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[硕士论文] 张雪梅
水产养殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:WT1(Wilms'tumor suppressor gene1)是一种编码锌指蛋白的转录因子,对哺乳动物泌尿生殖系统的发育有重要作用,哺乳类WT1基因突变会导致肾、性腺和脾等器官缺陷。在斑马鱼(Danio rerio)中存在两个WT1同源基因,分别命名为wt1a和wt1b。本实验采用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中分别敲除wt1a和wt1b来研究其对斑马鱼胚胎发育的作用。纯合的wt1a-/-突变体后代表现出生长发育畸形,出现心包积液、卵黄囊水肿同时肾小球的发育也会受损;纯合的wt1b-/-突变体表型正常、能正常存活,没有观察到类似于敲降wt1b时所出现的表型。
  足细胞是机体形成肾小球滤过屏障的重要部分,其缺失能引发多种肾脏相关的疾病。为进一步验证wt1a-/-突变体发育畸形是否与肾脏足细胞发育相关,我们选取了足细胞标记基因podocin和nephrin,通过二者的表达量变化可知wt1a的缺失会阻断足细胞的分化并抑制podocin和nephrin的表达。然而podocin和nephrin在wt1b-/-突变体中能正常表达。因此,wt1a在斑马鱼肾脏发育过程中发挥着重要作用而wt1b可能不是肾脏发育所必须的基因。细胞自噬(autophagy)是真核细胞中一种普遍而又重要的生命现象,在维持细胞稳态和细胞生命活动等方面起重要作用,自噬异常与细胞生长发育及多种疾病密切相关。检测发现在wt1a-/-突变体中自噬水平明显降低,为进一步研究自噬、wt1a在足细胞发育中的功能,我们选取自噬激活药物雷帕霉素处理斑马鱼胚胎一段时间后检测足细胞标记基因的表达水平,发现足细胞的损伤得到了部分改善。综上所述,我们的实验确认了wt1a是斑马鱼肾脏发育所必须的基因,并且为建立鱼类足细胞损伤的研究模型提供了一条思路。
[博士论文] 余泽辉
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种重要的水生动物病原菌,与霍乱弧菌(Vibrio cholera)亲缘关系最近,曾被误认为是同种病原,可致人类急性霍乱样腹泻或痢疾样腹泻,给公共卫生安全也带来严重威胁。拟态弧菌作为严重危害淡水鲇形目鱼类的新发现病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征,给我国淡水鲇养殖造成严重的经济损失。免疫预防或成为防控该病最为有效手段,基因缺失减毒疫苗被认为是鱼类疫苗开发的重要发展方向,而构建基因缺失减毒疫苗的前提是对拟缺失靶基因功能的明确。目前,对鲇源拟态弧菌的基因组学及其致病相关的功能基因尚不完全清楚。为此,本研究以鲇源拟态弧菌强毒株(SCCF01菌株)为研究对象,进行全基因组测序和比较基因组分析,并在了解基因组遗传信息的基础上,采用Natural transformation技术构建三种毒力基因的缺失株,通过比较缺失株和野生株生物学特性,以深入揭示缺失靶基因功能,以期为基因缺失减毒疫苗的研发奠定理论基础。论文中具体研究结果如下:
  1.拟态弧菌SCCF01菌株全基因组测序注释及组分分析
  提取SCCF01菌株的基因组DNA,在DNA样品的完整性、纯度和浓度质控检测合格的基础上,构建DNA测序文库,采用PacBio RSⅡ测序平台进行测序。下机数据进行Denovo组装,获得了两个完整的环状染色体基因组序列。两个染色体序列的长度分别3,213,040bp和1,270,975bp,GC含量46.61%和45.88%,获得NCBI登录号分别为:CP016383(1号染色体)和CP016384(2号染色体)。随后,利用COG、GO、KEGG、ARDB和VFDB等数据库对两个基因组序列进行功能基因、耐药基因和毒力基因注释,并绘制基因组圈图。通过功能基因注释获得SCCF01菌株各个基因的功能、分类和代谢途径等相关信息,基因组圈图展示SCCF01菌株的基因组特征,耐药基因数据库注释共发现20个耐药相关的基因,毒力数据库注释获得SCCF01菌株基因组中粘附素、鞭毛系统、外毒素和分泌系统等毒力基因信息。最后,使用Prodigal、barrnap、tRNAscan-SE、RepeatMasker、IslandViewer和PHAST等软件进行基因组组成分析,预测显示SCCF01菌株的基因组中共含有31个rRNA和106个tRNA,并获得基因组中的重复序列、基因岛和前噬菌体的相关预测信息。
  2.拟态弧菌SCCF01菌株比较基因组学分析
  为解析SCCF01菌株的进化来源和变异情况,对SCCF01菌株与其他拟态弧菌进行共线性比较分析、基因家族分析、SNP注释和系统进化分析。共线性分析获得SCCF01菌株基因组与拟态弧菌典型株(ATCC33654和ATCC33655)全基因组的线性关系,但无法判断亲缘关系;基因家族分析预测拟态弧菌SCCF01菌株可能的进化方向为:临床菌株→环境菌株→SCCF01菌株;SNP注释和系统进化分析结果显示SCCF01菌株与环境菌株具有更近的亲缘关系;因此结合基因家族分析、SNP注释和系统进化分析的结果推测SCCF01菌株可能来源于环境菌株。另外,对拟态弧菌进行种属差异整体比较,获得SCCF01菌株在种属间的整体差异列表;Core-Pan基因分析获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌的共有和特有基因关系;SV检测和Indel检测获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌基因组DNA结构变异情况。最后,基于基因组对常见弧菌构建系统发育树,结果显示SCCF01菌株与拟态弧菌的标准株聚为一簇,进一步在基因组水平证实SCCF01菌株属拟态弧菌。
  3.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的构建与鉴定
  基于全基因组序列采用Natural transformation技术分别对溶血素基因、Ⅱ型分泌系统(Type2Secretory System,T2SS)基因簇和两个TonB系统进行重组缺失,分别获得三种毒力基因(簇)缺失的重组株;随后利用PCP20质粒对重组株中的抗性基因筛选标记进行剔除,获得对应的缺失株。进一步使用PCR技术、第一代测序技术、RT-PCR技术对构建的重组株和缺失株进行基因水平和转录水平的鉴定。PCR鉴定结果显示所有重组株和缺失株中的靶基因均被敲除,所有重组株中的抗性基因均被PCP20质粒剔除获得对应的缺失株,FRT位点检测结果显示引物扩增出缺失株的目的条带大小正确,所有缺失株均不含有PCP20质粒的残留;第一代测序技术结果表明缺失株的上下游同源臂均能与野生株匹配且缺失靶基因已被敲除;对缺失靶基因RT-PCR结果表明缺失株在RNA转录水平不含有缺失靶基因,且缺失靶基因的上下游开放阅读框基因的均能正常转录。最后,通过对缺失株进行传代培养(共50代)证实缺失株能在传代过程中稳定遗传。上述结果从基因和转录水平证实SCCF01菌株T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的基因缺失株被构建成功。
  4.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的表型特征研究
  将构建成功的T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的缺失株与野生株进行表型特征比较。结果显示,三种毒力基因(簇)缺失后菌体形态和生理生化特性未发生明显变化,但其在Luria-Bertani琼脂和TCBS琼脂上的菌落形成大小和被膜生成率均极显著低于野生株(P<0.01)。T2SS基因簇缺失后其在液体培养基的生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力均极显著低于野生株(P<0.01);但溶血素基因和两个TonB系统缺失后生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力与野生株差异却不显著(P>0.05)。T2SS基因簇和TonB系统缺失菌株在软琼脂的运动能力极显著低于野生株(P<0.01)。
  将不同浓度的缺失株和野生株浸泡感染黄颡鱼,考察各基因(簇)在致病中的作用。结果显示,溶血素基因缺失后半数致死量(Lethal Dose50%,LD50)与野生株无明显差异,但T2SS基因簇和TonB系统缺失后LD50明显升高,减毒倍数分别为307.26(缺失T2SS基因簇)、26.61(缺失TonB1系统)、81.75(缺失TonB2系统)和141.25(缺失TonB1系统和TonB2系统)。最后将T2SS和两个TonB系统进行联合基因缺失后进行致病性试验,结果显示联合基因缺失株LD50值为4.46E+07,减毒倍数高达668.34倍。
  5.T2SS对分泌蛋白、自然感受现象及TonB系统对铁利用的影响研究
  为进一步揭示拟态弧菌T2SS基因簇与TonB系统的功能,分别开展T2SS基因簇缺失后对蛋白分泌和介导自然转化现象影响及TonB系统对铁利用影响的研究。研究结果表明,T2SS基因簇缺失后,分泌的胞外蛋白位于15-25kDa(4条)、35-50kDa(1条)和50-70kDa(1条)间,蛋白含量均相较于野生株降低,此外分泌的胞外产物蛋白酶活性、卵磷脂酶活性和几丁质酶活性均显著低于野生株(P<0.05);对缺失株的自然转化效率分析结果表明,T2SS基因簇缺失后不能形成自然感受态摄取外源DNA进行基因水平转移。TonB系统对铁利用的影响研究结果表明,对TonB系统缺失后对Fe2+、Fe3+和乳铁蛋白的摄取与野生株差异不明显,但对TonB1系统缺失后将显著降低对血红蛋白和血红素的摄取能力;2,2'-Dipyridyl敏感试验结果表明对TonB1系统或TonB2系统任何一个系统缺失后均能增加对菌株2,2'-Dipyridyl的敏感性。本章结合第五章表型特征研究进一步揭示了Ⅱ型分泌性系统和TonB系统基因缺失后的减毒机制。
  综上,本论文通过第三代测序技术对拟态弧菌SCCF01菌株进行全基因组测序和分析;随后基于全基因组序列选择缺失靶基因和设计打靶载体引物,利用Natural transformation技术构建SCCF01菌株的Ⅱ型分泌系统基因簇、溶血素基因和两个TonB系统基因的缺失株,并对其鉴定;最后通过比较野生株和缺失株的生物学特性验证是否减毒和揭示其减毒机制。SCCF01菌株全基因序列、缺失株的成功构建以及生物特性的研究将为基因缺失弱毒疫苗的研制提供物质基础与理论依据。
[硕士论文] 徐永胜
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:泥鳅是东亚国家,最重要的经济养殖鱼类之一。随着泥鳅养殖业的快速发展,由病原导致的感染性疾病越来越严重,尤其是细菌性疾病,这给我国的泥鳅养殖户造成了巨大的经济损失。然而,现在对泥鳅抗细菌感染的免疫机制的研究却并不是很多。补体系统是机体很重要的免疫防御系统,而补体C3是补体系统3条激活途径的一个中心分子,这3条激活途径最终都会回归到C3转化酶的形成,和共享最后的终末溶解途径。本论文利用分子克隆的方法对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)补体C3基因进行了克隆与鉴定,构建了补体C3基因的系统进化树,分析了补体C3基因的mRNA在不同组织中的表达水平。并且在此基础上,构建了嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅的模型。用苏木精/伊红染色(HE染色)呈现了皮肤和鳃在感染以后的形态变化规律,用qPCR分析了泥鳅补体C3基因和其它9种补体相关基因在感染以后mRNA的表达规律,并以此构建了基因表达的热图。
  1.利用实验室已经获得的泥鳅转录组数据库比对分析,经过PCR验证发现了在泥鳅中存在3种C3亚型,分别命名为C3-1、C3-2和C3-3。克隆出了泥鳅C3-1的全长cDNA序列。C3-1cDNA序列由4509bp核苷酸组成,预测编码1454个氨基酸。C3-1的氨基酸序列中存在对C3功能非常重要的保守结构域。并且还在C3-1的氨基酸序列中发现典型的硫酯键序列(GCGEQ)存在一个氨基酸的突变。补体C3的系统进化树显示泥鳅补体C3-1与鲤科鱼类的补体C3亲缘关系较近。检测了3种C3亚型mRNA在肾脏、眼睛、脾脏、性腺、心脏、鳍条、肠道、肌肉、大脑、鳃、皮肤、血液和肝脏中的表达情况。发现C3-1和C3-3的表达模式类似,主要在肝脏中表达,然后是脾脏和性腺。然而,C3-2mRNA的表达却与C3-1和C3-3有所不同。C3-2主要在肾脏中表达,然后是血液和性腺。
  2.用1×107CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,它的皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。与对照组相比,泥鳅的次级鳃丝会变得又短又宽,而皮肤的表皮层也会有一个明显的变宽。
  3.用1×107CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,C3-1和C3-3基因的mRNA的表达规律在鳃和皮肤中类似,分别在鳃的36h和皮肤的24h有一个显著的上调表达。而C3-2在鳃和皮肤中达到上调表达峰值的时间点都是感染以后48h。在感染以后,3种C3亚型mRNA的表达在肝脏和脾脏中的表达都呈现出了一个很明显的上调趋势。同样的,也检测了一些补体调控相关的基因表达,BF、C1qb、C2b、C3aR、C3b、C4、C5、C8b和MASP-1。发现大多数补体相关基因的表达在鳃、皮肤和肝脏中也出现了一个上调的趋势,只是上调的倍数有所差异。
  本研究是第一次在泥鳅中报道存在3种C3亚型,并且首次克隆出了泥鳅补体C3-1的全长cDNA序列。3种C3亚型在许多组织中都有所表达,只是表达水平有所差异。泥鳅在受到嗜水气单胞菌感染以后,皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。而感染实验也可以造成3种C3亚型和其它补体基因在鳃,皮肤和肝脏中的表达上调。综上所述,我们的研究暗示着补体C3可能在黏膜组织抗细菌感染的过程中,发挥了一个重要的作用。本研究的结果同样也可以为后续补体C3的功能研究提供一个很坚实的基础。
[硕士论文] 牟维豪
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:2016年4月,四川双流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)养殖场的蝌蚪爆发一种流行性传染病,死亡率近90%,主要临床特征为腹部肿胀,下颌与腹部等体表出血;剖检见腹腔内有淡黄色腹水,肝肿大充血,肠道空虚,腔内充有大量黏液,脾肿大。组织病理学上,患病蝌蚪心、肝、肾、肠与脾等全身多组织器官受损,出现明显的变性与坏死病灶,且在肝细胞与肠上皮等细胞胞浆内发现嗜碱性包涵体。患病蝌蚪组织匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),25℃恒温培养4d,出现明显的CPE,Reed-Muech法测得其滴度为107TCID50/0.1mL。用5%浓度的病毒液浸泡8h对健康蝌蚪进行人工感染试验,感染蝌蚪表现出与自然发病蝌蚪相似的症状,死亡率达到80%,证实分离病毒为该病病原。电镜观察发现病毒颗粒为正六边形、有囊膜,对角线直径约135±8nm,在胞质中呈晶格状排列或游离状;主要衣壳蛋白基因(Maior capsid protein,MCP)序列分析表明其与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上。综上,判断此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原为虹彩病毒科蛙病毒属病毒,将其命名为黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。
  采用常规研究方法,对RNRV的病毒滴度、酸碱敏感性、胰蛋白酶敏感性、有机试剂敏感性、温度敏感性以及病毒最适培养细胞系、最适培养温度、增殖特性等理化特性与表型进行测定。结果显示RNRV具有与蛙病毒属病毒相似的理化特性与表型,其对过酸(pH≤3)、过碱(pH≥10)、有机试剂及胰蛋白酶敏感;60℃作用30min可被灭活;最适培养细胞系为EPC和GCO,最适培养温度范围为25℃-28℃;在25℃条件下感染EPC细胞,12-24h内病毒增殖速度达最大,36h后病毒增殖速度减缓,在72-96h则进入生长平台期。
  基于高通量测序技术,采用HiSeq2000测序仪对RNRV进行了全基因组测序。结果显示,该病毒基因组序列全长为104286bp,包括104个ORFs,其中已知功能的有55个,未知功能的有49个,它们所编码蛋白的氨基酸长度在41-1293AA之间,分子量在4.4-140.8KDa之间,整个基因组GC含量为55.2%,且在基因组序列中的79069-79186bp位置间存在59个CA重复。通过点阵分析发现RNRV基因组与RGV最为相似;以RNRV26个核心基因编码蛋白的串联氨基酸序列与其他14株虹彩病毒相关序列根据邻近法共同构建系统发育树发现,RNRV归属于蛙病毒属FV3病毒类群,且在进化关系上与分离自中国的RGV、STIV的亲缘关系最近。
[博士论文] 郭慧芝
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:鳜是我国主要的高值经济养殖鱼类之一,随着养殖密度的提高,病害越发严重,其中鳜传染性脾肾坏死病毒病(ISKNVD)和弹状病毒病(SCRVD)是阻碍鳜养殖业健康发展的最主要病毒病,因此对其开展防治研究非常必要。p53是一种重要的肿瘤抑制因子,具有调节细胞周期、控制细胞死亡和分化、参与细胞凋亡等功能。近年来研究发现,p53蛋白在细胞先天性抗病毒免疫中发挥着重要的作用。本论文以鳜为研究对象,克隆、表达了鳜p53基因,制备了其多克隆抗体,在此基础上,开展了p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式研究,并进一步对其抗病毒功能进行了确定。取得的结果如下:
  1、获得了鳜p53序列并制备其多克隆抗体,探讨了鳜p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53(Sc-p53)的cDNA全长为1,5555p,编码380个氨基酸,5'和3'非编码区分别为165bp和247bp。Sc-p53蛋白同其他物种p53蛋白一样,在结构上也含有5个进化上高度保守的区域,是p53功能的关键位点。系统进化分析表明,鳜p53与雀鲷等鲈形目亲缘关系最近。构建了鳜p53原核表达载体pET30a-Scp53,将其转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下表达了Sc-p53,Sc-p53蛋白以包涵体形式存在。将纯化的Sc-p53重组蛋白免疫兔子,制备了抗Sc-p53的兔多克隆抗体。荧光定量PCR检测健康鳜的Sc-p53mRNA在各个组织中呈组成型表达,主要表达于鳃和后肾。Western blotting检测发现健康鳜的Sc-p53在肝脏、鳃、脾脏、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后,Sc-p53在鳜脾脏中表达呈现双相性上升的变化,在感染3h时表达显著上调,随后表达下降,然后在48h至7d表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞(CPB)后的表达趋势与鳜脾脏情况相似。Western blotting检测结果显示ISKNV感染CPB细胞后p53蛋白水平也呈现双相性上升的变化。然而,SCRV感染鱼体和细胞后Sc-p53表现出不同的表达模式。SCRV感染鳜后在脾脏组织中表达情况是感染24h后表达显著上调,而感染CPB细胞后,Sc-p53在感染6h表达显著上调。Western blotting检测SCRV感染CPB后,p53蛋白在感染1h后表达显著上调,持续上升到感染4h,而后下降。
  2、获得了鳜p53的基因组结构及其一种新的剪接异构体(Sc-p53I6),在此基础上进一步探讨了Sc-p53I6对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53基因组全长为5,543bp,包含10个内含子和11个外显子。采用RACE-PCR的方法获得了鳜p53的一种新的剪接异构体(Sc-p53I6),其cDNA全长为1,106bp,编码254个氨基酸,5'和3'非编码区分别为165bp和179bp。相比Sc-p53,Sc-p53I6的cDNA全长少了5个外显子,并保留了第六个内含子的一部分。荧光定量PCR检测发现Sc-p53I6在健康鳜的各个组织中也呈组成型表达,主要表达于鳃、血细胞和后肾中。Western blotting结果显示Sc-p53I6在健康鳜的肝脏、头肾、中肾、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后,Sc-p53I6在鳜脾脏中的转录表达也呈现双相性上升的变化,在感染6h表达显著上调,随后表达下降,然后在48-72h表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞后的转录表达趋势与鳜脾脏表达趋势相似。SCRV感染鳜后Sc-p53I6在脾脏组织中转录表达情况呈现出不同的表达模式,只表现一次上升的变化,感染12h后表达显著上调;感染CPB细胞后在感染4h表达显著上调。
  3、为了研究鳜p53的抗病毒功能,构建了鳜p53敲降CPB细胞系,在此基础上,进一步探讨了鳜p53敲降CPB细胞系对ISKNV和SCRV病毒增殖复制的影响。首先构建了p53基因的RNA干扰真核表达载体pMAGic-Scp53A和pMAGic-Scp53B。将构建好的干扰载体转染CPB细胞,获得稳定转染细胞系,将其命名为CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B。通过荧光定量PCR和Western blotting检测其干扰效率,qRT-PCR结果表明CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为63%、60%;Western blot结果表明,CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为79.42%、78.28%,表明成功获得了两个鳜p53敲降CPB细胞系。然后采用ISKNV和SCRV分别感染鳜p53敲降CPB细胞系,结果显示,与对照组相比,在CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B中,ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著增加,且增加水平与敲降效率呈正相关。
  4、促进鳜p53表达抑制了ISKNV和SCRV病毒的增殖复制。添加5-氟尿嘧啶可以增强鳜p53蛋白的表达,ISKNV和SCRV感染后,与对照组相比,添加5-氟尿嘧啶组ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著降低。
  综上所述,ISKNV和SCRV在鳜p53敲降CPB细胞系中的增殖复制显著增加,促进鳜p53表达后,ISKNV和SCRV病毒增殖复制显著降低。表明鳜p53在ISKNV和SCRV病毒增殖复制中发挥着重要的抗病毒作用。
[硕士论文] 纪剑飞
水产动物医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是启动先天性免疫和诱导获得性免疫的关键模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。TLR能够识别病原体的保守分子结构,称为病原体相关分子模式(pathogen-asociated molecular patterns,PAMPs),激活免疫细胞以响应病原体的感染。虽然TLR在哺乳动物上已经得到了深入的研究,但TLR在鱼类上的功能研究依然不足,而人们对于硬骨鱼类特有的TLR,如TLR19更是知之甚少。
  在这项研究中,从草鱼(Ctenopharyngodon idella)中鉴定了TLR19,并对其在抵抗草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)中的作用进行分析,随后探究了其配体、接头分子以及信号通路。主要的研究结果如下:
  1.TLR19抑制GCRV增殖
  构建TLR19-HA过表达载体,合成小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA),分别转染草鱼肾细胞系(C.idella kidney,CIK)。在GCRV的感染下,分别检测了CIK细胞中病毒的含量以及病毒对细胞的损伤情况。结果发现,过表达TLR19抑制了病毒在CIK细胞中的增殖,且细胞存活率明显高于对照组,而干扰TLR19则取得相反的结果。
  2.TLR19定位于早期内体
  构建TLR19-eGFP绿色荧光蛋白融合载体、Rab5-RFP(早期内体标记蛋白)和Rab7-RFP(晚期内体标记蛋白)红色荧光蛋白融合载体,转染CIK细胞,分别用内质网染料(ER-Traker)和细胞核染料(Hoechst33342)染色,最后用共聚焦显微镜观察。结果发现TLR19定位于早期内体。
  3.TLR19识别双链RNA(double strand RNA,dsRNA),招募下游包含TIR结构域接头蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein,TRIF)
  表达并纯化TLR19-LRR蛋白,选取聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I∶C))、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)和双链DNA(double strand DNA,dsDNA)4个代表性的PAMP,运用酶联免疫吸附剂测定法探究TLR19识别的配体。同时在CIK细胞中过表达TLR19,运用双荧光素酶报告实验加以验证。结果显示TLR19识别dsRNA类似物poly(I∶C)。分别构建TRIF、骨髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)、Toll/白介素1受体相关蛋白(TIR-associated protein,TIRAP)、包含SAM和TIR域的蛋白(sterile alpha and TIR motif containing1,SARM1)和SARM1s2的Flag标签融合载体和TRIF-RFP、MyD88-RFP、TIRAP-RFP、SARM1s2-RFP红色荧光融合载体。运用免疫荧光共定位和免疫共沉淀检测TLR19下游接头分子。结果表明TLR19只与TRIF共定位且蛋白之间存在相互作用。
  4.TLR19通过干扰素调节因子3(interferon regulatory factor,IRF3)诱导干扰素(interferon,IFN)和核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号
  过表达TLR19,运用蛋白质印迹(western blotting,WB)对IRF3和IRF7的蛋白和磷酸化水平进行检测,结果发现过表达TLR19有效地促进了IRF3的蛋白和磷酸化水平,抑制了IRF7的磷酸化。此后,运用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对IRF3和IRF7下游的IFN和NF-κB的mRNA水平以及启动子活性进行检测,结果发现IFN的主要成员以及NF-κB的mRNA水平和启动子活性都显著上调。而草鱼的另一个抗病毒成员TLR3只诱导了IFN1的表达,对比TLR3,TLR19在应对GCRV感染时,诱导了更强的IFN和NF-κB应答。
  总的来说,这些结果表明,硬骨鱼类特有的TLR19识别dsRNA,募集接头分子TRIF,增强IRF3蛋白和磷酸化水平,触发IFN和NF-κB途径并抑制病毒增殖。TLR19是第三个识别dsRNA的TLR成员,这是第一次系统地阐述TLR19信号通路。该结果将为硬骨鱼类抗病毒免疫机制和进化免疫学提供理论依据。
[硕士论文] 李亚军
基础兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种宿主范围广泛的革兰氏阳性链球菌,不仅能引起新生儿脑膜炎和奶牛乳腺炎,而且可感染多种养殖鱼类,给水产养殖业造成巨大损失。现有研究发现血清Ⅰa型与Ⅲ型是人源、牛源和鱼源常见的血清型,但目前对于在养殖中流行的不同血清型鱼源无乳链球菌间的表型与分子特性上差异的研究还很缺乏。为此,本研究在对28株鱼源无乳链球菌的血清型和毒力基因谱等分子特性检测的基础上,对同一地区同源的血清型分别为Ⅰa型和Ⅲ型的两株菌进行表型与基因组学的比较研究,以期探明该菌不同血清型菌株在表型与分子生物学特性上的差异,为该菌致病机制、耐药机制和防控研究提供实验依据。
  1、28株鱼源无乳链球菌血清型、耐药性与毒力基因谱研究:
  对28株菌血清型、耐药性、耐药基因和毒力基因谱的检测结果显示,其中24株为血清Ⅰa型,4株为血清Ⅲ型,Ⅰa型为优势血清。Ⅲ型菌株对抗生素的耐药率和耐药基因检出率高于Ⅰa型菌株;所有检测菌株对抗生素氟苯尼考、氨苄西林和万古霉素敏感率均为100%,耐药性最高的抗生素是红霉素,耐药率为42.6%;耐药基因parC、gyrA和ermB检出率均为100%,tetM和pbp2x检出率分别为82.1%和25%。毒力基因检测中,cylE、hylB和cfb的检出率为100%,bca、lmb和sodA检出率分别是32.1%、28.6%和17.9%,cfb/cylE/hylB/bca是被检菌株最为流行的毒力基因谱。
  2、两株不同血清型无乳链球菌(Ⅰa型S07和Ⅲ型S03)表型特征比较研究
  为明确Ⅰa型与Ⅲ型无乳链球菌在表型上的差异,本研究选取裂腹鱼源菌株S07(Ⅰa型)和S03(Ⅲ型),对其生长特性、生理生化特性、耐药性、粘附入侵能力和致病性等表型特征进行比较研究。结果发现,Ⅲ型株S03生长速度明显快于Ⅰa型株S07。S03生长受pH、温度和盐度的影响比S07小。S03和S07在蔗糖和VP试验等40种反应中结果一致,但在葡萄糖和磷酸盐等11种反应中S03呈阳性而S07呈阴性。S03的耐药性明显强于S07,S03表现出7重耐药而S07对所测抗生素均敏感或中度敏感。S07黏附能力明显强于S03。S07对齐口裂腹鱼和斑马鱼的毒力(LD50分别为8.9×103cfu/mL和1.88×103cfu/mL)显著强于S03(LD50分别为5.27×108cfu/mL和7.09×107cfu/mL)。
  3、两株不同血清型无乳链球菌(Ⅰa型S07和Ⅲ型S03)基因组学比较研究
  为进一步明确Ⅰa型与Ⅲ型无乳链球菌在基因组学上的差异,对Ⅰa型S07和Ⅲ型S03进行了全基因组测序和基因组学比较研究。提取S03和S07菌株基因组DNA,采用IlluminaMiseq平台进行全基因组测序,下机数据进行Denovo组装获得了两株菌的基因组序列。结果表明,S03和S07序列长度分别为2157989bp和1795371bp,S03基因组大小显著大于S07基因组。利用COG、ARDB和VFDB等数据库对S03和S07基因组序列进行功能基因、耐药基因和毒力基因注释,并绘制基因组圈图,预测到S03在基因岛、耐药和毒力基因方面的数目均多于S07。在前噬菌体预测方面,S07预测4个噬菌体基因,而S03未预测到噬菌体基因。提取数据库中35个无乳链球菌基因组与S03和S07多基因联合构建进化树,分析结果显示S03与人源血清型Ⅲ型ST19型中国株SAG158、新加坡株SG-25、血清Ⅲ型ST736型中国株H002聚为一支,而S07单独聚为一支。
  综上所述,本研究对28株鱼源无乳链球菌的血清型、耐药性、耐药基因和毒力谱的检测表明,被检地区菌株存在Ⅰa型和Ⅲ型两个血清型,其中Ⅰa型为优势血清型;所有菌株对氟苯尼考、氨苄西林和万古霉素的敏感率均为100%;cfb/cylE/hylB/bca是被检菌株最为流行的毒力基因谱。血清Ⅰa型S07和Ⅲ型S03两株裂腹鱼源无乳链球菌在生长速度、生理生化、耐药性、致病性等表型特征和全基因组大小、功能、毒力和耐药基因、进化关系等分子特性上均存在较大差异,推测S03和S07可能有着不同的起源和进化方向。本研究结果将为鱼源无乳链球菌不同血清型(Ⅰa型和Ⅲ型)在致病机制、耐药机制和进化机制上的进一步研究奠定基础。
[博士论文] 张志敏
水产养殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:微生物是生态圈中不可或缺的生命组成部分,它对动物的环境适应和进化起着重要作用。微生物与动物共栖是经过长期互作、协同进化的结果,它们的关系是当前生命科学和生态科学共同关注的前沿问题。在过去10年间,随着高通量测序技术和生物信息分析学的发展与结合,很大程度上解决了长期以来肠道微生物难以分离、培养的技术性难题,如今我们可以逐渐揭示微生物群落多样性及其功能与动物的关系,探索微生物群落、宿主和环境因子的相互影响机制。从宿主微生物的角度出发,围绕与动物生长发育密切相关的宿主和环境因素开展研究,揭示动物微生物群落的发展、形成及演替过程,有望进一步了解宿主微生物组的动态发展、稳定性,以及解析动物健康稳态的维持和适应性进化的机制。
  水产养殖业是我国农业增长最快的一个产业,鱼类是重要的水产养殖对象。尽管我国鱼类养殖产业比较发达,但针对与鱼类健康密切相关的肠道微生物研究尚存诸多不足。绝大部分肠道微生物研究的方法相对传统,且没有针对与养殖密切相关的重要环节(诸如个体发育、饲料加工方式和渔药使用等)展开系统的研究。此外,极少数研究关注了除肠道以外的鱼类其它组织或器官的微生物群落。针对目前的研究不足与薄弱环节,本论文选用特色鱼类养殖品种——南方鲇(Silurus meridionalis)为主要研究对象,结合现代分子生物学技术、生物信息学和养殖生理学,从个体发育、食物消化、食物热处理、抗生素扰动与恢复等多个时间尺度上研究鱼类肠道微生物的动态发展、演替与建立;比较分析南方鲇不同组织位点的微生物空间分布,结合共栖的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作全面的比较分析;进一步与陆地动物C57BL/6小鼠对比分析,旨在全面解析鱼类微生物的形成机制及微生物组“图谱”构成。本论文的主要研究结果如下:
  1.在早期生长发育过程中,南方鲇肠道微生物的发展、演替与建立
  鱼类生长发育过程中,会面临食物的不确定性或改变等情况,导致很难确定肠道微生物的变化是由食物变化引起的,还是由宿主本身相关的个体发育造成的。在相同的养殖条件下,我们比较了孵化后8dpf、18dpf、35dpf、65dpf和125dpf的南方鲇肠道微生物,并分别探究了8dpf、35dpf和125dpf的肠道、养殖水体和食物的微生物群落。结果显示:随着个体生长发育,南方鲇肠道微生物的多样性逐渐增加,微生物群落结构也逐渐变化;与早期发育阶段相比,65dpf和125dpf的肠道微生物群落趋于另一个不同且稳定的状态,说明南方鲇肠道微生物建立是一个逐步演变、发展的动态过程。同环境微生物相比,肠道微生物多样性较低,微生物群落结构显著不同。南方鲇肠道中主要以无壁菌门(Tenericutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)为主,而食物和水中分别以螺旋体门(Spirochaetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主。研究结果说明南方鲇在早期的生长发育过程中,宿主可不依赖于食物的扰动作用,其本身就有能力塑造肠道微生物的定植与发展。这一发现有助于理解鱼类肠道微生物的发展与演替过程。
  2.鱼类组织微生物地理学图谱的空间异质性
  为更好理解南方鲇组织微生物地理学图谱构成,本研究不仅分析了南方鲇内部组织消化道(胃和肠道)微生物,而且还研究了南方鲇外部组织(鳃和皮肤)微生物,并与和其共栖,虽食性不同但喂食相同食物的草鱼各组织微生物进行比较,最后从整体上探讨鱼类微生物组与养殖水体微生物群落的关系。我们发现两种共栖鱼类的微生物群落结构差异十分明显,两种鱼组织间的微生物群落显著不同,但同一类型组织(外部或内部)的微生物结构更为相似。研究还使用RMT(random matrix theory)模型,分别构建了南方鲇和草鱼微生物组的分子生态网络。结果显示南方鲇和草鱼微生物的分子生态网络结构及其主要特征参数都存在显著差异,表明不同鱼类间不同的微生物作用以及鱼类微生物之间相互作用的多样化。此外,养殖水体微生物显著区别于鱼类消化道微生物。尽管外部组织与养殖水体直接接触,但水体微生物也未能反映外部组织微生物。本研究基于不同鱼类比较,从内部消化道到外部组织的研究结果证实了鱼类所有组织微生物既受宿主种类影响,也与不同组织生态位的差异有关,揭示了鱼类微生物组的差异及鱼体微生物空间分布差异的特点。
  3.在食物消化过程中,南方鲇消化道微生物群落的动态性
  以鲫(Carassius auratus)肉块作为饵料,南方鲇摄食3h、12h和24h后,分别测量消化道(包括胃和肠道)pH,采集消化道微生物样本,比较摄食后消化道各位点在不同时间点下的微生物差异。研究结果显示食物消化期间,胃部pH呈酸性而肠道pH呈弱碱性;随着食物消化,胃部pH显著减小,而肠道pH减小较少。胃部和肠道微生物群落显著不同,胃部最为主要的门类是厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门,肠道中主要的微生物是梭杆菌门和变形菌门(Proteobacteria)。食物消化过程中,胃部和肠道中厚壁菌门的丰度显著增加,梭杆菌门显著减少,而在摄食24h时,肠道中变形菌门的丰度减少,拟杆菌门则显著增多。整个消化道微生物群落结构均随食物消化而呈现动态变化,但胃部微生物多样性始终高于肠道。利用PICRUSt进行微生物的功能预测,发现了胃部和肠道微生物功能基因代谢通路的差异,如能量代谢、多糖生物合成与代谢、碳水化合物代谢和辅酶因子和维生素代谢等功能基因发生变化;在食物消化时间上,也涉及到许多功能基因富集的差异。研究揭示食物消化能够引起整个消化道微生物群落的动态变化,为解释动物肠道微生物变异性提供普遍性的依据,暗示在动物肠道微生物的比较研究中需要考虑肠道样品采集时间的一致性。
  4.食物的加热处理减少肠道微生物多样性并改变肠道菌群
  投喂热加工的食物是水产养殖中普遍存在的现象。以南方鲇和C57BL/6小鼠为研究动物,选用热加工和未加工的草鱼肉块和麦穗鱼(Pseudorasbora parva)为食物进行投喂,研究食物热处理对肠道微生物的影响,并比较动物间肠道微生物的响应差异。通过检测实验食物的营养组成和微生物群落以及南方鲇肌肉营养组成,发现加热并没有显著改变食物的主要营养成分及食物微生物多样性和群落组成;摄食加热食物的南方鲇肌肉脂肪酸没有受到影响,但其氨基酸组成明显改变。通过肠道微生物的研究,发现南方鲇和小鼠肠道微生物群落差异极其显著。研究结果还显示摄食加热食物的南方鲇和小鼠肠道微生物的多样性比摄食未加热食物个体的更低,成对组个体的肠道微生物群落差异显著,表明食物热处理显著降低动物肠道微生物的多样性,引起肠道微生物群落结构的改变。梭杆菌门是南方鲇肠道最高丰度的微生物,而拟杆菌门和厚壁菌门是小鼠肠道微生物的主要种类。此外,很多高丰度微生物在南方鲇和小鼠中的变化模式截然相反,暗示了食物热处理对肠道微生物的影响还与宿主本身有关。研究结果首次证实了食物热处理对肠道微生物的影响,对理解肠道微生物变化提供了新的证据,同时对调控动物肠道微生物群落提供新的视野。
  5.短期使用氟苯尼考影响南方鲇肠道微生物群落,但不引起长期的干扰效应
  抗生素在水产养殖中普遍使用,它对鱼类肠道微生物的影响也应该引起重视。本实验用添加和未添加抗生素氟苯尼考的饲料分别投喂南方鲇幼鱼1周,然后都投喂未添加抗生素的饲料1周,来研究肠道微生物对氟苯尼考的干扰响应和恢复过程,以及与之对应的生长性能和肠道结构。分析结果显示:与对照组相比,氟苯尼考暴露3d的实验组的南方鲇肠道微生物多样性、群落结构没有显著变化,只有11个微生物代谢通路的功能基因发生改变;到处理7d时,实验组的南方鲇肠道微生物多样性减少,群落结构改变显著,有差异的微生物功能基因代谢通路增加到174个;然而,从恢复3d,再到恢复7d,微生物群落逐渐恢复到对照组水平,相应地,有差异的功能基因数目逐步减少到107个,最后变为0个。对照组与实验组的养殖水体微生物群落组成相似,但明显不同于南方鲇肠道微生物。在抗生素处理的后期,实验组的南方鲇摄食量显著减少,饵料系数增加;在停药恢复期内,其摄食量有所提升,饵料系数逐步恢复到对照组水平。而在整个养殖过程中,氟苯尼考没有引起南方鲇肠道组织结构的改变。以上研究结果说明氟苯尼考的短期使用会造成肠道微生物群落的扰动,但不会引起肠道微生物的长期扰动效应。然而,关于氟苯尼考在水产养殖中的使用,我们仍需要谨慎对待。
  综上所述,南方鲇肠道微生物群落具有明显的时间动态性和稳定性,鱼体微生物图谱有明显的空间分布差异。鱼类微生物的动态变化是宿主和微生物对微环境的适应(如动态的食物消化等),它受外源性(抗生素暴露、食物处理)和内源性(个体发育和组织差异)因素的双重调控。
[硕士论文] 李婷婷
生物学;水生生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:日本沼虾(Macrobrachium nipponense,俗称河虾或青虾)是一种重要的淡水养殖虾类,其味道鲜美,营养价值很高,可创造极大的经济价值。但随着日本沼虾养殖业的发展,养殖水域环境的复杂化,日本沼虾的养殖遭受着疾病的困扰,因此预防虾类病害,研究其先天免疫防御机制刻不容缓。纤维胶凝蛋白(ficolin)在识别和清除先天免疫中的病原体方面具有关键作用。Toils在对抗病原侵染的先天免疫应答中发挥重要作用。免疫缺陷(IMD)信号途径介导甲壳动物对革兰氏阴性菌的先天免疫。本论文以日本沼虾为研究对象,研究ficolin-like蛋白、Toll和IMD信号通路关键因子在其免疫系统中的作用。
  1.两种ficolin-like蛋白在先天免疫防御中的作用
  在这项研究中,鉴定了来自日本沼虾的两个ficolin-like基因。这两种基因被命名为MnFico1和MnFico2。MnFico1的cDNA全长有1600bp,而MnFico2有1486bp。除了卷曲螺旋区域或低复杂度区域之外,这两种ficolins都含有信号肽和纤维蛋白原样结构域(FReD)。qRT-PCR结果表明MnFico1在鳃中表达量最高,而MnFico2在心脏中表达量最高。MnFico1和MnFico2的转录本都可以对细菌刺激作出反应。利用RNA干扰技术将MnFico1或MnFico2敲低后,抗脂多糖因子ALFs(MnALF1和MnALF2)和甲壳肽crustin基因(MnCru,MnCru5,MnCru6和MnCru7)的转录在副溶血弧菌刺激后的24h明显受到抑制。重组蛋白rMnFico1和rMnFico2可以与不同的细菌结合,并在存在钙离子(Ca2+)的情况下凝集革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。rMnFico1和rMnFico2蛋白也具有脂多糖和肽聚糖结合活性。这两种重组ficolin蛋白都可以在日本沼虾体内帮助清除副溶血弧菌。我们的研究结果表明,MnFico1和MnFico2可能作为模式识别受体在日本沼虾对抗细菌入侵的先天免疫防御中发挥重要作用。
  2.Toll受体在鳃中调节抗菌肽(AMP)的表达
  在这项研究中,一种新的Toll基因MnToll1首先从淡水虾日本沼虾中被鉴定出来。MnToll1cDNA全长3186bp,包含2867bp的开放阅读框,编码含955个氨基酸残基的蛋白质。MnToll1包含1个信号肽,12个LRR结构域,3个LRR_TYP结构域,2个LRR_CT结构域,1个低复杂度结构域,1个跨膜区结构域和1个TIR结构域。qRT-PCR分析表明,MnToll1广泛表达于所有被测试的组织。并且在副溶血弧菌刺激后,鳃中MnToll的表达显著上调。dsRNA干扰的结果显示,MnToll1能够调节日本沼虾鳃中2种甲壳肽Crustins(MnCru4和MnCru6)的表达。此项研究表明日本沼虾MnToll1在诱导抗菌肽表达的先天性免疫应答中具有重要作用。
  3.免疫缺陷同系物(IMD)在先天免疫中的作用
  在本研究中,在日本沼虾中鉴定了一个IMD受体(MnIMD)。MnIMD的全长cDNA为782bp,开放阅读框为549bp,编码一个含182个氨基酸的蛋白质,在C末端的一个死亡结构域。多序列分析显示,日本沼虾和其他甲壳类动物中的IMD具有很高的相似性,并且系统发育树的同一分支。对MnIMD重组蛋白进行表达和纯化并制备抗血清。运用该抗血清进行Western印迹分析,结果显示MnIMD存在于大多数组织中,且在鳃中的表达量最高,这与qRT-PCR结果一致。副溶血弧菌刺激后,鳃中MnIMD基因的表达显著上调。dsRNA干扰实验结果表明IMD途径参与调控不同抗菌肽(AMP)基因(Cru4和Cru6)的表达。综上所述,对ficolin-like、Toll以及IMD等免疫基因的研究有助于加深对日本沼虾先天免疫机制的认识,同时也对虾类病害防治具有理论指导和现实应用意义。上述实验结果有助于促进对日本沼虾先天免疫的研究。
[博士论文] 路畅
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)在肌肉发育中发挥重要功能,它们参与肌肉的增殖、再生和修复等过程,发挥着调控肌肉数量及质量的功能。Dmrt2b(doublesex and mab-3related transcription factor2b)已经被证实参与斑马鱼(Danio rerio)慢肌的发育,作为dmrt2b的同源基因,dmrt2a在斑马鱼肌肉发育中的功能尚不清楚。本研究发现,在斑马鱼中敲降dmrt2a会造成胚胎发育的严重缺陷,并且引起快肌标记基因myhz-2的下调和慢肌标记基因myhz-5的上调。生物信息学预测dmrt2a是miR-203的一个候选靶基因,miR-203有两个亚型,miR-203a和miR-203b,两者之间只有一个碱基不同,且它们的核心序列完全相同,本研究选用miR-203a作为研究对象。荧光素酶报告实验证实,miR-203能够靶向结合dmrt2a3'UTR来抑制dmrt2a的表达。在斑马鱼胚胎中注射miR-203a mimic后,dmrt2a的表达受到了抑制。与敲降dmrt2a相似,miR-203a过表达之后,导致myhz-2的下调和myhz-5的上调。本研究表明miR-203a能够直接调控dmrt2a的表达进而调控快肌和慢肌的分化,斑马鱼中过表达miR-203a和敲降dmrt2a都会损害快肌的发育并且促进慢肌的发育。
  生物信息学预测igf2bp1(insulin-like growth factor-2mRNA-binding protein1)也是miR-203的候选靶基因,本研究发现,在斑马鱼胚胎中过表达miR-203a会造成igf2bp1的表达下调,这说明miR-203可能潜在结合igf2bp1,igf2bp1是miR-203的潜在靶基因。在斑马鱼胚胎中敲降igf2bp1不会对斑马鱼的表型及肌肉发育造成影响,表明在斑马鱼胚胎中igf2bp1与肌肉发育没有功能关联。进一步研究发现,敲降igf2bp1会导致肝脏体积变小,肝细胞标记基因fabp10a的表达量减少,同时内胚层标记基因gata6和foxa3的表达没有变化。利用基因芯片技术对注射Cont-MO和igf2bp1-MO后两组芯片中基因的表达谱进行了分析,igf2bp1-MO组芯片中fabp10a的表达量显著下调,而gata6和foxa3的表达在两组芯片中则无差异。igf2bp1突变体(igf2bp1-/-)斑马鱼与WT(wild type)斑马鱼在外部形态上无差异,但是在igf2bp1-/-斑马鱼胚胎中,肝脏的体积变小,fabp10a的表达下调,gata6和foxa3的表达没有变化。本研究表明,igf2bp1在斑马鱼早期肝脏发育过程中是肝脏生长所必需的。
  综上所述,在斑马鱼胚胎发育中dmrt2a和igf2bp1分别在肌肉发育和肝脏发育中起重要作用。
[博士论文] 赵丹丹
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:粘体动物(myxozoans)是一类世界分布的后生动物寄生虫,主要寄生于鱼类,部分物种能引发鱼类病害,有些物种能导致重大病害的发生,造成严重经济损失,但至今仍缺乏有效的粘体动物病害防控措施。粘体动物的生活史包括两个时期,分别是感染鱼体的粘孢子虫(myxospores)时期和感染水生环节动物的放射孢子虫(actinospores)时期,解析粘体动物的生活史对粘体动物病害的防控具有重要意义。然而,到目前为止仅有50余种粘体动物的生活史得到解析,绝大部分的粘孢子虫和放射孢子虫没能形成一一对应关系,尤其是部分严重危害养殖鱼类的粘体动物,这严重阻碍了对粘体动物病害防控方法的建立。本论文运用形态学、组织病理学和分子生物学等方法,研究了淡水养殖池塘中放射孢子虫类群的形态特征、分子特性及物种多样性,发现了6个放射孢子虫集合群,其中5个放射孢子虫类型为首次发现和报道,1个首次在中国发现,4个为重描述。另外,7个放射孢子虫类型与粘孢子虫形成了对应关系,阐明了6种粘体动物的生活史。主要结果如下:
  1.橘瓣放射孢子虫集合群Aurantiactinomyxon Janiszewska,1957
  (1)Aurantiactinomyxon type2of Zhao et al(2016):具有1个三叶草形的孢子体、3个三角形的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。形态学显示该橘瓣放射孢子虫为一种新类型。18S rDNA序列分析显示,Aurantiactinomyxon type2of Zhao et al(2016)与吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)具有99.2%-99.9%的相似性,表明Aurantiactinomyxon type2of Zhao et al(2016)是吉陶单极虫对应的放射孢子虫。
  (2)Aurantiactinomyxon type of Zhao et al(2017):具有1个三角形的孢子体、3个叶状的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。形态学显示该橘瓣放射孢子虫为一种新类型。透射电镜结果显示,该橘瓣放射孢子虫的不同泛孢子母细胞发育不同步,但同一泛孢子母细胞中孢子的发育基本一致;同时,本研究观察到了孢子母细胞的形成以及孢子生殖的发育过程,发现该橘瓣放射孢子虫在苏氏尾鳃蚓体内进行减数分裂,并对内出芽生殖假说提出质疑。18S rDNA序列分析显示,Aurantiactinomyxon type of Zhao et al(2017)与龟壳单极虫(Thelohanellus testudineus)为同一物种,表明Aurantiactinomyxon type of Zhao et al(2017)是龟壳单极虫对应的放射孢子虫。
  (3)Aurantiactinomyxon type A:具有1个球形的孢子体、3个叶状的尾突和3个极囊,孢原质中含有8个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,Aurantiactinomyxon type A与一种未定种楚克拉虫Zschokkella sp.(DQ118776)具有99.9%的相似性,表明Aurantiactinomyxon typeA是这种楚克拉虫对应的放射孢子虫。
  (4)Aurantiactinomyxon type B nov.:具有1个球形的孢子体、3个细长的叶状尾突和3个极囊,孢原质中的生殖细胞数目尚不清楚。形态学显示该橘瓣放射孢子虫为一种新类型。18S rDNA序列分析显示,该橘瓣放射孢子虫与鲇楚克拉虫(Zschokkellaparasiluri)具有99.0%的相似性,表明Aurantiactinomyxon type B nov.是鲇楚克拉虫对应的放射孢子虫。
  (5)Aurantiactinomyxon type C:Aurantiactinomyxon type C1nov.的孢子体顶面观呈球形,3个细长的叶状尾突向下弯曲,孢原质中的生殖细胞数目尚不清楚。形态学显示该橘瓣放射孢子虫为一种新类型。Aurantiactinomyxon type C2的孢子体顶面观呈球形,3个短宽的叶状尾突轻微向下弯曲,孢原质中具有8个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,Aurantiactinomyxon type C1nov.与Aurantiactinomyxon type C2具有99.6%的相似性,表明两者为同一种放射孢子虫(统称为Aurantiactinomyxon type C)。BLAST比对结果表明,Aurantiactinomyxon type C与一种未定种楚克拉虫Zschokkella sp.(DQ118776)具有98.1%-98.5%的相似性,目前尚不确认其对应的粘孢子虫种类。
  (6)Aurantiactinomyxon type JD of Xi et al(2015):具有1个三叶草形的孢子体、3个三角形的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,该橘瓣放射孢子虫与武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)具有95.7%-95.8%的相似性,目前尚不清楚Aurantiactinomyxon type JD of Xi et al(2015)对应的粘孢子虫种类。
  2.新放射孢子虫集合群Neoactinomyxum Granata,1922
  (1)Neoactinomyxum type A:孢子顶面观呈三叶草形,具有1个球形或近球形的孢子体、3个圆盘状的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,此类新放射孢子虫与汪氏单极虫(Thelohanellus wangi)具有99.2%-99.3%的相似性,表明Neoactinomyxum type A是汪氏单极虫对应的放射孢子虫。
  (2)Neoactinomyxum type B nov.:孢子顶面观呈圆三角形,具有1个三角形的孢子体、3个细月牙形的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。形态学结果表明此类新放射孢子虫为一种新形态类型。分子分析结果表明,在GenBank中未能找到与Neoactinomyxum type B nov.的18S rDNA序列匹配的物种,目前尚不清楚此类新放射孢子虫对应的粘孢子虫种类。
  (3)Neoactinomyxum type A1of Eszterbauer et al(2006):孢子项面观呈三角形,具有1个球形或近球形的孢子体、3个月牙形的尾突和3个极囊,孢原质中含有32个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,此类型的新放射孢子虫与武汉单极虫具有97.9%的相似性,目前尚不确认Neoactinomyxum type A1of Eszterbauer et al(2006)对应的粘孢子虫种类。
  3.雷放射孢子虫集合群Raabeia Janiszewska,1955
  Raabeia type of Myxobolus cultus:寄生于苏氏尾鳃蚓(Branchiura sowerbyi)和维窦夫盘丝蚓(Bothrioneurum vejdovskyanum)的肠道,具有1个桶状或烧瓶状的孢子体、3个向上弯曲的尾突和3个梨形的极囊,孢原质中包含8个或16个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,该雷放射孢子虫与培养碘泡虫(Myxobolus cultus)具有99.1%-99.9%的相似性,表明培养碘泡虫是此类雷放射孢子虫对应的粘孢子虫。此外,本研究在寡毛类体内发现了粘孢子虫的混合感染,从维窦夫盘丝蚓释放的雷放射孢子虫样品中检测到了吴李碘泡虫(Myxobolus wulii)。
  4.匈牙利放射孢子虫集合群Hungactinomyxon Rácz,Eszterbauer et Molnár,2005
  Hungactinomyxon type of Rácz et al(2005):由8个单位的棘放射孢子虫所组成的复合群体。18S rDNA序列分析表明,此类匈牙利放射孢子虫与Myxobolus lentisuturalis具有95.6%-95.7%的相似性,目前尚不清楚此类匈牙利放射孢子虫对应的粘孢子虫种类。匈牙利放射孢子虫在中国首次发现。
  5.三突放射孢子虫集合群Triactinomyxon(S)toic,1899
  Triactinomyxon type:整体呈锚状,具有1个圆筒状的孢子体、1个柱状的孢柄、3个向上弯曲的尾突和3个梨形的极囊。3个样本(编号TAM-1、TAM-2和TAM-3)的形态及形态学测量数据表明,TMA-1与TAM-2为同一类型的三突放射孢子虫,TAM-3具有较长的孢子轴,推测TAM-3是另外一种三突放射孢子虫类型。
  6.古放射孢子虫Guyenotia Naville,1930
  Guyenotia type of Eszterbauer et al(2006):具有1个球形的孢子体、3个指状的尾突和3个位于孢子体顶端的极囊,孢原质中包含8个生殖细胞。18S rDNA序列分析显示,此类古放射孢子虫与一种未定种楚克拉虫Zschokkella sp.(DQ118776)具有99.9%的相似性,表明Guyenotia type of Eszterbauer et al(2006)是这种楚克拉虫的放射孢子虫阶段。将本研究中的Aurantiactinomyxon type A与Guyenotia type of Eszterbauer et al(2006)进行比较,发现两者具有99.9%的遗传相似性,表明Aurantiactinomyxon type A和Guyenotia type of Eszterbauer et al(2006)都是Zschokkella sp.(DQ118776)对应的放射孢子虫阶段。基于此结果,本文对划分古放射孢子虫集合群和橘瓣放射孢子虫集合群的形态分类指标进行了讨论,并对其有效性提出了质疑。
[博士论文] 张旭峰
环境科学与工程 大连海事大学 2017(学位年度)
摘要:本文通过研究中国沿海地区(辽宁、河北、山东、江苏和福建)海洋底栖动物刺参和扇贝(虾夷扇贝和栉孔扇贝)的稳定同位素和脂肪酸组成特征,包括碳、氮稳定同位素组成、脂肪酸含量组成及单分子脂肪酸碳同位素组成,分析和比较不同地区刺参和扇贝的稳定同位素和脂肪酸组成的差异,并结合统计学分析方法,如主成分分析和判别分析,区分不同产地来源的刺参和扇贝。同时,通过研究刺参和扇贝潜在食源的贡献、食物来源组成以及脂肪酸碳稳定同位素的分馏,评价食物来源和脂肪酸代谢对刺参和扇贝稳定同位素和脂肪酸组成的影响,为深入分析和研究海洋底栖动物稳定同位素和脂肪酸组成的地域性差异提供理论依据。
  不同地区刺参和扇贝的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,不同产地来源的刺参和扇贝能通过碳、氮稳定同位素组成得到有效区分;不同季节刺参和扇贝的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,秋季刺参的δ13C、δ15N值相对于春季均偏正(δ13C:0.066~2.310‰;δ15N:0.527~1.246‰),而秋季虾夷扇贝和栉孔扇贝的δ13C值相比于春季偏负(分别为0.081~1.861‰和0.201~1.566‰)。
  海洋底栖动物的脂肪酸组成存在明显的物种特异性,不同食性海洋底栖动物的脂肪酸组成差异较大;不同地区刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著性差异,结合统计学分析方法能有效对不同地区的刺参和扇贝进行区分;不同季节刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著性差异,同时不同养殖方式也能导致刺参脂肪酸组成的差异。
  刺参和扇贝饱和脂肪酸的δ13C值普遍高于不饱和脂肪酸;不同地区刺参和扇贝的脂肪酸碳稳定同位素组成存在显著性差异,结合统计学分析方法能有效对不同地区的刺参和扇贝进行区分;刺参和扇贝的脂肪酸碳稳定同位素组成存在显著的季节性差异,秋季刺参单分子脂肪酸的δ13C值高于春季,而秋季虾夷扇贝和栉孔扇贝单分子脂肪酸的δ13C值低于春季,与全样δ13C值的季节性变化规律一致;不同养殖方式刺参的脂肪酸碳稳定同位素组成也存在明显差异,圈养刺参单分子脂肪酸的δ13C值高于底播刺参。
  不同地区刺参潜在食源的碳、氮稳定同位素组成存在显著性差异,同时,4种潜在食源对刺参生长的贡献存在显著性差异,莱州地区贡献率大小依次为大型藻类、紫贻贝、浮游生物和SOM,担子岛地区为SOM、浮游生物、大型藻类和紫贻贝,獐子岛地区为SOM、大型藻类、紫贻贝和浮游生物。潜在食源碳、氮稳定同位素组成的差异及对海洋底栖动物生长贡献的差异是导致海洋底栖动物碳、氮稳定同位素组成存在地域性差异的主要原因。
  不同食性海洋底栖动物食物来源组成不同,沉积食性刺参食物来源主要为硅藻,而滤食性扇贝食物来源主要为硅藻和鞭毛藻,2种扇贝之间也存在略微差异,虾夷扇贝的食物来源以硅藻为主,而栉孔扇贝的食物来源以鞭毛藻为主。不同地区刺参和扇贝的食物来源组成不同,导致刺参和扇贝的脂肪酸组成存在显著的地域性差异。
  刺参脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.588~7.403‰,其中,饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为1.098~7.403‰,单不饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.588~2.778‰,多不饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏为-1.559~5.614‰,饱和脂肪酸碳稳定同位素的分馏程度大于不饱和脂肪酸。刺参不同脂肪酸的来源及代谢不同,饱和脂肪酸主要来源于食物,刺参能利用20碳以下偶数碳饱和脂肪酸通过去饱和、碳链延长合成其他脂肪酸;20碳以下单不饱和脂肪酸主要来源于食物,20碳以上单不饱和脂肪酸主要来源于其他脂肪酸的转化合成;多不饱和脂肪酸18∶3n-3、20∶5n-3和20∶3n-6主要来源于食物,其中18∶3n-3和20∶5n-3参与了代谢反应,用于合成其他脂肪酸或激素,20∶4n-6主要来源于18∶2n-6的转化合成,22∶6n-3同时来源于食物和18∶3n-3的转化合成。
  海洋底栖动物食物来源的稳定同位素组成及脂肪酸的代谢过程都受到环境因子的影响,因此,环境因子是海洋底栖动物稳定同位素和脂肪酸组成呈现地域性差异的最终决定因素。
[硕士论文] 缪栋
农用海洋资源 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:海参养殖业是我国特色海水养殖产业之一,主要分布在辽宁和山东沿海。海参养殖业发展迅速,2010年全国海参养殖面积已达到万公顷,产量达万吨,产值接近亿元。然而,相对于其迅速发展的规模,与海参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。因此,相关基础研究越来越受到人们的重视。
  海参养殖环境中微生物有着十分重要的地位,大部分微生物以生产者或分解者作用参与水生生态系统,部分寄生或共生型病原微生物会造成海参疾病爆发,与海参的健康生长有着十分紧密的联系。而在人工养殖过程中,不规范的投放饵料、药物滥用等造成池底物质堆积,往往会导致水体微生态平衡受到严重破坏,水质恶化、缺氧等,造成海参免疫力下降或死亡;另外,水体富营养化也会造成水体优势青苔与养殖生物饵料藻类竞争,造成底质腐败等,进而给海参养殖造成直接或间接的负面影响。因此,海参养殖环境的健康状况与微生物群落的丰度、群落结构有着紧密的联系,探究养殖环境中微生物群落的组成与动态变化对于海参养殖业具有重要的理论和实践意义。
  基于以上背景,本工作对海参养殖池塘中的微生物多样性和年度动态变化进行了研究,采用流式细胞术检测水体中浮游微生物丰度;通过高通量测序检测真菌、古菌、细菌等不同类型的微生物多样性及其丰度变化;利用连续流动分析仪对海参养殖水体的环境因子进行测定;综合群落结构和环境因子寻找影响微生物群落变化的制约性因素。另外,针对青苔爆发频繁的实际性问题,利用特异性引物设计和定量PCR技术相结合,探讨检测海参养殖池中青苔孢子的分子检测方法,以期达到对青苔爆发的早期预警。本研究旨在为海参养殖池塘环境微生物生态调控模式的建立提供一定的基础资料。主要研究结果如下:
  1.海参养殖池浮游微生物的分布
  利用流式细胞仪技术研究了海参养殖池塘水体环境浮游微生物丰度变化及其与环境因子的关系。
  结果表明:
  (1)浮游微生物检测出聚球藻、皮微级浮游植物、纳微级浮游植物、隐藻、高低核酸异养细菌几大类型,其中细菌数量级非常大,几乎达到106/mL,而浮游植物的数量级较小,只有102/mL~103/mL。
  (2)浮游微生物一般都是3月开始生长,到6月份处于爆发顶峰期,9月份的时候已经处于衰退期。
  (3)浮游微生物数量与环境中的溶解氧,盐度、pH、可溶性总氮具有一定的相关关系,其中,溶解氧和pH对于浮游微生物的影响是最大的。
  2.海参养殖池微生物多样性分析
  水样过滤膜提取DNA,并进行高通量测序,再结合环境因子对比,研究海参养殖池微生物多样性。
  结果表明:
  (1)细菌中变形菌门是重要组成部分,其中α-变形菌(Alphaproteobacteria)是主要类群。CCA分析结果显示,原核生物类群受pH、亚硝态氮、硅、氨态氮、温度控制。
  (2)古菌生物中,大部分样品优势类群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都与各种形态可溶性氮元素有着显着甚至是极显著相关性。CCA分析的结果显示出微生物群落受盐度和硅控制。
  (3)真核微生物中泛植物界占据主要组成部分,而在泛植物界中绿藻门是最主要的。CCA结果显示生物类群受盐度、温度、pH、溶解氧、亚硝态氮、氮磷比控制影响。
  3.海参养殖池三种藻类孢子/配子qPCR检测
  对海参养殖池三种爆发性青苔进行了18S和ITS区间测序,设计了以核糖体转录间隔区(ITS)为靶区域的种类特异性PCR引物,通过藻类和环境水样DNA对照实验检验其特异性和适用性。
  结果如下:
  (1)所得三种藻类ITS引物均具有一定种类或类群特异性。
  (2)三对引物在qPCR方法中呈现一定的灵敏度,三株藻类最低检出限度:缘管石莼约1.66×10-4 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;未能鉴定到种约6.6×10-6 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;萱藻1.66×10-4 ng/μL,400个ITS基因拷贝数。
  (3)使用qPCR方法对烟台海参养殖水体6个季度环境水样中的萱藻孢子/配子进行定量检测,发现样品中萱藻孢子/配子ITS拷贝数的季节变化与青苔爆发规律呈现较高的吻合度,萱藻爆发前期伴随水体中孢子/配子量的增高,初步显示藻类爆发可被qPCR方法预测。
[硕士论文] 钟继汉
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:Tc1转座子超家族广泛分布于细菌、真菌及昆虫等各种生物中,有些Tc1转座子超家族成员已经被开发为重要的遗传育种操作工具,如SB转座子已经作为基因治疗和转基因的介导载体得到广泛应用。pogo转座子是Tc1转座子超家族的重要成员,但对其分布、进化和活性研究报道很少。本研究通过硬骨鱼转座组注释,并在脊椎动物中针对Tc1转座子超家族的重要成员pogo转座子进行分布、进化和活性研究,以挖掘活性pogo转座子,研发自主知识产权的遗传操作工具,为动物转基因和基因治疗等研究提供技术支撑。主要研究内容如下:
  (1)通过生物信息学手段对9种硬骨鱼转座组进行注释。结果表明9种硬骨鱼类转座组大小和构成差异显著,其转座组含量从高到低分别为斑马鱼、矛尾鱼、青鳉鱼、花斑剑尾鱼、大西洋鳕鱼、三刺鱼、金娃娃、罗非鱼和红鳍东方纯,转座子含量和基因组大小呈正相关。DNA转座子在硬骨鱼类中具有多样性高和含量差异大的特点(0.50%-38.37%),是硬骨鱼类转座组差异的主要决定因素,其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨鱼类主要的DNA转座子。RNA转座子在硬骨鱼类中也具有多样性高的特点,其中LINE转座子占硬骨鱼类基因组0.53%-5.66%,共检测到12个(I、CR1、L1、L2、R1、R2、Jockey、 RTE和Rex)超家族分布,其中L1、L2、RTE和Rex转座子扩增较为明显,LTR转座子除了在斑马鱼和三刺鱼中含量达到5.58%和2.51%,在大多硬骨鱼类基因组中的含量低于2%,在硬骨鱼类中共检测到6个LTR转座子(Copia、DIRS、ERV、Gypsy、 Ngaro和Pao)超家族分布,其中扩增最为明显的是Gypsy。而SINE转座子在硬骨鱼类中扩增最弱,仅在斑马鱼和矛尾鱼中分别达到3.28%和5.64%,在其它7个品种中低于1%。SINE中tRNA、5S和MIR三个超家族在部分硬骨鱼类中有一定程度扩增。本研究表明硬骨鱼类转座组具有多样性丰富、差异大的特点,转座组差异与硬骨鱼基因组大小有很强的相关,转座组是决定硬骨鱼基因组大小的重要因素。
  (2)通过TBLAST程序对NCBI数据库中脊椎动物基因组比对发现pogo转座子主要分布在鱼类基因组中,其中在28个鱼物种中发现了pogo转座子的分布,在2种两栖动物(西方爪蛙和高山蛙)和4种爬行动物中发现了pogo转座子的分布,在鸟类和哺乳动物未能发现者典型的pogo转座子结构。pogo转座子在进化中衍生出POGK和POGZ功能基因,POGZ在脊椎动物中分布广泛,而POGK主要分布在哺乳动物中。POGK和POGZ功能基因含有保守的pogo转座酶DBD和DDE结构域,且DDE氨基酸残基高度保守,提示POGK和POGZ可能具有DNA酶活性。
  (3)为验证人源POGK和POGZ在哺乳动物细胞上的活性,构建了pogo转座子介导的新霉素报告基因表达质粒pPG-PGK-NEO,及转座酶表达质粒pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ,同时构建斑马鱼pogo转座酶表达质粒pT2-CMV-Pgase。将pPG-PGK-NEO与分别上述三个转座酶表达质粒共转染Hela细胞,通过G418筛选获得稳定表达Neo基因的阳性细胞,阳性细胞克隆数比较表明,pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ组显著高于对照组,而pT2-CMV-Pgase组显著高于POGK、POGZ和对照组,提示pogo转座酶、POGK、POGZ基因均具有转座活性。
  (4)为了进一步明确斑马鱼pogo转座酶PGase转座子时空表达特性,以PGase正、反义RNA为探针,对不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行原位杂交,结果表明,PGase在胚胎早期发育各阶段具有表达活性,正向表达水平明显高于反向,且表达无明显组织特异性,
  本研究表明,pogo转座子主要分布在鱼类、两栖类和爬行类动物中,具有较高的转座活性,且其衍生基因POGK和POGZ也具有转座活性。
[硕士论文] 刘帅军
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:转座子(Transposon,Tn),存在于生物界的各种生物基因组中,是一段可以在基因组上自由移动并改变其位置的DNA序列。转座子天然具有基因转移特性,可作为基因载体用于基因组遗传修饰。Sleeping Beauty(SB)、PiggyBac(PB)和Tol2等三种转座子目前被广泛应用于脊椎动物转基因研究构建基因突变体库,研究基因表达调控机理及表达特性。本研究利用自行构建的SB、PB和To12介导的增强子捕获载体制备了增强子捕获斑马鱼,比较报告基因和捕获的增强子及内源基因时空表达模式,以期获得调控组织发育或细胞分化的特异性增强子。主要获得以下研究结果:
  1、根据不同荧光表型将SB、PB及To12介导的增强子捕获转基因斑马鱼F1代进行分类,选择具有典型表达模式的个体建立7个品系,分别为SK-1、SK-3、SK-6、SK-12、TK-1、TK-4及PK-0。将7个品系分别与野生型交配产生F2代,观察其胚胎早期不同发育阶段绿色荧光蛋白表达模式,结果表明7个品系荧光表型主要分为:脑、躯干、眼睛、心脏、下颌等。以F2代基因组为模板进行SP-PCR及测序结果表明,捕获载体分别插入整合在基因组不同位点分布在5个不同染色体;共捕获了7个不同的内源基因(slc9a8、ednraa、mettl22、wdr33、dlx1a、rps26和itgav),其中4个插入位点位于内含子,1个位于外显子,2个分别位于基因上游20Kb和下游10bp处。
  2、利用内源基因反义RNA作为探针进行斑马鱼胚胎原位杂交,结果表明在24hpf和48hpf两个发育阶段,内源基因与报告基因绿色荧光蛋白表达模式大体一致。脑、眼及全身等荧光信号强的组织其杂交后着色也较深。
  综上所述,本研究表明,三种转座子介导的增强子捕获载体均能有效应用于增强子捕获。报告基因和内源基因可能在相同增强子调控下表达,绿色荧光信号基本可代表内源基因的时空表达特性。本研究可为增强子注解提供重要参考,为进一步研究增强子表达调控功能及基因活性奠定基础,对后基因组时代的研究具有重要的意义。
[硕士论文] 贾雪卿
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:肠道菌群是一个受遗传、营养和环境因子影响的动态生态系统,复杂的肠道菌群因其对宿主生长、健康等方面的影响而日益受到研究学者的关注,是宿主体内不可缺少的“器官”之一。花鳗鲡,是鳗鲡类中体型较大的一类,广泛地分布在热带和亚热带的海水与淡水水系里,是一种珍贵的鱼类资源,为中国国家二级保护动物。随着养殖集约化的增加和养殖技术的限制,花鳗鲡养殖水平参差不齐。在花鳗鲡养殖过程中,因为营养不良和管理不当等因素,会出现一些养殖时间长却生长极缓慢的个体。它们通常头大尾小,体色多呈棕黄色或黑色,被称为僵鳗。
  本研究中,运用传统培养手段和高通量测序技术揭示不同生长程度花鳗鲡肠道菌群结构,并结合饲喂实验初步探讨花鳗鲡肠道关键菌群对其生长的影响。实验设计三组鳗鲡肠道样品(快速生长组Am-R、缓慢生长组Am-S和僵滞生长组Am-F)和两组环境样品(养殖水体组Am-W和饲料组Am-B),本研究结果如下:
  1、利用传统培养手段分离Am-R组和Am-F组的鳗鲡肠道细菌共包括14个属,分别为乳球菌属、肠球菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、变形菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、不动杆菌属、邻单胞菌属、柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属、爱德华氏菌属,和微杆菌属。其中,仅在Am-R组中分离得到了乳球菌属和肠球菌属。
  2、利用高通量测序技术分析花鳗鲡样品菌群结构,经过滤和去冗余处理,11个样品共获得625,583有效读段和36,863个可操作分类单元(OTU)。所有样品中,Shannon指数平均值Am-W>Am-B>Am-F>Am-R>Am-S,Simpsom指数平均值Am-W<Am-B<Am-F<Am-R<Am-S,ACE和Chao指数平均值Am-B>Am-W>Am-S>Am-R>Am-F。其中,Am-W组菌群微生物多样性最高,Am-B组菌群丰度最高,而在肠道样品中Am-S组菌群多样性最低、丰度最高。花鳗鲡肠道样品中Am-R组和Am-S组菌群结构相似,共有核心菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属和拟杆菌属。而Am-F组核心菌群为螺原体属。Am-W组核心菌群为黄杆菌属、新鞘氨醇菌属和假单胞菌属。Am-B组核心菌群为棒状杆菌属。此外,在快速生长和僵滞生长的花鳗鲡肠道中,主要差异菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属、拟杆菌属、爱德华氏菌属、邻单胞菌属、魏斯氏菌属、肠杆菌科和螺原体属等。
  3、三组饲料添加剂均对僵鳗生长产生了促进作用,其中以拟杆菌属与梭菌属添加组(BC组)促生长效果最好,乳球菌属与肠球菌属添加组(LE组)的促生长效果与甘露寡糖添加组(MO组)的促生长效果没有显著差异。
  本研究结果阐明了养殖花鳗鲡肠道菌群基本组成,分析了影响鳗鲡生长的关键菌群,对几种潜在益生菌能否促进僵鳗生长进行了初步探索,为后续关于鳗鲡保护和养殖的研究提供了基础,并丰富了肠道微生物和饲料添加剂方面的研究。
[硕士论文] 许佳霖
农业资源与环境 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:渔业养殖行为可导致沉积物中有机质和抗生素的异常积累,而沉积物又是汞甲基化发生的主要场所。因而,这些有机质和抗生素有可能对养殖区沉积物中的甲基汞形成过程产生影响。本论文以舟山六横岛养殖区和对照区沉积物为研究对象,在对养殖区和对照区沉积物中总汞、甲基汞以及抗生素浓度进行原位调查的基础上,通过室内模拟实验,分别研究了有机质和抗生素对沉积物中汞甲基化的影响效应。通过实验和分析得出以下主要结论:
  1.原位调查结果显示:养殖区沉积物中的总汞、甲基汞以及甲基汞占总汞比例均高于对照区,表明渔业养殖行为促进了沉积物中总汞的积累以及汞的甲基化。夏季养殖区沉积物的总汞含量要比冬季高11.9%,差异达到显著性水平(P<0.05);而对照区夏季沉积物总汞含量比冬季显著降低25.6%(P<0.05)。对照区沉积物甲基汞含量在垂直剖面上较为稳定;养殖区沉积物MeHg含量在2cm处出现峰值,随后逐渐下降并趋于稳定。舟山六横岛沉积物中,土霉素和四环素的检出率和含量最高,养殖区分别为18.65ng·g-1和8.66ng·g-1,远高于对照区的2.01ng·g-1和0.96ng·g-1。
  2.室内模拟实验表明,添加相同剂量的无机汞后,沉积物中总汞浓度基本处于稳定状态,未发生显著变化;但是养殖区沉积物甲基汞含量以及甲基汞占总汞的比例显著高于对照区(P<0.05),这证实富含有机质的养殖区沉积物更有利于汞的甲基化。此外,对照区和养殖区沉积物中的甲基汞含量与添加的Hg2+量呈正相关,但与此同时甲基汞占总汞的比例反而有所下降,这是因为在Hg2+供应充足条件下,甲基供体的数量成为汞甲基化的限定因子,导致有机质对汞甲基化的促进作用出现阈值。
  3.四环素类抗生素对沉积物中汞形态变化的结果显示,经64天的培养周期后,沉积物中的总汞含量和抗生素含量有所下降。这说明沉积物中无机态汞与抗生素进行了络合,并伴随电子迁移的发生,形成了零价态汞和抗生素自由基,致使汞的挥发。同时,沉积物中的甲基汞含量以及甲基汞占总汞的比例增加,这在添加低剂量汞的沉积物中尤为明显,证明抗生素的添加能促进沉积物中汞的甲基化。
[硕士论文] 聂媛媛
水产养殖 大连海洋大学 2017(学位年度)
摘要:2015年7月至2016年6月在安宁河流域共采集硬刺松潘裸鲤(Gymnocypris potanini firmispinatus Wu et Wu,1988)582尾,对其年龄结构、生长特点和繁殖特性等基础生物学进行研究,旨在探索硬刺松潘裸鲤的生物学特性与环境的适应性,并为其资源保护提供科学依据。主要结果如下:
  1.硬刺松潘裸鲤耳石、脊椎骨和鳃盖骨均呈现出宽带和窄带交替相间排列的年轮特征。耳石的年轮形成于每年的3~4月份。三种年龄材料中,耳石的年轮最为清晰,是最佳的年龄材料,其次为脊椎骨,鳃盖骨最差。
  2.硬刺松潘裸鲤雌性样本的体长范围为47mm~207mm,体重范围为1.7g~148.17g,年龄组成范围为1龄~13龄;雄性样本的体长范围为45mm~137mm,体重范围为1.48g~41.58g,年龄组成范围为1龄~9龄;雌雄不辨样本的体长范围为23mm~69mm,体重范围为0.16g~4.88g,年龄组成范围为1龄~2龄。体长和体重的关系式为:W=2.01×10-5SL2.955(R2=0.9738,n=582)。von Bertalanffy生长方程为:雌性:Lt=258.0[1-e-0.105(t+1.058)], Wt=268.9[1-e-0.105(t+1.058)]2.955;雄性Lt=188.0[1-e-0.102(t+3.494)],Wt=105.5[1-e-0.102(t+3.494)]2.955。硬刺松潘裸鲤的雌雄鱼表观生长指数?分别为3.84和3.56。硬刺松潘裸鲤雌雄鱼的拐点年龄分别为9.26龄和7.13龄。
  3.硬刺松潘裸鲤的雌雄性比(♀:♂)为0.97:1,与1:1不存在显著性差异。估算的硬刺松潘裸鲤雌鱼的初次性成熟体长和年龄分别为119.24mm和6.79龄;雄鱼的初次性成熟体长和年龄分别为69.81mm和2.51龄。从不同月份不同性腺发育期所占比例,以及性体指数和卵径分布的周年变化,可以看出,硬刺松潘裸鲤卵巢一年成熟一次,属于同步产卵类型,繁殖高峰期为每年的3~4月份。绝对繁殖力550~3257粒,平均值1284±556粒;相对繁殖力16~62粒/克,平均值37±14粒/克。绝对繁殖力与体长和体重均呈幂函数相关关系,与卵巢重呈二元多项式相关关系,与年龄则无显著性相关关系。
[博士论文] 赵君
水产品加工及贮藏 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,我国鲍鱼养殖规模不断扩大,产量逐年递增,鲍鱼加工业发展迅速。在加工过程中,产生了大量的低值副产物,如鲍鱼脏器、鲍鱼壳等,其中脏器约占鲍鱼体重的20~30%,在加工过程中多数被直接丢弃,不仅造成了资源浪费,还带来环境污染。鲍鱼脏器中生殖腺所占比例很大,富含蛋白质、多糖等功能成分,对其进行有效利用十分必要。
  本文以皱纹盘鲍生殖腺(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,通过生物酶法获得生殖腺中的多糖和多肽,对其进行构效关系方面的研究。主要研究内容及结果如下:
  (1)采用碱性蛋白酶/胃蛋白酶复合水解技术及离子交换、凝胶排阻柱层析技术对皱纹盘鲍生殖腺多糖进行提取及分离纯化,并对多糖组分进行化学组成对比分析。结果表明,皱纹盘鲍生殖腺粗多糖(Abalone GonadPolysaccharides,AGP)经分离纯化得到三个均一的多糖组分,分别命名为AGP-31、AGP-32和AGP-33,分子量分别为37.8、32.2和27.5 kDa。三个组分均为非糖胺聚糖类的硫酸化多糖,主要化学组成及含量为:蛋白质0.68~1.04%,中性糖53.10~58.82%,硫酸基8.30~9.48%,糖醛酸17.02~18.26%。其中,AGP-32的中性糖含量显著高于另外两个组分,糖醛酸含量显著低于另外两个组分,而AGP-33的硫酸基含量显著高于另外两个组分(p<0.05)。三个多糖组分均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖8种单糖组成。
  (2)采用部分酸水解、甲基化、红外光谱及核磁共振波谱分析确定皱纹盘鲍生殖腺多糖AGP-33的主链结构。结果表明,对AGP-33进行部分酸水解后得到皱纹盘鲍生殖腺多糖的主链部分BAGP-33,经高效液相色谱法检测为均一多糖,分子量为17.0kDa。主链结构中只包含甘露糖、葡萄糖和半乳糖,比例为1∶1∶3,主要采取三种连接方式,即1→3连接,1→4连接和1→6连接。经综合分析得出,皱纹盘鲍生殖腺多糖AGP-33的主链核心结构为[→4)-α-Galp-(1→6)-α-Glcp-(1→]n。
  (3)采用体外实验研究皱纹盘鲍生殖腺多糖的促胆囊收缩素(CCK)释放活性和抗凝血活性。以小鼠肠道内分泌肿瘤细胞STC-1为工具细胞,评价皱纹盘鲍生殖腺多糖促进CCK释放活性,并对主要信号通路进行初步研究。结果表明,在浓度达到2mg/mL以上时,三种皱纹盘鲍生殖腺多糖均可显著诱导STC-1细胞释放CCK(p<0.05)。Ca2+/钙调蛋白/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM/CaMKⅡ)、环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-p38这3条信号通路都参与了AGP-32诱导的CCK释放。通过体外抗凝血试验对皱纹盘鲍生殖腺多糖的抗凝血活性进行评价。结果表明,三种多糖在浓度为25μg/mL以上时,均具有显著的抗凝血活性(p<0.01),且均通过内源性凝血途径和抑制血浆纤维蛋白原酶来发挥抗凝血作用。浓度为50μg/mL时,AGP-33及其主链部分(BAGP-33)、脱硫产物(AGP-33-deS)中AGP-33的抗凝血活性最强,表明分子量、硫酸基含量及取代位点对多糖组分的抗凝血活性均有一定影响。
  (4)以中性蛋白酶为工具酶,对皱纹盘鲍雄性生殖腺(Abalone MaleGonad,AMG)脱脂粉和雌性生殖腺(Abalone Female Gonad,AFG)脱脂粉进行酶解,考察水解效果。结果表明:雌、雄生殖腺冻干粉经丙酮脱脂后,蛋白含量分别达到50.46±0.53%和58.44±0.44%。中性蛋白酶对雌、雄皱纹盘鲍生殖腺酶解效果均较好,且对雌性生殖腺的水解效果优于雄性。酶解3h后,肽得率分别为51.20%和44.56%,水解度分别为37.12%和35.78%。雌性生殖腺酶解物(Abalone Female Gonad Hydrolysates,AMGHs)中分子量在3kDa以下的组分占酶解物的90%以上。氨基酸组分分析表明,雌、雄皱纹盘鲍生殖腺氨基酸种类齐全,必需氨基酸和呈味氨基酸约占总氨基酸的77%以上,是制备生物活性肽的良好来源。
  (5)针对水解过程中皱纹盘鲍雄性生殖腺酶解物(Abalone Male GonadHydrolysates,AMGHs)呈凝胶状的现象,对其功能特性进行进一步研究。结果表明,水解过程中AMGHs的弹性模量(G')均大于黏性模量(G"),表明AMGHs是以弹性为主的体系。酶解物的凝胶性随着酶解时间的延长而增强,呈现明显的剪切稀化现象,为非牛顿流体中的假塑性流体。水解后,AMGHs的理化特性同AMG相比有所改善。酶解50min后,溶解性显著提高,在pH值2~10范围内,氮溶指数达65%以上。持水性和持油性显著提高(p<0.05)。起泡性、泡沫稳定性及表面疏水性随着水解度增大先显著增加,50min后变化不大。同时,AMGHs的乳化性随水解度增大而降低。
  (6)以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶水解皱纹盘鲍雌性生殖腺脱脂粉制备酶解物,并利用凝胶柱层析及ESI-QTOF-MS/MS质谱技术对皱纹盘鲍雌性生殖腺抗氧化肽进行分离鉴定。结果表明,中性蛋白酶对皱纹盘鲍雌性生殖腺酶解效果较好,1 kDa以下的组分占酶解物的65%以上,其中富含与抗氧化活性相关的氨基酸。对其进一步分离纯化得到5个抗氧化组分,其中组分4(F4)的抗氧化活性最高,对F4进行质谱分析,鉴定出一个序列为His-Gly-Asp-Gly-Trp-Trp-Gln的七肽(P1)。P1对DPPH和羟基自由基均有明显清除能力,其半抑制率浓度分别为6.50mmol/L和7.48mmol/L。
[硕士论文] 徐乐
渔业 上海海洋大学 2017(学位年度)
摘要:海带是一种重要的大型海洋经济藻类,具有富集碘元素的生物学特性,是生物界中重要的碘存储器之一,其吸收、储存与释放过程是碘生物地球化学循环的重要组成部分。海带中碘积累的主要形态是碘化物,它参与藻体的免疫反应,可以有效清除体内的活性氧(ROS),所以,海带中的碘是一种非常有效的无机抗氧化剂。在逆境条件的刺激下,藻体中的碘会释放,在海带叶片表面以及质外体,碘化物可以和体内产生的氧化剂或者空气中的臭氧反应,从而导致大量的分子碘释放到体表。分子碘随后会被臭氧 O3氧化成高吸湿性的碘氧化物,逐步形成云凝集核,从而影响 O3的含量。由此可见,海带对碘元素的生物地球化学循环起到不可或缺的作用。另外,在海带的碘代谢过程中有一种关键酶—钒依赖型卤代过氧化物酶(vanadium-dependent haloperoxidase,vHPOs),在催化卤素离子与过氧化氢反应生成卤素的氧化形态的过程中发挥着重要的催化作用。此外, vHPOs还可能参与调控海带游孢子体和配子体附着发育及细胞壁增厚机制。因此,研究海带中的碘代谢机制具有一定的可行性和较高的研究价值。
  受人类活动与全球气候变化的双重影响,大气中二氧化碳(CO2)排放量持续增加,造成温室效应,引起了全球变暖。海洋作为一个天然的CO2储存库,吸收了人类排放CO2总量的约30%,又引起海洋酸化现象。海洋系统在碘元素的生物地球化学循环中是重要的组成部分,而海带作为海洋中重要的碘储存器,全球气候变化所引起的海洋酸化及温度升高可能会影响海带中碘元素的含量,从而影响人类食用碘的含量。另外,低潮状态下的海带会将碘释放到空气中,而我国又是世界上海带栽培面积和养殖产量最大的国家,主要养殖品种为日本真海带(Saccharina japonica),由海洋酸化引起的海带中碘含量的改变会影响碘的生物地球化学循环。由于海带中碘含量随气候变化会对人类健康及碘的生物地球化学循环两方面均有重要影响,本研究从实验生态学和分子生物学两方面探究海带(S. japonica)中碘代谢对气候变化的应答与调控机制。首先,我们通过设置不同的温度及酸化梯度,探究海带(S. japonica)对海水温度升高和酸化的应答;其次,我们对海带中碘的抗氧化机制进行了研究;最后由于 vHPOs在海带碘代谢中重要的催化作用,我们在海带(S. japonica)全基因组测序的基础上,对其中的vHPOs基因家族进行鉴定和结构功能分析。本文的主要研究结果如下:
  1)采用单因子实验,分别研究温度和酸化诱导对海带碘代谢的影响。实验结果表明,温度变化和酸化诱导均对海带中碘含量有显著影响,在实验温度5℃,10℃,15℃,20℃,23℃范围内,海带中碘含量呈现出先升高后下降的趋势,在15℃取得最大值;酸化实验结果表明,在海水pCO2(二氧化碳分压)(400μatm,700μatm,1000μatm,1500μatm,2000μatm)范围内,海带中碘含量也呈现先升高后下降的趋势,在1000μatm取得最大值,且酸化培养对海带碘吸收具有促进作用。此外,15℃和20℃与酸化耦合在一定程度上对海带中的碘含量具有促进作用。在海区中开展的中试酸化实验也验证了海洋酸化条件下海带的个体大小以及总碘含量明显高于正常条件下的海带,但总体上随着海带的生长其碘含量逐渐下降。另外,本研究通过对海带中无机形态碘的测定发现,碘离子的变化趋势与总碘的变化趋势一致,而碘酸根离子不在检测限度内。最后,通过在海带的培养体系中添加100μg/mL的低聚古罗糖醛酸,发现在3h时海带中碘释放速率达到最大。结果显示当海带在氧化应激状态时,体内碘离子大量释放与活性氧反应来消除活性氧,起到了抗氧化作用。
  2)通过生物信息学方法在S. japonica基因组中检索鉴定出75个vHPO基因,其中58个钒依赖型碘过氧化物酶(vanadium-dependent iodoperoxidase, vIPO),17个钒依赖型溴过氧化物酶(vanadium-dependent bromoperoxidase, vBPO)。通过与其他真核和原核生物的vHPOs全长蛋白质序列构建系统进化树,发现所有的vHPOs蛋白质被分为三个不同的亚家族:钒依赖型氯过氧化物酶(vanadium-dependent chloroperoxidase, vCPO)、vBPOs和vIPOs。通过进一步分析进化树拓扑结构发现海洋藻类中的vHPO起源于真菌的vCPO,其中vBPO在红藻和褐藻中独立进化,海带中vIPO由褐藻中的vBPO祖先进化而来。
  3)通过对海带(S. japonica)雌雄配子体、小孢子体及成熟孢子体不同部位的转录组数据分析发现,vHPOs在海带不同世代及组织中具有明显的表达特异性。在海带不同世代中,雌、雄配子体中表达的vHPO的数目最多,其次是小孢子体世代,最后是成熟孢子体。在成熟孢子体的不同组织中,梢部和根茎表达的vHPO数目最多。另外,为了从分子生物学水平上揭示胁迫条件下vHPOs基因表达量的变化,我们对高温及CO2充气培养3h下S. japonica的荧光定量PCR结果分析发现高温及CO2充气培养条件下各有8个vHPO基因表达量明显增加,推测这些基因在高温及酸化胁迫条件下的海带碘的吸收中发挥重要作用。
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