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[硕士论文] 贺国园
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:葡萄孢属真菌的寄主范围十分广泛,能侵染1400多种植物,引起重要的灰霉病,造成重大的经济损失。本文主要研究了灰葡萄孢HBstr-470的生物学特性,对其中的真菌病毒进行了分子鉴定,并研究了病毒的传播特性和对灰葡萄孢生物学特性所造成的影响。此外,本文通过RNA-seq初步筛选分析了菌株HBstr-470菌落分生孢子产生阶段的差异表达基因。
  菌株HBstr-470在PDA上生长速度缓慢,菌落形态表现异常,形成大量的气生菌丝并产生丰富的分生孢子。分生孢子正常萌发,且形成的菌落再次无性繁殖形成分生孢子的性状稳定,分生孢子的产生不受光照条件限制且早于强毒菌株B05.10。但分生孢子在本氏烟叶片上的致病力与竞争性致病力都弱于强毒菌株B05.10。
  菌株HBstr-470由5种真菌病毒复合侵染,分别为Sclerotinia sclerotiorum hypovirus2/HBstr-470(SsHV2/HBstr-470)、Botrytis cinerea hypovirus1/HBstr-470(BcHV1/HBstr-470)、Botrytis cinerea victorivirus1/HBstr-470(BcVV1/HBstr-470)、Botrytis cinerea RNA2/HBstr-470(BcRV2/HBstr-470)和Botrytis cinerea partitivirus2/HBstr-470(BcPV2/HBstr-470)。其中,SsHV2/HBstr-470、BcHV1/HBstr-470属于Hypoviridae病毒科,BcVV1/HBstr-470属于Totiviridae病毒科中的Tctorivirius;BcRV2/HBstr-470与RnQV1/W1075的同源关系较近,但并未发现编码CP的dsRNA片段,可能为Quadrivirade的一个新成员;BcPV2/HBstr-470在系统进化上与Partitiviridae病毒科中成员构成一大支,是Partitiviridae中的一个新成员。菌株HBstr-470中的真菌病毒能通过分生孢子稳定地垂直传播给后代。通过对水平传播后获得的衍生菌株中真菌病毒种类及相关生物学进行分析发现:SsHV2/HBstr-470、BcVV1/HBstr-470可能与分生孢子产量增加有关;BcHV1/HBstr-470与致病力衰退有关;BcRV2/HBstr-470与生长速率的降低、分生孢子产量的增加和致病力的衰退有关;BcPV2/HBstr-470与致病力衰退和分生孢子产量的增加有关。
  菌株HBstr-470分生孢子产生阶段(48~72h)中的368个DEGs富集在氧化还原、氧化还原酶活性、血红素结合和四吡咯结合进程,表明氧化还原相关基因参与菌株HBstr-470分生孢子产生过程;KEGG分析表明基因显著富集在核糖体和氨基糖与核糖代谢通路。此外,比较转录组分析发现:菌株HBstr-470特异性表达的DEGs中涉及病毒的传播、转录和质膜的融合,可能与菌株HBstr-470中真菌病毒通过分生孢子的形成垂直传播到后代有关。
[硕士论文] 文栋
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大气CO2浓度的不断升高使农业生态系统受到一定程度的影响,不仅农作物的生长和营养结构发生改变,以农作物为食的农业害虫也受到间接影响。本研究以水稻刺吸式害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens St(a)l)为研究对象,设置3个CO2浓度,即380μL/L(当前大气CO2浓度)、550μL/L(中间浓度)、750μL/L(倍增浓度),利用两性生命表对连续饲养多代后褐飞虱的生长发育、繁殖、存活率、种群动态进行分析,然后结合16S rDNA测序,对三个CO2浓度下褐飞虱共生菌的多样性和丰富度进一步比较分析,并通过COG功能预测和KEGG代谢途径分析,比较3个CO2浓度下代谢差异,从微生物角度揭示不同CO2浓度下褐飞虱的适应机制。实验结果如下:
  1.高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱的生活史和种群动态的影响
  以三个CO2浓度下连续饲养到第32代的褐飞虱为对象,研究高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱的生长发育、繁殖、种群动态的影响。分析发现550μL/LCO2浓度下褐飞虱若虫发育历期和总产卵前期较当前CO2浓度显著缩短(P<0.05),而750μL/L CO2浓度下除5龄若虫历期缩短外,其它龄期和总产卵前期无显著差异(P>0.05)。CO2浓度升高提高褐飞虱若虫的存活率,中间浓度550μL/L的雌雄成虫寿命较其他浓度显著延长(P<0.05)。中间浓度550μL/L下褐飞虱的产卵量显著高于当前大气CO2浓度和倍增CO2浓度(P<0.05),而当前CO2浓度和倍增CO2浓度之间无显著差异(P>0.05),可见中间浓度提高褐飞虱的繁殖率。对种群动态进行模拟,发现中间浓度下褐飞虱内禀增长率、周限增长率和净繁殖率均显著高于其他浓度(P<0.05),而当前浓度和倍增浓度之间无显著差异(P>0.05),平均世代周期3个CO2浓度之间也无显著差异(P>0.05)。
  2.长期倍增CO2浓度对褐飞虱种群演化的影响
  本实验以倍增浓度下连续饲养到49代的褐飞虱为主要研究对象,当前大气CO2浓度下连续饲养到第49代的褐飞虱为对照。通过两性生命表理论分析发现,倍增浓度下褐飞虱5龄若虫历期显著缩短(P<0.05),其它若虫期无显著差异(P>0.05),成虫产卵前期和总产卵前期也无显著差异(p>0.05)。倍增CO2浓度使成虫寿命显著缩短(P<0.05)。两种浓度各龄期若虫存活率无显著差异(P>0.05),但倍增CO2浓度下雌虫存活率高于雄虫,而当前大气CO2浓度却相反。对种群动态进行模拟发现,两种CO2浓度内禀增长率、周限增长率和净繁殖率上无显著差异(P>0.05),但倍增浓度平均世代周期显著缩短(P<0.05)。3.高CO2浓度对连续饲养多代后褐飞虱体内共生菌多样性的影响
  通过16S rDNA测序,对3个CO2浓度下连续饲养多代褐飞虱体内共生菌进行多样性分析,发现中间CO2浓度550μL/L下褐飞虱共生菌OTU(operational taxonomic units)数值略高,说明该浓度下共生菌丰富度较其它浓度高。3个浓度下褐飞虱共生菌优势菌门相同,分别是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);优势菌属也相同,分别是不动杆菌属(Acmetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、节细菌属(Arthrobacter)和微杆菌属(Microbacterium)。3个浓度下褐飞虱共生菌各分类单元丰度存在一定差异,但种类无显著差异。通过COG功能预测和KEGG代谢途径分析,褐飞虱共生菌参与了其体内绝大部分生理代谢过程,其中中间CO2浓度550μL/L各代谢通路的丰度值最高,说明中间浓度对褐飞虱的生理代谢有一定促进作用。
  4.高CO2浓度下褐飞虱体内优势菌的定量及不动杆菌属功能初探
  选取了3个CO2浓度下褐飞虱4种优势菌属不动杆菌属Acinetobacter、杀雄菌属Arsenophonus、节细菌属Arthrobacter和金黄杆菌属Chryseobacterium进行荧光定量分析,发现不动杆菌属相对含量在当前大气CO2浓度下最低,而杀雄菌属相对含量在3个浓度下均无显著差异(P>005)。节细菌属相对含量在中间CO2浓度下显著低于当前CO2浓度和倍增CO2浓度(P<0.05),而当前浓度和倍增浓度之间无显著差异(P>0.05)。金黄杆菌属的相对含量在倍增浓度下最高,当前CO2浓度和中间CO2浓度下无显著差异(P>0.05)。同时在当前大气CO2浓度下,进行不动杆菌属共生菌饲喂实验,对褐飞虱饲喂后生长发育和繁殖进行比较。通过两性生命表分析,发现饲喂不动杆菌属菌株组和空白对照在不同龄期的发育历期、成虫寿命、成虫繁殖率和种群参数等方面均无显著差异(P>0.05),不动杆菌属对褐飞虱其它方面生物学意义还有待采用分子生物学技术去研究和验证。
[博士论文] 宋杰辉
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:稻曲病已发展成为我国水稻的三大病害之一,不仅引起水稻产量损失,还产生毒素污染谷物,对我国粮食安全及食品安全造成严重威胁。随着稻曲病人工接种技术的改善,国内外对稻曲病菌的侵染机制进行了大量研究,极大地提高了对稻曲病菌侵染的认识。本研究使用GFP标记的菌株接种感病水稻品种晚籼98,在接种后逐日观察病菌的侵染进程及水稻各花器的发育情况,对稻曲病菌的侵染机制进行了探讨,同时对侵染阶段的稻曲病菌效应子进行了鉴定,最后评价了种子带菌不是稻曲病的主要初侵染来源,取得了如下研究结果:
  (1)使用GFP标记的菌株G2接种感病水稻品种晚籼98,在接种后逐日观察稻曲病菌的侵染进程及水稻各花器的发育情况,初步揭示了稻曲病菌对水稻的侵染是一种逐步侵染模式。使用体视荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜,分别观察到稻曲病菌在水稻花器发育成熟前通过内外颖壳的缝隙进入谷粒,首先侵染水稻花丝,随后侵入柱头和花柱,偶尔能通过花柱到达子房。病菌侵染过程中,没有观察到吸器、侵染钉等侵染结构,且病菌只在寄主细胞间隙中生长。KI-I2染色试验和DAPI染色试验证明被侵染的水稻小穗中花粉发育明显受到抑制,子房受精受阻,无法继续发育且不能被KI-I2染色。然而,实时荧光定量PCR显示水稻中一些灌浆相关基因包括bZIP转录因子、淀粉代谢相关基因和种子储藏蛋白基因在稻曲病菌侵染后被大量诱导表达,表现出与子房受精后类似的表达模式,表明病菌阻止水稻受精的同时,能模拟水稻的受精,以便获取水稻营养形成稻曲球。使用G2接种温敏雄性不育系品种Hua9s,在接种后第3d用晚籼98的花粉对接种的稻穗进行人工授粉,探究病菌与受精子房之间的竞争。结果发现绝大多数授粉以后的子房都能继续发育成幼嫩的种子,表明稻曲病菌无法与成功受精的子房竞争,阐释了稻曲病菌侵入水稻小穗后首先侵染花丝,抑制花粉成熟的原因。本研究揭示的稻曲病菌逐步侵染模式以及病菌模拟水稻受精来劫持营养供应形成稻曲球的方式,代表了一种较新颖的病原菌与植物互作的生物学过程。
  (2)对水稻晚籼98接种稻曲病菌后第1d、5d和9d的样品,以及相应对照用PSB接种的样品,共6个样品进行转录组测序分析。在3个侵染时期分别鉴定出89、308和3545个差异表达基因,并对其进行了GO富集分析和KEGGPathway富集分析。GO富集分析结果显示接种后第9d,上调基因主要富集在糖类代谢过程和一些调控相关过程。KEGG Pathway富集分析结果显示差异表达基因主要富集在糖类代谢和能量代谢这两大类,其中参与糖酵解和糖异生途径的差异表达基因在接种后第5d和第9d同时显著上调表达。另外,水稻糖转运蛋白OsSWEET家族中大部分基因在病菌侵染后都有不同程度的上调表达,尤其是接种后第9d,OsSWEET1a、OsSWEET1b、OsSWEET4、OsSWEET、OsSWEET6a、OsSWEET14、OsSWEET16和OsSWEET11-like都显著上调表达。选取OsSWEET5作进一步的研究,利用酵母单杂交技术筛选到3个与OsSWEET5启动子互作的稻曲病菌效应子Uv33、Uv46和Uv48,对候选效应子的转录组分析表明它们在稻曲病菌侵染过程中大量表达。此外,用酵母单杂交试验对效应子Uv33、Uv46和Uv48与OsSWEET5启动子的互作进行了体内验证。为了验证候选效应子是否具有分泌功能,采用pSUC2酵母分泌系统进行信号肽分泌功能验证,结果表明效应子Uv33、Uv46和Uv48的信号肽具有分泌功能。
  (3)为了研究种子带菌是否是稻曲病的一种主要初侵染来源,在2014、2015和2017年分别使用药剂多菌灵、三唑酮、福美双和生石灰对被田间稻曲球污染的水稻种子进行处理,随后在水稻苗期、分蘖期和孕穗期分别对水稻各组织取样,用稻曲病菌特异性PCR检测样品中是否携带稻曲病菌,并且在水稻成熟期调查田间稻曲病的发生情况。在苗期对水稻的芽和根进行PCR检测,发现处理组与对照组相比,稻曲病菌的检测率显著降低。然而,在水稻分蘖期对叶片、茎和根进行PCR检测,以及孕穗期分别对叶片、茎、穗和根进行PCR检测,发现各处理之间没有显著差异,最后在水稻成熟期的田间稻曲病调查分析也发现各种处理之间没有显著差异。结果说明种子带菌不是主要的初侵染来源。
[硕士论文] 赵飞飞
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来我国南方梨区早期异常落叶的发生普遍,造成的损失十分严重。本实验室前期对造成梨早期落叶的病原菌进行系统鉴定,证实该病系由果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)侵染所致,同时发现,该菌在田间的症状表现存在有两种类型,Ⅰ型产生不扩展的黑色斑点症状,Ⅱ型产生可扩展的坏死斑症状。本研究选取来源于两种不同症状类型的代表菌株F J-85(产生黑点症状)和菌株FJ-11-2(产生坏死斑症状),比较两个菌株有性态与无性态的症状表现,并利用荧光标记和组织染色方法显微观察这两种不同致病型菌株的侵染过程,为探讨果生炭疽菌的致病机制和解析果生炭疽菌在我国梨上的致病多样性提供新的实验依据。取得的主要研究结果如下:
  1.两个不同致病型菌株子囊孢子单孢菌系的生物学特性及致病性研究。以梨果生刺盘孢的两种致病型菌株FJ-85(产生黑点症状)和菌株FJ-11-2(产生坏死斑症状)为材料,研究发现这两个菌株的子囊孢子单孢培养均可产生正、负两种类型的单孢菌系,正型单孢菌系菌落浅白色,其上形成的子囊孢子再培养,可形成正、负两种类型的单孢菌系。负型单孢菌系菌落深灰色,其上形成的子囊孢子再培养,只形成负型一种单孢菌系。两个菌株的单孢菌系中,负型的比例明显多于正型。两种类型的单孢菌系对峙培养,在菌落内及菌落交界处均可形成子囊壳,而同种类型的单孢菌系对峙培养仅在菌落内产生子囊壳。结果表明同种类型的单孢菌系可同宗配合,而正、负两种类型的单孢菌系还可异宗配合。正型单孢菌系的致病力与原始菌株相近,而负型单孢菌系较原始菌株弱。两个菌株的单孢菌系在翠冠梨上引起的症状差异与其原始菌株相同。
  2.两个不同致病型菌株GFP转化体系的建立。利用ATMT法对两个致病型菌株F J-85和FJ-11-2进行GFP标记,选取并测定转化子的荧光稳定性和潮霉素B抗性,并通过分子方法检测转化子中的hph和gfp基因。通过比较野生型菌株和转化子的菌落形态、生长速率和和致病力,筛选出与野生型较一致的转化子FJ-85-24和FJ-11-2-39。
  3.两个不同致病型菌株GFP转化子对梨叶侵染的显微观察。用转化子菌株FJ-85-24和FJ-11-2-39的分生孢子悬浮液,在翠冠梨叶上无伤和针刺接种后定期进行显微观察。结果显示,接种菌株FJ-85-24后,在黑点症状部位可以看到附着胞附着在叶片表面,黑点症状周围细胞出现明显的防卫反应,但未看到明显的侵染菌丝在叶片内部的扩展,怀疑黑点症状可能是由附着胞在侵染中产生的某种次生代谢产物与寄主进行非亲和互作而引起过敏性坏死反应。而菌株FJ-11-2-39的附着胞在叶片上并未显症而是以附着胞形式潜伏侵染。在发病后期两个菌株均会在叶片角质层下形成大量子囊壳。通过两个转化子的分生孢子液无伤和针刺接种丰水梨叶后发现,症状出现明显较早,且坏死部位可以看到菌丝的扩展。荧光显微镜下观察到叶片栅栏组织与海绵组织之间的组织坏死,但并未观察到菌丝在病组织内的扩展情况。
  4.两个不同致病型菌株侵染梨叶的组织染色法观察。在梨叶上接种菌株FJ-85和FJ-11-2的分生孢子,观察发现二者具有相同的萌发率,但萌发后形成的附着胞数量与类型,在接种初期存在显著性差异,菌株FJ-85的附着胞数量较菌株FJ-11-2多,前者多为短芽管末端形成的附着胞,后者则多为芽管伸长形成的附着胞。但接种24h后,二者差异不明显,均可观察到在芽管末端及周围芽生分生孢子,产生大量的附着胞。
[博士论文] MUHAMMAD IRFAN WARIS
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:复杂敏锐的嗅觉系统在草食性昆虫寄主定位行为中起着重要的作用,如果能够探明昆虫嗅觉感受的机制,则可以为基于昆虫嗅觉机制发展害虫行为调控手段奠定重要的理论基础。目前虚的许多研究表明,多种蛋白在昆虫嗅觉感受过程中起着重要的功能,其中的化学感受蛋白(CSPs)被证明可参与昆虫的嗅觉感受过程,但也许多研究发现CSPs也可能参与昆虫的发育等其他生理过程,CSPs确切的功能目前仍不清楚。褐飞虱Nilaparvata lugens(Stal)是为害水稻上重要的害虫,每年给水稻产量造成巨大的损失。本课题组在前期对褐飞虱触角转录组测序中发现了多个CSPs,但对于这些CSPs在褐飞虱嗅觉中的功能不明确。因此,我们在对褐飞虱几个CSPs基因克隆的基础上,对其CSPs的时空表达谱、重组CSPss与水稻挥发物的结合特性及机制进行了研究,并通过RNA干扰技术分析了CSPs在褐飞虱行为选择中的功能,以期为基于嗅觉感受机制发展褐飞虱的防治技术奠定理论基础。主要结果如下:
  1.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP3的功能分析
  在本研究中,为了更好的理解化学感受蛋白在褐飞虱中的生理功能,我们在体外克隆了NIugCSP3基因。荧光定量PCR结果显示NIugCSP3在3天交配短翅雌虫触角和三天未交配雄虫腹末和触角中高表达。通过体外荧光竞争性结合、荧光猝灭,我们提供了筛选行为活性物质的一种可行有效的方法。在25种配基中,体外结合和行为选择实验表明十九烷和2-十三酮与NIugCSP3表现出很强的结合活性而且能很好地吸引褐飞虱。NIugCSP3与水稻挥发物有很好的结合活性表明其可能参与水稻普通气味物质的接受过程中。结合机制分析表明NIugCSP3与配基相互作用的很多信息。参与与配基相互作用的关键性氨基酸残基被揭示。鉴于热力学方程和联合相互作用,疏水作用是NIugCSP3与配基相互作用的主要作用力。荧光猝灭实验也表明,十九烷和2-十三酮能使NIugCSP3发生静态猝灭,而且两者的结合是自发进行的,相互作用力主要为疏水性作用。此研究提供了一种从荧光猝灭的角度进行行为活性物质筛选的方法。
  2.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP8的功能分析
  在此研究中,我们从褐飞虱中成功克隆了NIugCSP8基因序列。蛋白序列分析表明NIugCSP8与其他昆虫CSPs具有很高的保守性并且含有4个保守的半胱氨酸残基。基因表达分析表明NIugCSP8基因特异性表达于3天交配短翅雌虫的翅中,表达量是3天未交配短翅雌虫翅的175倍。此外,NlugCSP8也高表达于5天未交配短翅雄虫腹末中,与年龄、性别、成虫翅型和交配状态有关。荧光竞争性结合表明,具有较长碳链的配基如橙花叔醇、己醛和反-2-己烯醛与NIugCSP8具有很强的结合能力。通过利用生物信息学的同源建模与分子对接等方法,我们预测了NIugCSP8与具有良好结合活性的气味物质的结合位点数。此外行为选择实验表明,与NIugCSP8具有较强结合活性的气味物质中有四种气味物质能引起褐飞虱显著的行为活性。NIugCSP8的功能进一步被RNAi验证。RNA干扰实验结果表明,干扰NIugCSP8之后褐飞虱对具有吸引作用的物质的吸引效果明显降低。此研究表明NIugCSP8可能会成为褐飞虱环境友好经济的防治靶标。
  3.褐飞虱化学感受蛋白NIugCSP10的功能分析
  在此研究中,我们成功将NIugCSP10在大肠杆菌进行原核表达,并在体外进行荧光竞争性结合实验、荧光猝灭以及RNAi研究其可能具有的生理功能。结果显示与雌虫相比,NIugCSP10显著高表达于雄虫,可能参与交配的生理过程。荧光竞争性结合实验表明NIugCSP10与顺-3-己烯酯、二十烷和(+)-β-派烯具有很强的结合特性。为了证实NIugCSP10与配基的结合机制,通过同源建模和分子对接,我们发现其与配基相互作用的主要作用力为疏水性作用和范德华力。在这三种pH7.4条件下具有很强结合能力的配基中,二十烷对褐飞虱具有很强的吸引作用,顺-3-己烯乙酸酯和(+)-β-派烯表现出很强的驱避作用。本研究通过RNA干扰技术也证NIugCSP10参与褐飞虱识别顺-3-己烯乙酸酯的过程。总之,我们的发现NIugCSP10能特异性结合寄主植物的挥发物质,而且这些特异性结合的挥发物能作为引诱剂和驱避剂进行褐飞虱的生物防治。
[硕士论文] 史佳阳
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:晚疫病菌通过释放效应子进入植物体内来调节植物的免疫应答反应,从而帮助病原菌更易侵染寄主植物。基因组测序发现晚疫病菌中至少含有500多个具有RxLR-dEER保守结构域的效应子。本实验在前期晚疫病效应子研究基础上,选取了其中11个效应子,运用农杆菌介导的瞬时表达系统在本氏烟上对这些效应子的基础功能进行鉴定。首先对效应子的表达模式进行了检测,并对效应蛋白在植物体内的表达情况进行了验证,对效应蛋白的亚细胞定位进行了观察,然后进行接种鉴定确认效应子是否对病原菌侵染及扩展有影响,最后通过效应子与PTI及ETI途径激发物的共注射了解这些效应子是否会抑制激发物诱导的HR反应。得到的主要结果如下:
  1.在本氏烟上接种晚疫病菌优势菌株“88069”后,在病菌侵染后0,24,48和72h对效应子的表达水平进行检测,结果显示11个效应子均在侵染早期显著上调表达。
  2.通过Western-blot确认效应蛋白瞬时表达载体的有效性。在本氏烟叶片注射1d后取样,提取蛋白后进行Western-blot,结果显示11个蛋白都可以正常表达,条带大小与预测一致。
  3.为了确定效应子的亚细胞定位,在信号肽切除位点的上游融合了GFP标签。通过在本氏烟上的瞬时表达,结果显示四个效应子Pi08278,Pi15972,Pi19617和Pi07555定位在细胞质中;Pi16195,Pi17063和Pi00582定位在细胞膜上;Pi07550和Pi21388定位在细胞核和核仁中;Pi09732定位在细胞膜和类细胞骨架上。
  4.为了确认这些效应子是否会促进晚疫病菌的侵染及扩展,在本氏烟上进行了接种鉴定,结果显示Pi15972,Pi19617,Pi16195和Pi09732显著地促进了晚疫病菌的侵染及扩展;Pi08278,Pi17063,Pi00582,Pi07550,Pi21388和Pi01934对晚疫病菌的侵染及扩展无影响;而Pi07555抑制病菌的扩展。
  5.将效应子与PTI途径激发物INF1和XEG1,ETI途径的激发物Avr3a/R3a和Avr4/Cf4共注射后,对其诱导产生的HR进行了统计,11个效应子中没有发现可以抑制INF1,XEG1,Avr3a/R3a和Avr4/Cf4诱发HR的效应子。
[硕士论文] 张冉
农药学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起,核盘菌是世界上最具毁灭性和分布最广泛的植物病原真菌之一,对其防治仍然以化学防治为主。在我国,2007年咪鲜胺首次正式登记用于防治油菜菌核病,但目前尚未有核盘菌对咪鲜胺敏感性基线的报道。本论文研究了核盘菌对咪鲜胺的敏感性、咪鲜胺的盆栽防效以及咪鲜胺和菌核净混配对核盘菌的低剂量刺激作用,这些研究对科学、合理地使用咪鲜胺防治油菜菌核病具有重要意义。
  通过测定咪鲜胺对2008年(N=73)和2014年(N=76)采集于安徽省油菜田菌株的抑制中浓度(EC50),建立了核盘菌对咪鲜胺的相对敏感性基线。2008年和2014年菌株的EC50平均值分别为0.0463μg/mL±0.0190(SD)和0.0434μg/mL±0.0193(SD),EC50值分布均为单峰型,两年之间没有显著差异(P=0.348)。20μg/mL咪鲜胺对盆栽油菜上菌核病的保护作用为98.7%,90μg/mL咪鲜胺对其治疗作用为78.97%。在含0.01和0.04μg/mL咪鲜胺的PDA上生长的菌丝,其细胞膜通透性显著(P<0.05)降低,透射电镜观察发现菌丝细胞壁不规则增厚。在含0.01μg/mL咪鲜胺和不同浓度刚果红的PDA上,菌丝生长的实际抑制率小于理论抑制率,说明菌丝对刚果红的敏感性降低,表明咪鲜胺处理降低细胞壁中几丁质含量。菌丝在含0.03μg/mL咪鲜胺的PDA上生长后,其细胞中甘露聚糖含量显著(P=0.041)提高。
  咪鲜胺、菌核净、及其混配对菌核净抗性菌株的生长和致病力具有低剂量刺激作用。PDA中0.0002~0.004μg/mL咪鲜胺对菌株HLJ4生长的刺激率为5.44%~11.09%,1~100μg/mL菌核净对菌丝生长的刺激率为6.4%~19.25%,同时含有咪鲜胺和菌核净(比例1∶5000),浓度(咪鲜胺/μg/mL+菌核净/μg/mL)为0.0002+1~0.004+20对菌丝生长的刺激率为2.91%~9.34%。喷施0.0004~0.04μg/mL咪鲜胺对菌株HLJ4在油菜离体叶片上致病力的刺激率为18.9%~30.19%,10~200μg/mL菌核净对菌丝致病力的刺激率为23.03%~45.91%,喷施咪鲜胺和菌核净混剂(配比为1∶5000),浓度(咪鲜胺/μg/mL+菌核净/μg/mL)为0.0004+2~0.04+200对菌丝致病力的刺激范围为10.04%~48.33%。在含咪鲜胺、菌核净、及其混剂的PDA上生长48h的菌丝转接至空白PDA和离体油菜叶片上,与对照相比,其生长速率和致病力提高。咪鲜胺显著(P<0.05)降低而菌核净显著提高(P<0.05)了菌丝细胞膜通透性,咪鲜胺和菌核净混剂(配比1∶5000)对细胞膜通透性的影响与对照处理无显著差异(P>0.05)。咪鲜胺、菌核净、及其混剂(配比1∶5000)可以提高核盘菌对H2O2的耐受力。
[硕士论文] 夏婵
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa)是世界上约一半以上人口的主食,在可耕地面积减少的形势下,理想株型对提高水稻单产尤为重要,而水稻叶夹角是理想株型的主要特征之一。很多研究表明,油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)在调控水稻叶夹角过程中起重要作用,而赤霉素(Gibberellin,GA)对水稻叶夹角的调控机理尚不清楚。本试验利用GA合成受阻突变体(d18)、GA信号减弱突变体(d1、slr-D3)、GA信号增强突变体(slr1)、BR合成受阻突变体(d2-1)和BR信号减弱突变体(d61-2)材料,探索了GA对水稻叶夹角的调控机制,主要试验结果如下:
  1.GA促进水稻叶夹角增大。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体的第二叶夹角减少,GA信号增强突变体的第二叶夹角增大;与对照相比,外源GA3处理的水稻叶夹角增大,GA合成抑制剂PP333处理下的水稻叶夹角减小。
  2.GA可以与BR协同调控水稻叶夹角。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体对BR的敏感性降低,BR合成受阻突变体及BR信号减弱突变体对GA的敏感性减弱;与对照相比,GA3+BR处理下水稻叶夹角增加值大于GA3、BR单独处理时水稻叶夹角增加值之和。
  3.GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。外源GA3、BR处理下水稻叶枕细胞形态观察结果表明GA减少了水稻叶枕远轴厚壁组织细胞层数和细胞大小,而不改变叶枕近轴细胞层数;BR不改变叶枕近轴、远轴细胞层数,而是促进叶枕近轴伸长和扩张。转录组数据和qRT-PCR结果证实BR促进叶枕近轴细胞膨胀素基因的表达上调,而GA降低远轴细胞的细胞周期蛋白和细胞壁纤维素合成酶基因的表达。
  综上所述,本研究结果证实GA能够促进水稻叶夹角增大。GA可以与BR协同促进水稻叶夹角的增大;GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。BR主要是促进水稻叶枕近轴细胞膨大,GA主要是减少叶枕远轴细胞数目和细胞大小来促进水稻叶夹角增大。
[博士论文] ZAHOOR AHMAD
MOLECULAR PLANT PATHOLOGY 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着世界人口以及对粮食生产需求的增加,开发出新的能够提高农作物品质抗性及产量的方法变得越来越重要。而传统化学药剂的过量使用对人类健康及环境产生了巨大的危害,所以,开发绿色环保生物防治的方法逐渐成为世界的焦点。其中,使用植物生长促生细菌(PGPB)就是最好的方法之一。PGPB能够引发植物对生物/非生物胁迫耐受性的增强,在植物生长过程中发挥重要作用。
  本研究分离了具有广谱抑菌能力和生理活性的植物生长促生菌-芽胞杆菌。通过研究共分离得到了277株菌株,并与纹枯病菌AG1-IA对峙,进行了抑菌检测。经过筛选,发现70株优良菌株能够抑制纹枯病菌的生长,特别是有5株能够高度抑制其生长。本研究的目的是分离出高效的枯草芽胞杆菌菌株,并研究其生防机制。所以,在分离到的菌株中选择了一株内生枯草芽胞杆菌330-2,对其增强农作物玉米的生长、对非生物胁迫和叶片的耐受性以及抗纹枯病的作用等方面进行了深入的研究。菌株330-2可以产生IAA,嗜铁素,水解酶,有机/无机磷酸盐和锌。此外,该菌株能够强烈抑制纹枯病菌AG1-IA,灰葡萄孢菌,尖孢镰刀菌,链格孢及玉米小班病菌等的生长。该菌株还显着提高了水稻和玉米的幼苗生长(14-37%)。
  据我们所知,基因消除PCR(R-PCR)是用于研究基因组DNA片段差异表达的简单且成本较低的方法之一。在本研究中,利用R-PCR技术从枯草芽胞杆菌330-2中分离和鉴定了147个差异表达的基因。这些差异表达的基因大部分能够参与到生物和非生物胁迫的过程中。结果显示R-PCR效率为92.52%。其中有10%,32%和11%的基因分别参与了抗生素生产(srfAA,bae,fen,mln,dfnI等),代谢(gltA,pabA,ggt等)和营养物质运输(fhu,glpT,gltT等)的过程。总而言之,这些结果清楚地表明了枯草芽胞杆菌菌株330-2在增强植物生长以及对生物/非生物胁迫耐受性等方面的有效性和机制,表明该菌株作为重要的生物防治菌株具有巨大的商业潜力。
  秀丽隐杆线虫是一种营自由生活的土壤线虫。由于其生物学特性简单,产卵数目大,生活史较短,因此常被用作毒理学研究的模型。在秀丽隐杆线虫生存的自然环境中存在各种细菌,包括无毒食源和致病菌食源。线虫取食这些致病菌后会影响线虫的行为和生理特性。芽胞杆菌可以作为秀丽隐杆线虫的食源,并可诱导次生代谢产物及其它一些生物活性物质的产生,然后会影响秀丽隐杆线虫的寿命。秀丽隐杆线虫能够感知细菌食源的特性,并通过趋避行为尽量减少和致病菌的直接接触。研究表明,秀丽隐杆线虫与环境之间的相互作用可能会影响线虫的老化和寿命。本研究构建了枯草芽胞杆菌330-2的基因组文库,宿主菌为大肠杆菌DE3,可用IPTG诱导基因表达。为了研究这些基因表达产物对线虫的摄食行为的影响。最初选择80个含基因的菌株作为线虫的食源。其中,筛选到了8个基因进行下一步研究。结果表明,当秀丽隐杆线虫取食了诱导表达的宿主菌后,生长速率和产卵数量显着降低,并且线虫的寿命显著减少或增加。基因spoⅢE显著降低了后代数量,低至27%。取食含基因yqeK和spoⅢE的菌株后,秀丽隐杆线虫的寿命分别增加了33%和30%,而取食含基因ltaS1和bmr的菌株后秀丽隐杆线虫的寿命分别比对照组(大肠杆菌OP50和DE3)降低了11%和9%。实验结果表明,枯草芽胞杆菌330-2的基因通过不同的机制影响线虫的衰老和寿命。这项研究首次对枯草芽孢杆菌330-2新的潜在基因进行了抗线虫评估。
  在本项研究中也对本实验室以前建立的基因消除PCR技术进行了优化和改进,使得R-PCR的效率从73.6%提高到了92%。优化后的详细方案被放置在附录中。
[博士论文] MUHAMMAD WAQAR ALI
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:橘小实蝇,Bactrocera dorsalis(Hendel),作为一种东南亚普遍存在的毁灭性害虫,能危害超过250种水果蔬菜,造成严重的经济损失。相对于化学农药防治,雄性不育技术(Sterile insect technique,SIT)防治橘小实蝇具有特异性高、环境友好的显著优势。传统的SIT方法通过辐射或化学不育剂实现,但由于其降低雄虫交配能力、生存力、免疫力等生物性能而限制了害虫防控效果。近期出现的基于遗传干扰技术(例如RNAinterference(RNAi))的SIT却展现出巨大的害虫防治应用潜力。RNAi是一种由dsRNA启动的保守基因表达抑制机制,已成功应用于功能基因组、医药、农业,以及害虫防控研究领域。虽然RNAi技术已经在众多农业害虫中成功实现,但在田间实际应用之前仍需要克服诸多使用技术问题。为了开发基于RNAi的SIT技术用于防控橘小实蝇,本研究首先筛选了精子形成关键基因,并验证了其RNAi的雄性不育效果。为了进一步提高dsRNA稳定性和干扰效果,本研究开发了关键基因(Boul)的dsRNA的纳米颗粒包装技术,筛选出最佳的物质配比和pH值条件,并验证其对基于RNAi的雄性不育技术的改进效果。最后,我们应用Sf9细胞系在细胞水平上研究了最佳制备条件(pH=6.5,Chitosan∶dsRNA=1∶4)下纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响。
  1.诱导橘小实蝇雄虫不育的RNAi靶标基因
  第一部分研究中,我们通过RNA干扰橘小实蝇雄虫候选生殖细胞分化和精子缺失相关基因,再检测其与正常雌虫交配产卵等繁殖力,研究筛选了诱导雄虫不育的RNAi靶标基因。结果表明在喂食dsRNA处理后,橘小实蝇雄虫中靶基因(Boul,ZPG,dsxM,FZO and Gas8)的表达水平显著降低,并严重影响雄性的生殖能力,与对照组(dsEgfp)相比,卵孵化率降低60%-75%。不同基因dsRNA进行不同组合(Boul+ZPG,Boul+dsxM and ZPG+dsxM)干扰试验表明,发现其RNAi可以进一步提升雄性不育效果,其中最佳组合Boul+ZPG可造成86%的雄性不育。最佳的Boul+ZPG dsRNA组合不同使用浓度试验结果表明250,500,750和1000ng/ul分别造成了20.1%,39.63%,59.24%和86.28%的雄性不育;不同日龄的雄虫RNAi处理后表明1、5、7、10日龄雄虫的不育比例分别为86.28%,34.14%,22.60%和10.83%。这些结果表明在最佳dsRNA组合下进行RNAi,可显著减少雄虫的精子和活精子的数量。我们的研究有助于在B.dorsalis中发展基于RNAi的新型SIT技术用于防控橘小实蝇。
  2.橘小实蝇dsboul壳聚糖纳米颗粒包装释放技术
  在第二部分研究中,我们进一步开发了dsRNA的纳米颗粒包装释放技术。针对雄性不育效果最好的Boul基因,我们比较了两种纳米颗粒制备方法:1)嵌入法,2)吸收法;同时比较了三种pH值(6.5,7.5和8.5)条件。qRT-PCR结果表明,pH的变化可以显著影响dsBoul的RNAi效率。RNAi处理后持续25d的观察结果表明在pH=6.5条件下嵌入法制备的dsRNA纳米颗粒的RNAi效率最高,尤其是在第5天的Boul基因表达水平仅为对照组的0.22倍。而吸收法制备的dsBoul纳米颗粒处理15,20,25天后的基因表达水平与嵌入法制备的无显著差异。在此之后,我们分别使用嵌入法和吸收法,在pH6.5条件下使用了不同质量比(1∶1,1∶2,1∶3,1∶4)的壳聚糖:dsRNA组合进行纳米颗粒制备用于RNAi喂食处理。嵌入法制备条件下,质量比为1∶4的壳聚糖:dsRNA组合制备纳米颗粒处理25天后基因表达水平显著低于处理组(0.6倍),而吸收法制备条件下,不同壳聚糖:dsRNA组合制备的纳米颗粒处理后皆与对照组无显著性差异。在最适pH6.5条件下,我们进一步比较了物质配比(Chitosan∶dsRNA)为1∶1,1∶2,1∶3,1∶4条件下的效果,发现在两种包装技术条件下,1∶4物质配比的效果皆优于其它配比条件,且嵌入法效果优于吸收法。两种包装技术方法对chitosan纳米颗粒尺寸的影响研究结果表明:嵌入法产生的纳米颗粒尺寸约为80nm,优于吸收法(约为110nm)。因此在pH6.5和1∶4物质配比条件下嵌入法被进一步用于后面一系列生物测定并验证SIT相关基因的功能。与对照组(Chitosan/dsEgfp)和无纳米材料包装的dsBoul相比,处理组导致卵孵化减少77%以上,而产卵量差异不显著。在处理14天后进行雄性橘小实蝇精囊中精子总数的定量,发现进行Chitosan/dsBoul处理的雄性橘小实蝇的精子平均数目显著减少;而精子活力测定则显示处理组的活精子百分比仅为约20%,显著低于对照水平。这些结果表明纳米材料处理显著提高了dsRNA的稳定性和RNAi效率。
  3.纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响
  最后,我们检测了嵌入法制备的dsBoul纳米颗粒材料(Chitosan∶dsRNA=1∶4)对sf9细胞系的影响。通过流式细胞分析技术发现Chitosan/dsBoul处理导致细胞凋亡,且细胞周期停滞在G2期。此外,通过多种细胞死亡率分析和透射电子显微镜(TEM)技术证明Chitosan/dsBoul可诱导Sf9细胞畸形。这些结果表明dsBoul可显著影响sf9细胞系,使细胞停滞于G2期。
[硕士论文] 王天义
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:黄萎病给我国棉花生产带来了严重的威胁。落叶型黄萎病菌能导致棉花迅速落叶,因而造成更为严重的棉花减产和品质下降。抑制发病棉株落叶是一种增强棉花对黄萎病耐性,减少产量损失的有效方式。乙烯可以促进植物衰老、成熟和离层形成并导致脱落。本研究探讨了乙烯信号路径在棉花与黄萎病菌互作中的作用,取得的主要结果如下:
  1.接种落叶型黄萎病菌‘V991’第7天、9天和11天时,棉株的乙烯产生量明显升高,达到119.49μl/kg、126.82μl/kg和148.83μl/kg,显著高于接种非落叶型黄萎病菌‘lcd3-2’棉株的乙烯产生量,分别达到1.60、1.33和1.51倍。接菌时外施0.5μg/ml、2.5μg/ml和12.5μg/ml乙烯利可以加重棉株发病,相对于水处理对照在接种‘V991’第16天时病指增加18%-23%。
  2.分离到参与棉花乙烯合成的基因家族GhACOs。利用基因家族的保守序列构建VIGS载体以抑制棉花GhACOs的表达。研究发现接种‘V991'7天时抑制GhACOs表达的棉株乙烯生成量显著下降。
  分离到棉花乙烯信号路径的正调控基因GhEIN2s并根据基因家族的保守序列构建了VIGS载体。研究发现利用VIGS抑制GhEIN2s的表达可降低‘V991’接种棉株后导致的落叶,增强棉株对黄萎病的抗性。
  3.构建了拟南芥乙烯信号路径负调控基因AtCTR1的超量表达载体并转化棉花。研究发现超量表达AtCTR1可以削弱棉株对乙烯的敏感性。且超量表达AtCTR1的棉花材料增强了对黄萎病的抗性,减少了发病过程中的落叶率。
  4.细胞学检测发现接种‘V991’后可诱导棉株叶柄离层的形成。而超量表达AtCTR1可以减缓棉株叶柄离层的形成;基因表达分析发现接种‘V991’导致的棉株落叶与离层形成相关基因,如GhBXL1等基因的表达有关,但超量表达AtCTR1后抑制这些基因的表达。
  以上结果表明黄萎病菌可诱导棉花乙烯的合成,并激活叶柄离层形成相关基因的表达促进落叶。在抑制棉花乙烯信号路径后可显著降低接种强致病力落叶型黄萎病菌导致的棉花落叶,显著提高棉花对黄萎病的耐性。以上研究结果为通过调控棉花乙烯合成或信号路径防控黄萎病的发生或降低黄萎病的危害提供了理论基础和技术支持。
[硕士论文] 强翠翠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:盾壳霉(Coniothyrium minitans)作为防治菌核病的生物制剂已经被大量研究。本论文主要研究盾壳霉与田间两种灭生型除草剂草甘膦和草铵膦共同施用问题,并针对试验过程中出现的现象,主要研究了除草剂草铵膦的靶标基因在盾壳霉生长过程中的功能。试验结果如下:
  1.盾壳霉对两种除草剂敏感性评价:草甘膦和草铵膦对盾壳霉菌丝均有较强抑制作用,EC50分别为714.3μg/mL和574.5μg/mL;对孢子抑制作用相对较弱,草甘膦EC50为1019.8μg/mL,而草铵膦对盾壳霉孢子的萌发基本没有抑制作用;对核盘菌菌丝均有较强的抑制作用,EC50分别为1695.8μg/mL和223.5μg/mL,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著;两种除草剂存在下会延迟盾壳霉孢子的萌发时间,但是对盾壳霉孢子没有杀灭作用;两种除草剂存在下,会影响盾壳霉对核盘菌菌核的寄生,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著。但结合两种除草剂的性质,草铵膦在田间能快速被降解且不能杀灭孢子,草甘膦也不能杀灭孢子且在较高浓度下仍对盾壳霉寄生核盘菌菌核没有太大影响。所以,在田间正常条件下盾壳霉孢子均可以和两种除草剂进行混合施用。
  2.盾壳霉在含草铵膦的PDA平板上生长异常,推测草铵膦的靶标对盾壳霉的生长起重要作用,为了探究生长异常原因,了解草铵膦的作用机理,为研究抗药性材料提供依据,我们研究了草铵膦对盾壳霉的作用。盾壳霉中存在三个含有谷氨酰胺合成酶保守结构域的基因,其中一个为FluG蛋白,另外两个为谷氨酰胺合成酶类似蛋白,将其分别命名为GlnA1(CmZS1_02675)和GlnA2(CmZS1_07614)。基因GlnA1敲除会使盾壳霉致死,加入一定量谷氨酰胺之后,敲除转化子可以恢复生长和产孢,但是菌落偏白,疑似黑色素产量降低,且加入其它类氨基酸不能恢复其生长和产孢。耐药性试验表明,草铵膦对GlnA1敲除转化子无抑制作用。GlnA2敲除转化子与菌株ZS-1相比,在菌落形态、菌丝尖端、生长、产孢、生物学产量和对草铵膦的抗药性方面均无显著差异。因此可以确定,在盾壳霉中GlnA1为除草剂草铵膦的靶标,而GlnA2不是。
[硕士论文] 牛炳棵
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是我国新近发现的危害柠檬的重要病毒,目前对其致病机制的研究较少。本研究以1年生柠檬实生苗为寄主植物,对嫁接接种CYVCV和模拟接种的柠檬植株叶片分别进行了转录组及小RNA测序,利用生物信息学技术挖掘CYVCV侵染诱导差异表达的基因和miRNA,研究这些基因和miRNA在柠檬应答CYVCV胁迫中的功能。取得的研究结果如下:
  1.将接种后第30d、60d和90d三个时间点收集的CYVCV侵染及对照柠檬植株叶片样品分别进行等量混合后进行转录组测序。测序结果显示,受CYVCV侵染的柠檬样品中有679个基因上调表达,637个基因下调表达,这些基因中分别有1114个和453个注释到GO功能和KEGG通路。GO功能主要集中在生物学过程和分子功能,其中细胞间信息传递、氧化还原过程、对真菌的防御反应、酶激活和酶抑制等功能富集最为显著。KEGG通路主要集中在代谢通路,其中光合作用、叶绿素生物合成与代谢、碳代谢和光合作用中的碳固定途径富集最为显著,共包含68个差异表达基因,推测这些代谢途径的基因表达量变化可能与柠檬受CYVCV侵染后叶片表现的叶片褪绿及黄化等症状相关。
  2.选取与光合作用、叶绿素生物合成与代谢以及碳代谢等通路相关的16个差异表达基因进行qRT-PCR分析,结果显示这些基因存在时间动态变化,其中有6个基因为先下调后上调表达,4个为先上调后下调表达。同时选取5个AGO同源基因和3个DCL同源基因进行qRT-PCR分析,结果显示有7个基因存在差异表达变化。分析这些基因的时间动态变化发现多数基因在第60d的表达量变化明显与30d和90d不同。根据qRT-PCR结果筛选出6个差异显著的基因,分析其在CYVCV侵染的甜橙和小梾檬植株中表达量变化,结果显示同一基因在柠檬、甜橙和小梾檬植株中的表达模式相似。此外采用qRT-PCR方法对接种CYVCV的柠檬植株叶片样品进行检测,发现柠檬接种CYVCV后第30d可检测到该病毒,至第60d病毒含量最高而第90d略有降低。
  3.从接种CYVCV(CY)和对照(MC)柠檬植株叶片样品中获得包含miRNA的Clean read各17170461条和18472346条,接种CYVCV和对照样品中分别有5360339条和6043365条read可比对到甜橙基因组。从2组样品共预测到159个miRNA,包括56个甜橙中已知的保守miRNA和103个从柠檬中新预测的miRNA。其中有13个保守的miRNA和20个新预测的miRNA受CYVCV侵染诱导差异表达。
  4.对20个新预测miRNA进行了miRNA茎环引物法RT-PCR扩增,其中12个扩增产物的序列与预测序列一致。测序结果显示,12个新鉴定的miRNA中,仅有两个下调表达,其余均为上调表达。差异表达的4个保守miRNA和4个新鉴定miRNA的qRT-PCR结果显示,miRNA的表达水平在接种CYVCV后第30d至第90d呈时间动态变化,其中保守miRNA均下调表达,新鉴定miRNA先下调后上调表达。以转录组测序数据作为参考,对25个差异表达miRNA进行靶基因预测,其中2个新鉴定miRNA和6个已知miRNA共预测到靶基因52个。靶基因功能分析表明,靶基因涉及应激反应和代谢等生物过程。此外,在甜橙基因组预测差异表达miRNA靶基因,靶基因功能分析表明,这些miRNA大部分与植物对非生物和生物逆境响应相关,保守miRNA靶基因的KEGG通路显示这些基因在植物逆境反应及光合作用和能量代谢相关通路中具有明显的富集现象。
[博士论文] 哈米德
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:真菌病毒是寄生真菌的病毒,其中一些病毒可以引起植物病原真菌致病力的衰退,具有控制作物病害的潜力。引起菌核病的核盘菌在自然界中广泛存在,可感染450多种或亚种植物。在此研究之前,实验室已经从核盘菌中发现了一些对核盘菌具有显著影响的真菌病毒,它们显著地降低了致病性。从中国湖北省、江西省和安徽省等地方分离获得了2000株核盘菌菌株,获得了173株生长异常菌以期从中筛选新的真菌病毒。分别从173个菌株中提取获得了总RNA并等量混匀,之后对总RNA样品进行了RNA_Seq分析。经过拼接,获得了247个具有显著病毒序列特性的contig,这些contig预示测定的173个菌株中存在多种多样的真菌病毒。对contig所推定编码的蛋白序列在NCBI数据中进行比对,发现247个contig可能代表了48种真菌病毒,其中35种ssRNA(+)病毒,7种ssRNA(-)病毒,5种dsRNA病毒和1种ssDNA病毒,其中线粒体病毒是主要类型。
  对四个Contig(contig3,contig50,contig71和contig1178)所代表的新RNA病毒进行了确认,其中contig3和contig50代表的为负链RNA病毒,contig3所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum bunya-like virus1(SsB1V1),隶属于Bunyaviridae科;contig50所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus9(SsNsRV9),与一些分类地位待定的病毒具有较近的亲缘关系。contig71和contig1178代表的为新的(+)ssRNA病毒,均为Tymovirales目的病毒,分别命名为Sclerotinia sclerotiorum mycotymovirus1(SsMTV1)和Sclerotiniasclerotiorum deltaflexivirus2(SsDFV2)。
  对SsDFV2进行了详细的研究,发现该病毒与Botrytis porri RNA virus1(BpRV1)共同侵染低毒菌株228。228菌株在PDA上生长缓慢,产生菌核少,而且产生时间延迟,几乎不能诱导油菜差生病斑。建立在Contig序列的基础上采用5'-和3'-RACE等对SsDFV2的基因组进行了全长测定。发现SsDFV2的基因组全长为6711nt,含有Poly(A)尾。SsDFV2的基因组只含有一个推定的大开放阅读框架,编码一个假定的病毒RNA复制酶,包括典型的甲基转移酶、RNA解旋酶和RdRp等三个功能域。SsDFV2与核盘菌上的另外一种病毒
  Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus1(SsDFV1)具有较高的同源性,复制酶中氨基酸相同性达到446/1185(38%),相似性达到625/1185(52%)。它们在系统上聚为一支,同属于拟建立的Deltaflexiviridae科。SsDFV1的基因组编码4推定的蛋白,而SsDFV2的基因只编码RNA复制酶,推定SsDFV2在核盘菌中可能丢失了其它的基因。
  营养体不亲和性反应严重限制了真菌病毒在寄主真菌间的扩散,严重制约了真菌病毒防治病害的效果。我们研究发现SsDFV2具有强的侵染能力,将菌株228与其营养体不亲和的菌株Ep-1PNA367和菌株1980进行对峙培养,发现病毒SsDFV2可以扩散到这两个菌株的菌落之中,而与SsDFV2共同感染菌株228的BpRV1却没有这种扩散能力。进一步将感染SsDFV2的Ep-1PNA367与菌株1980对峙培养,发现Ep-1PNA367同样可以扩散到菌株1980之中,进一步表明SsDFV2的扩散不受营养体不亲和性的限制。我们的发现表明真菌中存在高效突破寄主营养体不亲和性限制的RNA病毒,为利用真菌RNA病毒研究提供了新的思路。
[博士论文] 刘方舟
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在不同外界环境条件的影响下,同一种生物可以发育成形态不同、生活习性不同的个体,即发育可塑性。发育可塑性是生物在自然选择的压力下,为适应不断变化的生态环境而形成的一种极其重要的生存策略。很多昆虫(如蜜蜂、蚂蚁、蝗虫、稻飞虱)具有发育可塑性现象。稻飞虱是水稻重要害虫,翅的发育具有可塑性。成虫具有长翅型和短翅型类型:在寄主营养恶化时,主要产生长翅型个体,长翅型成虫飞行能力强,前翅与后翅均长于身体,且前翅长于后翅,、但繁殖能力较弱;在寄主营养丰富时主要产生短翅型。短翅型个体不能飞行,前翅与后翅均短于身体,、且后翅非常退化,类似果蝇平衡棒,但繁殖能力强。多年来,稻飞虱的翅二型现象吸引了众多昆虫学者的兴趣,取得了大量研究进展。褐飞虱翅型转换的开关基因已经鉴定出来:胰岛素受体Insulin Receptor1/2(InR1/2)。然而,InR1/2是非常上游的调控因子,翅发育基因是翅发育调控的具体执行者,翅发育基因是否能够响应InR1/2的信号,启动长翅型或短翅型翅发育的进程,进而调控翅型分化,目前还没有相关相关报道。
  本论文克隆了Ultrabithorax(Ubx)、Decapentaplegi(Dpp)、Vestigial(Vg)、apterous-A(apA)4个翅发育基因,利用本室构建的长翅型与短翅型种群,通过同源比对、分子克隆、RNAi、荧光定量、原位杂交、Gal4-UAS转基因果蝇品系等技术研究了以上4个基因对长翅型和短翅型稻飞虱翅发育的调控作用,并初步研究了翅发育基因对InR1/2的应答,取得以下研究结果:
  褐飞虱Ubx(NlUbx)对翅发育及翅型分化的调控作用
  通过定量PCR、原位杂交实验,发现稻飞虱Ubx的表达模式与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx在前翅与后翅中均有表达,且短翅型种群表达量高于长翅型品系。无论是长翅还是短翅品系,若虫后翅翅芽表达量高于前翅翅芽。而昆虫已知的Ubx只在后翅表达,前翅不表达。
  稻飞虱Ubx蛋白在结构上也与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx的MXSXFE结构域序列为MMNSYFE,QA结构域序列为QAQAAK,Ploy-Ala结构域序列为AAALAASQAQ。而昆虫已知的Ubx,这三个结构域的序列分别为:MNSYFE,QAQAQK和AAAAAAAAAA。
  稻飞虱Ubx不但在前翅表达,而且对前翅的发育也承担着重要功能,并调控前翅与后翅的大小。通过RNAi干扰,降低稻飞虱Ubx表达量之后,产生以下表型:长翅和短翅成虫的前翅和后翅畸形且短翅型成虫前翅和后翅刚毛增多,长翅和短翅成虫后翅前翅化且短翅型成虫后翅变大程度尤为明显。稻飞虱Ubx在长翅种群与短翅种群中,对其靶标基因的调控模式不同。根据前人的研究,NlDp,NlVg,NlapA,NlASH等基因是Ubx的靶标基因。通过定量PCR,检测了褐飞虱长翅、短翅种群中Ubx被干扰之后,这些靶标基因的表达量。结果表明:NlUbx在长翅和短翅品系的前翅和后翅中对靶标基因的调控作用均有不同。
  考虑到NlUbx在短翅型、长翅型种群若虫翅芽表达量不同,且Ubx对翅的大小有调控作用,推测Ubx可能通过剂量效应调控褐飞虱翅的大小。为了验证这一推测,本文利用Gal4-UAS转基因果蝇品系使褐飞虱Ubx(NlUbx)、果蝇(Drosophila melanogaster)Ubx(DmUbxIa)、丰年虾(Acanthokara kaputensis)的Ubx(AkUbx)在果蝇前翅(Ubx空背景组织)异位表达,并通过三种不同强度的启动子(Nub-Gal4(强),Sd-Gal4(中);C765-Gal4(弱))使转基因果蝇前翅表达不同剂量的Ubx。结果表明:DmUbxIa在前翅表达高、中、低3个剂量下,果蝇的前翅仍然是平衡棒,而NlUbx与AkUbx在中等剂量下,果蝇前翅变成一个较小的翅,在低剂量下,果蝇前翅转换成一个相对完整的翅。因此,DmUbxIa剂量效应不明显,而NlUbx与AkUbx剂量效应明显,通过剂量的变化,可以使翅的大小灵活变化。同时也说明NlUbx与AkUbx对翅形成基因的压制作用弱于DmUbxIa。
  通过点突变技术使果蝇前翅表达突变后的DmUbxIa、NlUbx、AkUbx,证明NlUbx负责抑制翅形成相关基因的结构域的压制能力显著弱于DmUbxIa,压制能力与AkUbx相似。因此,稻飞虱Ubx蛋白保留或者半保留了原始物种Ubx结构,这是其存在灵敏的剂量效应的分子基础。在此基础上,我们也发现营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱InR2表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻诱导稻飞虱InR1表达上升。Ubx对寄主营养也存在响应,即营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱Ubx表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻导稻飞虱Ubx表达量下降。
  褐飞虱apA(NlapA)对翅发育的调控作用
  apA在褐飞虱二龄和四龄短翅种群若虫中的表达量显著高于长翅种群。NlapA被干扰之后,造成成虫前翅刚毛消失,翅卷曲,翅长变短。进一步研究发现,apA RNAi导致稻飞虱翅刚毛变少的原因是由于apA的表达量降低致使控制刚毛发育的关键基因Achaete-scute homolog(NlASH)表达量降低。NlapA是NlASH的上游调控因子。
  褐飞虱Dpp(NlDpp)和g(NlVg)对翅发育的调控作用
  Dpp和Vg在长翅和短翅稳定遗传系若虫中的表达量存在显著差异,在长翅若虫中的表达量显著高于短翅。干扰长翅和短翅稳定遗传系三龄若虫Dpp和Vg表达,发现Dpp被干扰后成虫翅的翅脉完全消失;Vg被干扰后,长翅型成虫的前翅和后翅臀田域顶角区出现水泡;但是短翅成虫的前翅臀田域顶角区并无水泡(后翅为翅芽状,无臀田域顶角区)。
  本论文以Ubx、Dpp、Vg、apA4个翅发育基因为对象,比较这些基因在长、短翅型种群中的表达差异,揭示翅发育基因对翅发育、翅型分化的调控作用。研究结果将丰富不完全变态昆虫翅型分化分子机制理论,对揭示褐飞虱灾变的内在原因、实现褐飞虱虫源迁出时间的精细化预测、在褐飞虱迁出地进行源头治理具有重要的意义。
[博士论文] 顾琼楠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:由希金斯刺盘孢引起的炭疽病是十字花科蔬菜生产上的毁灭性病害之一。近年来,希金斯刺盘孢全基因组序列的公布和遗传转化体系的完善加速了希金斯刺盘孢致病相关基因的发掘和鉴定,同时也为从基因组水平上深入研究希金斯刺盘孢致病分子机制提供了新的平台。本研究对希金斯刺盘孢致病缺陷突变体Ch-1-G281的ChRgf基因和突变体Ch-1-E240的ChAcs基因的功能进行了研究,并观察了希金斯刺盘孢侵染荧光标记拟南芥植株寄主活体营养阶段的亚细胞反应,主要结果如下:
  (1)利用农杆菌介导的转化方法构建了希金斯刺盘孢Ch-1菌株的T-DNA插入突变体库,获得了2000个转化子。通过将突变体分生孢子接种拟南芥植株,观察接种第4天的发病症状及突变体侵染结构的形成情况,筛选得到了7株致病缺陷型突变体,分别为致病丧失突变体Ch-1-G281及致病减弱突变体Ch-1-G090、Ch-1-G256、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240。通过Southern杂交验证了7株致病缺陷型突变体的T-DNA插入拷贝数,其中Ch-1-G256、Ch-1-G281、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240为单拷贝插入,而Ch-1-G090为双拷贝插入。通过Inverse-PCR对致病缺陷型的侧翼序列进行扩增,分别获得了7个T-DNA插入突变体的侧翼序列。侧翼序列分析结果显示:突变体Ch-1-G281T-DNA插入破坏了RasGEF(Ch063_04179)基因,该基因全长3057bp,编码1018个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G090T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_10682)基因,该基因全长543bp,编码180个氨基酸,有1个外显子;另一个插入位点破坏了RNA加工蛋白FCF1(Ch063_10671),基因全长324bp,编码108个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G256T-DNA插入破坏了乳糖透过酶(Ch063_16024)基因,该基因全长477bp,编码159个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G310T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_15059)基因,该基因全长243bp,编码80个氨基酸,有1个外显子。突变体Ch-1-G323T-DNA插入破坏了丝氨酸苏氨酸激酶cot-1(Ch063_12968)基因,该基因全长1983bp,编码660个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G668T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_01887)基因,该基因全长645bp,编码214个氨基酸,有1个外显子。以及突变体Ch-1-E240T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶(Ch063_08070)基因,该基因全长1275bp,编码424个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。
  (2)T-DNA插入突变体Ch-1-G281在PDA上的菌落形态变化较大,其菌丝生长速度变慢,菌丝呈多分支状。突变体分生孢子产量降低,孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,分生孢子不能在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,推测该基因影响了分生孢子的萌发以及附着胞的形成。证实T-DNA插入破坏了Ras鸟氨酸交换因子(ChRgf),ChRgf基因全长为3276bp,编码1018个氨基酸。敲除ChRgf基因影响了希金斯刺盘孢的营养生长和菌丝形态,敲除转化子⊿ChRgf-42生长缓慢,菌丝呈现多分枝;产孢量显著下降,仅为野生型的8%;在塑料玻片上诱导孢子萌发,孢子萌发率明显降低,为野生型的50%,萌发的孢子不能正常形成附着胞,而附着胞产率约为野生型及互补突变体的5-10%,而附着胞膨压与野生型菌株并无明显差异。敲除转化子⊿ChRgf-42孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,敲除转化子⊿ChRgf-42分生孢子不能在叶片表面萌发并产生黑化的附着胞。敲除转化子⊿ChRgf-42孢内cAMP含量显著降低,仅为野生型胞内cAMP含量的60%,外源加入cAMP以及IBMX可使敲除转化子⊿ChRgf-42对外界疏水信号产生响应。敲除转化子⊿ChRgf-42对外界胁迫如NaC1,KCl的耐受性增强。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的产孢、萌发、附着胞形成及致病性均恢复至野生菌株水平。表明希金斯刺盘孢ChRg基因作为cAMP,Ras等通路的上游调控因子在调控营养生长、产孢以及致病相关的侵染结构的发育等方面具有重要的生物学功能。
  (3)T-DNA插入突变体Ch-1-E240在菌丝生长、产孢、孢子萌发及附着胞形成等方面与出发菌株Ch-1相比没有显著差异。孢子液喷雾接种拟南芥植株后拟南芥植株发病严重度低于野生型,显微观察表明分生孢子在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,能正常侵染产生初生菌丝,但次生菌丝产量明显降低,推测该基因影响了次生菌丝的产生。T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶基因(ChAcs1),ChAcs1基因全长为1441bp,编码432个氨基酸。生物信息学分析发现,希金斯刺盘孢中有两个乙酰辅酶A合成酶编码基因,分别命名为ChAcs1(Ch063_08070)和ChAcs2(Ch063_00691),采用基因敲除和互补策略,分别对这两个基因进行了功能分析:ChA cs1基因敲除对希金斯刺盘孢的营养生长、产孢和附着胞的形成与野生型无明显差异;ChAcs2基因敲除无明显的表型改变。通过GFP融合表达及蛋白定位分析,发现ChAcs1蛋白、ChAcs2蛋白的表达分布于整个细胞质。⊿Chacs1不能利用乙醛、乙醇、乙酸等非发酵碳源,胞内脂质含量下降。⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥叶片4天后,植株发病严重度低于野生型,只有47%的初生菌丝能正常发育并形成次生菌丝;而⊿Chacs2敲除转化子对致病性无明显影响。对⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥活体营养阶段(侵染40小时后)进行全基因组RNA-seq分析,表明ChAcs1参与调控了一系列与致病、乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环以及乙醛酸循环相关的基因,致病相关基因如MAPK,STE7等基因下调表达,乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环中重要节点基因如乙醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶等基因下调表达。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的致病性恢复至野生菌株水平。以上结果表明ChAcs1可能参与调控了丙酮酸-乙醛-乙酸代谢途径,在调控脂类代谢、致病相关侵染结构如次生菌丝的形成等方面具有重要的生物学功能。
  (4)用希金斯刺盘孢侵染不同荧光蛋白标记的转基因拟南芥植株,以研究拟南芥与希金斯刺盘孢互作过程中的活体营养界面的膜区室的重分布。在活体营养寄生阶段,寄主细胞的质膜蛋白表现出不同的定位模式,肉豆蔻酰化和棕榈酰化蛋白MAP,异戊二烯蛋白PAP,低温诱导蛋白LTI6b均定位于活养寄生界面,突触融合蛋白PEN1与ABC转运蛋白PEN3定位于初级初生菌丝的活养寄生界面,质膜H+-ATP酶PMA与质膜固有蛋白PIP2定位于初生菌丝的基部。与此同时,寄主细胞细胞膜脂也在初生菌丝侵染阶段呈现出不同的定位模式:磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P定位于初生菌丝的基部,磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸PI(4,5)P2定位于活体营养界面,磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养寄生界面。同时磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养界面说明液泡也参与了活养界面的合成以及互作。后期由不同的液泡膜标记蛋白包括液泡膜水通道蛋白以及囊泡相关蛋白VAMP711均包裹初生菌丝界面,证明了液泡参与初生菌丝界面的互作过程。随着初生菌丝的发展,液泡逐渐变小,直至液泡膜破裂,与此同时,粗大的初生菌丝向细长的次生菌丝进行转化,说明寄主细胞死亡与液泡的破裂以及初生菌丝向次生菌丝转变是同一时间点发生的。此外,内吞囊泡ARA7/RABF2b单一定位于初生菌丝的活体营养界面说明寄主细胞的内吞性质发生了改变。上述研究结果表明,希金斯刺盘孢与拟南芥互作过程中存在特殊的活养寄生界面,这一活养寄生界面可能是通过细胞膜的分化或者通过囊泡运输而来,同时,液泡也参与了活养寄生界面的形成。
[硕士论文] 高翠珠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:设施大棚草莓、番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染引起的一种世界性病害。本文主要研究湖北省设施大棚草莓和番茄灰霉病的发生动态及影响因素分析。2016年在湖北省农业科学院草莓大棚种植基地及武穴市吴谷英村番茄大棚种植基地分别选取3个具有代表性的设施大棚。结合保湿培养法和特异性PCR法检测健康组织上灰霉菌带菌率,系统调查各生育期不同时间、不同组织的病害发生动态。选取与果实发病率具有显著相关性的因子建立线性回归方程,分析草莓和番茄灰霉病的发生与不同流行因子之间的关系,主要结果如下:
  (1)分析设施大棚中草莓灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在12月下旬即可检测出草莓不同组织带菌,果实带菌率高峰期在3月下旬、4月中上旬和5月初,1月初、2月下旬和4月中上旬为花朵带菌率的高峰期,叶片带菌无明显高峰期。调查田间发生动态发现,在12月下旬即可在草莓不同组织上观察到灰霉病的发生,果实发病高峰期为3月上旬、4月下旬和5月上旬,3月上旬和5月中上旬为花朵发生灰霉病的高峰期,叶片无明显发病高峰期。基于对设施大棚草莓不同组织带菌率及发生动态的调查,选取其中两个设施大棚数据分析草莓果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度和相对湿度的相关性,结果表明:草莓果实发病率与花朵发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度显著相关。果实带菌率、花朵发病率和温度所建方程预测值与实际值拟合程度好。
  不同成熟度草莓果实影响灰霉病的发生,结果发现果实红熟期发病程度较绿熟期、白熟期和粉熟期重。
  (2)分析设施大棚中番茄灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在3月中上旬即可检测到番茄叶片上的灰霉菌,4月上旬即可检测到花朵带菌;3月下旬、4月下旬和5月中下旬均为叶片带菌率的高峰期,4月下旬和5月中下旬为花朵带菌高峰期。对番茄不同组织灰霉病的田间发生动态进行调查,发现叶部灰霉病在3月中上旬开始发病,4月中上旬花朵发病,茎秆发病时间在4月中下旬,果实发病时间在4月底;叶片发病高峰期在4月上旬、4月下旬和6月中上旬,花朵发病高峰期在6月中上旬,茎秆发病高峰期在5月下旬和6月中上旬,果实发病高峰期在5月中下旬和6月中旬。基于对设施大棚番茄不同组织带菌率及发生动态的调查数据分析番茄果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、茎秆发病率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度、相对湿度相关性结果表明:花朵发病率、叶片发病率、花朵带菌率、叶片带菌率和相对湿度与果实发病率呈显著相关性。花朵发病率、花朵带菌率、叶片带菌率所建回归方程预测值和实际值拟合程度好。
  不同成熟度番茄果实与灰霉病的发生,结果发现果实白熟期和转色期发病程度较绿熟期和红熟期重。
  不同温湿度及保湿时间对灰霉病发生的影响显著;果实有伤情况下接种,10-25℃不同保湿时间灰霉病均会发生,保湿12h后,病斑扩展明显,30℃时需保湿12h后才会发病。无伤情况下接种,在最适温度20℃时,至少需要保湿36h才会发病,10℃和30℃下,均需要保湿4d以上才能发病。番茄灰霉病在20℃下随着相对湿度(RH)的增加病斑直径也随之增大。在果实有伤条件下RH需达到66%可发病,无伤条件下RH需达到92%可发病。不管接种果实有无伤口,在RH为100%时病斑直径最大,在RH为20%时,均无病斑产生。
  番茄叶片和茎秆病残体中的灰霉菌在不同土壤湿度中存活期为:干燥土壤>半湿润土壤>湿润土壤。在不同土壤深度中存活期为:土壤表面>土下10cm>土下20cm。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
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