围内,该属蝶类共约100种,其中,青凤蝶亚属蝴蝶约30多种,其中我国有7种,绿凤蝶亚属共15种,纹凤蝶亚属共11种,剑凤蝶亚属共7种,奥利斯比亚属约30种。迄今为止,有关青凤蝶属的系统分类以及起源和进化方面的研究还比较匮乏,还有待于进一步的深入研究,特别是分子生物学数据资料和其他相关证据的介入。
  本研究以及推测青凤蝶属起源和分化的路径图和时间表,利用PCR和long-PCR相结合的方法测定了国内7种青凤蝶(青凤蝶、统帅青凤蝶、碎斑青凤蝶、黎氏青凤蝶、木兰青凤蝶、银钩青凤蝶和宽带青凤蝶)的线粒体基因组全序列或近全序列;同时,结合GenBank中已有的凤蝶科线粒体基因组全序列数据,基于13个蛋白编码基因(PCGs)序列数据重建凤蝶科主要类群的系统发生树,并重点探讨7种青凤蝶的系统发生关系;基于已有的凤蝶科及其寄主植物的相关化石记录资料,运用宽松分子钟手段,推测青凤蝶属相关类群的分歧时间和进化路线图,以期为青凤蝶属及各亚属的分子进化和谱系发生方面的研究提供一些基础资料。实验结果显示:青凤蝶、统帅青凤蝶、碎斑青凤蝶、黎氏青凤蝶、木兰青凤蝶、银钩青凤蝶线粒体基因组全长分别为15299 bp,15377 bp,15235 bp,15213 bp,15169 bp,15212 bp,已测宽带青凤蝶近线粒体基因组序列长度为14540 bp,七种青凤蝶的线粒体基因组中均包含13个PCGs、2个rRNA基因、22个tRNA基因以及非编码的AT富集区。其中宽带青凤蝶的12S rRNA和tRNAMet基因序列不完整,而AT富集区未测出。这七种青凤蝶的PCGs的起始密码子除COI为CGA外,其它均为ATN;终止密码子除COI和COII基因是单个碱基T外,其余的均为TAA或TAG,编码的氨基酸数目分别为3727,3724,3728,3728,3726,3727,3728个。七种青凤蝶线粒体基因组中相邻基因或多或少存在重叠区或间隔区,重叠区长度范围为1~12 bp,间隔区长度范围为1~40 bp。除宽带青凤蝶外其余六种青凤蝶的控制区中 AT含量都是整个线粒体基因组中最高的,均达到94%以上。基于线粒体基因组全序列数据的凤蝶科主要类群间的最大似然树和贝叶斯树均显示,凤蝶科内各族之间的系统发生关系为(凤蝶族+裳凤蝶族+喙凤蝶族+青凤蝶族+(锯凤蝶族+绢蝶族);青凤蝶族内部,燕风蝶先分离出来,其次是铁木剑凤蝶;七种青凤蝶形成二个互为姊妹群的进化支,其系统发生关系为(((青凤蝶+宽带青凤蝶)+统帅青凤蝶)+(碎斑青凤蝶+木兰青凤蝶+银钩青凤蝶+黎氏青凤蝶)。基于已知的COI和ND5基因序列重建的青凤蝶属系统发生树显示,本研究所涉及七种青凤蝶的系统发生关系与上述结果一致;并推测绿凤蝶亚属、纹凤蝶亚属及青凤蝶亚属都是多系起源,而剑凤蝶亚属和奥利斯比亚属为单系起源。谱系发育年代学分析结果显示:凤蝶科的分歧时间是在86.8百万年前(Ma)的晚白垩纪时期(95%置信区间:70.6~106.1 Ma;下同);凤蝶亚科和绢蝶亚科的分化时间也都是在白垩纪晚期,分别为77.6 Ma(63.4~94.3 Ma)和72.0 Ma(48.8~95.4 Ma);青凤蝶族的分歧时间在第三纪古新世(61.9 Ma;47.1~79.9Ma);青凤蝶属的分化时间在第三纪始新世(43.66 Ma;29.61~51.0 Ma)。
[硕士论文] 龚永昌
遗传学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:研究发现真核生物基因组中有大量的DNA生成了非典型性的转录本,它们的的功能引起了广泛的争议。这些转录本中包含很多小的开放读码框(small open reading frames,sORFs),这些sORFs起初被认为是不能翻译成蛋白的RNAs,然而,越来越多的证据表明其中的一些sORFs可以翻译成为小肽,而且它们的作用被严重低估了。sORFs翻译成的小肽可能代表一类被忽视的生物活性分子,近年来的研究表明这些小肽在发育、分化等生物过程中具有重要的功能。其中对tal-like基因相关小肽的研究较为深入,该基因最早在果蝇中被发现。在果蝇中,Tal控制基因的表达和组织的形成,作为一个结构和形态发生的链接,对果蝇的生长发育起到非常重要的作用。家蚕作为一种典型的模式经济昆虫,在生长发育的诸多方面与果蝇有很多相似的地方。本研究在成功克隆了家蚕tal-like基因(Bombyx mori tal-like gene,Bmtal)的基础上,检测了Bmtal基因在家蚕五龄三天不同组织的表达水平,研究了过表达Bmtal和抑制Bmtal对家蚕ovo基因(Bmovo)及部分信号通路基因表达的影响,利用RNA-Seq技术开展了过表达Bmtal的BmN细胞与对照组BmN细胞的比较转录组学研究,为理解Bmtal基因对家蚕生长发育的影响提供了新的线索。
  本研究主要内容包括:⑴为了研究家蚕tal-like基因的功能,根据序列设计引物进行RT-PCR,成功克隆到1661bp的Bmtal全长cDNA序列。结构分析显示,Bmtal基因中存在多个sORFs,其中前四个sORFs(A1-A4)分别编码11-12个氨基酸、且序列相似的小肽,紧跟着一个编码32个氨基酸的sORFs(B)。其结构模式与果蝇的非常相似,提示Bmtal基因的功能有可能与果蝇的相似。通过荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了Bmtal基因在家蚕五龄三天各种组织的表达水平,结果显示,Bmtal基因在五龄三天的气管丛、马氏管、丝腺中表达量较高,在性腺中也有表达。⑵在果蝇中,越来越多的证据表明tal-like基因对个体的生长发育起到至关重要的作用,为了探讨Bmtal的表达规律以及细胞定位特征,将Bmtal的功能区域编码序列与DsRed基因融合,克隆进pET-32a(+),在E.coil中成功表达了重组蛋白。并利用免疫小鼠制备了多克隆抗体。细胞定位结果显示,BmTal定位在BmN细胞的细胞核中。⑶为了进一步探讨Bmtal基因的功能,本研究通过过表达和RNAi的方法调查了上调和下调Bmtal基因对Bmovo基因及其他信号通路基因表达水平的影响。结果显示,过表达的Bmtal基因可以调控ovo基因的表达水平,对其他信号通路的部分基因的表达水平也起到明显的影响。⑷为了研究Tal-小肽在家蚕BmN细胞中的相互作用蛋白,采用免疫共沉淀技术从过表达BmTal的家蚕BmN细胞中筛选互作蛋白,然后对与BmTal互作的候选蛋白进行质谱鉴定,共鉴定到6种候选蛋白(14-3-3蛋白zeta、纤毛和鞭毛关联蛋白、鞭毛轴丝关联蛋白mst101、多聚泛素、U3小核仁RNA互作蛋白、细胞生长调节核仁蛋白)。信息分析结果显示,这些蛋白涉及到信号传导、细胞增殖分化、蛋白降解、细胞表面突起形成、核苷酸代谢等各个方面。表明BmTal可能通过多种方式调节生物学过程。⑸将Bmtal基因克隆进昆虫表达载体pIZT-V5/His构建重组质粒pIZT/V5-His-tal,将pIZT/V5-His-tal和pIZT/V5His质粒转染家蚕BmN细胞,通过Zeocin连续筛选两个月后,获得转化2组转化细胞,利用高通量转录组测序技术(RNA-Seq)进行了比较转录组学研究。结果显示,差异表达基因主要集中在与细胞的生长分化及增值过程中。表明Bmtal基因在细胞的生长分化及增值过程中起重要作用。
[硕士论文] 孙文英
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是专性吸血的体外寄生虫,在自然界中存在两性生殖种群与孤雌生殖种群,可携带多种病原体而导致疾病,给人类健康和畜牧业生产带来极大危害。防御素(defensin)是一种抗微生物肽,在动植物中广泛存在,尤其在节肢动物中,由于缺乏适应性免疫反应,防御素在其先天免疫防御过程中发挥重要作用,可以有效对抗入侵的病原体。蜱作为专性吸血的特殊类群,同样具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原体的侵袭。
  本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为研究对象,利用Clontech建库试剂盒和3'RACE的方法构建cDNA文库,分子克隆得到三条防御素基因,分别命名为Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。开放阅读框大小分别为225bp、210bp和237bp,编码氨基酸个数为74、69和78,成熟肽长度分别为38、37和46,等电点分别为9.69、8.33和9.50。通过对Hp-defensin-1进行原核表达及功能分析,结果表明,长角血蜱Hp-defensin-1与边缘革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,为75.68%。系统发育树表明,Hp-defensin-1基因序列与革蜱属(森林革蜱KJ885301.1)亲缘关系最近。荧光定量结果表明,Hp-defensin-1表达量在不同时期和不同组织存在显著性差异(P<0.05),大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌胁迫效果依次减弱。将Hp-defensin-1连入载体pET-32(a+),并转入BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE电泳显示目的蛋白大小约23kDa,与预测大小一致。该多肽对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌性,对部分革兰氏阴性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。表达产物的抗氧化实验表明,该多肽对ABTS·+和DPPH·自由基具有很强的清除能力,具有很强的抗氧化活性,但不存在溶血活性,因此对健康的人血细胞无伤害,为新型抗菌药物的研发提供了基础。
[硕士论文] 高小贺
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱Haemaphysalis longicornis是一种专性吸血的体外寄生虫,世界范围内广泛分布,宿主种类多样、可携带多种病原体而导致疾病,对其防治研究具有重要的经济学和流行病学意义。伊维菌素(ivermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的半合成大环内酯类多组分抗生素,是一种新型的广谱、高效和低毒抗生素类抗寄生虫药,对寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好的驱杀作用。
  本研究对家兔注射不同浓度的伊维菌素,分别于兔耳饲喂长角血蜱成蜱、若蜱和幼蜱,记录蜱的叮咬率、吸血期、饱血体重、产卵前期、产卵量和死亡率等生物学参数,分析伊维菌素对长角血蜱生殖和发育的影响。结果表明,伊维菌素对蜱的叮咬率、吸血期和产卵前期无显著影响(p>0,05),对长角血蜱的饱血体重、产卵量、卵的孵化率、若蜱和幼蜱的死亡率有显著影响(p<0.05)。用超景深显微镜观察对照组和处理组雌蜱卵巢在饱血当天至产卵当天的形态学变化,发现处理组雌蜱卵泡发育不良,产生皱缩。测定伊维菌素长效性实验中,对家兔注射伊维菌素后7天、14天和21天,分别于兔耳饲喂长角血蜱成蜱,记录饱血体重、产卵量和孵化率生物学参数。结果表明,处理组和对照组无显著差异,说明伊维菌素对长角血蜱没有长效的防治效果。综合实验数据得出,伊维菌素对长角血蜱叮咬率无显著影响,对若蜱和幼蜱的死亡率有显著影响,对成蜱的死亡率无显著影响,但通过显著降低吸血量和产卵量抑制长角血蜱的发育和生殖,降低长角血蜱的数量。
[硕士论文] 谭量量
食品科学 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:类二十烷酸是一种主要由二十碳四烯酸(arachidonic acid,AA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)通过环氧合酶(COX1/2)、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP)三种酶路径代谢而成的脂类衍生物,主要衍生物包括前列腺素(PGs)、白细胞三烯(LTs)、凝血嗯烷(TXs)、过氧化羟基四烯二十烷酸(HPETEs)、羟基四烯二十烷酸(HETEs)、羟基五烯二十烷酸(HEPEs)和表氧化三烯二十烷酸(EETs)等脂氧素类。以往研究报道表明,果蝇既不需要也不合成二十碳多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs),但也有研究证明C20 PUFAs的衍生物类二十烷酸对果蝇具有重要生理作用。为探究这一矛盾,本文以Canton-S野生型果蝇为研究对象,开展了果蝇的脂肪酸组成及果蝇是否具有产生相关类二十烷酸能力的系统性研究。
  本研究分为三个部分:
  (一)用添加了1 g/kg AA或EPA的饲料以及基础饲料作为对照分别培养果蝇,并检测各组果蝇整体、头部和胸腹部的脂肪酸组成。结果显示,对照组果蝇脂肪酸组成为12∶0,14∶0,14∶1n-5,16∶0,16∶1n-7,18∶0,18∶1n-9,18∶2n-6,18∶3n-3;相对于对照组,AA和EPA组果蝇的脂肪酸组成分别多出了AA或EPA;其中AA组果蝇整体、头部和胸腹部AA的相对含量分别为2.35±0.45%、2.92±0.39%和1.39±0.23%; EPA组果蝇整体、头部和胸腹部的AA的相对含量分别为1.98±0.57%、2.92±0.39%和1.39±0.23%。该结果证实,果蝇本身不能产生20C以上的PUFAs,但可以通过食物吸收,并且主要富集于头部。
  (二)选取了AA和EPA在COX、LOX和CYP路径代谢产生的15种类二十烷酸作为对象,以果蝇为研究体系,根据所选类二十烷酸的性质,通过优化样品前处理、液相色谱条件以及质谱检测条件,建立了最佳的代谢产物定性、定量分析HPLC-MS/MS方法。结果表明:在2.5 ng/ml~100 ng/ml范围内,15种代谢产物均具有良好的线性关系,相关系数(R2)都在0.9900以上,检出限为0.1-2.6 ng/g。在空白果蝇样品中添加三个浓度水平的代谢产物混合标准溶液,回收率为89.3%-111.5%,相对标准偏差为1.0%-15.0%,均满足分析方法要求。
  (三)检测了AA和EPA饲料组果蝇组织及AA和EPA添加组匀浆体系中AA和EPA的代谢情况。结果表明:对照果蝇组织中未检测到AA或EPA的代谢产物;AA和EPA饲料组果蝇组织及AA和EPA添加组果蝇匀浆体系中都检测到了15(S)-HETE和15(S)-HEPE。15(S)-HETE和15(S)-HEPE分别是AA和EPA在人体15-LOX路径对应的代谢产物,AA和EPA产物路径的一致性表明,果蝇可能具有与人体15-LOX酶功能相同的代谢酶。此外,实验表明果蝇不能产生15(S)-HETE和15(S)-HEPE的前体15(S)-HpETE和15(S)-HpEPE,故果蝇对AA和EPA的代谢路径与人体15-LOX路径又存在差异。而AA在COX路径的代谢产物PGH2、PGF2α和PGE2、AA在人体5-LOX路径的代谢产物5(S)-HpETE和LTB4、AA在人体CYP路径的代谢产物20-HETE和11(12)-EET以及EPA在人体COX路径的代谢产物PGF3α和PGE3、EPA在人体CYP路径的代谢产物17(18)-EpETE和17,18-DiHETE都未检测到,说明果蝇可能不具备与人体COX、5-LOX和CYP路径酶功能相同的代谢酶。
[硕士论文] 季莉丽
动物学 河北大学 2015(学位年度)
摘要:广炮步甲Pheropsophus occipitalis通过防御腺体喷射化学液体并瞬时产生高温对付猎敌,其防卫方式在昆虫纲极为特别。揭示该虫防御体系形态结构、揭秘其分泌物化学成分,以及伴随其喷射防御物质而产生的一系列行为反应,对于阐述其生命奥秘具有重要科学价值。本文分别从广炮步甲的形态、生活习性、喷射行为,防御腺的总体及各部分形态结构,防御反应的反应物、生成物以及催化剂、和研究展望等几个方面对广炮步甲及其防御机制进行了全面的研究分析。
  本研究主要内容包括:⑴防御体系构成经三维数码显微镜(VHX-100,日本 KEYENCE公司产)、扫描电镜(TM3000,日本HITACHI公司产)与显微CT(SKYSCAN1172)拍摄得知广炮步甲的防御体系由贮液囊、分泌组织和反应室三部分组成。贮液囊是薄而透明且坚韧的囊袋,中间着生1束由12根细管组成的丛根状导管以从体内吸收或生产反应物。反应室为1对骨化的马蹄形结构,表面可见稠密、大小不一和分布不甚均匀的粗瘤;其纵截面内部为复杂的蜂窝状结构并长满形态各异的枝刺,用以加固内壁和控制和液体流向;入口处可见人字形瓣膜,是控制喷射和产生脉冲的关键部分,对于降低反应室温度和虫体控制喷射时间有重要意义。⑵腺体内存化学物质测定经GC/MS质谱仪测定,共测得炮步甲的防御腺化学物质6种,主要成分为甲基对苯二酚(Methyl on phenol)、对苯二酚(hydroquinone)、甲基对苯醌(Methyl-p-benzoqu inone)与对苯醌(p-benzoqu inone);腺体外化学物质测定:相对于贮液囊囊体的化学成分,喷射出的化学物质多达13种,是反应之后苯环断裂的结果,其中除对苯醌以外还有甲酸、乙酸等多数物质都具有刺激性和毒性,可进行有效的防御;将反应室的上清液于不同温度下进行酶活性测定,其颜色反应吸光度在40℃左右最高,超过40℃之后逐渐失去活性,说明于反应室中确实是过氧化物酶起的催化反应,而不是金属离子。⑶广炮步甲喷射“炮弹”的防御行为是主要研究内容,实验得知炮步甲对感到有危险的方向有独特的瞄准方式,它主要通过甲虫通摆动腹部姿势,协调足与足之间角度对喷射方向做出初步判断。此后,再由腹部末端的上唇结构进一步对方向做出调整。其喷射持续0.01~0.03s,0.002s左右即有1脉冲波,一次喷射有5~15次脉冲。
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