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[硕士论文] 周媛
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大部分昆虫可在滞育诱导期感受光周期信号的变化从而进入滞育,而昆虫在滞育诱导期对光周期信号的分子响应尚不明确。二化螟Chilo suppressalis是一种重要的水稻害虫,受短光照诱导后可以幼虫形式进入滞育,幼虫3龄期是滞育诱导敏感期。本研究以滞育诱导光周期(LD12:12h)和非滞育诱导光周期(LD16:8h)下的二化螟幼虫为材料,采用了转录组测序、qRT-PCR、基因克隆等技术探究了二化螟滞育诱导期对光周期信号的分子响应,主要结果如下:
  1、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄
  光周期转换试验结果表明,25℃条件下,二化螟幼虫响应光周期信号的敏感日龄为9-12日龄(幼虫3龄时期)。
  2、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异表达基因
  将25℃下,LD12:12h和LD16:8h光周期下的二化螟10日龄幼虫进行比较转录组分析,共得差异表达基因1260个,在滞育诱导条件下上调基因664个,下调基因596个。结果分析表明,差异基因富集到显著富集在Cardiac muscle contraction和Parkinson's disease通路上,同时也富集在ECM-receptor interaction、Calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、Phototransduction-fly等与光信号转导相关的通路上。研究结果为进一探讨二化螟滞育诱导期光信号转导过程提供了基础。
  3、二化螟滞育诱导期光信号转导基因的克隆与表达模式
  对inaD、myosin-Ⅲb(属“Phototransduction-fly”通路),PKG(属“cGMP-PKG signaling pathway”通路)和CBP E63-1这4个光信号转导相关基因进行克隆和表达模式分析。结果表明PKG、myosin-Ⅲb可能在滞育诱导期对光周期信号进行转导;CBP E63-1、inaD可能主要在滞育诱导后期对光周期信号进行转导。结果说明这4个基因可能参与二化螟滞育诱导期响应光周期信号的调控。
  本研究明确了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄,获得了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异基因,分析了与光信号转导相关基因在二化螟滞育诱导期的表达模式。研究结果为明确二化螟滞育诱导期对光周期信号的响应机制奠定了基础,同时可为昆虫滞育诱导期光信号转导机制的研究提供参考。
[硕士论文] 孙新新
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:白蚁能够高效降解木质纤维素,其降解木质纤维素的速率超过了木腐真菌和其他的食草动物。白蚁肠道中存在多种共生微生物,根据白蚁后肠有无鞭毛虫,将白蚁分为低等白蚁(有鞭毛虫)和高等白蚁(无鞭毛虫)两大类。高等白蚁根据食性分为食木/草白蚁、食土/腐殖质白蚁和培菌白蚁。
  培菌白蚁属于大白蚁亚科,其在菌巢中培养真菌鸡枞菌。在干旱的热带地区培菌白蚁可以降解90%以上的木质材料,所以培菌白蚁在碳循环中具有重要的作用。培菌白蚁和许多的微生物共同进化,不仅包括具有木质纤维素降解能力的鸡枞菌,还包括肠道共生微生物以及菌巢中的细菌。白蚁-真菌-共生微生物系统将木质纤维素彻底降解。为了探究白蚁肠道微生物如何帮助白蚁消化食物,本研究以培菌白蚁—黄翅大白蚁为研究材料,对其肠道微生物进行研究。
  首先,采用高通量测序的方法,比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠共生微生物(细菌、真菌和古菌)的多样性。分析结果发现,白蚁前肠和中肠的优势细菌菌门为Proteobacteria(变形菌门),后肠的优势细菌菌门为Bacteroidetes(拟杆菌菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门);白蚁肠道的优势真菌菌门为Ascomycota(子囊菌门);白蚁肠道的古菌85%为未知古菌,鉴定到的古菌大多数与甲烷的产生有关。Alpha多样数指数表明,后肠细菌多样性高于中肠和前肠;中肠真菌多样性高于后肠和前肠;前肠古菌多样性高于中肠和后肠。黄翅大白蚁不同肠道区域的肠微生物菌群结构存在明显的差异。
  然后,利用传统的分离纯化方法,以几丁质为唯一碳源的培养基分离培养能够降解几丁质的后肠微生物。根据胶体几丁质水解圈的大小筛选可以降解几丁质的微生物。然后通过形态学、生理生化以及16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。从黄翅大白蚁后肠中筛选到8株能够降解胶体几丁质的细菌,它们分别属于Flavobacterium(黄杆菌属)、Dactylosporangium(指孢囊菌属)、Brevibacillus(短芽孢杆菌属)、Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)、Paenibacillus(类芽孢杆菌属)、Cellulomonas(纤维单胞菌属)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)。纯化的8株菌,均具有几丁质、EG和BG酶活。这一研究为了解白蚁肠道微生物协助白蚁消化食物机制提供了依据。
  最后,将第二部分得到的新菌Cellulomonas macrotermitis进行分类鉴定。
  本文以培菌白蚁黄翅大白蚁为研究材料,比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠微生物菌群结构的差异;从后肠中分离培养了8株能够降解几丁质的细菌,为肠道微生物协助白蚁降解食物提供了依据;对新菌Cellulomonasmacrotermitis进行了鉴定。通过上述研究表明,黄翅大白蚁肠道中存在许多的共生微生物,这些微生物在参与白蚁的碳代谢、氮代谢以及抵御病原体的侵染方面均具有潜在的作用,但具体作用还需进一步研究。
[硕士论文] 韩晓林
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及意义:
  昆虫发育是一个受到激素调控高度协调的过程,激素调节特定蛋白质的表达,表达后的蛋白质行使功能,完成昆虫的发育。昆虫发育分为完全变态发育昆虫和不完全变态发育昆虫。不完全变态昆虫的幼虫和成虫有一定的差异,而完全变态昆虫幼虫和成虫的形态差异十分巨大。完全变态昆虫的生活史包括卵、幼虫、蛹和成虫,在幼虫向成虫的转变过程中,涉及到组织重建。通过程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD),将幼虫的组织降解掉,同时特定的细胞分化增殖来形成成虫的组织。组织重建过程中,幼虫中肠的重建十分重要,在幼虫中肠PCD过程当中,多种蛋白酶参与到这一过程当中,目前研究发现的蛋白酶包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、及组织蛋白酶F以及组织蛋白酶D,这些组织蛋白酶在昆虫的发育中起着非常重要的作用。组织蛋白酶的活性位点不同,依据活性位点,组织蛋白酶分为精氨酸组织蛋白酶(D,E)、半胱氨酸组织蛋白酶(B,C,H,F,K,L,O,S,V,W)、以及丝氨酸组织蛋白酶(A,G)。其中,组织蛋白酶B、D、L等在鳞翅目昆虫的发育中有着重要的作用,参与到虫体的组织重建以及免疫过程当中。
  存在的科学问题:
  虽然有研究表明在虫体中肠组织重建的过程中,CathD的mRNA表达会升高,但是CathD作为一种蛋白酶,有着酶原形式和活性形式,它们的表达有着什么变化?它在组织重建过程中的中肠的定位情况如何?它对于棉铃虫的中肠重建中起着什么功能?
  研究结果:
  1.CathD具有组织特异性分布,表达在虫体的表皮和中肠。
  2.CathD表达有时空差异,表皮中只在蛹期有表达,中肠中在变态蜕皮期和蛹期有表达。
  3.CathD在虫体中肠重建过程中定位于虫体的旧中肠中。
  4.干扰之后虫体虫体化蛹延迟,幼虫中肠的PCD受到抑制。
  结论及意义:
  在虫体中肠重建过程中,CathD主要以活性形式存在,定位于幼虫中肠当中,有着促进幼虫中肠PCD的作用;在蛹期成虫的表皮形成过程中,CathD以酶原形式存在,它的定位以及作用还需实验验证。
  我们首次使用免疫印迹的方法对CathD在虫体发育中的表达情况作了检测,发现酶原形式出现在表皮组织当中而活性形式出现在中肠当中。活性的CathD定位于幼虫中肠中,有着促进幼虫中肠PCD的作用。
[硕士论文] 康玮楠
动物学 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:打斗行为在动物界广泛存在,个体之间常常为食物、领地、异性等资源发生打斗。长颚斗蟋雄成虫具极为发达的打斗武器,在争夺领地或配偶时会发生打斗,且打斗获胜雄成虫获得更高的资源占有优势。本文以长颚斗蟋(Velarifictorusaspersus Walker)为材料,检测了不同经历(飞行、获胜、失败)和雌虫资源对雄成虫打斗行为的影响,探讨了章鱼胺受体激活剂—杀虫脒(chlordimeform,CDM)对其打斗及打斗获胜后呜叫行为的调控,观察了雌成虫的打斗行为及不同资源(洞穴和雄成虫)对其打斗行为的影响。
  获得以下主要结果:
  1不同经历对长颚斗蟋雄成虫打斗行为的影响
  飞行经历和获胜经历可以明显提高长颚斗蟋雄成虫的斗性,但打斗等级均未达到最高等级,而失败经历则显著抑制其斗性;在有雌虫资源存在的情况下,雄成虫斗性显著提高,出现激烈的身体搏斗行为,其打斗等级显著高于具飞行和获胜经历的雄成虫,显示长颚斗蟋雄成虫的打斗行为具明显的可塑性。
  2章鱼胺特异性受体激活剂—CDM对长颚斗蟋雄成虫打斗行为的影响
  浓度梯度的实验结果显示,以0.15 mol/L的CDM丙酮溶液处理长颚斗蟋雄成虫,其打斗等级和打斗时长的提升效果最为明显。CDM能显著提升失败者的斗性,而对胜利者的斗性无显著影响;CDM处理,可以显著抑制飞行经历及雌虫资源对斗性的提升效果。说明章鱼胺仅是调控长颚斗蟋雄成虫打斗行为的生物胺之一,要达成打斗的最高等级,还有其他的通路的参与。
  3章鱼胺特异性受体激活剂—CDM对长颚斗蟋雄成虫呜叫行为的影响
  飞行、获胜经历和雌虫资源能够显著降低打斗后获胜者胜利声呜叫次数。经CDM处理,不同社会经历雄成虫打斗后呜叫行为均受一定程度的抑制,其中,具飞行经历的抑制效果最为显著。说明章鱼胺系统的激活可抑制长颚斗蟋雄成虫的呜叫行为。
  4洞穴资源对长颚斗蟋雌成虫打斗行为的影响
  长颚斗蟋雌虫之间一般不发生打斗行为,但是有洞穴资源存在的情况下,为占据洞穴,其斗性显著提升。无论是长翅型组合还是短翅型组合,占穴者的胜率超过70%,均高于进攻者,且长翅型防守者胜率显著高于短翅型防守者。说明洞穴被长颚斗蟋雌虫视为重要的资源,不同翅型的长颚斗蟋雌虫存在打斗策略差异。
[硕士论文] 唐帅
生物学 浙江师范大学 2016(学位年度)
摘要:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质氨基酸,于动植物、藻类、细菌和真菌中广泛存在。在动物神经组织中,作为一类抑制性神经传递物质,具有降血压、增进神经营养、增加采食行为、增进生长、抗衰老、治疗癫痫、活化肾功能、肝功能等多种生理功能。常作为食品及饲料等领域中的一种添加剂。
  本研究为探索发现新型药用发酵生产菌,从昆虫肠道特境入手,筛选产γ-氨基丁酸等活性氨基酸的昆虫肠道共生菌并作相关实验研究。
  首先,本研究从白蚁、蜜蜂、蝗虫、蜻蜓等数十种昆虫肠道中分离得到昆虫肠道共生菌270多株。采用薄层层析定性分析法(TLC)初筛,Berthelot比色法及高效液相色谱法(HPLC)复筛,获得多株产γ-氨基丁酸(GABA)菌株。对从昆虫肠道筛选得到的产GABA共生菌株进行显微形态及生理生化特性研究初始鉴定,对三株产量较高的菌株进行了分子生物学鉴定,对其中一株高产FE-7菌株扩增序列系统发育分析,鉴定FE-7为芽孢杆菌属(Bacillus)的一个可能的新种,并作为后续研究菌株。该菌发酵液中GABA含量初测为2.1 g/L以上,表明从昆虫肠道特境中筛选产γ-氨基丁酸菌株具有挖掘开发前景。
  其次,以实验确定的最佳诱变条件对菌株FE-7进行了硫酸二乙酯(DES)化学诱变和紫外复合诱变处理,选取数株诱变处理菌株进行发酵试验,得到1株产量提高的突变株,编号UD-36,传代后其遗传特性较为稳定,其GABA产量为2.64 g/L,比菌株FE-7提高24.7%。
  其中对三株昆虫肠道共生菌进行了单因素发酵试验,分析比较了他们最佳碳源和氮源利用情况,得出突变株UD-36利用葡萄糖作为碳源,蛋白胨作为氮源时GABA产量较高,之后以单因素实验结果对突变株UD-36发酵转化条件中的四个主要影响因素进行了L9(3)4正交优化实验,确定该菌最佳发酵条件为葡萄糖5 g/L,蛋白胨25g/L,谷氨酸10 g/L,pH5.5。优化发酵后GABA产量可达3.31 g/L。
  最后,对昆虫肠道共生菌UD-36的发酵产物中其它氨基酸组分进行了测试分析,测试结果显示发酵物中18种氨基酸种类齐全,分析比较了其中必须氨基酸和非必须氨基酸成分比例及药用氨基酸成分比例情况,并对菌体发酵物的营养价值进行分析评估。其中菌体发酵物中含量最高的前五氨基酸为Glu(2.51 mg/100g),Asp(1.64mg/100g),Leu(132 mg/100g),Lys(1.30 mg/100g),Ala(1.06 mg/100g),第一限制氨基酸为Val。其含有的7种必须氨基酸含量占氨基酸总量的48.60%,高于WHO/FAO的规定标准(40%);药用氨基酸含量占氨基酸总量的61.69%,高于漆枯草(43.31%)和松茸(60.09%)。
[博士论文] 李尧
生物学;动物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:变态发育是昆虫发育中最具特色和最为重要的现象,也是昆虫对外界环境长期适应进化的结果。根据发育过程中是否存在蛹期把昆虫分为完全变态与不完全变态两大类。完全变态昆虫被认为是昆虫纲中进化程度最高的一群,其一生要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。通常完全变态昆虫的成虫形态和大小是由蛹个体长度大小来决定的。然而,哪些因素影响了昆虫蛹体长度的大小呢?已有的研究发现蛹体长度大小的形成涉及一系列的基因表达、网络调控和激素调节,其发育调控机制极其复杂。目前,人们对于这一机制的了解还只是冰山一角,特别是miRNA如何调控昆虫蛹期发育更是知之甚少。miRNA是一类21~24nt的非编码小RNA,其通过调控靶基因的转录后表达水平发挥生物学功能。由于成熟miRNA的片段较短以及靶基因众多等特点导致目前对miRNA确切的和多样化的功能研究较为困难,因此利用生物信息学和分子生物学实验相结合方法对miRNA调控昆虫蛹体长度大小进行深入研究,不仅对深刻揭示miRNA在昆虫变态发育中的调控机制具有重要的理论意义,而且对农业昆虫的防治也具有重要的实践价值。
  黑腹果蝇是完全变态昆虫同时也是经典的模式生物,因此本论文选取黑腹果蝇为研究对象,对miRNA调控黑腹果蝇的蛹体长度大小进行研究。分析黑腹果蝇miRNA的表达谱,发现miR-11在三龄幼虫后期到预蛹期均出现表达量的增加,而在其它阶段表达量较低。进一步对miR-11所属家族进化分析发现miR-11只在完全变态昆虫中保守,而不完全变态昆虫中没有发现miR-11的存在,这些结果暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹期发育调控。为了验证这一假设,论文进行了以下研究:
  1.利用RMCE技术和Gal4/UAS系统构建了miR-11的敲除或缺失品系以及miR-11的过表达品系,并且对miR-11突变品系进行表型观察,发现miR-11的敲除或功能性缺失突变体品系会导致黑腹果蝇蛹体长度和重量均变大,而miR-11全身过表达品系则出现蛹期致死。对一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹和成虫五个不同发育阶段表型观察及体长测量排除了发育延迟导致蛹变长的可能,同时发现miR-11的敲除会导致蛹和雌雄成虫的体长均出现增长,而幼虫期的miR-11敲除品系与野生型相比没有显著性差异。敲除或者抑制miR-11活性能够使黑腹果蝇在变态过程中形成体长较大的蛹,暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹体长度大小的调控。
  2.为了揭示miR-11调控黑腹果蝇的蛹体长大小的机制,利用生物信息学技术对miR-11的189个靶基因进行信号通路富集性分析,发现这些靶基因主要涉及Ras/MAPK信号通路,并且miR-11能够靶向Ras/MAPK通路中的Ras85D和Sos基因。进一步对miR-11与Ras85D、Sos基因的靶标关系进行体内和体外验证,发现miR-11能够作用Ras85D基因的3'UTR区域,而无法靶向Sos基因的3'UTR区域,表明miR-11可能是通过靶向Ras85D基因来调控蛹体长度大小。
  3.为了证明是否miR-11直接靶向Ras85D来调控蛹体长度大小的形成,对靶基因Ras85D在miR-11诱导的蛹缺陷表型中的作用进行了研究。我们运用基础遗传学方法构建双突变体:同时敲除miR-11和抑制的Ras85D的功能品系,发现双突变株能够挽救了miR-11敲除株的表型缺陷。对Ras85D和miR-11的时间表达模式分析,发现m iR-11和Ras85D的表达量在化蛹以后的呈现此消彼长表达模式。这些结果表明miR-11在整个变态发育过程中抑制Ras85D的表达,并且通过直接靶向Ras85D调控蛹体长度大小的形成。
  综上所述,我们利用生物信息学结合分子生物学实验的有效手段,证明了黑腹果蝇miR-11可以通过直接靶向Ras85D的3'UTR进而调控蛹体长度大小的形成,最终参与了蛹期变态发育的调控。论文结果为miRNA调控昆虫变态发育提供了有力的和切实的实验证据;为深入揭示昆虫变态发育的调控机制提供了新视角和有益的启示;生物信息学和分子生物学技术相结合的手段能有效地发现miRNA的靶基因和功能,这为进一步研究miRNA的潜在功能提供了新的研究策略;揭示miR-11调控昆虫变态发育的机制将对于农业害虫防治也具有深远意义。
[博士论文] 赵文丽
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:随着分子生物学技术的发展,人类研究昆虫发育的机制有了更好的平台。通过阐明昆虫发育的分子机理,可以为人类研究与疾病相关的生理过程提供参考和理论依据。全变态昆虫的整个生命周期要经历多次蜕皮,包括幼虫各龄期之间的蜕皮、幼虫向蛹过渡的变态蜕皮以及蛹到成虫的羽化蜕皮。昆虫的发育和蜕皮变态过程主要受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)共同调控。因此,阐明20E膜信号通路终止机制和JH胞内受体Methoprene耐受基因1(Met1)传导JH信号的机制具有重大意义。
  国内外研究进展及科学问题
  目前关于昆虫JH功能的研究主要集中在对其受体功能机制的研究上,关于最有可能的JH受体Methoprene耐受基因(Met)的研究结果有很多。Met结合JH后和bHLH-PAS家族其他蛋白一起作为复合体结合到Krh1基因启动子区域JH响应元件(JHRE)中的E-Box上,启动Krh1的转录,进而传导JH信号;在赤拟谷盗中干扰Met,会引起幼虫的早熟变态。超气门蛋白(USP)参与20E信号通路的同时还能与JH结合。Met作为JH的胞内受体如何传导JH信号,USP如何与Met相互作用一起参与JH通路,这些科学问题的答案尚不明确。20E膜信号通路是目前的研究热点,20E最有可能的膜受体是GPCR。G蛋白偶联受体激酶(GRK)最著名的功能是磷酸化G蛋白偶联受体(GPCR),使GPCR信号脱敏。棉铃虫中的GRK2分布在细胞质中,GRK2如何在20E的诱导下由细胞质移位至细胞膜终止GPCR的功能,GRK2是否介导20E膜信号的终止都是目前研究的热点科学问题。
  结果:
  本文以棉铃虫及其表皮细胞系为实验材料,通过体内和体外实验,运用分子生物学技术,深入研究了Met1和GRK2在棉铃虫生长发育中的功能及机制,获得如下结果和结论:
  1.磷酸化的Met1和非磷酸化USP1形成转录复合体促进基因转录维持幼虫状态Met1的表达被JHⅢ上调,但是被高浓度的20E抑制。虫体干扰Met1导致提前化蛹。Met1通过促进JH通路基因转录和抑制20E通路基因转录来维持幼虫状态。无激素时,存在Met1-Met1-USP1复合体;JHⅢ诱导下,Met1的PAC结构域发生磷酸化导致Met1同源二聚体解离,Met1和Hsp90,USP1一起以复合体形式结合到Krh1基因启动子中的JHRE序列上起始Krh1的转录;在20E诱导下,USP1的第21位丝氨酸发生磷酸化,打破Met1与USP1的结合并破坏Met1-Met1的二聚化,Met1以单体形式存在,磷酸化的USP1与20E的核受体EcR-B1结合形成转录复合体传导20E信号。
  2.GRK2终止GPCR在细胞膜上传导20E信号的功能
  GRK2蛋白在虫体变态时期高表达,GRK2的表达被20E上调。在虫体干扰GRK2导致化蛹进程加速、20E通路基因转录上调和凋亡变态过程的提前。20E通过细胞膜上的ErGPCR-2调控PKC磷酸化GRK2的第680位丝氨酸,导致GRK2的膜转位;位于细胞膜上的GRK2结合ErGPCR-2并使之磷酸化导致ErGPCR-2的内吞,进而终止ErGPCR-2传导20E信号的功能。20E和GRK2之间存在负反馈调控机制。
  结论:
  Met1通过抑制20E通路并促进JH通路基因转录来维持幼虫状态,磷酸化的Met1和非磷酸化USP1一起传导JH信号,本文的研究结果为JH维持昆虫幼虫状态抑制变态发生提供了新的实验证据和理论支持。通过对GRK2的功能研究,揭示了类固醇激素20E终止的机制,阐明了GRK2和ErGPCR-2相互作用使20E通路在虫体中正常的发挥作用不致过量。为昆虫发育及蜕皮变态提供了新的理论知识,为害虫防治提供的新的靶标。
[硕士论文] 裴旭阳
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:背景、科学问题和研究意义:
  钙离子是一种十分重要的信号分子,它参与调节生物各种生理活动,包括细胞分裂生长、程序性死亡、组织分化和发育等。钙离子水溶性较差,因此细胞中自由的钙离子浓度被严格控制在大约100nM的极低水平,而胞外钙离子浓度可以达到1mM。在信号来临时,钙离子通过钙通道从内质网释放或从细胞外进入,结合钙调蛋白并激活钙调蛋白激酶,调控基因表达。而进入细胞的钙离子通过钙泵被储存在内质网中或排除胞外。生物体内主要有3类钙离子通道,包括电压门控钙通道、受体控制钙通道和钙库控制钙通道。其中,钙库控制钙通道又称为储存调控型钙离子通道(store-operated calcium channel,SOC)是非神经兴奋性细胞中的钙通道,在细胞接收信号后由磷脂酶产生三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate,IP3),IP3结合内质网上的IP3受体(IP3R),导致细胞内质网中储存的钙离子排空,内质网膜上的Stim蛋白感受到内质网中钙离子减少发生聚集,与细胞膜上的钙离子通道Orai结合使Orai开放,使细胞外的钙离子流入到细胞内。钙离子在昆虫的变态发育中起到重要作用,在变态期,钙离子主要受到20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(juvenile hormone,JH)的调控。前期研究发现20E调控细胞内钙离子增加,但调控机制不清楚。本文主要研究了Orai1是否参与了20E诱导的钙流动,若是参与,它的开放机制又是什么,对昆虫的生长发育又产生什么影响。本研究有助于了解20E调控的钙离子加的机制,进一步揭示昆虫的生长发育机理,为害虫的防治提供新的靶标基因。
  结果:
  棉铃虫是一种完全变态的鳞翅目夜蛾科昆虫,我们以棉铃虫幼虫和表皮细胞系为研究材料,通过激素刺激和干扰、细胞系上过表达等方法,探索了Orai1在棉铃虫的虫体生长发育中的作用,并探明了20E所诱导的钙离子流动的钙通道的类型,并初步了解了Orai1的开放激活机制。以下是研究的结果:
  在虫体中,Orai1的表达量在变态期达到峰值,20E在虫体和表皮细胞系均可以诱导Orai1的基因高表达;而在虫体中干扰Orai1可以影响棉铃虫的变态,推迟棉铃虫的化踊时间;在虫体和表皮细胞系中干扰Orai1可以抑制20E下游的基因的表达。结果说明Orai1受到20E调控并参与变态。20E诱导的钙离子增加有内钙释放和外钙内流两个峰,用IP3受体的抑制剂处理细胞后,钙离子的两个钙峰均下降。表皮细胞系上干扰Orai1后,20E诱导的钙峰的第二个峰受到抑制。说明20E诱导的钙离子内流是Orai1介导的SOC型钙离子内流。在表皮细胞系上单独过表达Orai1或Stim1,20E诱导的钙流峰并没有明显变化,而同时过表达Orai1和Stim1后,20E诱导的钙流峰大幅上调,说明Orai1需要Stim1来激活钙离子流。在表皮细胞系中共转染Orai1-GFP和Orai1-RFP,利用免疫共沉淀实验,可检测到二者有相互作用,而20E刺激后,两者的相互作用量明显上调;20E的上调作用可以被GPCR的抑制剂和PLC的抑制剂所抑制,干扰掉ErGPCR1、PLCG1和Stim1也可以抑制这种上调作用。说明Orai1至少是以二聚体存在,20E可诱导Orai1的聚集和开放。
  结论:
  通过以上实验结果可以得出结论:20E诱导的钙离子内流是一种Orai1所介导的SOCE,并由,Orai1通过聚集来开放。
  创新点和意义:
  本研究揭示了20E诱导的钙离子增加是Orai1介导的SOCE;丰富和完善了20E调控途径;阐明了Orai1在昆虫生长发育中的作用,并为害虫控制提供了新的靶标分子。
[硕士论文] 李静
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:蜱是世界上仅次于蚊子的第二大吸血节肢动物。吸血过程中不但破坏宿主(包括人)皮肤组织造成多种病原体侵染,同时蜱类也是多种极其危险病原体的传播媒介,如伯氏疏螺旋体、粒细胞无性体、斑疹伤寒等。因此对其研究具有重要的意义。雌蜱在吸血过程中身体会经历巨大的变化,特别是交配完成后,雌蜱体积会迅速增大数十倍,最终依靠大量的血液提供原料和能量来完成产卵活动,因此全面了解蜱类不同吸血期的标志性分子对于分析这一物种特殊的生活史具有重要的意义。除此之外蜱类的重要器官----唾液腺具有特殊的生理机能,可以促进蜱类在短时期内大量吸血,因此解析唾液腺的分子机能对于全面了解并开展蜱类的综合防治具有重要意义。
  本研究采用高通量第二代测序技术(Illumina HiSeq2500)对饥饿期、交配前吸血期、交配后半饱期和饱血期的亚洲璃眼蜱进行了转录组测序,以期找到不同吸血期蜱类所表达的特殊基因,为全面了解蜱类吸血和交配过程中的生理机能奠定基础,同时该数据作为后期开展唾液腺的定量蛋白质组研究的Database,为全面分析唾液腺的生理机能奠定基础。测序结果共得到16.39 GbClean Data,各样品Q30碱基百分比均不小于82.91%。将Clean Data中的Reads进行拼接组装,共得到71586条Unigene。Unigene的N50为2109,预示着基因的组装完整性较高。将这些Unigene与Nr、Uniprot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam七个数据库分别进行BLAST比对,其中在Uniprot库中注释上相关功能的基因数为15414个,同时对差异基因进行GO分析,从“细胞组分”、“分子功能”和“代谢过程”三方面,来对亚洲璃眼蜱生长过程中出现的差异变化进行描述。最终将这些基因翻译成相应的氨基酸序列,作为定量蛋白质组学研究的Database。通过计算Unigene的FPKM值寻找亚洲璃眼蜱体内的表达基因,并比较同一Unigene在四个时期表达值的高低变化,共发现6448个在四个吸血时期均出现表达量变化的基因。同时利用iTRAQ定量蛋白质组学方法对四个吸血时期的雌蜱唾液腺中所有蛋白质进行了高通量定量研究,用114~117四标iTRAQ试剂分别标定四个吸血时期的雌蜱唾液腺蛋白,结果显示在这四个时期表达量均出现变化的蛋白有617个。通过对结果中差异蛋白的分析,使得我们能够更加全面的了解亚洲璃眼蜱唾液腺的生理机能,以及更深层次的调控机制和部分物质的代谢规律,为研究和探寻蜱类的综合防治提供了有力的理论支撑。
[博士论文] 吴忠霞
细胞生物学 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:保幼激素(juvenile hormone,JH)除了在昆虫幼虫阶段拮抗蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的作用而决定昆虫蜕皮或变态之外,它还在许多昆虫的成虫羽化后起促进生殖的作用,但对JH促进生殖的的分子机制仍缺乏了解。飞蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要农业害虫,有很强的繁殖能力。不同于果蝇、伊蚊、家蚕、赤拟谷盗等研究对象的生殖由JH和20E共同调控,飞蝗的卵黄发生、卵巢发育和卵成熟则由JH调控。因此,飞蝗也是研究JH调控昆虫生殖分子机制的一个理想模式。飞蝗的卵巢属于无滋式(panoistic),即卵小管没有滋养细胞或滋养丝,卵成熟所需的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)等由脂肪体合成,通过血淋巴和卵泡细胞的胞间隙运送到成熟过程中的卵母细胞。早期的研究发现,飞蝗羽化后到产卵前的第一个促性腺周期内,脂肪体和卵泡细胞进行内分裂(endocycle),形成高达16倍体的多倍性(polyploidy)细胞,为飞蝗生殖发育所必需,也受JH调节,但不清楚其中的分子调控机制。
  为了解码JH调控飞蝗生殖的分子机制,课题组通过RNA-seq方法获取了JH缺失和JH诱导脂肪体的差异基因表达谱。KEGG通路分析表明,DNA复制和细胞周期信号通路分别位列第一和第四。QRT-PCR验证了DNA复制通路的16个基因和细胞周期通路中的13个基因都在JH诱导下显著上调。本论文首先选择在DNA复制中起核心作用的6个复制解旋酶基因(Mcm2-7)开展进一步的研究。对JH受体Met基因进行RNAi后,发现Mcm3、Mcm4和Mcm7表达水平显著下降。对Mcm4和Mcm7的启动子区域进行序列分析,分别鉴定到Met结合的E-box-like和E-box元件。荧光素酶报告和电泳迁移实验均证明JH受体复合体(Met/SRC)可以结合Mcm4和Mcm7上游的E-box或E-box-like序列,直接调控Mcm4和Mcm7的转录。通过RNAi沉默Mcm4或Mcm7,脂肪体细胞的DNA复制和细胞多倍化严重受阻,Vg表达大幅度下调,卵巢发育和卵母细胞成熟受到显著抑制,表型与JH缺失和Met RNAi相似。这些研究结果表明,Mcm4和Mcm7在JH调控的飞蝗生殖发育中发挥重要作用,JH通过其受体复合体Met/SRC直接调控Mcm4和Mcm7的表达,影响细胞的DNA复制和多倍化,进而调节卵黄生成、卵巢发育和卵母细胞成熟。
  Mcm2-7加载到DNA复制起点形成复制前体依赖于Cdc6,而Cdc6在JH诱导的差异基因表达谱中也显著上调。鉴于Cdc6在DNA复制和细胞周期检控中的重要作用,本论文也对Cdc6在JH调节的飞蝗生殖发育中的功能和调控机理进行了研究。QRT-PCR结果显示,Cdc6的表达不但受JH诱导上调,也在MetRNAi后显著下调。对Cdc6基因上游的DNA序列进行克隆和分析,在启动子区域-1063到-1058处发现一个E-box-like元件。利用飞蝗脂肪体和果蝇S2细胞进行电泳迁移实验都证明Met可以结合Cdc6启动子区域含E-box-like元件的20bpDNA序列。荧光素酶报告实验表明,JH/Met/SRC直接调控Cdc6的转录。Cdc6RNAi和流式细胞实验显示,Cdc6缺失不但显著降低脂肪体细胞和卵泡细胞的倍性,也导致这些组织的细胞分裂;同时,Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟都受到非常显著的抑制;而且,上述表型缺陷在JH处理后并不能恢复到正常水平。这些研究结果表明,Cdc6参与JH调节的飞蝗细胞多倍化和生殖发育,在JH诱导下,Cdc6与Mcm4、Mcm7协同提高DNA复制和细胞的倍性,可能增加包括Vg在内的所有基因的拷贝数,进而促进Vg的大量合成,同步满足所有首卵的成熟。
  此外,本论文还对调控细胞内分裂的E2f1开展了初步研究。E2f1 RNAi造成脂肪体细胞和卵泡细胞的双核或多核化,并显著降低细胞的倍性。与Cdc6、Mcm4或Mcm7 RNAi相似,E2f1 RNAi后飞蝗的Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟也受到显著抑制。论文的初步研究结果表明,E2f1在JH调控的飞蝗细胞多倍化过程中也发挥着非常重要的作用。以后对E2f1的进一步研究将会阐明JH怎样调控E2f1的表达,E2f1如何作用于飞蝗细胞的内分裂和多倍化。
  综合上述研究结果,特别是对JH通过Met/SRC直接调控Mcm4、Mcm7和Cdc6的表达,提高脂肪体细胞和卵泡细胞的多倍化,进而促进Vg的大量合成和卵成熟的解析,揭示了JH促进昆虫生殖的一个重要机制。
[硕士论文] 宋晓彬
动物学 上海师范大学 2015(学位年度)
摘要:前角隐翅虫亚科 Aleocharinae隶属于鞘翅目 Coleoptera、隐翅虫总科Staphylinidea、隐翅虫科 Staphylinidae。前角隐翅虫在世界各地均有分布,它们的生境十分多样。前角隐翅虫的大多数种类都靠捕食小型节肢动物为生;另外有相当一部分种类的前角隐翅虫生活在蚁巢或白蚁巢的周围和内部,它们和蚂蚁以及白蚁有着密切的关系,我们把它们的这种习性称为好蚁性(Myrmecophilous)和好白蚁性(Termitophilous)的。
  对于中国好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫的研究,之前几乎所有的已知种都由外国学者记载,导致中国的模式标本的流失。我国西高东低,呈阶梯状,且跨古北区和东洋区两动物区系,好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫资源十分丰富。为澄清我国的好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫种类资源和建立准确的分类系统,本文以中国好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫多样性研究为题。作者查阅了我国及周边地区好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫有关的资料和文献的基础上,通过对采自浙江天目山、龙王山;广东天河区,梧桐山;广西大瑶山脉、猫儿山、大明山;云南那版河保护区、百花岭保护区;四川米仓山;老挝,日本等地好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫标本共计300余头,进行了对我国好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫的种类总结性研究和系统整理,结果如下:
  1.本论文总共记述了我国好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫5族11属18种,其中包括13新种(7种已正式发表)。
  2.编制了我国短角隐翅虫属的分种检索表。
  3.对所记载的每个种的主要特征进行了拍照和详细描述,附有整体彩图和详细的分类特征图。并标注了每个种的采集数据、研究历史和地理分布。
  4.组建了中国及周边地区好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫属已知种类及其相关同物异名的数据库。
  5.编写了中国好蚁性与好白蚁性前角隐翅虫名录。
[硕士论文] 林芳芳
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:管氏肿腿蜂(Sclerodermus guani Xiao et Wu)是一种专门寄生鞘翅目等钻蛀性害虫的体外聚寄生蜂,可有效防治天牛类、吉丁虫类及部分小蠹类等钻蛀性害虫,具有重要的生物防治应用价值。国内关于管氏肿腿蜂生物学特性和防治应用方面的研究很多,但对肿腿蜂的行为生态学研究比较少。肿腿蜂是寄生蜂中唯一具有准社会行为的类群,因而是研究昆虫生活行为进化的理想模式生物。
  本学位论文研究了管氏肿腿蜂母蜂抚育和子代蜂幼虫数量对其发育表现的影响,寄主体型大小和母蜂数对管氏肿腿蜂产卵前期和发育历期的影响,并测定管氏肿腿蜂的最大生殖力及子代性比等。本研究结果为深入了解管氏肿腿蜂的行为特性、大规模繁蜂提供了新的依据。
  1、管氏肿腿蜂母蜂抚育和初始子代幼虫数对后代发育表现的影响
  为深入了解母蜂抚育对其子代发育的影响,本试验设有、无母蜂存在2个处理水平—当母蜂产卵后移走母蜂或允许母蜂与子代在一起;各水平下分别保留幼虫基数为10、20、30、40和≥50等5个处理水平;青杨天牛Saperda populnca幼虫寄主体型大小(体重)不设固定的梯度。观察母蜂抚育、初始幼虫数和寄主体重等3因素对后代发育适合度相关表现的影响。结果表明,母蜂抚育对子代幼虫发育至成虫的存活率没有显著影响。子代幼虫发育至成虫的存活率随初始幼虫数量增加总体呈下降的趋势,并随寄主体重的增加而增大。母蜂抚育下初始幼虫数和寄主体重对子代蜂的性比均无显著影响,但无母蜂抚育下子代雄蜂所占的比例随寄主体重的增加有增大的趋势。子代雌蜂体重随初始幼虫数的增加而减小,随寄主体重的增加而增大。据研究结果推测,寄主体重和初始幼虫数对子代蜂发育的影响远大于母蜂抚育的影响,故寄主体型大小以及子代数调节可能是管氏肿腿蜂母蜂抚育进化的重要选择因素。
  2、寄主体型大小和母蜂数对管氏肿腿蜂产卵前期和发育历期的影响
  肿腿蜂是寄生蜂中唯一具有母蜂共同产卵于同一寄主、互助抚育子代等准社会行为的类群,如何有效利用寄主是共享寄主的肿腿蜂面临的重要选择压力,为揭示时间相关特征在肿腿蜂生活史中的意义,本研究以管氏肿腿蜂和寄主松墨天牛(Monoohamus alternatus)幼虫为对象,观察寄主体质量和母蜂数如何影响产卵前期和子代蜂各虫态的发育历期等时间相关的生活史特征。结果表明,管氏肿腿蜂产卵前期随寄主体质量增大而延长,但在母蜂较多比在较少时显著缩短,与接1头母蜂相比,接2、4、6和8头母蜂的产卵前期分别缩短17.5%、35.8%、41.3%和49.7%。寄主体质量和母蜂数对卵发育历期没有显著影响,卵历期平均为7.27d;对子代蜂幼虫和蛹历期均没有显著影响,幼虫期平均为6.81d,蛹期平均为14.38d。研究结果说明,产卵前期是肿腿蜂寄生和子代发育的重要特征,而虫态发育历期在母蜂抚育下较少受到环境因素的影响。
  3、管氏肿腿蜂潜在生殖力及子代性比
  本试验利用寄主青杨天牛幼虫,比较管氏肿腿蜂雌蜂在单头和多头寄主上的逐日产卵量和羽化出蜂的性比。研究结果表明,管氏肿腿蜂的产卵量受寄主资源的多少影响,在寄主条件合适并充足的条件下,单头蜂的产卵量约为184.5±9.6(标准差)粒,远高于寄生1头寄主的产卵量37.2±1.2(标准差)粒,出蜂量也远高于寄生单头寄主处理。随着母蜂寄生的寄主数增多,子代雄蜂的比例越来越大,直至全部为雄蜂。多寄主处理的卵孵化率比寄生单一寄主的低,但孵化后幼虫的存活率和子代蜂平均体重却比后者高。在寄主充足条件下,雌蜂产卵量受产卵天数和寄主体重的影响,且两者存在互作。随着产卵天数的增加,产卵量有逐渐下降的趋势,但随着寄主体重的增加,产卵量略有增长。子代性比随母蜂产卵天数的变化趋势显示,随产卵天数或是寄生次数的增加,子代中雄性的比例逐渐上升,直至趋近于1。研究结果说明,抚育子代需付出巨大的生殖代价。
[博士论文] 杨永强
组织工程与细胞工程 重庆医科大学 2015(学位年度)
摘要:第一部分:瘦叶带绿蝇的生长发育规律及在死亡时间推断中的应用
  目的:为了解决死亡时间推断这一难题,本课题对瘦叶带绿蝇在不同恒温条件下的生长发育进行研究,探讨瘦叶带绿蝇的生长发育规律,建立根据瘦叶带绿蝇进行死亡时间推断的模型,为法医学检案提供依据。
  方法:本课题以瘦叶带绿蝇为研究对象,分别在16、19、22、25、28、31、34℃等七个恒温条件下对瘦叶带绿蝇幼虫进行培养,测量不同恒温条件下幼虫长度随生长发育的变化,统计不同温度条件下瘦叶带绿蝇不同发育标志(孵化、第一次蜕皮、第二次蜕皮、离食、化蛹、羽化)发育所需时间。根据不同温度条件下幼虫长度、发育历期分别建立用于死亡时间推断的长度等位线模型、历期等位线模型。根据不同阶段(卵期、一龄期、二龄期、三龄期、离食期、蛹期)的发育历期,通过线性回归分析,总结不同发育阶段的积温常数和发育起点温度,建立积温模型。
  结果:不同恒温条件下瘦叶带绿蝇幼虫长度随生长发育均呈现出先升高后降低的趋势,温度越高,幼虫长度增长速率越快。不同发育标志发育所需时间随温度的升高而缩短,但当温度≥31℃时,化蛹时间、羽化时间有所延长。不同发育阶段的发育起点温度、积温常数被建立。瘦叶带绿蝇总发育历期要求发育起点温度为8.28±0.22℃,积温常数为5747.45±110.25h℃h。三个死亡时间推断模型被建立,即长度等位线法、历期等位线法和积温法。
  结论:本研究首次对瘦叶带绿蝇在不同恒温下的生长发育进行研究,建立了瘦叶带绿蝇幼虫长度随生长发育变化的规律,总结出了不同发育阶段的发育时间。同时,该研究建立了应用瘦叶带绿蝇进行死亡时间推断的三个常用模型,可以使死亡时间推断更简单、更容易推广。本研究还发现≥31℃可能不是瘦叶带绿蝇的最优发育温度,当环境温度高于31℃时,我们利用瘦叶带绿蝇进行死亡时间推断时要非常谨慎。
  第二部分:波动温度对瘦叶带绿蝇生长发育的影响
  目的:为了实现恒温条件下瘦叶带绿蝇的生长发育数据在波动温度(自然环境)中的应用,本课题对瘦叶带绿蝇在不同波动温度下的生长发育进行研究,同时与恒温条件下的生长发育数据相对比,探讨波动温度对瘦叶带绿蝇生长发育的影响,实现恒温下的生长数据在自然环境中的应用。
  方法:本课题以瘦叶带绿蝇为研究对象,实验模拟自然环境建立三个波动温度(14~24)℃、(20~30)℃、(26~36)℃,分别对应平均温度为19℃、25℃、31℃。分别在三个波动温度条件下对瘦叶带绿蝇幼虫进行培养,测量波动温度条件下幼虫长度随生长发育的变化,统计波动温度条件下瘦叶带绿蝇不同发育标志发育所需时间。同时与相应恒温条件下瘦叶带绿蝇的研究结果相对比。
  结果:在平均温度相同的情况下,波动温度与恒温条件下的幼虫长度生长变化趋势基本一致,但局部存在一定的差异。分别在波动温度和恒温条件下利用幼虫长度进行死亡时间推断,最大差异在6h以内。在平均温度为25℃时,波动温度下的总历期与恒温条件下的总历期没有明显差异。平均温度为19℃时,波动温度下的总历期比恒温下的总历期缩短51.96h。平均温度为31℃时,波动温度下的总历期比恒温下的总历期缩短20.04h。
  结论:在平均温度相同的情况下,波动温度对瘦叶带绿蝇幼虫体长的生长发育存在一定影响,但影响程度较小,恒温条件下幼虫长度数据可以在波动温度环境中应用。在平均温度为25℃条件下,在波动温度下的总历期与在恒温条件下的总历期没有明显差异。而当温度过低、或过高时,波动温度下的总历期比恒温下的总历期呈现一定程度的缩短。
  第三部分:被迫离食对瘦叶带绿蝇生长发育的影响
  目的:该部分对瘦叶带绿蝇幼虫在被迫离食情况下的生长发育进行研究,观察幼虫被迫离食后不同时间重新给予食物对幼虫发育历期的影响,探讨被迫离食对死亡时间推断的影响。
  方法:本课题以瘦叶带绿蝇为研究对象,于幼虫不同发育时间(8h、20h、32h、44h、56h、68h)取样使其被迫离食,再于不同离食时间(3h、6h、12h等)重新给予幼虫食物,观察幼虫对食物的反应,统计被迫离食以及重新给食后幼虫化蛹时间、羽化时间及蛹重情况。
  结果:一龄、二龄幼虫被迫永远离食后将停止发育,直至死亡;三龄幼虫被迫永远离食后可以继续发育、化蛹。一龄、二龄幼虫被迫永远离食时,幼虫存活时间随幼虫龄期的延长而延长;在死亡发生之前,幼虫重新得到食物将可以重新取食,并继续发育;但化蛹时间、羽化时间随重新取食时间的延长而延长,化蛹时间、羽化时间较正常对照组最大可延长89.76h、88.02h。未发育成熟的三龄幼虫被迫离食达到一定时间,将进展为不可逆的离食期,但其所形成的蝇蛹较正常蛹重小,其化蛹时间、羽化时间也较正常提前,化蛹时间、羽化时间较正常对照组最大可提前28.61h、52.56h。在温度一定的情况下,蛹期只与蛹重有关;蛹重越小,蛹期越短;蛹期最大可较正常对照组缩短23.95h。
  结论:被迫离食是瘦叶带绿蝇的生长发育的一个影响因素。一龄、二龄幼虫被迫永远离食后将会死亡,未发育成熟的三龄幼虫被迫永远离食后可以化蛹,但蛹体积较小。被迫离食后再重新给食对幼虫发育历期存在一定影响,不同的被迫离食时间、重新给食时间均可导致不同程度的生长发育时间的延长。
[硕士论文] 颜廷婷
农业昆虫与害虫防治 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)属鞘翅目叶甲科,主要危害十字花科蔬菜,在我国分布非常广泛,全年可分春夏季为害和秋季为害两个高峰时期。研究发现黄曲条跳甲雄虫在取食寄主植物时可以产生释放聚集信息素使其发生聚集行为。不过,黄曲条跳甲对喜食寄主植物的种类也会表现出一定的选择性。因此,深入研究和了解黄曲条跳甲对信息化合物包括植物挥发物和聚集信息素的识别的行为与化学机制,对于利用信息化合物防治黄曲条跳甲有重要意义。
  本研究在室内采用四臂嗅觉仪,测定并分析了黄曲条跳甲对不同十字花科蔬菜种类以及植物受到虫害对其嗅觉行为影响,并利用气相色谱-质谱联用仪,检测分析了不同植物和虫体受害后挥发物的差异,初步探讨了其嗅觉行为反应的化学机理。最后利用扫描电镜,观察和分析了黄曲条跳甲触角感器的类型与分布。
  (1)利用四臂嗅觉仪测定了黄曲条跳甲对同一生长期不同寄主植株挥发物嗅觉行为反应,结果表明青菜和甘蓝对黄曲条跳甲诱集率分别为67%和33%,两种蔬菜之间差异极其显著,表明黄曲条跳甲偏好青菜。青菜和花菜相比,同样显示其对黄曲条跳甲诱集率显著高于花菜。但是青菜和白菜之间、甘蓝和花菜之间,其对黄曲条跳甲引诱力无显著差异。
  (2)利用四臂嗅觉仪测定白菜植株不同处理后挥发物在黄曲条跳甲选择中的作用。结果表明,在完整白菜植株、空白对照、雌虫-白菜复合体植株与雄虫-白菜复合体植株之间,无论白菜植株处于4真叶期还是处于8片以上真叶期,雌虫正在取食的白菜植株对春夏季和秋冬季黄曲条跳甲均具有明显引诱作用,但雄虫正在取食白菜植株对黄曲条跳甲表现出明显驱避作用,使其诱集率均小于其他处理和空白对照;在雄虫损伤白菜植株、雌虫损伤白菜植株、雄虫-白菜复合体植株、雌虫-白菜复合体植株之间,大部分黄曲条跳甲选择虫体-白菜植株复合体高于虫伤植株,差异极其显著,以雌虫体-植株复合体偏好性尤为显著,但雄虫-青菜复合体植株和虫伤植株之间,对其选择比列差异并不显著。在试虫-青菜体系中,黄曲条跳甲同样对雌虫-植株复合体偏好性明显。
  (3)四种蔬菜挥发物包含了烷烃类、醇类、酯类、酸类、酰胺类、酮类、萜烯类等多种化合物,还含有苯并三唑、苯并咪唑等含氮物质,同时包括含硫及含氯物质。有10种组分在4种蔬菜植株挥发物都有检测到,但含量上有所差别。四种蔬菜挥发物组分指纹图谱上的这些差异可能是黄曲条跳甲选择性差异的主要原因。
  (4)雌雄虫损伤后白菜植株挥发物种类及含量都发生明显改变,雄虫-白菜复合体植株挥发物的总量上低于雄虫体,同时产生了3种新组分,分别为环己烷、a-石竹烯、a-金欢烯,而雌虫-白菜复合体植株挥发物总量同雌虫体相比不存在十分明显差异,但产生5种新的组分,分别为萘、环己烷、环戊烷,a-石竹烯、a-金欢烯。
  (5)对黄曲条跳甲触角超显微结构的研究发现,黄曲条跳甲触角上有11种感器类型,各类的感器的特点与分布不同,黄曲条跳甲雌雄虫触角感器数量和类型差别不明显。
[博士论文] 张学潮
生物化学与分子生物学 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)是中国东北地区优势蜱种,同时也是蜱媒疾病主要传播媒介。作为一种专性吸血的外寄生虫,血餐摄取不仅对其生活史的完成至关重要,同时也影响着病原菌和微生物群落的增殖与传播。目前,对于全沟硬蜱血餐过程中生理生化和微生物群落变化的研究匮乏,对其携带的病原菌致病机制更是知之甚少。
  本文针对以上问题进行探索性研究,并得到以下结论:⑴利用Illumina测序技术获得全沟硬蜱参考转录组(含有56900条unigene),并首次发现全沟硬蜱可能是利什曼原虫(Leishmania)载体;⑵分别比较了全沟硬蜱不同吸血阶段表达谱,发现其吸血过程中基因表达显著改变,其中未吸血和半饱蜱虫之间差异表达的unigene有12332条,半饱和饱血蜱虫之间差异表达的unigene有3261条。经GO富集分析发现差异表达基因在与血液摄取、营养代谢、呼吸、激素合成、卵发育、免疫反应、活性氧解毒、转录翻译相关的生理过程中显著富集;⑶深入分析了全沟硬蜱代谢解毒酶系和抗氧化酶系,发现这些超基因家族出现物种特异性扩增,且在应对血餐摄取和消化过程中激增的外源物质和氧压时发挥重要作用;⑷利用16S rRNA V4区Hlumina测序全面分析了全沟硬蜱吸血前后微生物群落的变化以及蜱虫叮咬后大鼠血样中微生物群落组成。分别在未吸血蜱虫、饱血蜱虫、大鼠血样中检测出了373、289、441个菌属的细菌,其中237个菌属是该三个样本共有的,推测这些细菌可能是吸血过程中经由蜱虫传播给宿主的潜在致病菌;⑸以蜱传莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi B31A3)为模型,初步分析了病原菌在血餐过程中感染哺乳动物的致病机制。通过基因敲除和动物模型实验分析了莱姆病螺旋体的六个编码蛋白(BBA68-BBA73),发现蛋白BBA68、BBA69、BBA71可能是感染哺乳动物必需的致病因子;⑹制备了两种基因型莱姆病螺旋体(B.burgdorferi B31 A3和B.garinii NMJW1)全菌抗血清,并利用获得的抗血清成功地对莱姆病螺旋体抗原片和幼蜱中肠病原菌进行了血清学检测;此外还利用免疫印迹法,以两种基因型莱姆病螺旋体(B.burgdorferi B31A3和B.garinii NMJW1)全菌裂解物作为抗原,检测全沟硬蜱叮咬后一个月大鼠血清的抗体反应,并分析了不同基因型全菌抗原检测到的特异条带之间的差异。
[硕士论文] 李培光
植物保护 山东农业大学 2014(学位年度)
摘要:蝇蛹金小蜂Nasonia vitripennis是一种重要的蝇蛹寄生蜂,在世界范围内广泛分布。因为其遗传背景清晰、操作简单方便、种群数量大等特点,常常将其用于生物学的试验研究,是一种潜在的模式生物。2010年,蝇蛹金小蜂N.vitripennis的基因组测序也已完成,这大大促进了蝇蛹金小蜂N.vitripennis的相关研究。Wolbachia是一种母系遗传的专性胞内共生菌,在节肢动物及线虫中广泛存在。Wolbachia不仅可以对寄主的生殖方式进行调控(主要为细胞质不相容、雌性化、杀雄和孤雌生殖),也会对寄主的生殖力甚至物种形成产生重要的影响。本文选用8种利福平浓度喂食蝇蛹金小蜂N.vitripennis,探究了不同利福平浓度对蝇蛹金小蜂N.vitripennis存活率的影响并检测了去除蝇蛹金小蜂中Wolbachia的效果。并在该试验结果的基础上对5种利福平处理蝇蛹金小蜂N.vitripennis进行连续饲养,观察记录了3-12代各处理组及对照组蝇蛹金小蜂N.vitripennis的出蜂量及性比的变化。同时研究了Wolbachia对蝇蛹金小蜂N.vitripennis寿命的影响。最终得到如下试验结果:
  ⑴不同浓度利福平对蝇蛹金小蜂N.vitripennis死亡的影响及去除Wolbachia的效果研究。不同利福平处理会对蝇蛹金小蜂N.vitripennis产生显著的影响。随着利福平浓度的增加,蝇蛹金小蜂N.vitripennis的校正死亡率也不断增大。当利福平浓度达到1.0mg/ml时,蝇蛹金小蜂N.vitripennis24h的校正死亡率就高达50%;当利福平浓度达到5.0 mg/ml时,5d的蝇蛹金小蜂N.vitripennis的校正死亡率就高达90%。而低浓度的利福平0.1 mg/ml在7d时,其校正死亡率才达到10.03%,远远低于高浓度利福平处理蝇蛹金小蜂N.vitripennis93.33%的死亡率。因此,在兼顾消除Wolbachia的效率和对蝇蛹金小蜂N.vitripennis影响的前提下,应最大可能地减小利福平的浓度。本试验中,较理想的利福平浓度应控制在0.1 mg/ml~0.5 mg/ml的范围内。
  ⑵不同浓度利福平处理及Wolbachia对蝇蛹金小蜂N.vitripennis出蜂量的影响。因为高浓度的利福平对蝇蛹金小蜂N.vitripennis有潜在的致死威胁,虽经过多代遗传,后代仍表现出高浓度利福平对蝇蛹金小蜂N.vitripennis的影响——降低蝇蛹金小蜂N.vitripennis的出蜂量。高浓度的利福平与低浓度的利福平相比,其降低蝇蛹金小蜂N.vitripennis的出蜂量在8.7%-16.7%之间。Wolbachia也能对蝇蛹金小蜂N.vitripennis产生一定的影响,消除Wolbachia的蝇蛹金小蜂N.vitripennis和对照组相比,其蝇蛹金小蜂N.vitripennis的出蜂量也降低了4%-8%之间。
  ⑶Wolbachia对蝇蛹金小蜂N.vitripennis性比的影响。在试验中,没有发现抗生素会对蝇蛹金小蜂N.vitripennis的性比产生明显地影响,但Wolbachia会对蝇蛹金小蜂N.vitripennis的性比产生明显的影响。试验中发现,自然感染Wolbachia的蝇蛹金小蜂N.vitripennis雌虫的性比在80%-85%左右,而使用抗生素利福平消除Wolbachia的蝇蛹金小蜂N.vitripennis雌虫的性比在65%-70%左右。也就是说,在蝇蛹金小蜂N.vitripennis中,Wolbachia可以提高子代雌虫的比例。
  ⑷Wolbachia对蝇蛹金小蜂N.vitripennis雌蜂寿命的影响。试验中发现使用利福平消除Wolbachia后,对蝇蛹金小蜂N.vitripennis的寿命没有明显的影响。因此可得Wolbachia对蝇蛹金小蜂N.vitripennis的寿命影响不显著。
[硕士论文] 王梦龙
特种经济动物饲养 江苏科技大学 2014(学位年度)
摘要:小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)幼虫是我国名贵中药冬虫夏草的寄主昆虫,主要生活于青藏高原及其周边的高海拔、高寒地区,低温适应性强,但在室温下(25-27℃)不能正常存活。由于虫草价格不断上涨、过度采挖,导致虫草资源日益紧缩;另外,随着全球气候变暖,寄主昆虫的生境温度改变,这对虫草资源也造成了一定的影响。本文针对小金蝠蛾幼虫室温下不能正常存活这一问题,就其生理生化和分子机制进行研究。
  首先,通过对虫体的血淋巴中的氧化损伤标志物——丙二醛(Malonalde hyde, MDA)的测定,发现27℃胁迫后,血淋巴中的MDA含量是对照组的将近2倍,说明虫体内氧化损伤程度严重,大量的膜脂结构发生过氧化,确定了高温胁迫下氧化损伤的存在。对血淋巴中保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶)进行了测定,发现只有过氧化物酶的相对酶活力升高显著,但超氧化物歧化酶以及过氧化氢酶的相对酶活力均没有变化,而在活性氧的清除中,超氧化物歧化酶属于关键环节,可催化超氧阴离子生成过氧化氢,然后由过氧化物酶或过氧化氢酶进一步降解过氧化氢。可见27℃胁迫后,虫体血淋巴中的保护酶相对酶活力整体水平较低,不足以清除过多的活性氧,导致活性氧在体内积累造成氧化损伤。
  其次,从结构上对27℃胁迫后的虫体进行研究,发现其中肠细胞的线粒体出现肿胀、线粒体膜破裂,线粒体内嵴排列混乱,说明小金蝠蛾幼虫在27℃胁迫下,线粒体受到了氧化损伤。
  利用气相色谱-质谱联用技术,对血淋巴及脂肪体进行了代谢组学分析,结果显示血淋巴与脂肪体中的还原性物质,如还原性糖类、氨基酸类含量显著下降,其中血淋巴中胆固醇含量显著性上升,而有研究表明胆固醇与诱导活性氧的生成有一定的关联;通过对磷酸戊糖途径多种物质含量变化的分析,得出磷酸戊糖途径整体代谢水平的变化情况,结果显示,在血淋巴中该代谢途径是增强的,说明该途径为机体提供了大量的还原力NADPH,而酶活测定表明NADPH氧化酶活性是显著性升高的,代谢组数据显示,胆固醇含量显著升高,胆固醇可诱导NADPH氧化酶催化NADPH瞬时生成大量活性氧,所以推测NADPH的升高恰恰得到了一个相反的效果;脂肪体中该途径则是减弱的,说明脂肪体中的还原力水平较低。27℃处理后,虫体内的还原性物质水平低下,虽然血淋巴中磷酸戊糖途径代谢水平提高,提供较多的还原力NADPH,但是由于NADPH氧化酶活力升高,活性氧大量声称,活性氧代谢平衡难以维持,造成氧化损伤。
[博士论文] 刘卫敏
动物学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:蚧虫在分类上属昆虫纲Insecta,半翅目Hemiptera,蚧总科Coccoidea。全世界已记录49科7500余种。在进化上它们与蚜虫的关系最为近缘,是重要的经济昆虫,大多数是农林、果树、花卉的重大害虫。蚧虫的最大特点是体壁具有多种蜡腺,能够分泌蜡质,在虫体表面形成固定形状的蜡层或蜡壳,对虫体起保护作用,化学杀虫剂不易渗入,防治十分困难。
  为探索利用病原真菌感染蚧虫,使其致病死亡,以减少虫口密度和危害,实现生物防治的新途径。本文选择专门危害松林的松干蚧科Matsucoccidae,松干蚧属Matsucoccus的日本松干蚧Matsucoccus matsumurae(Kuwana)作为古蚧类Archaeococcoids的代表,选择分布范围广、寄主多、虫体表面具有厚蜡壳保护的蚧科Coccidae蜡蚧属Ceroplastes的日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus Green作为新蚧类Neococcoids的代表。选择从蚧虫和褐飞虱上分离的病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株、镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株作为试验菌种,研究病原真菌对这两种蚧虫的感染过程,引起的病理学症状和生化反应。
  日本松干蚧部分研究结果如下:
  1、日本松干蚧形态特征、泌蜡特点与发育进度的研究
  日本松干蚧雌雄两性变态复杂,不同龄期的形态结构变化很大,泌蜡特性不同,同时,日本松干蚧在我国东部地区从东北到南方都有分布,气候差异很大,虫体发育出现时间各地都有不同,以往的研究资料不太充分,对于应用病原真菌开展生物防治不能提供科学指导。本研究选择辽宁省抚顺市(LNFS)、山东省青岛市(SDQD)和浙江省金华市(ZJJH)作为三个气候区的代表,在日本松干蚧危害的林区布点,通过野外观测和室内显微观察拍照等方法,详细观察研究日本松干蚧的各龄期的发育、形态特征变化、泌蜡特点、出蛰、越冬、交配、产卵等生物学特性。结果表明,日本松干蚧在上述三个气候区都是一年发生两代,但三个气候区各虫态发育历期明显不同。ZJJH种群春季3月上旬开始出蛰、SDQD种群4月下旬-5月上旬出蛰,LNFS种群5月中旬-下旬才出蛰,LNFS种群在10月份进入越冬期,而ZJJH种群在12月才开始越冬。并发现这些差异与各地的温度变化直接相关。研究发现了日本松干蚧一些新的生物学特性和规律,特别是掌握了二龄珠形期若虫在春季的显露过程、三龄雄若虫分泌蜡丝和结茧行为、雄成虫的羽化、求偶与交配行为、雌成虫的羽化、交配、分泌蜡丝、形成卵囊和产卵行为。这些结果都为开展日本松干蚧的病理学研究和生物防治应用提供了基础。
  2、日本松干蚧雌性生殖系统的显微和超微结构研究
  日本松干蚧成虫期是一个交配和繁殖的时期,雌成虫的体腔内主要由卵巢占据,病原菌在这个阶段对日本松干蚧的侵染必然涉及到卵巢的病理变化,但是以往对雌成虫的生殖系统的结构还没有研究报道。本文采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术研究雌成虫生殖系统的构造,为组织病理学研究提供基础知识。
  结果表明,日本松干蚧的雌性生殖系统由一对卵巢、一个主输卵管、一对侧输卵管、一个储精囊和两对副腺构成。每一个卵巢具有大约50个端滋式卵巢管,卵巢管无端丝,占据体腔大部分空间。每个卵巢管包括一个端部的滋养室,一个生长区和一个末端的卵柄,卵柄与侧输卵管相连。滋养室包含8-10个滋养细胞和2个早期的卵黄发生前卵母细胞。卵成熟后,滋养细胞退化,停滞卵母细胞能够继续发育。生长区包含3-6个处于不同发育阶段的卵母细胞:卵黄发生前、卵黄发生和绒毛膜发生三个阶段。生长区的表面有多边形网状结构花纹,花纹中央具有一个圆形突起。卵母细胞内有大量的卵黄球和脂滴,外部被一单层滤泡细胞包围。首次在蚧虫中观察到滤泡细胞在卵黄发生的开始具有双核细胞;在卵黄发生过程中,卵母细胞质的外围具有副核。本研究结果首次提供了日本松干蚧雌成虫生殖系统的细微结构,为日本松干蚧的分类提供了新性状,为理解整个松干蚧科昆虫的进化地位提供了新的资料,具有重要意义,并为研究病原菌对日本松干蚧卵巢的感染和病理学症状分析提供基础。
  3、昆虫病原真菌蜡蚧霉和镰孢霉对日本松干蚧的致病性研究
  本文试验了昆虫病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株对日本松干蚧四个龄期的致病性。结果表明,四个菌株都能引起日本松干蚧染病和死亡。蜡蚧霉的两个菌株比镰孢霉的两个菌株对日本松干蚧表现出更强的毒力,其中以蜡蚧霉V3.4505菌株的毒力最强,它的感染引起二龄若虫和雌成虫的死亡率分别为61.33%和100%。不同龄期的日本松干蚧对蜡蚧霉V3.4505菌株的敏感性不同,最敏感的阶段出现在雌成虫期和雄性三龄若虫期,但是雌成虫(LD50=1.96)比雄性三龄若虫(LD50=5.67)更容易感病。根据对日本松干蚧在不同发育阶段虫体的形态特征、体表结构、表皮层厚度和蜡壳的研究结果,分析了对病菌侵染敏感性不同的原因。确定了雌成虫和雄性三龄若虫为应用真菌进行生物防治的最佳虫期。这是首次关于病原菌感染日本松干蚧的报道。
  4.日本松干蚧受蜡蚧霉感染的组织病理学和糖代谢变化研究
  以日本松干蚧雌成虫作为研究对象,利用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,研究了病原真菌蜡蚧霉对日本松干蚧的感染过程和组织病理学。结果表明,蜡蚧霉能够快速的侵染日本松干蚧,主要通过体壁侵染。分生孢子在虫体表面附着后萌发很快,染菌12h后,在虫体表面就观察到菌丝。虫体的节间褶、背疤、足的基部和阴门处是病菌最易附着和分布的地方。染菌24h后,观察到菌丝已经穿透体壁,菌丝的入侵导致表皮层的蛋白质和几丁质嵌合结构变形。菌丝进入血腔后,首先侵染血细胞,导致血细胞的细胞膜破裂,细胞器消失,然后侵染其他内部组织。菌丝对肌肉的附着和入侵,导致菌丝周围的肌肉组织发生扭曲变形,肌纤维变得疏松;大量菌丝侵入脂肪体,导致脂肪细胞膜消失,多个脂肪细胞的脂滴融合在一起。卵巢管占日本松干蚧体腔的大部分,观察到菌丝附着和侵染卵巢管表面的滤泡细胞,使滤泡细胞和卵母细胞分离。菌丝在虫体内大量繁殖,耗尽虫体内的营养,菌丝又向虫体外扩散。本研究还发现病原菌可以直接通过阴门侵入虫体内部,对卵巢和相邻器官造成感染。
  利用生化反应和酶标仪测定了日本松干蚧感染蜡蚧霉后,血淋巴中糖代谢指标的变化。结果显示,染菌后,虫体内海藻糖酶的活性呈现先升高后降低的趋势,在染菌后12h,染菌组虫体内的海藻糖降解酶活性就比对照组的高,36h后,其酶活性升高到最大值(0.480±0.020)U/mg,约为对照组的1.5倍。随后海藻糖酶的活性很快下降。同时,染菌后,蚧虫血淋巴内海藻糖的含量逐渐降低,24h后,处理组的海藻糖含量已低于对照组,到96h,其含量只有(0.623±0.047)mM。葡萄糖含量在12h到36 h期间快速上升,36h后达到最高值(0.704±0.029)mM。随后其含量逐渐降低。这三项指标的变化说明,由于病原真菌的感染,引起虫体内海藻糖酶活性的增加,促进了海藻糖降解,转化成葡萄糖,形成了海藻糖酶—海藻糖—葡萄糖的连环反应,最终虫体内的营养被耗尽,虫体死亡。
  本研究结果从组织病理学和血糖平衡两方面揭示了蜡蚧霉如何感染和致死日本松干蚧。
  日本龟蜡蚧部分研究结果如下:
  5.病原真菌对日本龟蜡蚧蜡壳的入侵机制研究
  为了研究病原菌对蚧虫蜡壳的作用机理,选择蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株,以泌蜡量大的日本龟蜡蚧雌成虫作为对象进行研究。结果显示,蜡蚧霉能够成功的穿透日本龟蜡蚧的蜡壳侵入虫体,但是,病原菌在带有蜡壳的蚧虫上的生长、繁殖和入侵速度明显的比在没有蜡壳的虫体上慢,说明蜡壳对病原菌的入侵有阻碍作用;以蚧虫的完整蜡壳、单独蜡质、蜜露分别作为唯一碳源,制备成三种培养基,试验发现4个菌株在这三种培养基上都能萌发生长,形成菌落,说明真菌可以降解蚧虫蜡壳,并利用蚧虫蜡壳成分作为营养物质。4个菌株对完整蜡壳的降解率17.23%-18.70%显著大于对单独蜡质的降解率7.15%-12.78%,说明病原真菌在对蜡壳的降解过程中除了利用蜡质成分,还利用蜜露作为碳源营养。GC/MS分析显示,病原菌主要降解日本龟蜡蚧蜡壳中的酯醇和短链的羧酸酯。生化技术测定菌株代谢的酯酶活性的变化,结果显示酯酶参与了蜡壳的降解,酯酶活性与病原菌对蚧虫的致死率之间呈显著正相关,回归方程:y=0.0127x-0.6605,R2=0.9431。本研究结果揭示了病原真菌降解蚧虫蜡壳的机制。
  6.病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透及胞外酶的作用
  本文研究病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透过程及胞外酶的作用,采用了麦胚凝集素/卵类黏蛋白-胶体金细胞化学标记技术,将胶体金颗粒成功地结合到日本龟蜡蚧原表皮的几丁质上,利用透射电镜首次观察到几丁质的片层结构,发现几丁质纤维丝呈螺旋状排列,并观察到病原菌穿刺进入体壁,导致表皮几丁质片层结构断裂的组织病理学症状,在菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,说明几丁质已被病原菌分泌的胞外酶降解。
  用酶标仪测定病原菌分泌的类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)、几丁质内切酶、几丁质外切酶(β-乙酰-N-葡萄糖苷酶,NAG)和脂肪酶活性,结果显示这四种酶都参与了蚧虫表皮的降解,其中脂肪酶的活力最高值出现的最早,在培养2d后即达到最大值,蛋白酶活性次之,培养3d后达到最大值,而几丁质内切酶和几丁质外切酶的活性在培养4-5d天后才达到最大值。说明这几种酶在降解体壁成分中作用的先后顺序,病原菌在入侵体壁过程中首先接触到上表皮,分泌脂肪酶降解上表皮中的脂肪,然后侵染原表皮,诱导蛋白酶降解蛋白质,几丁质骨架暴露出来,几丁质酶再发挥作用,降解几丁质。在这些酶的联合作用下将表皮降解,以利菌丝穿透体壁。而菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,印证了几丁质内切酶和几丁质外切酶的降解作用。日本龟蜡蚧的致死率与NAG酶活性之间呈显著正相关(R2=0.9109)。
  7.病原真菌对日本龟蜡蚧血淋巴的感染作用研究
  采用透射电镜技术观察了蜡蚧霉进入日本龟蜡蚧血腔后对血细胞的感染作用,在蜡蚧霉侵染初期的样本上,观察到蚧虫血淋巴中的浆细胞和粒细胞将病原菌吞噬并消化的现象;在侵染后期的样本上,观察到大量病原菌侵入血细胞,使细胞膜破裂,细胞器消失;在受损的血细胞中还发现很多髓样小体。
  用酶标仪测定血淋巴中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性,结果显示,这四种酶在蚧虫感染后的2-3d活性值都最高,在后期,血淋巴内的酶活力逐渐下降。同时测定了海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的变化,它们也呈现前期高后期低的变化规律,揭示出海藻糖和葡萄糖含量的变化与海藻糖酶活性呈显著的相关性,说明蜡蚧霉的入侵,对蚧虫免疫系统和糖代谢造成影响,是其致病的重要原因。该研究首次为蜡蚧霉感染蚧虫血淋巴的作用提供了新证据。
[博士论文] 高英
动物学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:白蜡绵粉蚧(Phenacoccus fraxinus Tang)是白蜡树上一种刺吸性害虫,该虫体表具有多种蜡腺,在生长发育过程中可分泌大量对虫体具有保护作用的蜡质。现已在我国多个省市危害猖獗,严重影响了树势和城市景观。化学防治效果不理想,且严重污染环境。对白蜡绵粉蚧的生物防治尚未见报道。在生物防治中,蜡蚧霉(Lecanicilliurn lecanii)和布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)是应用广泛的两种昆虫病原真菌,其代谢物在对昆虫的致病过程中发挥了重要作用。真菌代谢物成分复杂,以往分离纯化代谢物的步骤繁琐且不易得到纯品。高速逆流色谱技术是一种新型的分离技术,已经广泛应用于天然产物的分离纯化,但利用高速逆流色谱技术分离纯化病原真菌代谢物的报道很少。
  本文研究了L.lecanii3.4505对白蜡绵粉蚧的致死率,通过光学显微镜、扫描电镜与透射电镜研究了蜡蚧霉对白蜡绵粉蚧的侵染过程以及白蜡绵粉蚧被感染后的组织病理变化。同时,利用高速逆流色谱对L.lecanii3.4505和B.brongniartii2382菌株的代谢产物进行分离纯化,利用GC/MS分析检测分离产物。这些研究可为昆虫病原真菌的杀虫机制研究和利用该菌防治害虫提供理论依据。
  研究结果如下:
  1.L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫生物测定结果显示:L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫有较高的感染致死率,2d后雌、雄若虫的死亡率就达到40%以上,5d后的死亡率达到90%。该菌能在短时间内完成对白蜡绵粉蚧虫的侵染,这可能是由于白蜡绵粉蚧2龄若虫本身虫体弱小和分泌的粉状干蜡尚不能够阻止蜡蚧霉入侵。
  2.采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,系统地观察研究了L.lecanii3.4505菌株孢子在白蜡绵粉蚧若虫体表附着、萌发、菌丝穿透体壁的过程和对内部组织的侵染及其引起的组织病理学变化。研究发现:L.lecanii3.4505分生孢子感染蚧虫后,分生孢子主要附着虫体节间褶、体表的凹陷处、与寄主植物接触的体缘部位,这些地方成为蜡蚧霉侵染蚧虫的重要途径,这表明蜡蚧霉孢子可冲破蚧虫蜡质的疏水性和抑菌作用在虫体某些部位附着。孢子随后萌发,一端膨大形成附着胞,紧紧固着在体表。芽管继续生长形成菌丝,菌丝沿寄主体表在蚧虫分泌的蜡质中穿过,有些菌丝前端特化形成锥状侵入钉,并寻找合适的入侵位点穿透寄主表皮。孢子或菌丝在生长过程中分泌大量的粘液,这些粘液会对寄主表皮造成明显的物理性破坏。染菌2d后,菌丝已经将寄主体壁结构破坏完全进入其体内。进入血腔之后,菌丝利用寄主血腔中的物质作为生长所必需的营养物质迅速生长,生成大量的芽生孢子。血细胞中的各种细胞器都被破坏,内质网扩张、聚集成指纹状;线粒体变形、肿胀、膜破裂、嵴突变形。肌肉中肌细胞内的线粒体同样遭到严重破坏,肌原纤维界限不清,成不规则状态,部分肌丝断裂甚至溶解。气管、脂肪体、马氏管、肠和神经节等多种内部器官均受到不同程度的破坏,最后菌丝完全占据了寄主的整个血腔,整个虫体被白色的菌丝体包裹,菌丝成辐射状向外延伸。
  3.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5)从蜡蚧霉发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到苯酚、二甲苯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯。其中邻苯二甲酸二丁酯的含量较高,面积归一法计算纯度为98%。
  4.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5)从白僵菌发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到2-香豆满酮、间甲基苯甲酸甲酯、对甲基苯甲酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯。GC检测其纯度分别为81%、89%、80%和78%。
  5.白僵菌代谢物测定结果表明,间甲基苯甲酸甲酯和对甲基苯甲酸甲酯均对油松毛虫产生不同程度的毒性。间甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是饲喂法34.44%、接触法35.56%、注射法87.78%,而对甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是37.78%、38.89%、91.11%。
[硕士论文] 张毅
动物学 山西大学 2014(学位年度)
摘要:红环瓢虫( Rodolia limbata Motschulsky)属于鞘翅目( Coleoptera)瓢虫科( Coccinellidae),是草履蚧的主要捕食性天敌。草履蚧( Drosicha corpulenta(Kuwana))属于半翅目Hemiptera,蚧总科Coccoidea,对经济果林尤其是柿树有极大危害。丽草蛉( Chrysopa formosa Brauer)属于脉翅目( Neuroptera)、草蛉科(Chrysopidae),在我国大部分地区均有分布,是各类蚜虫及草履蚧等蚧虫及粉虱的重要天敌昆虫。本研究着重从结构方面阐述红环瓢虫和丽草蛉作为草履蚧的捕食天敌的头部感器,并结合趋性行为测试,探究红环瓢虫和丽草蛉作为草履蚧捕食性天敌的结构基础。于2012年和2013年在运城市稷山县柿树林内采集试验昆虫样本,在实验室条件下进行试验和观察,内容包括:
  1、于2012年4-6月份测试了红环瓢虫对草履蚧等害虫气味以及环境中相关气味的趋性测试,并与异色瓢虫对相关气味的趋性测试结果进行了对比,结果表明:红环瓢虫成虫对草履蚧幼虫和虫卵有明显的趋性;其幼虫对草履蚧雌成虫有明显趋性;异色瓢虫对生境中各种害虫都有明显趋性。以上天敌对害虫的趋性行为反应与害虫虫体气味浓度相关,天敌在气味浓度必须达到一定程度时才能表现出明显的趋性;
  2、于2012年至2013分别采集红环瓢虫雌雄成虫和幼虫,并对其头部感器的进行光学显微、扫描电镜和透射电镜的观察,结果表明:
  红环瓢虫雌雄成虫的触角均为棒状,由柄节、梗节和6个鞭节组成。其上发现有毛形、刺形和锥形三种感器,各种感器长短不一,分布不同,其中锥形感器集中分布于鞭节的4-6亚节,以末节端部最为密集。成虫下唇须上只发现一种栓锥感器,下颚须上的栓锥形感器分为两种,且Ⅱ型数量极多。Ⅱ型栓锥形感器顶部由圆形突起和小孔,且内部可看到有两束树突,Ⅰ型栓锥感器顶端尖细有顶孔,内有一束树突伸入,而毛形结构和齿形结构是表皮几丁质的延伸,无神经元结构。
  四龄幼虫触角短,圆锥状,分为三节,感器只有毛形和锥形两种,且数量极少,超薄切片中发现触角基部厚壁的毛形感器,感器基部未见神经元;锥形感器壁薄,感器基部可见鞘细胞围绕的神经元。幼虫的下颚须和下唇须顶端分布着两类栓锥形感器,幼虫的栓锥感器很短,未见树突伸入其中,但基部可见神经元分布。
  成虫和幼虫的下颚须和下唇须形态上虽有很大区别,但均观察到典型的栓锥形感器分布。
  3、于2013年10月采集丽草蛉雌成虫,并对其头部感器进行光学显微和扫描电镜的观察,结果表明:丽草蛉的触角为长的鞭状,由柄节、梗节和鞭节组成,鞭节极长,由114个鞭亚节组成,各亚节上感器组成及分布相同。感器在鞭亚节上分5圈排布,共发现两种毛形感器、锥形感器、钉形感器和刺形感器4种,在柄节和梗节上还存在短毛形、短刺形感器和 B?hm氏鬃毛;下颚须上存在栓锥感器、指形感器、短钉形感器、钟形感器和短毛形感器,下唇须上较下颚须上多一种腔锥形感器,内外颚叶高度骨化,下唇上有锥形和毛形感器。
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