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[博士论文] 李晓童
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:在植食性昆虫与宿主植物长期的协同进化过程中,宿主植物能分泌多种次生代谢物以抵御昆虫取食,而植食性昆虫则演化出多种生理结构和代谢调控上的适应性性状来抑制宿主植物次生代谢物的活化与释放,以免受宿主植物防御物质的毒害。其中,强碱性中肠腔环境和基因转录水平的可塑性调节,是鳞翅目昆虫进化出的代表性防御机制。α-葡萄糖苷酶家族在鳞翅目昆虫糖类代谢、氨基酸转运和糖蛋白修饰加工等生理过程中发挥着关键作用,然而其在宿主植物次生代谢物质胁迫下以及自身中肠强碱性环境中的转录可塑性及适应性进化机制目前仍不清楚。为了探明上述问题,本研究对鳞翅目昆虫中以α-葡萄糖苷酶GH13家族为代表的消化型葡萄糖苷酶和以α-葡萄糖苷酶Ⅱ为代表的非消化型葡萄糖苷酶的转录可塑性和进化适应性进行了研究。
  通过分析鳞翅目昆虫α-葡萄糖苷酶GH13家族的基因扩张和分歧进化机制,发现α-葡萄糖苷酶GH13家族编码基因在鳞翅目昆虫进化早期发生特异性分化,产生了蔗糖特异性水解酶(SUH)基因,随后SUH在锤角亚目昆虫基因组中发生复制,形成SUH1和SUH2两个基因拷贝。上述分化时间与种子植物和被子植物“辐射”式产生时间相近,表明植物的两个物种爆发事件对鳞翅目昆虫的生存和食性产生了巨大的选择压力,造成了消化酶家族的扩张和功能分化。通过基因家族的功能分化分析,发现SUH与α-葡萄糖苷酶GH13家族其他成员相比,功能上发生了显著分化,并鉴定到若干导致功能分化的潜在位点。选择压力分析表明,SUH在进化过程中受到了显著的正选择影响,在鉴定到的正选择位点中,有9个位点同时也是导致SUH功能分化的潜在位点。通过同源建模分析,得到了SUH的空间结构模型,并预测了SUH的蔗糖配体结合结构域。通过位点定位,发现上述9个位点恰好位于配体结合结构域,表明这些位点影响了SUH与底物的结合与催化过程,同时也从空间结构角度印证了这些功能分化-正选择位点在α-葡萄糖苷酶GH13家族的分化扩张及SUH的进化过程中发挥了关键作用。
  以桑叶单食性鳞翅目昆虫对桑树次生代谢性生物碱DNJ(1-deoxynojirmiycin,1-脱氧野尻霉素)的适应性为例,研究了宿主植物次生代谢物对鳞翅目昆虫消化和解毒过程外的其它生理功能的影响。α-葡萄糖苷酶Ⅱ(GⅡ)由催化亚基GⅡα和调节亚基GⅡβ构成,在从细菌到人类的几乎所有生物的糖蛋白修饰加工中发挥了重要作用。用桑树中含量较高的生物碱DNJ处理后,发现桑叶专食性鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)GⅡα的转录水平,相比对照组和非桑叶专食性鳞翅目昆虫蓖麻蚕(Samia cynthia ricini)DNJ处理组显著上升,而GⅡβ的转录水平在两类昆虫中趋于稳定,表明GⅡ催化功能受DNJ胁迫后,在桑叶专食性鳞翅目昆虫中具有更好的转录水平可塑性。选择压力分析发现,GⅡα在3类桑叶专食性鳞翅目昆虫分化产生中受到了正选择影响,而GⅡβ在鳞翅目昆虫中普遍受到纯化选择影响,表明两个亚基在进化中受到了不同的选择压力,催化与调节功能在部分支系中存在进化上的不平衡性。进一步分析桑叶专食性鳞翅目昆虫GⅡα正选择位点的空间结构分布,发现关键的正选择位点主要位于C端结构域和DNJ结合区域,这些位点很可能影响了桑叶专食性鳞翅目昆虫GⅡα对DNJ的敏感性以及酶复合体空间构象的稳定性。
  本论文首次从分子进化角度阐释了鳞翅目昆虫消化型与非消化型α-葡萄糖苷酶家族的适应性进化机制,证明了正选择作用作为适应性进化的重要驱动力,导致α-葡萄糖苷酶GH13家族在鳞翅目昆虫中发生扩张和功能分化,产生了蔗糖特异性水解酶SUH,同时也促进了非消化型α-葡萄糖苷酶GⅡ,在受DNJ胁迫下的桑叶单食性鳞翅目昆虫中催化功能的可塑性进化。本研究将有助于理解昆虫特异性消化吸收方式的产生原因和适应性进化机制,并为昆虫功能基因的分化扩张和趋异进化研究提供背景资料和理论支持。
[硕士论文] 王颖
园艺学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:菜用大豆(Glycine max(L.)Merr.)属于豆科,又称毛豆,是一种重要的豆类蔬菜。在其生长发育过程中常受到多种病虫害的危害,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是众多病害中分布最广、对产量和品质影响最大的病害之一,它的危害区域广,破坏性强,严重影响大豆的产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),寄主范围狭窄,主要局限于豆科植物。Potyvirus是世界上最大的、对大豆生长影响最重要的植物病毒属。Potyvirus病毒编码11个蛋白,通过与其它编码蛋白及寄主蛋白的相互作用来共同完成病毒的侵染循环。其中P3蛋白既是Potyvirues三个膜蛋白之一,又是Potyvirues多聚蛋白中变异性最大的,因此研究P3蛋白与其寄主的互作关系更有利于研究膜相关蛋白在病毒复制中的功能及机理,从而进一步分析Potyvirues的复制机制以及为病害防治提供理论指导。
  本实验室前期利用SMV6067-1分离物的P3序列构建诱饵载体,通过酵母双杂交(Y2H)的方法初步筛选菜用大豆品种‘南农1138-2’的cDNA文库,筛选与大豆花叶病毒P3蛋白互作的寄主蛋白36个。本研究从中选取了2个寄主蛋白endo-1,3-beta-glucanase和cysteine proteinase inhibitor,分别命名为GmGLu和GmCYS,从大豆感病品种‘南农1138-2’中分别克隆出这两个基因的编码区全长,利用酵母双杂交、双分子荧光互补和qRT-PCR技术对这两个基因的功能进行了鉴定。主要研究结果如下:
  (1)采用膜蛋白酵母双杂交系统,将2个菜用大豆蛋白(GmGLu、GmCYS)编码区全长构建到酵母表达载体pPR3-N中,与pBT3-STE-P3共转化结果表明,SMVP3可分别与2个候选菜用豆蛋白在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基上生长良好,且呈蓝色阳性菌落。该结果初步表明,SMV P3可与这2个候选菜用大豆蛋白互作。
  (2)进一步通过双分子荧光互补(BiFC)试验对以上互作进行体内验证。将SMV-P3与2个菜用豆蛋白(GmGLu、GmCYS)分别构建到BiFC载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN,融合表达载体通过农杆菌介导在本氏烟叶片内进行瞬时表达。接种农杆菌的叶片采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。结果表明,SMV P3与2个大豆蛋白均可以发生强烈互作,产生稳定的荧光。其中,P3与大豆GmGLu的互作出现在本氏烟细胞的细胞膜,与大豆GmCYS的互作区域在细胞膜和细胞核上。蛋白亚细胞定位结果与BiFC结果类似,GmGLu蛋白定位在细胞膜,GmCYS蛋白定位在细胞膜和细胞核,SMV P3与2个候选菜用大豆蛋白具有互作关系。
  (3)采用实时荧光定量RT-PCR,对SMV胁迫下2个菜用大豆基因的表达量进行了动态表达分析。结果表明,在SMV侵染下,两8个菜用大豆基因在24hpi、48hpi、72hpi、14dpi均呈表达量上调,GmGLu在处理24h后表达量有所增加,在处理72h表达量达到最高,之后表达量随时间推移有所下降,而且在72h时产生显著性差异。GmCYS在24h时表达量最高,之后表达量开始降低,在24h和14d时差异性显著。
  SMV P3可与2个菜用大豆蛋白(GmGLu、GmCYS)直接互作,进而参与了SMV的侵染。
[硕士论文] 刘娴
蔬菜学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科(Nymphaeaceae)莲属多年生水生草本植物,生产上依据用途分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕是中国栽培面积最大的水生蔬菜,栽培历史悠久,其产品富含淀粉、蛋白质、维生素和矿物质等营养成分,深受国内外消费者喜爱。莲藕多采用根状茎进行无性繁殖,容易导致病害积累,引起种性退化。目前,已报道的莲藕病害以腐败病、褐斑病等真菌性病害为主,而有关病毒病仅见有莲藕线条病毒(Lotus streak virus)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)的报道。
  “僵藕”是发生在莲藕主产区的一个普遍现象,藕身瘦小僵硬,表面布有黑褐色点斑、条斑,且深入表皮以下,严重影响莲藕的产量和品质。前期研究表明,“僵藕”可能是由植物病毒引起的,但其症状与上述三种病毒症状不一致。为进一步研究“僵藕”发病病因与致病机制,在“僵藕”中检测鉴定到一种马铃薯Y病毒属病毒,并就该病毒的寄主范围、发生分布、基因组结构、分类地位及遗传多样性进行了研究。主要结果如下:
  1、采用高通量测序及RT-PCR技术,在“僵藕”中发现一种马铃薯Y病毒属病毒(potyviruses),扩增片段为854bp,经BLAST比对分析发现,该病毒与甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)的核苷酸相似性较高。该病毒能有效侵染豆科(Fabaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cueurbitaceae)、茄科(Solanaceae)中的植物,但未见明显的症状表现。发生分布调查结果显示,在江苏省莲藕主产区采集的43份莲藕样品中,该病毒的检出率达48.8%,其中12份“僵藕”样品的检出率为75%,表明该病毒在江苏省莲藕产区发生分布广泛。
  2、莲藕中检出的马铃薯Y病毒属病毒的全基因组序列具有10081核苷酸(nucleotide,nt),包括143nt的5,端非编码区、194nt的3'端非编码区和9741nt的开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码3247个氨基酸(amino acid,aa)。该病毒与SPLV的多聚蛋白均含有9741nt,与SPLV核苷酸相似性在76.28%-76.60%之间,与最新的国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)制定的马铃薯Y病毒科病毒的分种标准相同,且该病毒与SPLV有四个蛋白酶水解切隔识别位点存在差异,其编码的PIPO的长度差异较大。综上,在莲藕上分离的马铃薯Y病毒属病毒可能是一种新的病毒种,暂定名为莲藕潜隐病毒(Lotus latent virus,LLV)。
  3、对LLV的外壳蛋白(Coat protein,CP)和第一蛋白(First protein,P1)编码区序列的系统发育和遗传多样性分析可知:LLV遗传差异较小,可分为LLV-1和LLV-2两组,其中大部分分离物聚集在LLV-2组。通过选择压力分析发现:LLV在CP和P1编码蛋白中处于较强的负向选择压力下,这与其他已报道的马铃薯Y病毒属病毒相似,可能与这两个蛋白保守的功能域相关。
[硕士论文] 燕亚莉
园艺学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄瓜白粉病是危害黄瓜(Cucumis sativus L.)生产的主要病害之一,植株发病时光合效能下降,进而影响黄瓜产量和果实品质,常引起30%左右的减产。黄瓜抗白粉病品种选育及应用是克服白粉病危害的有效途径。植物的抗性机制通常与蛋白质的差异表达相关。研究白粉菌接种后黄瓜抗感材料蛋白质组学水平上的变化及其与抗白粉病之间的关系,将有助于在蛋白水平上揭示黄瓜抗白粉病机制。
  以实验室选育的一个具有高抗白粉病且能稳定遗传的片段代换系‘SSL508-28’和易感白粉病受体亲本‘D8’为试验材料,利用iTRAQ技术,研究了接种白粉病菌48h的叶片蛋白质的变化;运用qRT-PCR技术对部分差异蛋白对应基因在‘SSL508-28’接种白粉菌48h后mRNA水平的表达量进行了分析,选择抗感白粉病差异性显著的黄瓜品系对抗病候选基因Csa4M290740.1的表达量进行了分析;主要研究结果如下:
  1.利用iTRAQ技术鉴定到具有定量信息的蛋白3629个,其中差异表达(FDR≤0.05、Fold changes≥2)蛋白151个;38个蛋白在抗感品系中被检测到,主要为谷胱甘肽S-转移酶、放氧增强蛋白、过氧化物酶73等;79个蛋白仅在抗病品系‘SSL508-28’中被检测到,主要为多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白、核糖体循环因子、苹果酸脱氢酶、remorin蛋白、DNA损伤修复/耐受蛋白DRT100等;34个蛋白只在感病品系‘D8’中被检测到,主要为甘油醛-3-磷酸脱氢酶和50S核糖体蛋白等;通过对差异蛋白进行生物信息学分析和功能注释分析,筛选出7个抗病候选蛋白。
  2.利用qRT-PCR对候选的7个抗病候选蛋白的对应基因在‘SSL508-28’接种白粉菌48h的表达量进行检测,结果表明,Csa4M290740.1(DNA损伤修复/耐受蛋白DRT100,属于抗病(resistance,R)蛋白的LRR类)表达量在‘SSL508-28’接种白粉菌48h后显著上调。
  3.利用qRT-PCR分析Csa4M290740.1在黄瓜不同抗感白粉病品系中的表达量,结果显示,Csa4M290740.1在抗病品系中的表达量高于感病品系,且在供体亲本‘Jin5-508’中的表达量最高,‘D8’中相对表达量最低。
  本研究初步探明了黄瓜应答白粉病菌胁迫的蛋白质变化规律,获得了与黄瓜白粉病抗性关系密切的抗性基因Csa4M290740.1,为黄瓜白粉病抗性机制解析及分子遗传改良奠定了重要基础。
[硕士论文] 王婧怡
草学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:面对化学除草剂给自然生态系统带来的破坏,我国提出了到2020年实现化肥和农药零增长计划。目前,以化感物质为先导结构研制绿色新型生物除草剂,已成为研究的热点领域。化感物质香豆素具有分子量小、生物利用度高、合成相对简单等优点,完全可以开发成为一种天然除草剂而被有效利用。因此,本研究以香豆素为供体,一年生黑麦草为受体植物,测定不同浓度和不同处理时间下香豆素抑制黑麦草的种子萌发初始阶段激素含量和贮藏物质含量的变化,扫描电镜和透射电镜下种子内部结构的变化情况,以及香豆素抑制黑麦草幼苗的生理生化指标、基因表达以及植株内香豆素残留等变化情况,为香豆素开发为新型生物源除草剂提供理论依据。
  试验一、香豆素抑制一年生黑麦草种子萌发的作用机理
  试验采用试验室生物检测,测定种子萌发初始阶段(露白)贮藏物质和激素变化情况。试验结果表明,不同浓度香豆素水溶液对种子的萌发均有显著抑制作用(P<0.05),且随着浓度的升高抑制作用增强;发芽过程中,处理组出现发芽延迟、出苗不齐的现象;对照组中根先萌发,而处理组中存在大量茎先突破种皮的现象。处理组中淀粉含量均显著高于对照组(P<0.05),且处理浓度越高,淀粉含量越多;处理组中可溶性糖含量均低于对照组。香豆素抑制GA和IAA激素分泌,促进ABA激素分泌。扫描电镜观察显示对照组中淀粉呈多边形、均匀分布,处理后淀粉粒体积变大,出现多个淀粉粒组成的复粒淀粉体,且随浓度的升高复粒淀粉体的个数也随之增加,200mg/L浓度处理下由原来的椭球形变得更加凹陷、扁平,出现了粘结现象;透射电镜观察显示处理后的细胞壁变厚甚至发生变形,细胞器降解,大液泡分解为小液泡。
  试验二、香豆素对黑麦草幼苗生理生化指标及基因表达的影响
  试验采用温室盆栽,根据预试验所测定的植株致死率选取处理浓度,测定分析幼苗生长过程中重要的生理生化指标和抗氧化酶调控基因的表达情况。试验结果表明黑麦草株高、根长茎叶鲜重、干重、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素均随香豆素浓度的增加呈下降趋势。相对电导率随处理浓度的升高而显著增加(P<0.05);处理组丙二醛均高于对照组。处理组CAT和POD活性均高于对照组,SOD活性于3、7、和14d高于对照组,21d低于对照组;CytCu/ZnSOD、MnSOD、POD和CAT抗氧化酶基因表达水平均显著上调(P<0.05)。
  试验三、香豆素对黑麦草幼苗的超微结构及体内香豆素含量的影响
  试验采用温室盆栽,从微观层面观察叶片细胞结构进行分析研究,通过液质联用对黑麦草体内的香豆素含量进行定量分析。结果显示香豆素处理后,叶绿体由原来的椭圆形、梭形变成了圆球形,嗜锇颗粒增多,基粒片层散乱、有断裂现象、呈断续状,有些线粒体发生变形;在500mg/kg处理下,中央大液泡裂解,叶绿体不再紧贴细胞壁排列,发生解体,细胞结构完全被破坏。处理21d,50mg/kg处理下黑麦草通过自身调节恢复正常,200mg/kg处理下黑麦草为抵抗胁迫淀粉粒显著增多变大,500mg/kg处理下细胞器几乎完全降解。在同一处理天数下,黑麦草植株体内香豆素含量随浓度的升高呈上升趋势;同一浓度处理组,香豆素含量在处理1d时达到最大值,随后均随处理时间的增加呈下降趋势。
[硕士论文] 卫婷婷
电子与通信工程 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:为了更好地推进宁夏回族自治区“十三五”重点研发计划重大项目的发展,实现蔬菜的无损检测,推动农业的发展,本文致力于设计一种植物叶片无损检测装置。以黄瓜叶片为研究对象,根据植物的荧光原理,完成病害图像的拍摄。利用OpenCV实现对病害图像的处理,从而得出叶片整体受损率和叶片病害程度;同时利用Keras和TensorFlow完成白粉病和霜霉病以及健康叶片的模型搭建,从而完成黄瓜病害类型的识别。最后利用PyQt在树莓派上进行用户操作界面设计,用户快速登录,操作相应按钮就可完成整个黄瓜叶片的整体受损率和病变类型的检测。主要工作如下:
  1.根据对叶绿素荧光采集装置的研究,设计出一款上窄下宽的荧光采集装置,采集装置由亚克力板组装而成,整个装置经济实用。根据叶绿素的特性,选定蓝色LED作为检测系统的激发光源,同时,选定白色LED为其辅助光源,通过与树莓派的连接,可以快速的拍摄出符合要求的病害照片。
  2.装置的调试和控制,利用GPIO口通过继电器实现小电压对大电压的控制,从而实现了摄像头和电源的协调配合;调试摄像头参数,保证拍摄叶片图片的效果。
  3.叶片的图像处理,叶片的处理是基于OpenCV完成的,分别对白光叶片进行处理得出病害叶片整体面积;对蓝光激发光源下的叶片进行病害面积提取,从而得出病害叶片受损率和病害程度。叶片图像处理快速,基本完成整个受损率的检测。
  4.叶片病害类型的判别,利用Keras和Tensorflow在ImageNet数据集上进行迁移和微调学习,搭建出叶片检测的病害模型,利用模型对图像进行病害判别,得出叶片的病变类型。
  5.用户界面的开发,特意设计了简单的用户操作界面,界面一目了然,简单上手,界面的设计是基于PyQt完成,可以实现叶片拍摄、整体受损率及病害类型等按钮功能,使用户快速直观的得出叶片的病害状况。
[硕士论文] 张楠楠
农业昆虫与害虫防治 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:灰飞虱Laodelphax striatellus是水稻和小麦重要的害虫。灰飞虱通过刺吸式口器取食水稻韧皮部,对水稻植株造成破坏,还可以作为传播水稻条纹叶枯病(Rice stripe virus,RSV)的载体,对作物造成严重损失。化学农药是防控稻田灰飞虱的常用有效手段。然而,大量的杀虫剂应用导致了灰飞虱的抗药性及天敌数量减少。此外,近来研究表明化学药剂的施用还会造成灰飞虱的再猖獗。已有研究证实,三唑磷亚致死剂量刺激增加灰飞虱的产卵量,而且会促进它对RSV的垂直传毒率。为进一步揭示其中的内在机制,本文研究了三唑磷对灰飞虱卵巢蛋白质、脂肪体蛋白质含量、以及对RSV传播相关基因表达的影响。结果如下:
  (1)采用点滴法测定了三唑磷对带毒、不带毒灰飞虱3龄若虫的敏感性,结果表明,不带毒灰飞虱3龄若虫相较于带毒灰飞虱对三唑磷更为敏感。三唑磷处理后,不带毒、带毒灰飞虱的卵巢蛋白质含量和脂肪体蛋白质含量均有不同程度的增加,其中不带毒灰飞虱卵巢、脂肪体蛋白质含量增幅更大。二次浸药处理引起的增加效应更加明显。其中三唑磷处理2d后带毒灰飞虱和不带毒灰飞虱体内卵巢蛋白质含量显著升高,分别升高了140.8%和32.9%;三唑磷处理2d后带毒灰飞虱和不带毒灰飞虱体内脂肪体蛋白质含量与对照相比有所升高;三唑磷处理3d后带毒灰飞虱和不带毒灰飞虱体内卵巢蛋白质含量与对照相比显著升高,分别增加了128.9%和32.2%。三唑磷处理不带毒灰飞虱脂肪体蛋白质含量比带毒灰飞虱明显高了33.6%。三唑磷点滴处理灰飞虱卵巢和脂肪体蛋白质含量均有所增加。
  (2)采用RT-PCR技术,测定了三唑磷LC20浓度处理对带毒灰飞虱垂直传播RSV体内相关基因表达量的影响。结果表明,三唑磷处理对一代带毒灰飞虱卵巢内传毒相关基因表达水平产生了明显的影响,与对照相比三唑磷处理1、2、3、5d卵巢RSV的表达量显著增加,分别增加了38.7%、53.4%、86.3%和82.7%。三唑磷处理2、3、5d后卵巢内CP基因的表达量与对照相比显著增加,分别增加了89%、126%和100%。与对照相比三唑磷处理1、2、3、5d卵巢内Vg的表达量也显著增加,分别增加了14.4%、51.4%、63.6%和104.5%。三唑磷处理对二代灰飞虱卵巢内传毒相关基因表达水平与对照相比也有显著性差异。
  (3)采用RNA干扰技术研究灰飞虱卵巢内相关传毒基因的表达水平。结果表明,干扰灰飞虱1、2和3d后测定虫体内RSV、CP、Vg的相对表达量与对照CK和对照dsGFP均显著下降,干扰后2d RSV、CP、Vg的表达量下降最为明显,与对照相比,分别下降了75%、63%和、56.9%,与dsGFP相比,分别下降了63.5%、75%和40%。
[硕士论文] 黄岳
生物工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:苹果蠹蛾(Cydia pomonella)属鳞翅目卷蛾科小卷蛾属。幼虫以蛀食苹果、梨等水果为食,具有极强的适应性和繁殖能力。在中国主要分布在新疆、甘肃等地,并有向内地扩增的趋势。当前常规的防控手段对苹果蠹蛾的杀伤作用较小,这种情况对中国水果的产量、质量和果品贸易构成严重威胁。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来兴起的基因沉默技术,在农业害虫领域主要是通过给虫体饲喂含双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)的食物沉默关键基因的表达,从而达到杀死害虫的目的。但是这种方式在不同虫体间的沉默效果不同,以鳞翅目为主的昆虫如苹果蠹蛾、家蚕、亚洲玉米螟等基因沉默的效率很差,主要原因是在饲喂过程中大量的dsRNA被核酸酶降解。本研究旨在探讨苹果蠹蛾核酸降解酶(RNase)与RNAi效率之间的关系,建立苹果蠹蛾RNAi体系,最终达到杀灭害虫的目的。
  首先,根据苹果蠹蛾转录组测序结果,筛选出RNase1、RNase2、RNase3和RNase4四个基因,设计相应的引物扩增全长基因序列并进行测序验证。荧光定量PCR结果显示,RNase1和RNase4基因在苹果蠹蛾的中肠组织中高表达,RNase3基因在唾液腺组织中高表达,而RNase2基因在不同组织均有不同程度的表达。生物信息学分析表明,这四种RNase的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性,存在一个共同的结构域,主要负责对核酸序列的切割和降解。
  其次,体外检测RNase酶蛋白对EGFP双链RNA(Double-stranded EGFP,dsEGFP)的降解作用。解剖实验证明,在苹果蠹蛾不同组织同比例稀释50-100倍的情况下,唾液腺、肠道和血淋巴都具有显著降解dsEGFP的能力。与此同时,本研究还构建了四个RNase基因的原核表达载体,将诱导表达的细菌裂解液与dsEGFP反应,结果显示RNase2蛋白具有降解dsEGFP的功能。
  最后,本研究以细胞凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP)基因作为研究对象,检测在RNase表达水平下降时目的基因的RNAi效率。结果显示,在苹果蠹蛾RNase基因为正常水平时,分别注射和饲喂1μg IAP双链RNA(Double-stranded IAP,dsIAP),IAP基因的表达水平均未发生显著变化。将人工合成的四种RNase的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)分别注射到苹果蠹蛾体内,并在两天后检测沉默效果。结果显示,RNase1基因的表达水平相比对照增加到152%,RNase2、RNase3和RNase4基因各自的表达水平相比对照减少到31%、39%和11%。在RNase2、RNase3和RNase4基因被敲减的情况下,再次饲喂等剂量dsIAP,两天后IAP基因的表达水平相比对照减少到38%、28%和56%,说明基因RNase2和RNase3的沉默可以有效提升饲喂dsIAP的干扰效果。
  综上所述,本研究分析了苹果蠹蛾RNase系基因的结构和功能,并验证敲低RNase2和RNase3基因能够显著提高饲喂dsRNA的干扰效果,从而建立一套有效的沉默苹果蠹蛾基因表达的方法体系,为后期研究苹果蠹蛾的基因功能和创新防控手段提供重要支撑,此方式也为其他鳞翅目昆虫的基因沉默提供了参考依据。
[硕士论文] 潘丹丹
农业昆虫与害虫防治 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:水稻二化螟Chilo suppressalis(Walker)隶属鳞翅目Lepidoptera、螟蛾总科Pyraloidea、禾草螟属Chilo。该虫其分布广泛、适应性强,是目前影响我国水稻稳产、高产的重要害虫之一。二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)隶属膜翅目Hymenoptera、茧蜂科Braconidae、绒茧蜂属Apanteles,是水稻二化螟的重要寄生蜂之一,对二化螟田间种群起着重要的控制作用。但是,二化螟和二化螟盘绒茧蜂协同进化的机制以及二化螟应对二化螟盘绒茧蜂寄生的策略还不清楚。本研究通过比较分析二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的二化螟和未被寄生的二化螟的转录组数据,研究了二化螟4种热激蛋白对二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的表达特征,同时进一步揭示它们对温度响应的规律。这些结果不仅充实了寄主—寄生蜂的协调进化理论,也为利用二化螟盘绒茧蜂防治二化螟提供理论支撑。主要研究结果如下:
  1、运用转录组测序技术,测定了被二化螟盘绒茧蜂寄生的二化螟和未被寄生的二化螟转录组。通过比较发现寄生胁迫下的水稻二化螟体内表达存在差异的Unigenes有5685个,在昆虫激素的生物合成、氧化磷酸化、核糖体、药物代谢、丙酮酸代谢和代谢途径这6条通路富集显著。进一步分析发现:呈现表达差异的热激蛋白基因有4条,2条热激蛋白70基因(hsp70s)下调,2条小分子量热激蛋白基因(shsps)上调。
  2、克隆了二化螟体内3条新型热激蛋白基因的全长序列,分别为hsp705、hsp706和hsp21.7c。它们cDNA序列全长分别为2053,2392和870bp,开放阅读框长度分别为1896、1905和570bp,分别编码631、634和189个氨基酸,HSP705和HSP706中都发现有HSP70家族的保守序列,HSP21.7c中发现小分子量热激蛋白家族的保守特征—α-晶状体结构域。系统发育分析表明,二化螟的两条HSP70的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫表现出很高的同源性,CsHSP21.7c,不含内含子,与二化螟其他小分量热激蛋白未表现出较高同源性,是一种特异性小分子量热激蛋白。
  3、采用荧光实时定量技术对二化螟9个候选内参基因在二化螟盘绒茧蜂寄生胁迫下的稳定性进行筛选和评估,运用常用的内参基因筛选程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比较△Ct法对各内参基因进行了排名。综合看来TUB,EF-1和NADHD作为内参基因比较稳定,TUB是最稳定的,RPS11为最不稳定的基因。最后,通过寄生胁迫下二化螟目的基因HSP60的相对表达量验证了TUB的稳定性,确认寄生胁迫下的二化螟内参基因是TUB。
  4、二化螟hsp705在被二化螟盘绒茧蜂寄生前期先显著上升表达,而在寄生后期却下调表达;hsp706在被二化螟盘绒茧蜂寄生中后期显著下调表达;hsp21.7c在被二化螟盘绒茧蜂寄生中期显著上调,在被寄生末期也显著下调;hsp21.5寄生中期的表达量也显著上调。转录组比较分析发现:2个hsp70(hsp705和hsp706)显著下调,而2个shsps(hsp21.5和hsp21.7)显著上调,这表明qRT-PCR验证的结果与转录组测序结果基本一致。
  5、采用qRT-PCR技术研究了二化螟3条新hsps在高低温胁迫下的表达情况。结果表明:从-11℃到43℃这21个温度处理下的二化螟体内3条热激蛋白基因在mRNA水平上都显著上调表达,但他们对温度响应的趋势各不相同。hsp705和hsp21.7c都在-6℃达到最高表达量,而hsp706却在-11℃达到最高表达量。通过相对表达量比较发现:hsp21.7c在mRNA水平上更容易受热诱导,而hsp705和hsp706却更容易受冷诱导。
[硕士论文] 苏霞
生物化学与分子生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:杆状病毒是目前已知病毒种类中对人类最有益的病毒之一,已广泛应用于生物杀虫剂、真核表达载体系统、疫苗制备、蛋白表面展示系统和基因治疗等方面。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)是杆状病毒的模式种,是第一个被完全测序的,也是目前研究最多、最广泛的杆状病毒。为了更好地利用杆状病毒,就需要揭示病毒编码的各个基因在杆状病毒生活史中的功能。ac51、ac73、ac75基因是AcMNPV中功能未知的基因,ac51基因在Ⅰ和Ⅱ型鳞翅目NPV基因组都存在同源序列;ac73基因只在已测序的Ⅰ型鳞翅目NPV基因组有同源基因;ac75的同源基因存在于所有鳞翅目NPV、GV和膜翅目NPV基因组中,但不存在于双翅目基因组中。本论文分别对ac51、ac73、ac75基因进行实验分析,探究各基因在病毒增殖、病毒粒子组装和病毒感染虫体等方面的作用;并对ac51、ac73、ac75基因产物进行亚细胞定位分析,从而揭示ac51、ac73、ac75基因在AcMNPV的感染过程中的具体功能。
  论文开始对文献进行了综述,主要从杆状病毒的基因组和分类、杆状病毒的表型和感染周期、杆状病毒基因的表达、杆状病毒基因的分类、杆状病毒的应用等方面介绍了杆状病毒的研究背景,并阐述了ac51、ac73、ac75基因的背景知识和本论文的研究目的和意义。
  论文首先以ac73基因为研究对象,利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统构建了ac73基因缺失型和拯救型重组病毒,将这两种重组病毒质粒及野生型转染、感染Sf9细胞,通过普通光学显微镜、荧光显微镜观察,发现ac73基因缺失型的重组病毒可以产生多角体和感染性的病毒粒子;对三种重组病毒进行一步生长曲线分析,生长曲线总体走势相似,呈稳定增长的趋势,但缺失型重组病毒滴度明显低于野生型和拯救型,因此,缺失型病毒粒子的量低于拯救型和野生型病毒;电镜观察缺失型重组病毒发现有正常的核衣壳,也有异常的中空长管状结构;形成的多角体有些中间有大空腔,有些是未包裹核衣壳的空泡。生物学测定结果表明,缺失型重组病毒的半致死时间LT50比野生型重组病毒延长了42h;取食缺失型病毒多角体的甜菜夜蛾幼虫其血淋巴中含有病毒粒子,可以感染昆虫细胞。Ac73蛋白的亚细胞定位分析结果显示,在病毒感染的早期Ac73-EGFP蛋白定位于宿主细胞核中,感染后期细胞核和细胞质都有Ac73-EGFP蛋白。综上说明,ac73基因是病毒增殖的非必需基因,但基因缺失后会影响AcMNPV病毒粒子的产量和多角体的形态,病毒增殖能力减弱,杀虫速度减慢。Ac73蛋白可能感染初期仅在细胞核中行使功能,感染晚期在细胞质中也发挥功能。
  接着以ac51、ac75基因为研究对象,同样利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统,分别构建ac51、ac75基因的缺失型和拯救型重组病毒质粒,通过转染、感染Sf9细胞和绘制一步生长曲线等实验,分析发现缺失这两个基因的任何一个都会使病毒失去增殖能力,而拯救型重组病毒具有感染性。电镜观察结果发现,缺失这两个基因后病毒核衣壳无法组装,也无法形成多角体。因此,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因,缺失后病毒没有感染性。Ac51和Ac75蛋白的亚细胞定位分析结果显示,病毒感染后Ac51-EGFP蛋白主要定位在宿主细胞核中,后期在细胞核边缘聚集;Ac75-EGFP蛋白在感染早期主要定位在宿主细胞的核环带区中呈成聚集状分布,后期进入细胞质中执行其功能。说明病毒感染前期,Ac51蛋白和Ac75蛋白主要在细胞核中行使功能,后期Ac75蛋白还在细胞质中发挥一定的功能。预测Ac51和Ac75与病毒核衣壳的形成相关。
  综合研究表明,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因。ac73基因是非必需基因,其对病毒的增殖和经口感染昆虫并不是必需的,但基因缺失后会影响病毒粒子的产量和多角体的形态。病毒滴度下降,缺失病毒的杀虫速度减缓。
[硕士论文] 胡辰昱
植物保护 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)属鳞翅目螟蛾科,是一种分布广泛的多食性害虫。为了深入了解棉大卷叶螟的吐丝机理,本文研究了棉大卷叶螟丝素P25基因,通过基因克隆技术得到其cDNA序列全长,并检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。以此为基础,进行RNA干扰试验,采用饲喂法干扰其丝素P25基因的表达,从而进行功能验证。主要研究结果如下:
  1、通过比对其他已知的鳞翅目昆虫的丝素P25基因,运用RACE法克隆得到棉大卷叶螟丝素P25基因全长。棉大卷叶螟丝素P25基因cDNA全长为859bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码区全长为663bp,并将所获得的基因全长提交到GenBank,登录号为KY792994。依据棉大卷叶螟丝素P25基因的核苷酸序列转换为其氨基酸序列,并加以分析,估算该蛋白分子量为25.653kDa,等电点pI为8.02。将所获得的基因全长同已经登录到GenBank的其他昆虫丝素P25基因序列进行同源性比对,与大蜡螟(Galleria mellonella)的同源性最高,达到63%,其次为外米缀蛾(Corcyra cephalonica),同源性为62%。
  2、运用实时定量PCR技术,检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。分析结果表明,丝素P25基因的相对表达量与棉大卷叶螟的虫龄、虫态变化紧密相关。P25基因相对表达量的特点主要体现在2L幼虫和预蛹期各有一个高峰,其中预蛹期的表达量最高;1龄,3龄,5龄幼虫丝素P25基因的表达量相对较低;蛹期及羽化后,丝素P25基因的表达量快速下降,近乎于零;饲喂苘麻叶片的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因的相对表达量最高,蜀葵和棉花次之,且蜀葵略高于棉花,木槿最低。
  3、将表达棉大卷叶螟丝素P25基因dsRNA的菌液以饲喂法的方式干扰其幼虫目标基因的表达。喂食不同菌液浓度的试验结果表明,喂食表达dsRNA菌液后相对表达量均有所下降。而喂食不同虫龄棉大卷叶螟幼虫不同天数菌液的试验结果表明,饲喂菌液天数越长,表达量均会呈现下降趋势,其中3龄幼虫的下降幅度要小于其他虫龄,且对5龄幼虫的干扰效果最好。在不同寄主上饲喂菌液的试验结果表明,饲喂菌液后,不同寄主上的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因表达量均有所下降,其中以苘麻为寄主的幼虫丝素P25基因表达量显著下降。以上试验结果表明菌液浓度、取食时间、取食虫龄、取食寄主均会对丝素P25基因干扰效率产生影响。
[硕士论文] 秦晶
农业昆虫与害虫防治 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande),隶属缨翅目Thysanoptera,蓟马科Thripidae,花蓟马属Frankliniella,是世界性的观赏植物和经济作物上的重要害虫。在全球气候变暖的大背景下,西花蓟马在全球范围内迅速入侵和扩散。为研究温度对西花蓟马的入侵、分布及种群动态的影响,本研究在实验室条件下对恒温饲养条件的西花蓟马进行高低温胁迫处理,比较分析西花蓟马长期饲养前后的温度耐受性变化;对受温度胁迫后的西花蓟马进行转录组测序,从转录组中获取HSP70(Heat Shock Protein70,HSP70)基因,对其进行克隆并分析表达模式。本研究从生态和分子水平上分析西花蓟马对温度的耐受性,这为理解其扩散及适应机制提供理论依据,为今后的预测分布及综合治理提供指导。论文主要研究结果如下:
  1.通过比较西花蓟马不同性别和不同虫态在高低温下暴露1个小时后的成活率,分析长期恒温(26±1℃)饲养后的种群温度耐受性变化。结果表明,在经历长期的恒温饲养后,西花蓟马的雌虫、雄虫和二龄若虫对温度耐受性在一定程度上都有所提高。低温胁迫下,成虫和若虫种群的初始致死低温由-8℃降低到了-11℃,雌虫、雄虫和若虫的半致死低温由-12.5、-11.5和-12.8℃分别降低到-13.2、-13.8和-13.3℃;高温胁迫下,成虫和若虫的初始致死高温由33℃上升到37℃,雌虫、雄虫和若虫的半致高温分别上升了1.1、2.8和3.3℃。
  2.通过Illumina测序平台对低温(-13℃)、高温(40℃)和常温对照(26℃)处理下的西花蓟马进行转录组测序,组装拼接共获得了79,516个基因,与Nr(Non-redundant,非冗余)数据库比对,共成功注释28,765个基因。对三个转录组样本进行两两差异基因比较后发现,-13℃VS26℃转录组中差异表达的基因共有134个,其中上调60个,下调74个;40℃VS26℃转录组中差异表达的基因共有333个,其中上调153个,下调180个;40℃VS-13℃转录组中差异表达的基因共有230个,上调162个,下调68个。
  3.基于转录组数据库HSP70s unigene片段信息,采用RT-PCR(Real-time PCR)和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术,克隆获得3个包含完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF)的西花蓟马HSP70s基因cDNA序列,分别命名为Fohsp703(KY914546),Fohsc704(KY914547)和Fohsc705(MF377626)。这三条序列全长分别为2,106、3,048和1,917bp,开放阅读框分别为2,040、2,073和1,476bp,编码679、690和491个氨基酸。不同于已经报道的HSP70s,这三个蛋白分别以APAA、EKKN和GIFL结尾。多序列比对分析发现,FoHSP704和FoHSP705与其它物种HSP70相似性高,FoHSP703与其它物种HSP70相似性偏低。系统进化树分析表明,这三个蛋白与先前研究过的FoHSP70分布在不同的四个支上。通过比对基因组序列和cDNA序列发现,Fohsp703无内含子,Fohsc704和Fohsc705分别含有4个和6个内含子。
  4.采用qRT-PCR技术研究了西花蓟马Fohsp703和Fohsc704在高低温胁迫和不同性别及发育阶段条件下的表达情况,结果表明高低温胁迫都能诱导这两个基因表达,但表达情况各不相同。低温胁迫条件下,相对于雄虫、蛹和若虫,Fohsp703和Fohsc704在雌虫中的表达水平最高,尤其是在-10、-12和-14℃。在高温胁迫条件下,Fohsp703在二龄若虫处于37和39℃时表达水平最高;Fohsc704在成虫中差异不显著,但当蛹处于35℃及二龄若虫处于37℃时表达量较高。
[硕士论文] 李忠楠
生物工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:稻瘟病是限制水稻高产的主要病害之一。由于稻瘟病菌生理小种的易变性,所推广的抗稻瘟病品种常常在种植不久之后就丧失其抗病性,导致其失去使用价值。因此,快速、有效地筛选和利用优良的抗稻瘟病品种一直是国内外研究重点。其中,抗稻瘟病基因分子鉴定是水稻抗稻瘟病材料辅助选择的重要方面。针对目前抗稻瘟病基因分子鉴定主要是以DNA为模板定性检测水稻中抗性基因的有无及组成,不能鉴定抗稻瘟病功能基因是否表达的不足,本文以水稻所含的稻瘟病抗性基因(已被克隆,且为江苏省水稻品种的主要抗病基因)为对象,集成和研发了抗稻瘟病功能基因组成、表达鉴定和病菌接种鉴定技术体系。主要研究结果如下:
  1.稻瘟病菌的培养及接种方法比较
  本实验首先对所收集和保存的稻瘟病菌进行培养,获得稻瘟病菌孢子液。在此期间对水稻进行培养,于三叶一心期分别用喷施法、创伤法、诱发法进行稻瘟病菌接种,结果表明,创伤法对水稻伤害较大,易造成水稻枯萎,影响结果。所以喷施法接种相对较好。
  2.抗稻瘟病基因鉴定方法的研发、集成与应用
  利用水稻稻瘟病抗性基因的分子标记,研发了同时检测稻瘟病抗性基因Pikh与Pil的多重PCR体系,集成了同时检测稻瘟病抗性基因Pita与Pib的多重PCR体系。由于Pikm是由两个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因组成,故建立了分别检测Pikm1-TS和Pikm2-TS两个片段的Pikm基因鉴定方法。并用这两套体系和Pikm基因鉴定方法对江苏润扬种业股份有限公司所选育的114份杂交后代水稻材料中的抗病基因Pita、Pib、Pikh、Pil和Pikm进行了检测,以确定这些杂交后代水稻材料中抗稻瘟病基因的分布情况。
  检测结果表明,114份材料中含抗稻瘟病基因Pita的有81份,含Pib的有106份,含Pikh的有35份,含Pikm的有13份,含Pil的仅有3份。分别占检测材料的71.0%、92.9%、30.7%、11.4%、2.6%,表明了Pib、Pita和Pikh这三个抗稻瘟病基因广泛存在于江苏润扬种业股份有限公司所选育的杂交后代水稻材料中。这可能与该公司在杂交配组时注重对抗稻瘟病亲本的选择和选育过程中长期注重对稻瘟病抗性的筛选有关。
  3.水稻对穗颈瘟抗性的稻瘟病菌接种鉴定
  对田间水稻进行稻瘟病菌接种,接种7d后进行病情调查。穗颈瘟接种鉴定结果表明:114份材料中经人工接种鉴定表现为高抗的有2份,抗病的有27份,中抗的有32份,感病的有33份,高感的有20份。分别占鉴定总数的1.7%、23.7%、28.1%、28.9%、17.5%。抗稻瘟病基因和穗颈瘟抗性之间的相关性分析表明:Pita、Pikh基因与穗颈瘟的抗性呈显著(P<0.05)的正相关,相关系数分别为0.297、0.239。Pib Pil和Pikm基因与穗颈瘟的抗性之间相关性不显著。
  4.水稻对稻瘟病抗性的基因表达评价
  本试验针对多数育种单位不具备配备荧光定量PCR仪的实际情况,研发了抗稻瘟病基因表达水平的半定量RT-PCR便捷检测技术。以Ubq5为内参,选择Pib、Pita和Pikh为抗性基因进行检测。在所抽检的11个材料中,尽管Pita基因是组成型表达,但经检测发现在抗稻瘟病材料中该基因的表达仍然受到稻瘟病菌接种的诱导。Pikh和Pib基因是诱导型表达,稻瘟病菌接种后Pikh和Pib基因在抗稻瘟病材料中上调表达,而在感稻瘟病材料中Pikh和Pib基因均明显下调表达。这表明,在抗稻瘟病水稻材料中抗稻瘟病基因Pib、Pita和Pikh的表达受到稻瘟病菌接种处理的诱导,而在感稻瘟病水稻材料中这种表达诱导作用不明显,甚至Pikh和Pib基因出现表达下调。这一方面说明,抗稻瘟病基因表达水平可用于对含有抗稻瘟病主效基因水稻品种的抗性评价,另一方面说明,瘟病菌接种处理后抗稻瘟病基因的差异表达能更合理解释在生产上某些含有抗稻瘟病主效基因的水稻品种其抗性经常表现不理想的现象。
  5.水稻受稻瘟病侵染标志基因预测方法的建立
  根据转录组学检测结果,筛选出一个有可能作为一个水稻是否受到稻瘟病侵染的标志基因(Barwin),经本文所研发的半定量RT-PCR检测发现,不管在抗稻瘟病材料还是感稻瘟病材料中Barwin基因均随稻瘟病菌接种时间的推移其表达量逐步升高。因此,可通过检测Barwin基因表达水平随时间的变化来预测特定品种或特定田块的水稻是否受到稻瘟病侵染。
  6.感稻瘟病材料标志基因表达鉴定方法的建立
  根据转录组学检测结果,筛选出两个有可能作为感稻瘟病水稻材料鉴定的标志基因,即与防御相关的几丁质酶3和葡聚糖内切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因。据此,本文设计引物并建立了这两个基因表达水平的半定量RT-PCR检测方法。检测结果发现,这两个基因的表达在感稻瘟病水稻材料中受到稻瘟病菌接种的显著诱导,在抗稻瘟病材料中未见表达或者表达量很低。因此,可以通过检测这两个基因在稻瘟病菌接种条件下的表达水平鉴别某水稻材料是否为感稻瘟病材料。
[硕士论文] 赵敏
植物保护 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一类既可以侵染宿主植物又可以在土壤内生存的兼性寄生真菌,存在种下分化,具有多种专化型。尖孢镰刀菌的寄主范围非常广泛,可引起茄科、豆科、瓜类等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici,FOL,FGSC9935)导致的番茄枯萎病给全球农业生产造成巨大的经济损失。目前对于番茄抗枯萎病的研究主要集中在抗性品种的培育等方面,从寄主抗性相关基因的功能方面的探索番茄抗尖孢镰刀菌分子机理的研究还处于初期阶段。
  1、FRG3在抗番茄枯萎病过程中的功能研究
  NBS-LRR(Nucleotide-binding site-Leucine-reach repeats)类蛋白是植物抗性基因(R)编码的R蛋白,是植物机体内数量最多的一类R蛋白家族。本论文以NBS-LRR类抗性基因FRG3为研究对象,分析其在抗番茄枯萎病过程中的功能。(1)本研究利用番茄枯萎病病原菌尖孢镰刀菌番茄专化型(FOL),对具有相似遗传背景的番茄抗病品系Motelle(Mot)和感病品系Moneymaker(MM)进行侵染,总共构建4个文库,包括:用H2O处理Moneymaker(MM_H2O),用FOL处理Moneymaker(MM_FOL),用H2O处理的Motelle(Mot_H2O)和用FOL处理的Motelle(Mot_FOL)。通过生物信息学对sRNA-seq数据进行分析,结果表明slmiR482家族成员的表达受FOL侵染调控。(2)综合sRNA Northern Blot和qRT-PCR分析,发现slmiR482e-3p在抗性品系Mot中表达下调。(3)通过生物信息学预测表明FRG3是slmiR482e-3p的靶基因,编码一个含有卷曲螺旋(CC)结构域和P环结构域(P-loop)的NBS类抗病蛋白。(4)通过序列同源进化比较,FRG3与已知的抗性基因I2家族同源性较远,暗示FRG3蛋白在番茄抗枯萎病的过程中通过不同的方式参与了番茄抗枯萎病的过程。(5)通过烟草共表达,证实了FRG3在转录水平上受到slmiR482e-3p调控。(6)通过5'RACE的方法,确定slmiR482e-3p对FRG3的切割发生在miRNA的3'末端,多数在第10个核苷酸之后。(7)通过病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)方法在抗性品系Mot中部分沉默FRG3,结果显示FRG3的表达下调能导致Mot对FOL的敏感性,表明FRG3在一定程度上参与了番茄抗枯萎病的过程。
  总之,本研究发现了一个新的R基因FRG3,其在转录水平上受slmiR482e-3p调控来参与番茄抗枯萎病的过程。本研究结果为研究番茄抗病性的分子机理,并由此开发长治有效防治病害的新技术将具有重要的应用价值。
  2、番茄枯萎病病原菌的快速检测
  番茄枯萎病是一种世界性的土传真菌病害,病原菌能在土壤中越冬并且能存活数年,一旦被侵染,FOL就能在植株的维管束中由下向上蔓延。并会导致连年发病,难以根治。目前最主要的防治方法是选用番茄枯萎病抗病品种,但是至今并未培育出高抗的品种,因此做好番茄枯萎病的预测预报工作就显得尤为重要。本研究以感病品系MM为研究对象,探究番茄植株体内中病原菌的数量与发病程度之间的关系。(1)使用FOL对感病品系MM进行侵染,病原菌引起的番茄枯萎病会影响植株生长态势和植株维管束。(2)使用q-PCR,对FOL特异性引物的植物DNA进行扩增,建立了评估病原菌生物量的标准曲线。(3)通过q-PCR方法快速准确检测出植株中番茄尖孢镰刀菌的生物量,建立病原菌生物量与番茄枯萎病的发生及病害程度的关系。
  本研究结果对指导大田生产番茄枯萎病的发病早期预测预报有一定实际应用价值。
[硕士论文] 赵炎
土壤学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:新烟碱型农药是一种结构类似烟碱的新型杀虫剂,在全球范围内被广泛使用,它具有较长的半衰期,如果长期施用会在土壤中大量累积,对土壤生态有潜在威胁。尽管已经有报道说明其对于蜜蜂、水生节肢动物、蛾类等都具有一定危害作用,但对于其在土壤中的影响作用研究还基本处于空白阶段。本研究主要包括:1)分别向两种不同类型土壤(砂壤土和黏土)中加入不同浓度梯度的两种新烟碱型农药进行室内培养试验,通过高通量测序等技术,观察新烟碱型农药对土壤微生物活性及群落结构的影响;2)选用相同两种土壤,加入新烟碱型农药呋虫胺、13C标记的玉米秸秆及跳虫,利用13C同位素标记技术探究新烟碱性农药如何通过“跳虫-微生物”对土壤中外源添加底物矿化产生影响,得到如下主要结论:
  (1)高浓度呋虫胺会显著降低砂壤土中微生物量碳含量,加入玉米秸秆后这种抑制作用被削弱,但加入低浓度呋虫胺后,并未出现这种对微生物的抑制作用。吡虫啉对微生物量碳无显著影响。在砂壤土中添加呋虫胺后,土壤呼吸出现了先促进后抑制的趋势,加入玉米秸秆后,促进作用消失,仅存在抑制作用,且农药浓度越高抑制作用越强。在黏土中添加呋虫胺后,土壤呼吸被促进,且在50μg·kg-1浓度时达到最高。吡虫啉对土壤呼吸影响不大,仅出现微弱促进作用。
  (2)加入呋虫胺后,通过16s rRNA基因序列分析,两种土壤中细菌群落结构均发生了显著变化,尤其是在砂壤土中,细菌多样性和群落组成在三个添加浓度上均有显著变化。两种土中共有6个菌门在添加呋虫胺后相对丰度发生显著性交化,其中,Acidobacteria和Actinobacteria门水平下响应的微生物科是最多的。
  (3)两种新烟碱型农药都显著降低了跳虫的存活率和繁殖率,且呋虫胺能够影响跳虫对外源碳的直接同化作用。农药的加入对MBC和MBC-13C无显著性影响,但显著提高了CO2的总释放量,并且在黏土中显著抑制了13C-CO2的释放。呋虫胺的加入显著影响到了真菌和细菌的部分优势菌群,但未影响到与13C-MBC和13C-CO2有显著相关关系的菌群,这也解释了加入呋虫胺后部分处理中13C-MBC和13C-CO2未出现显著性差异的原因。
[硕士论文] 王卢燕
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:山核桃干腐病是山核桃生产中最主要病害,严重影响了山核桃产业的可持续发展。在种植中,临安实生山核桃发病严重,但是美国砧木嫁接临安实生山核桃(文中简称美国嫁接山核桃)和湖南砧木嫁接临安实生山核桃(文中简称湖南嫁接山核桃)发病较轻。本文以临安实生山核桃、美国嫁接山核桃、湖南嫁接山核桃、美国薄壳山核桃和湖南实生山核桃为材料,测定树干和树根中酚酸含量、生物碱含量和过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性之间的差异并分析与感病指数之间的关系,初步探讨嫁接山核桃抗干腐病的机理,为临安实生山核桃干腐病的预防与控制提供科学依据。主要取得了以下结果:
  1通过对山核桃林间干腐病调查,发现临安实生山核桃的感病指数最高,发病程度严重;美国嫁接山核桃和湖南嫁接山核桃的感病指数低,发病程度较轻微。2年生的山核桃较少感染干腐病,10年生的山核桃感病严重。
  2HPLC-SPE法测定山核桃树干和树根中酚酸种类和含量,发现均含有没食子酸和绿原酸。树干中,嫁接山核桃的总酚酸含量显著高于临安实生山核桃;树根中,2年生的嫁接山核桃总酚酸含量低于临安实生山核桃,10年生时高于临安实生山核桃。随着树龄增加,树干和树根中总酚酸含量都增加。在临安实生山核桃、美国嫁接山核桃和湖南嫁接山核桃中,2年生与10年生树干中总酚酸含量与感病指数间相关系数分别为0.943和0.768,呈显著负相关关系。树干中总酚酸含量越高,感病指数越低,抗性越强;树根中总酚酸含量与感病指数无明显相关性。
  3临安实生山核桃、美国嫁接山核桃和湖南嫁接山核桃的树干和树根中总生物碱含量无显著差异。随着树龄增加,5种试材的树干中总生物碱含量都显著减少,树根中除了美国薄壳山核桃显著增加,其它试材都无明显变化。2年生树干和树根与感病指数间呈微弱的负相关关系;10年生树干和树根与感病指数为不显著弱正相关关系。树干和树根中总生物碱含量可能影响山核桃的抗病性,但这种相关性不明显。
  4嫁接山核桃树干和树根中CAT活性和POD活性都高于临安实生山核桃。随着树龄增加,不同试材的CAT活性、POD活性和SOD活性都升高,PPO活性下降。2年生和10年生山核桃树干中CAT活性与感病指数的相关系数分别0.834和0.645,2年生和10年生POD活性与感病指数相关系数分别0.834和0.645,树干中CAT活性POD活性呈显著负相关。PPO活性和SOD活性与感病指数的相关系数小,无明显的相关性。树根中的酶活性与感病指数之间都无明显的相关性。因此,树干中CAT和POD活性越高,山核桃的抗病性越强。
[博士论文] 高美玲
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:番茄病害是目前导致番茄产量严重下降的主要原因,并给番茄产业带来巨大的经济损失。2013-2014年,本课题组调查番茄病害时,在我国大连地区商业温室种植番茄基地发现一种病原菌侵染番茄植株引起番茄叶斑病。该病害具有侵染速度快和死亡率高的特点,严重影响该地区番茄的产量和质量。对引起番茄叶斑病的病原菌进行分离和鉴定,并对该病原菌侵染番茄植株的入侵途径和致病分子调控机制的研究是控制该病害的重要前提。因此,本论文围绕以上科学问题开展研究,主要研究结果和结论如下:
  (1)发现层出镰孢菌可侵染番茄植株引起番茄叶斑病。在大连地区采集番茄叶斑病病叶,对病原菌分离纯化,科赫氏法则验证,并通过形态学、细胞学和分子生物学等方法对病原菌进行鉴定。表明层出镰孢菌是引起番茄叶斑病的新病原菌,其分类地位为真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes),肉座菌目(Hypocreomycetidae),丛赤壳科(Nectriaceae),镰孢菌属(Fusarium),藤仓赤霉菌交配群D(Gibberella fujikuroi D),层出镰孢菌(Fusariumproliferatum(matsush.)Nirenberg),命名该菌株为层出镰孢菌K140108。
  (2)层出镰孢菌K140108是通过气孔入侵番茄叶片组织。采用扫描电镜对层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作的不同阶段进行观察。结果表明,层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作12小时,叶片表皮细胞发生不规则褶皱;互作48小时,观察到分生孢子进入叶片气孔;互作72小时,大多数气孔填满分生孢子;互作96小时,分生孢子布满叶片组织,有菌丝从气孔中长出,叶片上出现褐色水渍斑点。
  (3)层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作转录组分析。利用RNA-seq技术对层出镰孢菌K140108侵染96小时的番茄病叶进行转录组测序分析,并以菌株K140108作为对照组。共获得61,544,598个clean reads用于de novo组装层出镰孢菌K140108参考转录组。基因功能注释分析后,得到75,044个Unigenes,其中19.46% Unigenes被分配到276个KEGG代谢通路,其中22.30%的Unigenes与水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)具有同源性。共鉴定出18,075个表达差异基因,通过生物信息学软件预测到720个外泌蛋白并从中筛选出184个候选效应分子,其中79.89%候选效应分子在互作96小时呈上调表达。
  (4)对互作96小时显著上调表达的五个效应分子进行功能研究,结果表明,它们与层出镰孢菌K140108的致病性不相关。对层出镰孢菌K140108原生质体的制备条件进行优化后,采用Split-PCR方法分别对五个效应分子(DN263、DN7752、DN12525、DN20100和DN18029)进行基因敲除。结果表明,与野生型相比,△dn7752和△dn12525突变体的菌丝紧贴培养基表面生长,△dn7752突变体产生明显的紫色色素,△dn263、△dn20100和△dn18029突变体的表型均无明显变化。番茄叶片侵染试验证明,五个突变体对菌株的致病力无明显影响。
  (5)层出镰孢菌K140108丝裂原活化蛋白激酶基因FpPMK1对该菌的菌丝生长和致病性具有显著调控作用。以禾谷镰孢菌直系同源的MAKR基因GPMK1编码的蛋白为靶序列,在转录组表达差异基因中获得与其相似度为99%的同源基因DN56288,将其命名为FpPMK1。敲除基因FpPMK1,获得的△Fppmk1突变体与野生型相比气生菌丝变短,生长速率和分生孢子产量明显降低。番茄叶片侵染试验证明,△Fppmk1突变体致病性显著降低。回复试验表明,FpPMK1基因回补菌株在菌落形态、生长速率、产孢量和致病力等方面都恢复到野生型状态。
[博士论文] 孙玉冰
农业机械化工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:茶树种植区域十分广泛,在世界范围内可分为东亚、东南亚、南亚、西亚、欧洲、东非和南美等6个主要区域。中国是主要的产茶区,已有3000多年的种植历史,因其优良的口感和丰富的保健作用受到广大消费者的青睐。据统计,中国的茶叶年消费量已高达66万吨左右,人均饮茶0.45公斤/年。但是,因害虫引起茶叶产量损失巨大,造成茶叶减产15%~20%,而局部茶区茶尺蠖暴发甚至可以致茶叶减产60%以上,由于害虫易转移且常常隐藏于叶片下方,现如今没有行之有效的检测手段。因此,本文借助于电子鼻和气质联用两种仪器,研究了受不同类型害虫危害的茶树、使用电子鼻检测茶树的最佳时间点及茶树受害时间、质量损失量、受两种害虫危害的茶树等内容。本研究探索电子鼻传感器响应信号与挥发物成分之间的相似性,比较不同特征提取方法、降维方法的效果,并进行相应的模式分类和参数预测。主要研究内容和结论如下:
  (1)采用基于二项式方程、高斯函数、指数函数和吸附动力学方程进行拟合的特征提取方法分别对3个电子鼻原始数据集进行特征提取。以拟合图的拟合情况和拟合均方根误差作为拟合效果的评价指标,结果表明使用吸附动力学方程进行拟合时获得了最佳的效果。使用多层感知器神经网络对不同特征提取方法获得的特征矩阵进行处理并比较,结果同样表明,使用吸附动力学方程进行拟合获得的特征矩阵具有最佳的分类效果。
  (2)分别使用电子鼻和气质联用技术对不同类型害虫茶树进行检测。不同类型害虫茶树的挥发物之间存在明显区别,说明了可以尝试使用电子鼻检测受不同类型害虫危害的茶树。不同受害类型茶树电子鼻响应结果的显著性分析同样表明了不同组分之间的显著性差异。使用主成分分析、局部保留投影、核主成分分析和局部线性嵌入分别对电子鼻数据进行降维并可视化分析,接着使用多层感知器神经网络、极限学习机和支持向量机分别对降维结果进行分类分析,并获得最佳的降维和分类算法的组合。电子鼻是一种进行不同类型害虫茶树检测的有效方法,基于局部保留投影和支持向量机的组合具有最佳的分类效果。
  (3)在不同时间点下,分别使用电子鼻和气质联用技术对不同危害时间茶树进行检测。气质联用结果表明,在不同的时间点下,受害茶树挥发物之间存在区别,说明电子鼻检测结果的不同,不同危害时间茶树的挥发物之间亦存在区别,可以尝试使用电子鼻预测受害时间。使用主成分分析和局部线性嵌入分别对不同检测时间点下,不同危害时间茶树的电子鼻检测结果进行分析。结果均表明,在中午12点时进行检测的电子鼻结果具有最佳的分类效果。使用极限学习机对中午12点时的电子鼻检测结果进行分类和回归分析,均取得了不错的效果,可以使用电子鼻预测危害时间。
  (4)分别使用电子鼻和气质联用技术检测受不同数量害虫危害的茶树和受不同时间害虫危害的茶树,并测量危害前后茶树的质量损失量。气质联用结果表明,不同数量害虫茶树和不同危害时间茶树的挥发物之间均存在区别,可以尝试使用电子鼻检测。传统上通常以害虫数量和危害时间作为评价茶树受害程度的指标,本研究引入茶树受害前后的质量损失作为评价指标。以电子鼻数据作为自变量,这三个指标作为因变量,使用偏最小二乘法进行回归分析。结果表明,以茶树质量损失量作为因变量具有更佳的预测效果。
  (5)分别使用电子鼻和气质联用对受两种害虫危害的茶树进行检测。气质联用结果表明,不同害虫比例茶树的挥发物之间存在区别,可以尝试使用电子鼻对害虫比例进行预测。使用支持向量机对电子鼻结果进行分类和回归分析,取得了不错的效果,可以使用电子鼻对危害茶树的害虫比例进行预测。
[硕士论文] 林马水
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:为探究山核桃树体微生物多样性及功能对山核桃干腐病的影响,本文采用高通量测序,比较了健康山核桃树、发病山核桃树发病与未发病部位树皮、木质部的pH值、养分和细菌、真菌多样性差异,并分析了相关性。主要研究结果如下:
  1、健康山核桃树皮与木质部pH值分别为7.03与7.63,显著高于发病山核桃树,发病、未发病部位树皮与木质部pH值分别为5.95、5.43与5.95、5.69(P<0.05)。
  2、健康山核桃树皮单宁、可溶性糖含量分别为0.317%、3.348%,木质部这两种养分含量分别为0.079%、0.626%,均显著高于发病山核桃树(P<0.05)。健康山核桃树皮、木质部还原糖含量分别为0.865%、0.420%,均显著低于发病山核桃树(P<0.05)。
  3、健康山核桃树皮细菌与真菌OTU数目显著高于发病山核桃树、木质部细菌OTU数目显著低于发病山核桃树,木质部真菌OTU数目显著高于发病山核桃树。健康山核桃树、发病山核桃树发病、未发病部位主要细菌菌属,树皮分别有7、8、8个,木质部分别有8、4、8个,主要真菌菌属树皮分别有7、12、5个,木质部分别有8、3、6个,且健康与发病山核桃树皮和木质部主要菌属在种类和多度上均存在显著差异(P<0.05)。健康山核桃树皮优势细菌属为蛭弧菌属、酸胞菌属、鞘氨醇单胞菌属,多度分别为0.13%、0.01%、15.32%,优势真菌属为附球菌属,多度为0.111%,木质部优势细菌属为Massilia、鞘氨醇单胞菌属,多度分别为1.2%、4.41%,优势真菌属为喙枝孢属,多度为4.47%,均显著高于发病山核桃树(P<0.05)。发病山核桃树发病与未发病部位树皮中,优势细菌属均为粘细菌属与甲基杆菌属,发病部位该2个菌属的多度分别为7.56%、6.46%,优势真菌属均为德福霉属与Spizellomyces,发病部位该2个菌属的多度分别为10.44%、0.014%,显著高于未发病部位,且发病山核桃树两种部位树皮该4个菌属的多度均显著高于健康山核桃树(P<0.05)。发病山核桃树发病与未发病部位木质部中,甲基杆菌属、Luedemannella、粘细菌属均为优势细菌属,多度分别为2.36%、0.35%、2.35%与1.76%、1.81%、0.55%,茎点霉属、念珠菌属均为优势真菌属,多度分别为1.31%、1.85%与0.51%、0.84%,且发病山核桃树两种部位木质部该5个菌属的多度均显著高于健康山核桃树(P<0.05)。
  4、健康山核桃树皮与木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson细菌多样性指数差异显著,分别为599、603、6.59、0.98与440、454、6.35、0.95,真菌这4种多样性指数差异显著,分别为321、318、4.42、0.92与311、263、5.93、0.96(P<0.05)。
  5、RDA分析表明,pH值、可溶性糖、还原糖均对山核桃树皮与木质部的细菌与真菌优势属有显著影响(P<0.05)。
  研究结果可为山核桃林可持续健康经营提供借鉴。
[硕士论文] 张书亚
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:随着高产水稻的大面积种植以及高产栽培技术的推广,水稻恶苗病、稻瘟病和稻曲病大面积发生,严重威胁水稻安全生产。明确病原菌流行规律及其对药剂的敏感性,对病害的防治至关重要。本研究针对浙江省水稻恶苗病主要致病菌种类及其抗药性和水稻主要真菌病害的早期检测预警技术开展研究。主要研究结果如下:
  1.从浙江省的金华、嘉兴和绍兴地区共获得134株镰刀菌,其中藤仓镰孢(Fusarium fujikuroi)101株,金华、嘉兴和绍兴地区分别为36、32和33株,分别占该地区种群的75.0%、71.1%和80.48%。
  2.测定了134株镰刀菌对多菌灵、咪鲜胺和氰烯菌酯的敏感性,结果如下:多菌灵敏感菌株有17株,抗性菌株117株,其中藤仓镰孢多菌灵低中和抗菌株分别有92株和9株。所有藤仓镰孢菌均为咪鲜胺抗性菌株,其中25株为低抗、44株为中抗,32株为高抗,5株禾谷镰刀菌和2株层出镰刀菌为低抗菌株,其它镰刀菌均为咪鲜胺敏感菌株。有121株镰刀菌为氰烯菌酯敏感抗性菌株,EC50值范围为0.19μg/mL~0.85μg/mL,平均0.46μg/mL;其中13藤仓镰孢菌为氰烯菌酯抗性菌株,EC50值在33.28μg/mL~80.33μg/mL之间,平均为59.27μg/mL,是敏感菌株平均EC50的129倍。
  3.分析了藤仓镰孢对多菌灵敏感和不同抗性水平菌株的β2-微管蛋白基因的全长,经序列比对发现:多菌灵高抗菌株中β2-微管蛋白基因第198位氨基酸由谷氨酸突变(GAG)为缬氨酸(GTG);2株多菌灵低抗菌株的β2-微管蛋白基因第200位氨基酸由苯丙氨酸突变(TTC)为络氨酸(TAC);18株多菌灵低抗菌株的β2-微管蛋白基因第167位氨基酸由苯丙氨酸(TTC)突变为络氨酸(TAC)。所有抗性菌株的235位密码子均由GGC突变为GGT,为无义突变。
  4.分析了藤仓镰孢咪鲜胺敏感和不同抗药性水平菌株的CYP51A、CYP51B、CYP51C基因序列和CYP51A基因启动子区域序列,分析了CYP51A基因相对表达量。序列比对结果表明:抗性菌株的CYP51A和CYP51C基因未出现点突变,CYP51A基因启动子区域无片段插入,CYP51B基因第312位氨基酸由丝氨酸(TCT)突变为苏氨酸(ACT);在10μg/mL咪鲜胺处理12h后,咪鲜胺低抗和高抗菌株的CYP51A基因的相对表达量与敏感菌株间差异不显著;在处理24h后,低抗和高抗菌株的CYP51A基因的相对表达量上升且与敏感菌株间差异显著;在处理48h后,低抗和高抗菌株的CYP51A基因的相对表达量均下降,高抗菌株与敏感和低抗菌株间差异仍显著,低抗菌株与敏感菌株间差异不显著。
  5.分析了藤仓镰孢氰烯菌酯敏感和不同抗性水平菌株的肌球蛋白-1基因的全长,经比对发现:抗性菌株的肌球蛋白-1基因219位密码子均由TCA突变为CCA,导致219位氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸。
  6.建立了稻种中恶苗病菌的LAMP检测体系。该检测体系具有良好的特异性,包括DNA提取和LAMP反应过程,可在70min有效检测0.001ng/μL浓度水平的病原菌基因组DNA,可在稻种催芽前和插秧前对种子和幼苗的带菌率进行快速检测。
  7.建立了稻曲病菌孢子实时定量LAMP检测体系,该体系理论上能检测到浓度为6.4个/mL的孢子,且能对复杂样品进行定量检测,与孢子捕捉仪器配合使用可对气传孢子进行定量,为稻曲病菌气传孢子释放规律与病害发生间的关系研究提供技术支持。
  8.建立了稻瘟病菌实时定量LAMP检测体系,该体系理论上能检测到3.2个/mL的孢子,可对气传孢子进行定量检测,且能在显症前对植株中稻瘟病菌进行检测。
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