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[博士论文] 马文涛
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的肝再生是在损伤刺激下肝脏进行的代偿性生长。在这个过程中,肝脏中的固有免疫系统,尤其是Kupffer细胞和NK细胞具有非常重要的调节作用。近年来的研究表明,Kupffer细胞在肝脏损伤时释放的细胞因子TNF-α和IL-6能够激活肝实质细胞内的Stat3信号通路,从而促进肝实质细胞的增殖。此外,Kupffer细胞也能够通过激活肝脏前体细胞促进肝再生。在另一方面,NK细胞对肝再生具有很强的抑制作用。NK细胞分泌的IFN-γ通过活化肝实质细胞的Stat1并因此抑制Stat3信号通路,从而抑制肝实质细胞的增殖。近期的一项研究表明,NK细胞是肝再生过程中最为重要的IFN-γ来源;在小鼠肝再生过程中,NK细胞上的一种共抑制性受体TIGIT的缺失将引起NK细胞的过度活化,从而抑制肝再生的进行。
  PTEN是一种重要的肿瘤抑制蛋白。在多种类型肿瘤的发生过程中,Pten基因的突变都能被检测到。PTEN可以负向调节维持细胞存活及增殖的PI3K-Akt信号通路,从而抑制多种细胞的增殖。另外,PTEN对免疫细胞的活化同样具有重要的调节作用。一项有关小鼠腹腔巨噬细胞的研究表明,PTEN能够正向调控LPS诱导的TLR4信号通路的活化,进而影响巨噬细胞炎性细胞因子的分泌。除此之外,PTEN也能够通过抑制巨噬细胞M2型极化所需的一些重要基因从而调控腹腔巨噬细胞的极化和炎性细胞因子的分泌。但是,PTEN是否参与了肝再生过程的调控未见报道。
  我们认为,阐明肝脏中Kupffer细胞和NK细胞的相互作用对于研究肝再生的分子学机制具有重要的意义。为了更好地探究肝脏中Kupffer细胞和NK细胞对肝再生的影响,我们主要利用PTEN在髓系细胞中特异性缺失的LysMcre/+PTENf/f小鼠(PTENmKO小鼠)及对照鼠PTENf/f鼠展开研究。我们的研究结果如下:
  正常小鼠肝再生过程中Kupffer细胞的特征。
  我们发现,同以往的研究报道一致,使用氯磷酸盐脂质体清除小鼠肝脏Kupffer细胞后,小鼠肝再生的速度将明显减慢。由于我们使用的Kupffer细胞清除方法同样能清除腹腔里的巨噬细胞,为了排除腹腔巨噬细胞在肝再生中的影响,我们在使用氯磷酸盐脂质体处理小鼠之前对其进行了腹腔清洗处理,该结果同样表明Kupffer细胞的清除抑制了小鼠的肝再生。以上结果表明小鼠肝脏Kupffer细胞在正常的肝再生过程中具有不可或缺的作用。进一步,我们发现将正常小鼠进行2/3肝切除后,Kupffer细胞的数量与对照鼠相比并没有显著的变化,但是 Kupffer细胞内PTEN蛋白的水平有明显的上调,并且伴随着PTEN的上调,Kupffer细胞呈现出显著的M1型极化的特征,这可以通过Kupffer细胞下调CD206以及上调CD11c、MHC-Ⅱ和CD80的表达得以体现。
  髓系细胞PTEN缺失的小鼠肝再生速度明显加快。
  我们利用PTENmKO小鼠及PTENf/f对照鼠进行了进一步的研究。通过PCNA和Ki-67免疫组化染色表征的细胞增殖情况、HE染色显示的细胞有丝分裂指数以及肝脏重量与体重的百分比等分析,我们发现PTENmKO小鼠的肝再生速度比对照鼠明显加快。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞表现为M2型极化的特征,从而对NK细胞的活化能力降低。
  进一步的研究表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞通过激活细胞内的Akt并抑制FoxO1信号通路,使其自身倾向于M2型的极化特征。此外,PTENmKO小鼠肝脏NK细胞的活化程度明显降低,这主要表现为IFN-γ分泌能力的降低以及活化相关分子表达水平的下降。进一步的实验结果表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞降低了其表面与NK细胞活化相关的多种分子的表达,减少了其IL-12的分泌水平,这是这类小鼠肝脏NK细胞活化程度降低的主要原因。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞分泌生长因子的能力增强。
  在2/3 PHx后48 h时,荧光定量PCR分析结果显示,PTENmKO鼠的Kupffer细胞表达更高水平的pdgf, hgf以及osm。这些生长因子通常能活化其下游的Stat3信号通路。与之一致的是,PTENmKO鼠肝脏中Stat3的磷酸化水平明显升高。我们进一步证明了Kupffer细胞对肝实质细胞的这种直接的增殖促进作用,因为PTENmKO鼠Kupffer细胞来源的条件培养液具有更强的促进小鼠肝实质细胞系体外增殖的能力。
  综上所述,PTEN蛋白抑制了Kupffer细胞的M2极化,从而使其更容易活化NK细胞,抑制肝再生的过程。另外,PTEN也能抑制Kupffer细胞分泌多种生长因子。因此,Kupffer细胞中PTEN蛋白的总体作用便抑制了肝再生的进行。考虑到Kupffer细胞的强吞噬能力以及由此开发的Kupffer细胞靶向药物,我们的结果表明,对Kupffer细胞中PTEN表达的干预有望为临床上肝脏部分切除病人的肝脏功能恢复提供新的治疗靶点。
[博士论文] 唐玲
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:肝脏作为天然免疫优势器官,存在高比例的天然免疫细胞,包括NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和Kuffer细胞。我们实验室的研究发现成年小鼠肝脏可根据CD49a和DX5的不同表达将其分为CD49a-DX5+的传统NK细胞(conventionalNK cells, cNKs)和CD49a+DX5-的肝脏驻留NK细胞(liver-resident NK cells,LrNKs)。与cNKs不同,LrNKs不参与外周循环并驻留于肝窦组织中,故将其定义为肝脏驻留NK细胞。LrNKs在胚胎肝脏造血时期及新生小鼠时期就高比例存在于肝脏,随着小鼠的发育成熟比例逐渐降低,直至成年期维持在50%左右。然而关于LrNKs的发育来源还没有研究清楚。在骨髓细胞转输小鼠模型中,骨髓细胞重建出的LrNKs的比例和数量与正常鼠相比显著下降。在长期连体小鼠中也发现,LrNKs依然保持都是宿主本身来源,说明骨髓造血并不是LrNKs的主要来源。
  在小鼠个体发育过程中,胚胎肝脏是HSCs增殖和分化的主要场所,成年期肝脏依然保留有少量HSCs。成年肝脏中的Lineage-(Lin-)造血前体细胞具有分化形成正常数量LrNKs的潜能,这些都暗示LrNKs可能存在独特的肝内发育途径。
  由于LrNKs表达NCR并在发育上依赖IL-15信号,所以一直将其看作NK细胞的一个亚群。最近的研究发现LrNKs和粘膜ILC1s的发育都严格依赖转录因子T-bet而不依赖Eomes,这与cNKs的发育是不一致的。并且LrNKs和粘膜ILC1s发育来源于共同的前体细胞Id2+CHILP(common helper-like progenitors,CHILP)。基于发育上的相似性,很多学者将LrNKs称为辅助样肝脏ILC1s。但是两者在表型、功能和迁移特性方面是否也具有相似性还没有研究清楚。
  针对以上切入点,我们的研究分为以下两个部分:
  Ⅰ.肝脏驻留NK细胞的肝内发育途径研究
  1.成年小鼠肝脏中存在造血干细胞
  通过集落形成实验我们发现成年肝脏单个核细胞能够形成髓系细胞和红系细胞集落。此外,在成年肝脏中存在着一群表型为Lin-Sca-1+c-kit+的细胞,这群细胞具有长期造血重建能力并且可重建受者鼠淋巴系及髓系细胞,说明成年肝脏依然存在HSCs。
  2.成年肝脏中CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+造血祖细胞来源于胚胎肝脏造血成年肝脏仍然保留有造血潜能,并且存在一群CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+(LMS)造血祖细胞,其表型不同于成年骨髓但是类似于胚胎肝脏HSCs。并且在胚胎肝脏和骨髓细胞重建实验中也可以看到,只有胚胎肝脏细胞可以重建出正常比例和绝对数的成年肝脏LMS细胞,而骨髓细胞则不可以。说明成年肝脏LMS细胞是由胚胎肝脏造血来源的。
  3.成年肝脏LMS细胞拥有造血潜能并能发育形成肝脏驻留NK细胞
  通过转输实验我们发现与新生小鼠肝脏LMS细胞类似,成年肝脏LMS细胞具有向各谱系细胞分化的潜能,并且分化形成的细胞主要是CD3+T细胞。LrNKs的发育起源于胚胎肝脏造血时期,并且在胚胎和新生小鼠肝脏中的NK细胞绝大部分都是LrNKs。转输成年肝脏LMS细胞后,在受者小鼠肝脏中可以发育形成LrNKs,而不形成cNKs。成年肝脏LMS细胞的这种造血潜能及向LrNKs发育的能力均与胚胎肝脏造血来源的HSCs保持一致。
  4.成年肝脏CD49a+NKPs特异地分化形成肝脏驻留NK细胞
  成年小鼠肝脏、骨髓和脾脏中都存在NKPs,但是只有成年肝脏中的NKPs高表达CD49a。我们转输成年小鼠肝脏CD49a+NKPs后发现,仅在受者鼠的肝脏中能检测到供者发育来源的NK细胞,在受者脾脏和骨髓中均检测不到,并且在受者肝脏中发育形成的均是CD49a+DX5-LrNKs。
  结论Ⅰ:成年小鼠肝脏依然保留有造血潜能,并且存在少量胚胎肝脏来源的CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+(LMS)造血祖细胞。成年肝脏LMS细胞的造血潜能与胚胎肝脏HSCs类似,都可在肝脏中仅发育形成LrNKs而不产生cNKs,并且向LrNKs的发育过程需经历CD49a+NKPs阶段。因此,我们发现LrNKs存在特殊的肝内发育途径。
  Ⅱ.肝脏驻留NK细胞与粘膜ILC1s对比分析
  1.肝脏驻留NK细胞表型不同于粘膜ILC1 s
  LrNKs的比例和绝对数都显著高于小肠固有层ILC1 s(small intestine laminapropria ILC1 s,siLP ILC1s),但是小肠固有层中ILC的种类更加丰富,存在一定量的ILC2s和ILC3s。对表型的检测我们发现,siLPILC1s表达IL-7Rα和CD27,而LrNKs几乎不表达IL-7Rα,部分表达CD27。在迁移相关受体方面,LrNKs特异的高表达向肝脏归巢的受体CXCR6,而siLP ILC1s特异的高表达向小肠迁移的受体CCR9。
  2.肝脏驻留NK细胞和粘膜ILC1s发育上都依赖转录因子T-bet和NFIL3
  在Tbx21-/-小鼠中,LrNKs和siLP ILC1 s都不存在,说明两者在发育上都严格依赖于转录因子T-bet。在Nfil3-/-小鼠中,LrNKs依然存在,但是绝对数显著降低,而cNKs细胞是缺失的。小肠固有层中的ILC1s,cNKs和NKp46+ILC3s绝对数都减少,这与NFIL3调控ILC共同前体细胞的发育是一致的。
  3.粘膜ILC1s具有组织驻留特性
  CD45.1+与CD45.2+B6小鼠连体实验发现siLP ILC1s和NKp46+ILC3s都不参与外周血液循环,与肝脏CD49a+DX5-NK细胞类似具有组织驻留的特性。
  4.肝脏驻留NK细胞相比于粘膜ILC1s有更高的细胞毒活性
  LrNKs在PMA/Ion刺激下会产生大量杀伤功能相关分子:perforin和Granzyme B,其能力与cNKs相似,显著高于siLP ILC1s。并且LrNKs相对于cNKs和siLPILC1s都高表达杀伤功能相关分子:TRAIL和FasL,说明肝脏驻留NK细胞也可以通过TRAIL和FasL来诱导靶细胞的凋亡。对靶细胞Yac-1的直接杀伤实验也证实LrNKs相比于cNKs具有更高的杀伤能力。
  结论Ⅱ:LrNKs和粘膜ILC1s粘附分子的表达及细胞毒活性方面都存在显著的不同。特别是相比于粘膜ILC1s,LrNKs具有强大的杀伤能力并具有独特的杀伤途径,这也是我们不建议将LrNKs归类为无杀伤能力的ILC1s的重要证据。
[博士论文] 王勇
动物遗传育种与繁殖 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:肝脏的发生和发育是一个受到精密调控的复杂过程。人们利用模式生物的研究已经逐渐了解了肝脏细胞的起源、形态发生及生长发育过程,也鉴定出了一些参与肝脏发育的重要因子。作为一种研究胚胎早期发育理想的模式生物,斑马鱼受到了越来越多研究人员的关注,尤其是结合目前迅速发展的CRISPR-Cas9等技术,使得相关的研究手段更加多样、层次更加深入。
  本课题综合利用遗传学、发育生物学、分子生物学和细胞生物学的研究方法,以斑马鱼为模式生物,系统研究了bms1l基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用。通过ENU化学诱变筛选小肝脏表型的斑马鱼,我们课题组获得了一个bms1l基因突变的斑马鱼品系bms1lsq163。研究显示在bms1lsq163突变体中,bms1l基因第5外显子发生了T到A的碱基突变,从而导致bms1l第154位密码子从亮氨酸(CTG)置换为谷氨酰胺密码(CAG)。相关表型分析发现bms1 lsq163突变体中,包括肝脏、外分泌胰腺和肠道在内的消化器官生长发育受到特异性的阻滞。进一步研究显示,肝脏在早期起始和分化阶段并没有受到影响。为了深入验证bms1l在肝脏发育过程中的重要作用,我们利用CRISPR-Cas9技术对bms1l基因进行敲除,从而获得了另一个品系的突变体bms1lzju1。在该突变体中,bms1l基因第2个外显子上有13个碱基的插入,从而破坏了蛋白的正常编码。由于Bms1l蛋白的完全缺失,bms1lzju1突变体有着更为严重的消化器官生长发育缺陷。我们在bms1 lsq163和bms1lzju1两个等位基因突变体的基础上深入研究了Bms1l在斑马鱼肝脏发育过程中的功能。
  前人在酵母的研究中发现Bmsl是一个核仁蛋白并且能与Rcl1蛋白形成复合物,共同参与核糖体前体RNA(pre-rRNA)的加工剪切。因此,Bms1对18S rRNA的成熟及核糖体生成有重要作用。根据以上研究,我们想了解斑马鱼中的同源基因bms1l是否有这些保守的功能。首先,通过免疫荧光共定位及免疫共沉淀实验,我们发现Bms1l和Rcl1都是核仁蛋白并且能够互作,同时也用人的这两个蛋白进一步验证了该功能的保守性。其次,我们发现bms1lsq163和bms1lzju1突变体中pre-rRNA的加工过程和18S rRNA的生成均受到了影响,说明Bms1l确实在其中行使重要功能。另外,突变体肝脏细胞的核仁由于受到异常的pre-rRNA转录和加工影响,其形态也发生了明显的改变。
  在上述研究过程中,我们发现bms1l突变体核仁中rDNA的转录水平显著上升,这使得与转录方向相反的DNA复制又受到严重阻滞,进而引起了DNA损伤反应。我们详细研究了其中的P53信号通路,结果显示在bms1l突变体中,P53及其异构体的表达水平显著提高,并且受P53调控的下游基因表达也被激活。由于P53的活化能够抑制细胞周期的进行,我们在P53突变的背景下分析了bms1lsq163突变体中消化器官的拯救情况。结果显示该双重突变体能够部分拯救小肝脏和小胰腺的表型。
  接着,我们详细分析了bms1lsq163突变体的肝脏细胞在细胞周期中具体受阻滞的时期。结合细胞周期标志蛋白免疫荧光和Edu掺入实验,我们发现突变体中处于S期DNA复制阶段的肝脏细胞比例显著上升,相应地,G2期至M期的比例显著下调。通过Edu和Brdu不同时间点的双标实验,我们进一步验证了bms1l突变体的肝脏细胞中存在旺盛的DNA复制现象,从而使得肝脏中非整倍体和多倍体细胞的比例上升。
  综合上述在bms1lsq163和bms1lzju1突变体中的研究,我们不仅验证了Bms1l是一个功能保守的蛋白,也发现了Bms1l在斑马鱼肝脏发育过程中有重要作用。此外,关于细胞周期和rDNA转录、复制的研究也让我们更系统、全面地了解突变体中发生的关键事件,为我们下一阶段更深入探索Bms1l的功能和作用机制打下了坚实的基础。
[硕士论文] 袁敏
遗传学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2015(学位年度)
摘要:胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要组成部分,对于维持细胞膜的结构和功能起着关键的作用,其在细胞内物质转运,细胞的分化和胚胎的发育等生理过程中也发挥着重要作用,但细胞内胆固醇水平升高会破坏细胞膜的结构并促进细胞凋亡。此外,血浆胆固醇水平升高会诱发多种疾病,如动脉粥样硬化和冠心病等。研究表明,通过饮食摄入过多的胆固醇是导致高胆固醇血症的主要原因之一,因此,有关胆固醇吸收的研究是目前脂类代谢领域的研究热点。
  SAK-HV蛋白是本实验室前期构建的一种多功能融合蛋白,分子量17KD,其分子结构包含突变的SAK(Staphylokinase,葡激酶)分子、RGD序列以及水蛭素12肽序列,其中SAK分子主要发挥溶解纤维蛋白的作用,RGD序列可以抑制血小板聚集,水蛭素12肽序列则可以抑制凝血酶引起的炎症反应。构建SAK-HV蛋白的最初目的是期望针对溶栓、抗凝和抗炎三方面实现多靶点抗动脉粥样硬化的作用。在药效学研究中我们发现SAK-HV蛋白可以抑制高脂喂养ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展和血管内皮细胞的炎性反应,此外我们惊奇地发现其还可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平,但是其降胆固醇的机制尚不清楚。
  哺乳动物体内胆固醇的代谢包括胆固醇的吸收、合成以及排泄等。小肠是机体胆固醇吸收的主要场所,表达于小肠上皮细胞刷状缘膜的NPC1L1蛋白是参与小肠胆固醇吸收的重要蛋白,NPC1L1蛋白通过其NH2端的一个富含半胱氨酸的氨基端结构域(N-terminal domain,NTD)结合胆固醇,随后通过囊泡内吞的方式进入细胞内从而介导小肠上皮细胞对胆固醇的吸收。研究表明NPC1L1基因敲除小鼠的小肠胆固醇吸收水平降低了70%,而NPC1L1的抑制剂Ezetimibe可以降低高脂喂养的斑马鱼的血浆胆固醇水平。另外表达于小肠上皮细胞刷状缘膜的ABCG5/ABCG8蛋白则可以将小肠吸收的游离胆固醇逆转运至肠腔随粪便排出,研究表明小鼠ABCG8基因的缺失明显升高了小肠对胆固醇和谷固醇的吸收,而小鼠ABCG5和ABCG8过表达则会降低胆固醇和谷固醇的吸收。肝X受体(Liver X receptor,LXR)是一种配体激活的转录因子,属于核受体超家族,其亚型LXRα(Liver X receptor-a)和LXRβ(Liver X receptor-β)在机体脂质代谢中发挥了重要的调节作用。文献报道Caco-2细胞和小鼠小肠中LXRα和LXRβ表达的上调可以降低NPC1L1的表达并上调ABCG5和ABCG8的表达。肝脏是胆固醇合成的主要场所,羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGCR)是胆固醇合成过程中的限速酶,哺乳动物肝脏中的ABCG5/ABCG8蛋白可以促进肝脏胆固醇排泄至胆汁,此外,在人和灵长类动物肝脏中表达的NPC1L1蛋白参与了胆汁中胆固醇的重吸收。
  前期的实验结果提示SAK-HV蛋白可以显著降低高脂喂养的ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平,但其是否通过抑制小肠胆固醇的吸收起作用,这需要我们进一步的研究证实。因此本研究通过动物实验和体外细胞实验研究了SAK-HV蛋白对小肠胆固醇吸收的影响及可能的机制,由于肝脏在胆固醇代谢中的重要作用,我们同时也关注了其对参与肝脏胆固醇合成和排泄的相关基因表达的影响。主要研究内容和结果分为如下两部分:
  1、动物水平研究SAK-HV蛋白对胆固醇吸收的影响及可能的机制:
  前期的实验证实高脂喂养的ApoE-/-小鼠给予SAK-HV蛋白处理后血浆胆固醇水平降低,因此本研究以ApoE-/-小鼠为实验对像,高脂饲料喂养建立高脂动物模型,同时以野生型C57小鼠为对照组,给予正常饲料喂养,高脂饲料喂养一周后检测血脂水平发现高脂喂养的ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平明显高于对照组C57小鼠,而高密度脂蛋白(HDL)则无明显变化,表明高脂模型建立成功。随后按体重将高脂喂养的ApoE-/-小鼠随机分为模型组和二个SAK-HV蛋白给药组(0.125mg/kg给药组、0.5mg/kg给药组),每组12只,给药组小鼠尾静脉注射连续给药14天,模型组小鼠给予同等体积的生理盐水,给药结束后检测血脂水平发现SAK-HV蛋白给药组小鼠血浆TC和TG水平相较于模型组明显降低,但给药组两组之间并无明显差异,LDL和HDL则无显著变化,说明SAK-HV蛋白可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血浆胆固醇水平。随后我们选择0.5mg/kg给药组和模型组ApoE-/-小鼠为研究对象,研究SAK-HV降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血浆胆固醇的机制,qPCR和Westernblot分别检测小肠和肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA和蛋白的表达水平,结果发现给药组小鼠小肠NPC1L1的表达降低、而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表达水平升高,LXRα的表达则有轻度下调。在肝脏中,ABCG5/ABCG8和LXRα/LXRβ的表达水平两组之间未见差异,但给药组HMGCR的表达水平较模型组表达下调。
  2、细胞水平研究SAK-HV蛋白对胆固醇吸收的影响及可能的机制
  为了进一步验证动物实验的结果,我们以Caco-2细胞作为实验对象,在体外研究SAK-HV蛋白对小肠上皮细胞胆固醇吸收的影响,分别给予不同浓度的SAK-HV蛋白刺激24h后,以NBD-胆固醇作为荧光探针检测Caco-2细胞胆固醇吸收水平,结果发现在50μg/ml浓度时Caco-2细胞胆固醇吸收水平明显降低。利用qPCR和Westernblot检测Caco-2细胞胆固醇吸收相关基因mRNA和蛋白的表达水平发现,NPC1L1的表达在100μg/ml时显著下调,而ABCG5和ABCG8分别在20μg/ml和50μg/ml时表达上调,LXRα mRNA和蛋白的表达水平在20μg/ml浓度时表达上调,但LXRβ仅在100μg/ml时表达上调。随后我们以100μg/ml的SAK-HV蛋白刺激Caco-2细胞不同时间研究不同刺激时间对Caco-2细胞胆固醇吸收和相关基因表达的影响,结果显示当100μg/ml的SAK-HV刺激6h时Caco-2细胞胆固醇的吸收水平显著降低,qPCR和Westernblot的检测结果表明NPC1L1在刺激6h时表达下调,ABCG5/ABCG8的蛋白表达水平在刺激3h时上调,LXRα的表达在刺激12h时表达上调,而LXRβ的表达水平在刺激3h时已经上调。
  由于在动物试验中我们发现SAK-HV给药组的高脂喂养的ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇合成限速酶HMGCR的表达降低,为了研究SAK-HV蛋白在体外对肝细胞胆固醇代谢相关基因表达的影响,我们以HepG2细胞为实验对象,以不同浓度SAK-HV蛋白刺激24h,qPCR和Westernblot检测结果显示SAK-HV蛋白对HepG2细胞的NPC1L1、ABCG5/ABCG8、LXRα/β以及HMGCR表达均无影响。
  综上所述我们通过动物实验证实了SAK-HV蛋白可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平,并发现小肠NPC1L1蛋白表达下调,而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表达上调。我们推测SAK-HV蛋白可能通过激活小肠LXRβ的表达,调节其下游靶基因NPC1L1和ABCG5/ABCG8的表达从而抑制小肠胆固醇的吸收,并最终达到降低血浆胆固醇的效果。通过细胞实验我们进一步证实了SAK-HV蛋白可以抑制Caco-2细胞胆固醇的吸收,并揭示了与动物实验相同的机制。因此我们初步得出结论:SAK-HV蛋白可以抑制小肠胆固醇的吸收,其作用机制可能为,SAK-HV蛋白激活转录因子LXRα/β的表达,进而调节小肠NPC1L1和ABCG5/8的表达,最终抑制了小肠胆固醇的吸收。以上的研究结果为SAK-HV蛋白作用机制的阐明和后续的药物研发打下了坚实的基础。
[硕士论文] 董兴川
动物学 山东师范大学 2015(学位年度)
摘要:大鼠束缚-浸水应激(restraint water-immersion stress,RWIS)是一项强大的复合刺激,既能产生包括胃运动机能亢进、胃酸分泌增多等现象的胃机能紊乱,同时也会使大鼠体温下降、情绪狂躁。赵东芹、李颖等发现在RWIS过程中丘脑内背内侧核(MD)、丘脑室旁核(tPVN)、丘脑中央内侧核(CM)三个核团的神经元都有显著的Fos蛋白表达,有Fos表达表明神经元在活动,说明这三个核团都参与了RWIS。李颖使用突触彭体素(synaptophysin,SYN)与突触蛋白I(synapsin I)作为检测神经元突触可塑性的指标,发现RWIS过程中这三个核团的突触可塑性发生了不同程度的上调性改变,进一步验证了这一结论。其中MD作为内脏和躯体活动的整合部位,是否参与了胃的运动机能和分泌机能的调控?如果参与了胃机能的调控作用,又在其中起到什么样的作用?是兴奋性作用还是抑制性作用?这些问题一直未见报道。
  为此,本文对这一问题进行了探讨。实验分为两个部分:
  第一部分,向大鼠右侧MD内微量注射不同剂量的L-谷氨酸钠(L-Glu),观察对胃运动的影响。实验分为五组:一组,向MD内注射生理盐水(0.1μl),作为对照组;二组,向 MD内注射低剂量的L-Glu(1nmol=0.1μl×0.01mol∕L);三组,向 MD内注射中剂量的L-Glu(10nmol=0.1μl×0.1mol∕L);四组,向 MD内注射高剂量的L-Glu(20nmol=0.1μl×0.2mol∕L);五组,为补充组,向 MD注射超高剂量 L-Glu(200nmol=0.1μl×2mol∕L)。
  实验过程为:水合氯醛麻醉大鼠,向胃内插入水囊,水囊连压力换能器,记录胃运动,立体定位MD核团位置(沿颅骨正中线自前囟向后2.9mm,右侧旁开0.8mm,深5.8mm),用玻璃微管微量注射药品。实验过程中通过RM6240生物机能实验系统全程记录胃运动,比较核团药物注射前、后胃运动的变化,同时记录大鼠的呼吸和心电活动。实验完成后,行心脏灌流,脑组织固定,冰冻切片后中性红染色进行注药位点鉴定。
  对胃运动机能的评估,分别分析药物注射前、后各15min内胃收缩波的频率、时程、幅度以及胃运动指数,以5min作为一个时间单位统计胃运动上述各项指标。分析发现,向大鼠MD注射生理盐水或四种不同剂量的L-Glu后15min,与注药前相比胃运动的总幅度、总时程和每分胃运动指数均无显著性变化。表明1-200 nmol剂量范围的L-Glu注入大鼠MD对胃运动无显著性影响。
  第二部分,向右侧MD微量注射不同剂量的L-Glu,观察对胃酸分泌的影响。实验分为四组:一组,向MD注射0.1μl生理盐水,作为对照组;二组,向MD内注射低剂量的L-Glu(1nmol=0.1μl×0.01mol/L);三组,向 MD内注射中剂量的L-Glu(10nmol=0.1μl×0.1mol/L);四组,向MD内注射高剂量的L-Glu(20nmol=0.1μl×0.2mol/L)。
  实验过程为:水合氯醛麻醉大鼠,食管插管向胃内灌流37℃生理盐水并在幽门下2cm处插管引出灌流液,立体定位MD(前囟沿正中线向后2.9mm,右侧旁开0.8mm,深5.8mm),玻璃毛细管微量注射药品。实验过程中收集并测定灌流液的体积以及 pH值,以此计算出胃内H+的分泌量。以20min作为一个时间单位统计H+的分泌量。实验完成后,行心脏灌流,脑组织固定,冰冻切片后中性红染色进行注药位点鉴定。
  分析发现,向大鼠MD注射生理盐水或低、中剂量的L-Glu后,1h内胃酸分泌没有显著变化,而高剂量却产生明显的抑制效应。表明低、中剂量的L-Glu注入大鼠MD对胃酸分泌没有显著性影响,而高剂量L-Glu显著抑制胃酸分泌。
[博士论文] 卢晓昭
生物学;生物化学与分子生物学 第四军医大学 2014(学位年度)
摘要:肝脏在饥饿状态下的能量平衡调节中发挥了关键作用。饥饿早期,肝脏糖原迅速分解,维持正常的血糖浓度,同时,肝脏的糖异生也开始启动,一些非糖物质经肝脏转化后生成葡萄糖,入血后维持血糖浓度和提供能量。随着饥饿时间的延长,脂肪组织分解,提供甘油和脂肪酸。甘油可以作为糖异生的原料,而脂肪酸能被进一步氧化,为全身能量供应提供支持。肝脏在进行脂肪酸氧化过程中生成酮体,酮体入血后运送到全身多个组织器官为细胞提供能量。因此,肝脏在饥饿的能量平衡中发挥了核心作用,而这些能量平衡调控的深层次机制涉及到多种错综复杂的分子信号。换句话说,饥饿状态下,糖原分解、糖异生、脂肪酸氧化、酮体生成等供能效应,其本质是细胞分子信号通路在饥饿环境下的适应性调控过程。许多病理条件下,如糖尿病、脂肪肝等疾病,肝脏能量平衡相关信号转导发生障碍,异常的分子调控导致了疾病的发生、发展。为此,深入研究肝脏代谢分子机制,可以丰富分子代谢理论,同时,为疾病的诊治提供新的思路。
  为适应环境变化,信号分子在表观遗传、转录、转录后、翻译、翻译后等水平的多重调节下发生自身表达和活性的改变,以便适应环境变化。饥饿时,肝脏中NAD依赖的蛋白去乙酰化酶Sirt1通过翻译后修饰(去乙酰化)促进PGC1α、FOXO1等代谢相关转录因子/转录共调节因子的活性,而活化的转录因子/转录共调节因子通过转录调节机制增加下游代谢相关酶的表达,促进长期饥饿下肝脏的糖异生和脂肪酸氧化,调节血糖的平衡和能量供应。可见,饥饿环境下,肝脏细胞中的代谢相关信号分子受到了不同层面的多重调控。
  RNA结合蛋白介导的转录后调控在肝脏代谢中少有研究。STAR家族成员QKI(Quaking)是一个RNA结合蛋白,由qkI基因编码,可产生多个异构体,在全身多种组织细胞中表达。其中,QKI5主要定位于胞核,但也能穿梭到胞浆,而 QKI6和QKI7主要分布在胞浆中。通过与mRNA的3'UTR的特异性识别元件(QRE)结合,QKI在调节mRNA的胞浆/胞核定位、稳定性、翻译效率等方面发挥了关键作用。在神经系统,QKI能增加MBP的表达,从而增加髓鞘的形成。在结肠癌中,QKI通过影响β-catenin的亚细胞定位,发挥抑癌基因效应。我们发现,QKI同样在肝脏表达,而有关其在肝脏中的功能尚没有研究报道。
  【目的】
  (1)在体内和体外模型中,查看 QKI在肝脏饥饿能量平衡过程中的表达变化,分析QKI与糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成的相关性;
  (2)在体内和体外模型中,探讨QKI是否受乙酰化修饰调节,并阐明QKI的乙酰化修饰在饥饿肝脏能量代谢中的作用;
  (3)分析 QKI乙酰化修饰的上游调节分子机制,探讨上游调节分子如何影响QKI,并在饥饿肝脏代谢中发挥效应;
  (4)分析受乙酰化修饰调节的QKI通过调节哪些下游关键分子,从而影响肝脏饥饿能量代谢,并进一步阐明QKI调节下游分子的深层次机制。
  【方法和结果】
  (1)在小鼠饥饿的肝脏组织、低糖和Forskolin/dexamethasone处理的HepG2细胞中,利用免疫组化、qRT-PCR和Western-blot检测QKI的表达变化。结果发现,肝脏中,QKI5是主要表达的异构体。与对照相比,QKI5的表达呈现升高的趋势。
  (2)在上述饥饿模型中,使用乙酰化抗体进行免疫共沉淀(IP),Western-blot检测QKI5乙酰化水平;利用生物信息学技术预测QKI5可能的乙酰化修饰位点;构建乙酰化位点突变的QKI5表达载体,探讨乙酰化修饰的改变对饥饿肝脏能量代谢的影响。结果表明,QKI5在饥饿的肝脏中表现为去乙酰化状态,而使用突变载体干预发现,QKI5的KH domain区赖氨酸突变为精氨酸(MTR5,乙酰化位点缺失)时,促进肝脏糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成;突变为谷氨酰胺(MTQ5,相当于乙酰化的氨基酸),则抑制糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成。
  (3)使用去乙酰化酶Sirt1的抑制剂和激活剂,IP试验检测肝脏细胞QKI5的乙酰化水平;在细胞中干涉Sirt1的表达,检测QKI5的乙酰化水平;在Sirt1敲除的小鼠肝脏中查看QKI5的乙酰化水平。结果表明,在肝细胞中抑制Sirt1的活性,QKI5乙酰化水平增加,促进Sirt1活化,则导致QKI5去乙酰化;在干涉Sirt1表达的肝细胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝脏组织中,QKI的乙酰化水平都是升高的。
  (4)在肝脏细胞中干涉QKI5、过表达QKI5、MTR5、MTQ5,结合饥饿模型刺激,qRT-PCR检测肝脏代谢相关的关键分子的表达。结果发现,干涉QKI5或过表达MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表达,而过表达QKI5或MTR5则促进FOXO1和PPARα表达。通过RNA-IP实验发现,QKI5与FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。
  (5)通过报告系统实验进一步验证QKI5、MTR5和MTQ5对FOXO1和PPARα的转录后调节机制。结果表明,过表达QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα报告基因的萤光素酶活性,而过表达MTQ5则抑制其活性。
  【结论】
  RNA结合蛋白QKI在饥饿肝脏能量代谢中发挥了重要作用。饥饿时,肝脏Sirt1促进了QKI的去乙酰化,去乙酰化的QKI通过转录后调节机制促进转录因子FOXO1和PPARα的表达,进而促进糖异生、脂肪酸氧化及酮体生成,从而在肝脏能量平衡中发挥作用。
[硕士论文] 蔡乃旋
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2014(学位年度)
摘要:肝脏是具有极强再生能力的器官,研究并阐明再生的机制可为肝移植与肝损伤相关的疾病治疗提供理论依据。质膜含有被命名为“脂筏(lipid rafts)”和“质膜微囊(Caveolae)”的微区,具有参与胞吞胞饮、信号转导、运输胆固醇等重要功能。该再生过程中,质膜微区脂筏蛋白质受到内部调控的影响会发生改变,捕获脂筏微区信号蛋白质分布的变化对于理解和阐明肝再生过程中信号通路途径等有着重要意义。本研究应用成熟的大鼠2/3肝切除模型结合蔗糖密度梯度离心法,提取假手术组(再生0h)与肝再生组(再生48h)大鼠肝脏细胞质膜,并进一步纯化获得质膜微区蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离以及ESI-Q-TOF质谱鉴定,对获得的微区蛋白质进行差异分析,结果显示,有40个微区蛋白质差异表达,其中17个蛋白质表达量上调,23个蛋白质表达量下调。生物信息学分析表明,所鉴定到的蛋白质主要参与细胞增殖、程序性死亡、细胞凋亡等调控,同时涉及到了与肝再生密切相关的血管生成等信号通路。
  脂筏标记蛋白1(Flotillin-1)是一个已知的脂筏微区特异性蛋白质,可作为生物标志物对复杂样本进行验证。本文通过选择Flotillin-1蛋白中两段特异性氨基酸序列合成标准肽段,并对其进行18O标记,验证质膜微区蛋白质肝再生48h组相应蛋白。该方法利用合成的标准肽段序列明确的特点,结合MRM技术(质谱多反应监测技术)对质谱结果进行分析。二级质谱图解析后的结果表明合成肽段序列能正常碎裂和鉴定。经18O标记后的合成肽段与复杂样本(质膜微区蛋白质48h组)混合,得到相差4Da质谱峰,从而可以验证复杂样本中的Flotillin-1蛋白。
  本研究为微区蛋白质的研究提供了方法上的参考以及相关基础数据,基于质谱技术对目标蛋白的验证为蛋白质验证方法提供了新思路,并为后续建立蛋白质绝对定量模型提供线索。
[博士论文] 李妍
生理学 山东大学 2014(学位年度)
摘要:第一部分:γ-氨基丁酸能信号通路在肠上皮表达及对小肠液分泌的调节
  目的:
  γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质之一,其在大脑和脊髓分布广泛,参与突触后神经元的快速抑制效应。在生理条件下,GABA由神经元内谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸形成。根据分子量的不同,GAD可分为两种,分别为:GAD65(65kDa)和GAD67(67kDa)。GAD65主要分布在神经元轴突末梢内的囊泡膜上,参与囊泡释放的GABA的合成;GAD67则在神经元胞体内散在分布,其合成的GABA释放后与突触外的GABA受体结合发挥作用。神经元轴突末梢的GABA释放后快速激活突触后膜上的GABAA(γ-氨基丁酸A型)受体门控的氯离子通道,引起氯离子向细胞内流动,使突触后神经元细胞膜发生超极化,从而抑制神经元的兴奋性。GABA、GABA受体及其代谢酶等分子统称为GABA信号系统(GABAergic signal system)。除中枢神经系统之外,GABA能信号系统在外周组织也广泛表达,如肺、肝脏、脾、生殖系统等。GABAA受体作为氯离子通道,在肺上皮细胞腔面侧表达,并且被证实通过氯离子跨膜向细胞外转运调节气管和支气管电解质和粘液的分泌。氯离子向肠腔内的跨膜转运是肠道液体分泌的原动力,肠道内氯离子的聚集为水、钠向肠道转运提供渗透压和电化学驱动力基础。有报道称GABA能信号系统在胃癌和结肠癌细胞内高水平表达,但是其在正常消化道各部分的表达和生理作用尚不十分清楚。我们推测GABA能信号系统可能在肠粘膜上皮表达,并且有可能参与肠道液体分泌。因此本研究的目的是观察GABA能信号系统是否在小肠组织表达,尤其是在参与液体分泌的上皮细胞上的表达情况;探讨GABA能信号系统在肠粘膜上皮表达的生理意义。
  方法:
  RT-PCR(反转录聚合酶链反应)
  无菌条件下,将IEC-18(a cell line derived from the ileum of rat intestine)细胞种植于直径为10cm的圆形培养皿中;待细胞浓度增殖达到90%以上时,用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗细胞三次,加入Trizol试剂提取细胞RNA。
  健康成年雄性Wistar大鼠脱颈牺牲后,小心取出大脑组织,用4℃预冷的PBS冲洗3次,剥离出新鲜大脑皮质,剪碎后,加入Trizol提取组织RNA。按照反转录试剂盒的说明,提取细胞和组织的cDNA;然后用GABAA受体各亚单位和GAD65/67的引物通过PCR扩增得到相应的DNA。再用DNA凝胶电泳观察各目的带表达情况。
  免疫组织化学
  石蜡切片染色步骤:将新鲜动物组织用4%多聚甲醛(PFA)固定液浸泡24小时后,将组织脱水并用石蜡包埋后切片(组织厚度:4-5μm),依次进行脱蜡、水化和抗原修复处理。用10%与二抗来源相同的血清室温条件下封闭切片1小时后,加入一抗,4℃环境下孵育过夜。PBS冲洗切片3次,每次5分钟,加入荧光标记的二抗室温避光孵育1小时。PBS冲洗3次,每次5分钟,75%甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察拍片。
  细胞免疫染色步骤:将IEC-18细胞种植在10%多聚赖氨酸(PDL)包被的盖玻片上,培养48小时,待细胞贴壁良好后,室温条件下,用4%多聚甲醛迅速固定10分钟,PBS冲洗三次,每次5分钟,其余步骤同石蜡切片染色。
  Western Blot
  将新鲜组织或细胞匀浆后,4℃离心(12000g)10分钟,取离心后的上清液进行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)下层胶和5%的上层分离胶电泳,湿转方法将蛋白转移至孔径为0.45微米的PVDF(Polyvinylidene Fluoride)膜上,5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1小时,加入一抗覆盖PVDF膜,4℃孵育过夜。用1倍的TTBS冲洗PVDF膜3次,每次10分钟。室温下加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1小时。用1倍TTBS冲洗3次,每次10分钟,ECL显影。
  膜片钳记录实验
  将IEC-18细胞种植在10%多聚赖氨酸包被的盖玻片上,24小时后待细胞贴壁,开始全细胞记录。记录时用正常细胞外液(155mMNaCl、1.3mMCaCl2、5.4mMKCl、25mMHEPES和33mM葡萄糖(pH7.4,渗透压315mosmol/kgH2O))常温循环灌流细胞,用700B放大器进行记录。记录电极内液为155mM KCl、15mM KOH、10mMHEPES、2mM MgCl2、1mM CaCl2、10mMEGTA和2mM Tetraethylammonium(pH 7.35,渗透压315 mosmol/kgH2O)。电压钳记录时,将细胞膜电位钳制在-60mV。信号采集后用低通滤波器(1-2kH)进行滤波处理。
  在体小肠液分泌实验
  成年雄性BALB/c小鼠,体重在25-30克之间,实验前禁食,自由饮水。用2%戊巴比妥钠(45-50mg/kg)腹腔注射麻醉动物,固定四肢和头部,在恒温条件下(36℃-38℃)行开腹手术。在距离盲肠1-2cm处结扎回肠,沿向心端方向量取2cm回肠进行结扎,使之形成长约2cm的回肠襻,用直径为0.33mm的胰岛注射器向肠襻内注射100μl的生理盐水或药物,确保无渗漏后依次关闭腹腔各层。待动物苏醒后给予鼠粮和饮水。5小时后,脱颈牺牲小鼠,取出回肠襻,量取回肠襻的长度和称取去除肠液前后的肠襻重量,进行统计分析。
  统计分析
  小肠液分泌试验中,用去除肠液前后重量差除以回肠襻的长度(g/cm)作为观察指标,比较对照组和处理组之间有无统计学差异。
  所有数据采用均数±标准误(Mean±SEM)表示,用单因素方差分析进行统计学处理,以P<0.05作为显著性差异界值。
  实验结果
  1、RT-PCR结果显示,小肠上皮细胞内表达GABA的合成酶谷氨酸脱羧酶65和67(GAD65/67)以及GABAA受体各亚单位;并且,在大鼠、小鼠的小肠以及小肠上皮细胞株等组织细胞表达GABAA受体β2、π亚单位以及GAD65/67蛋白。
  2、免疫荧光染色结果显示GABA和GAD65/67在小肠上皮细胞胞浆内表达,GABAA受体β2/β3和π单位分别在IEC-18细胞膜和小鼠、胎猪的小肠绒毛上皮细胞腔面侧表达。
  3、人的回肠隐窝和绒毛上皮细胞内也表达谷氨酸脱羧酶65/67和GABAA受体π亚单位。
  4、膜片钳全细胞记录显示,小肠上皮IEC-18细胞,其膜电位在-37±8mV;在约36%的细胞上记录到GABA诱导的内向电流,GABAA受体特异性激动剂—muscimol可模拟上述反应。电流钳记录结果显示muscimol导致上皮细胞膜去极化。
  5、小鼠回肠襻液体分泌实验表明,GABA(100μM)和muscimol(10μM)均促进小肠液体的分泌,这种促分泌作用不能被TTX(1μM,河豚毒素)阻断;而GABAA受体特异性阻断剂—Gabazine(100μM)则明显降低GABA引起的小肠液分泌量。
  结论:
  1,GABA能信号系统在小鼠、大鼠、猪和人的小肠上皮细胞功能性表达
  2,GABA可通过GABAA受体参与小肠液体分泌。
  第二部分:γ-氨基丁酸能信号通路在腹泻发生中的作用及其机制
  目的:
  腹泻是临床上常见的消化系统症状,病因和发病机制多样,但大多数是由于病毒或细菌毒素侵犯肠道黏膜,破环肠道结构和肠道上皮细胞正常的分泌和吸收,导致肠道组织通透性增加和上皮细胞电解质和粘液分泌增多,引起腹泻。由于小肠上皮细胞腔面膜上的氯离子跨膜转运是肠道水、钠、钾、碳酸氢根等物质分泌的原动力,很多腹泻的发生机制都离不开肠道上皮细胞膜上氯离子通道的参与,如CFTR和CaCC两种氯离子通道与霍乱毒素和旅行者腹泻的发生有直接关系。因此,对肠上皮细胞上氯离子通道的研究以及开发通道特异性的药物为临床治疗腹泻提供重要的理论基础。我们发现GABA能信号系统在小肠上皮细胞表达,外源性GABAA受体激动剂引起小肠液的大量分泌。因此我们推测,GABAA受体作为氯离子通道受体,有可能参与腹泻的发生过程。本部分我们对GABA能信号系统在食物过敏原诱导的腹泻过程中的作用及其机制进行了详细探讨。
  方法:
  免疫组织化学同第一部分
  食物致敏原诱导的腹泻动物模型的建立
  健康成年雄性BALB/c小鼠(20-25g),随机分为对照组、OVA(50mg,Ovalbumin,卵白蛋白)诱导模型组、OVA诱导和Gabazine(100μM)处理组、OVA诱导和Picrotoxin(100μM)处理组(非特异性GABAA受体阻断剂)。实验前禁食,自由饮水。所有动物在处理第一天均用硫酸铝佐剂稀释的OVA(1mg)腹腔内注射,致敏全部小鼠。从第七天开始,对照组给予生理盐水250μl灌胃,模型组和处理组给予OVA和相应药物溶于生理盐水中250μl灌胃,1小时后观察并记录动物粪便性状和排便反应。隔天灌胃一次,共灌胃10次后牺牲动物,收集动物回肠进行免疫组织化学染色和Westernblot检测。
  Western Blot
  动物组织蛋白获取和检测步骤同第一部分。
  IL-13处理后的IEC-18细胞,预冷的PBS冲洗3次,用裂解液破碎和收集细胞,4℃离心,取离心上清液蛋白定量,加入上样缓冲液后变性蛋白,进行SDS-PAGE电泳。湿转方法将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1小时,TTBS冲洗3次,每次10分钟,加入一抗,4℃环境下孵育过夜。TTBS冲洗3次,每次10分钟,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温条件下孵育1小时,TTBS洗3次后,ECL显影。
  统计分析
  动物模型指标观察:灌胃后1小时观察动物粪便稀薄、透明、不成型视为腹泻模型成功,计数每次灌胃后模型成功动物的个数,依次累计,直至牺牲动物。以每次灌胃后各组动物腹泻发生率作为统计指标作图分析。
  结果:
  1,OVA诱导的过敏性动物腹泻模型在第7次灌胃时达到100%成功;对照组动物无动物发生腹泻;用Gabazine和Picrotoxin处理的两组动物,明显降低小鼠腹泻的发生率并延缓腹泻的进程。
  2,OVA诱导的腹泻动物回肠表达GAD67和GABAA受体β2/β3、π亚单位比对照组显著增高。GABAA受体阻断剂则降低动物肠道β2/β3蛋白的表达,而小肠上皮细胞和腔面膜上的谷氨酸脱羧酶65/67、π亚单位表达则增加。
  3,IL-13作用4分钟和4.5分钟时最高。而GABAA受体β2/β3亚单位蛋白表达量亦在IL-13处理后4分钟开始增高。
  结论:
  1,γ-氨基丁酸能信号系统在过敏性动物腹泻发病过程中表达明显增加,特异性或非特异性阻断该系统后,动物经OVA诱导后腹泻的发病率明显降低,且发病进程减缓。
  2,γ-氨基丁酸能信号系统在腹泻发病过程中的上调很可能是由PI3K-AKT-GABAA-R信号通路介导完成。
[硕士论文] 吕羿
生物化学与分子生物学 华中师范大学 2013(学位年度)
摘要:在高等真核生物中,大部分蛋白质编码基因是割裂基因,一般由多个内含子和外显子组成。割裂基因的初始转录产物称为前体mRNA,具有和割裂基因一样的割裂结构。细胞会对前体mRNA进行初步加工,去除其中由内含子转录产生的序列片段,并将剩余的序列片段拼接起来,形成成熟的mRNA分子,这一生物学过程称RNA剪接。在前体mRNA剪接过程中,可以存在多种剪接方式,从而产生各种各样成熟的mRNA分子,这就是可变剪接。前体mRNA通过可变剪接过程,最终翻译形成多个同型的蛋白,从而有效调节生物体的生长发育。
  可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制,是功能基因组时代的研究重点之一。随着第二代测序技术的发展,公共序列数据库中积累了大量来源于生物体内不同组织转录本的32nt左右的短RNA-Seq序列。本文结合EST序列和RNA-Seq序列,使用差减比较分析算法,在转录组水平上预测小鼠大脑及胰腺组织不同发育时期的时序特异性可变剪接转录本。这种方式既能够排除人工嵌合体,同时也能够排除染色体易位,通过不同来源序列的交叉验证,还可以筛选具有较高可信度的可变剪接转录本。
  我们的研究共检测到小鼠大脑组织器官出现期特异性可变剪接转录本203条,胚胎期特异性可变剪接转录本1,629条,幼年期特异性可变剪接转录本118条,成体期特异性可变剪接转录本148条。来自小鼠胰腺组织胚胎期特异性可变剪接转录本40条,成体期特异性可变剪接转录本26条。我们为所得的结果建立了名为DMBPAS数据库,通过链接http://173.234.48.5/DMBPAS/可以对其进行在线访问。
  我们对所得到的结果进行进一步的分析后,发现小鼠大脑组织的时序特异性可变剪接转录本具有明显的染色体偏好,在剪接方式和剪接位点分布上也有明显的特点。在对小鼠胰腺组织的时序特异性可变剪接转录本进行生物信息学分析后,我们预测的部分尚未被数据库所记录的时序特异性可变剪接新转录本均与小鼠体内的多条重要代谢途径和信号通路相关,如胰腺分泌代谢途径、甘油脂代谢途径、细胞分裂信号通路等。有趣的是,产生新转录本的Pnliprp1基因第4内含子3'末端位点上游50bp区域在10种哺乳动物基因组比对序列中,位于一个相当保守的序列结构当中。这些数据为诊断、治疗、预防大脑及胰腺发育遗传疾病提供了辅助工具,为进一步开展相关实验研究提供了理论基础及未来方向。
[硕士论文] 周博
基础兽医学 河南农业大学 2012(学位年度)
摘要:共轭亚油酸(CLA)具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、提高免疫力、提高骨骼密度、减少脂肪和防治糖尿病等多种重要生理功能,因此广泛用做食品的添加剂。但研究发现,CLA能引起小鼠的代谢异常,如脂肪肝等。为研究CLA诱导的小鼠肝脏脂肪沉积的发生机制,我们首先用添加1.5%CLA的饲料饲喂小鼠,获得动物脂肪肝模型。然后对肝脏内脂代谢相关基因的表达调控进行了研究,并对试验结果进行了讨论。研究结果如下:
   小鼠脂肪肝模型的建立:在昆明公鼠饲粮中添加1.5%CLA38.5d后发现,与对照组相比,试验组小鼠肝重显著增加了1.67倍。对肝内甘油三酯(TG)含量进行酶比色法测定,发现试验组小鼠肝内TG含量增加了1.47倍。对小鼠血液代谢分析后发现,与对照组相比,试验组小鼠血液中的谷丙转氨酶(ALT)含量显著升高,说明肝细胞受损。
   分别对对照组和试验组小鼠肝细胞进行组织学观察。制作石蜡切片,光镜观察发现试验组小鼠的肝细胞结构发生变化,形态遭到破坏,内部有大小不一的疑似脂滴的空泡状结构;对照组小鼠的肝细胞结构正常。制作冰冻切片进行苏丹鉴别染色后观察发现试验组小鼠肝脏内存在大量脂滴;而对照组没有。制作电镜切片对小鼠肝脏细胞亚显微结构进行观察发现,试验组小鼠肝细胞内存在大量脂滴。试验组小鼠的肝细胞内线粒体结构明显破坏。
   肝内与脂代谢相关基因的表达变化:发现CLA能够影响脂肪代谢的多个途径。CLA使得硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)上调2.37倍,提示脂肪酸从头合成增加;脂肪酸结合蛋白(CD36)基因表达上调3.63倍,提示肝细胞吸收脂肪酸增强;脂肪酸氧化的关键酶肉毒碱棕榈酰基转移酶-1(CPT-1)显著下调0.75倍,表明脂肪酸氧化受阻。脂肪分解的限速酶激素敏感酯酶(HSL)基因表达显著下调0.67倍,表明脂肪分解出现障碍。而负责合成极低密度脂蛋白(VLDL)的APOB100基因的表达显著下调0.56倍,表明肝脏合成的内源性脂肪运出肝脏出现障碍。调节合成、转运、氧化等多过程的PPARa因子下调0.44倍,提示PPARα因子对多个过程的调控能力下降,造成肝脏内脂代谢出现紊乱。
   小鼠血液内胰岛素变化结果显示:放射性免疫检测发现,CLA小鼠血液胰岛素的含量比对照组升高了3.5倍。胰岛素耐受试验表明,对照组小鼠的血糖水平在60分钟内降低到4mmol/L,在120分钟达到5mmol/L。CLA组在60分钟为11mmol/L,而后在120分钟达到12mmol/L,证明CLA能够诱导小鼠产生胰岛素抵抗。
   CLA对CD36基因的表达调控的结果表明:首先克隆了CD36基因的-5’非翻译区(998bp)序列,并与Luciferase报告基因组装成表达载体。HepG2细胞瞬时表达试验发现,CLA能够提高CD36-5’非翻译区的转录启动活性。PPARα对CD36基因的5’非翻译区活性也有促进作用。
[硕士论文] 肖国丰
外科学(普外) 安徽医科大学 2012(学位年度)
摘要:目的:为探讨高能量、高脂摄入结合正加速度(positive acceleration,+Gz)暴露下对胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)、生长抑素(Somatostatin,SS)的变化及胆囊排空功能的影响,本研究采用高胆固醇饮食兔在动物离心机上进行+Gz暴露,探讨+Gz暴露下胆囊动力学异常在胆囊结石形成中的作用,并进一步探讨导致胆囊排空障碍的原因,为探讨特殊生理环境对胆道系统功能的影响机制提供相关依据。
  方法:(1)建立特殊生理环境下的成石动物模型,检测CCK、SS指标变化,计算空腹胆囊容积(FV)、+Gz暴露后胆囊容积(RV)、胆囊排出容积(EV=FV-RV)、胆囊残余指数(RF%=RV/FV)、胆囊排空率(E%=1-RV/FV);采用微电脑生理压力记录仪记录胆囊内压、胆汁流量;计量胆囊容量;观察胆汁性状及胆囊壁胆固醇结晶情况。(2)采用放射免疫法检测CCK、SS的含量变化,并将各阳性指标进行统计学分析。
  结果:(1)模拟空勤膳食和+Gz暴露下胆囊附壁结晶形成的发生和形成率明显增加,CCK、SS指标变化差异有显著性,其变化水平与胆囊结石的发生和形成进程及胆囊结石形成的危险因素有一定的相关性,但是否做为独立危险因素仍需要更深刻的研究与探讨。(2)在+Gz暴露和未暴露组及不同的+Gz暴露组别中,+Gz暴露组CCK及SS含量与对照组有显著差异,且随着+Gz暴露时间增加其含量显著变化,差异有统计学意义;+Gz暴露组胆道压力总体变化趋势高于对照组,随暴露时间增加而波动明显(P<0.05),+Gz暴露组胆汁流量总体变化趋势低于对照组,随暴露时间增加而波动明显(P<0.05)。(3)+Gz暴露4周、6周组胆囊容积增大,主要表现在最大排空率(E%)减少,空腹体积(BV)和残存体积(RV)增大,胆囊压力增加(P<0.05),;+Gz暴露4周、6周组胆囊CCK含量均明显低于对照组,且随着+Gz暴露时间增加,CCK含量逐渐降低(P<0.05);+Gz暴露4周、6周组胆囊SS含量均高于对照组,且随着+Gz暴露时间增加,SS含量逐渐升高(P<0.05)。+Gz暴露4周、6周后,镜下可见胆固醇结晶,但无肉眼可见结石。
  结论:(1)+Gz暴露可引起高胆固醇饮食兔胆囊排空功能异常,CCK含量降低、SS含量升高,导致胆囊收缩功能紊乱,胆汁淤滞,提示+Gz暴露下胆囊收缩功能异常为胆囊胆固醇结石的形成提供了条件。(2)做为内部条件的高胆固醇血症及外部环境下的+Gz暴露协同引起胆囊排空功能低下,并为胆固醇结晶的沉积创造了动力学条件。(1)特殊生理环境可引起胆囊CCK、SS失调及胆道动力学异常,与胆系结石的发生和形成相关,因此对预防中长期+Gz值暴露引起的胆道系统功能紊乱有现实指导意义。
[硕士论文] 汪新建
基础兽医学 河南农业大学 2012(学位年度)
摘要:为了研究脂多糖(LPS)致肝损伤对脂代谢基因转录水平的影响,本试验以昆明小鼠为研究对象,经腹腔给小鼠注射LPS,从形态学、肝功指标和炎性信号分子转录水平角度,判定肝损伤模型的建立,利用荧光定量PCR方法检测小鼠肝脏、脂肪和肌肉组织脂代谢基因的转录水平,阐明LPS对机体脂代谢基因转录水平的影响。结果如下:
   小鼠肝损伤模型的建立:随着LPS剂量的增加和作用时间的延长,肝脏组织病理变化明显,由仅有部分细胞核溶解,肝窦轻度充血、少数肝细胞浊肿,少量炎性细胞浸润,直至肝窦扩张,明显充血、淤血,大量炎性细胞浸润,肝细胞呈现点状、小片状坏死;LPS能使血液和肝脏中肝功能指标(GOP和GOT)的活性升高,上调肝脏炎性信号分子转录水平。提示成功建立了LPS诱导的肝脏损伤模型,LPS的使用剂量为3mg/kg,作用时间为6-9h。
   肝脏中脂代谢关键基因转录水平:时间效应试验中,LPS可显著下调SREBP、ACCmRNA的转录水平,随作用时间的延长而显著下调;12-24h可显著下调CD36、SCDmRNA的转录水平,3-6h显著下调PPARαmRNA的转录水平,6-9h显著上调了LXRβmRNA的转录水平,对LXRα和FASmRNA的转录水平影响不大;剂量效应试验中,LPS可显著下调PPARα、LXRα、SREBP、ACCmRNA的转录水平,对LXRβ、CD36、FAS、SCDmRNA转录水平影响不大。提示LPS通过下调核转录因子PPARα、LXRα、SREBPmRNA的转录,降低ACCmRNA的转录水平,使肝脏合成脂肪酸的能力下降。
   脂肪组织中脂代谢关键基因转录水平:时间效应试验中,LPS能下调脂肪组织中PPARα、SREBP、FAS、ACCmRNA的转录水平,对LXRα、CD36mRNA的转录影响不大,但能上调白色脂肪中LXRβmRNA的转录,下调褐色脂肪中SCDmRNA的转录,对白色脂肪中SCDmRNA和褐色脂肪中LXRβmRNA的转录影响不大:剂量效应试验中,LPS下调脂肪组织中LXRα、SREBPmRNA的转录水平,对LXRβ、FAS、ACCmRNA的转录影响不大,能下调白色脂肪中CD36、SCD、ACCmRNA的转录水平,下调褐色脂肪中PPARαmRNA的转录,对褐色脂肪中ACC、SCD、CD36mRNA和白色脂肪中PPARαmRNA的转录影响不大,且调节幅度不依赖于LPS作用时间和剂量。
   肌肉组织中脂代谢关键基因转录水平:时间效应试验中,LPS可上调SCD、PPARα、LXRα、LXRβ、FAS、ACC、CD36mRNA的转录水平,对SREBPmRNA的转录影响不大;剂量效应试验中,LPS上调PPARα、SCD、FAS、ACCmRNA的转录水平,下调LXRα、LXRβ、CD36mRNA的转录,对SREBPmRNA的转录影响不大,调节幅度不依赖于LPS作用时间和剂量。
   综合以上结果,LPS通过上调炎性信号分子的转录水平诱导小鼠肝脏损伤,损伤程度依赖于LPS的剂量和作用时间;LPS通过下调PPARα、LXRα、SREBPmRNA的转录,进而下调其靶基因转录水平,降低机体合成和转运脂肪酸的能力,降低的幅度具有组织特异性。
[硕士论文] 薛洋
动物遗传育种与繁殖 上海海洋大学 2011(学位年度)
摘要:胃蛋白酶(Pepsin)是胃中最重要的消化性蛋白酶,属于天冬氨酸蛋白酶家族,主要负责食物蛋白质的初步水解。胃腺分泌的胃蛋白酶原(Pepsinogen)是胃蛋白酶的无活性前体,在胃酸形成的胃部酸性环境下被激活,成为有活性的成熟的胃蛋白酶。胃质子泵(gastricprotonpump),即胃H+/K+-ATPase,是胃酸分泌的关键性酶,是由α亚基和β亚基组成的异二聚体。α亚基负责催化和转运H+、K+,β亚基起稳定α亚基和辅助泌酸的作用。因此,胃蛋白酶和胃酸共同构成胃中蛋白质的酸性消化方式。在鱼类个体发生早期,胃腺的分化、胃蛋白酶原和胃酸的分泌都是具有重要意义的事件,前者标志着胃形态发育的完善,后者则意味着胃功能发育的成熟。所以,胃蛋白酶原和胃质子泵基因的表达可以作为胃分化和功能完善的分子标志。
   本研究首先利用RT-PCR(反转录PCR)和RACE(cDNA末端快速扩增)技术获得了鳜胃质子泵α亚基和β亚基的全长cDNA序列。α亚基全长3581bp,包括178bp的5'端非翻译区(UTR),3069bp的开放阅读框(ORF)编码1022个氨基酸和334bp的3’UTR。β亚基全长1669bp,包括220bp的5’UTR和573bp的3'UTR,876bp的ORF共编码291个氨基酸。氨基酸序列分析显示胃质子泵α亚基具有10个跨膜结构域,第374-380氨基酸残基(DKTGTLT)是E1-E2型ATP酶磷酸化位点,N端18-28氨基酸残基(KKKKKKKMKKK)具有赖氨酸/甘氨酸簇结构,这一结构是α亚基的保守区域,在不同种属动物间同源性较高。胃质子泵β亚基仅有1个跨膜结构域,含有7个潜在的糖基化位点和3个二硫键。胃质子泵氨基酸序列比对和相似性分析显示了脊椎动物胃质子泵α亚基的高度保守性以及β亚基的相对可变性。
   为了阐明胃蛋白酶原和胃质子泵基因的时空表达特征,以及鳜个体发生早期胃蛋白酶原和胃质子泵基因的协同表达作用,根据本实验室前期获得的鳜3种胃蛋白酶原(PGA1、PGA2、PGC)以及本实验中获得的鳜胃质子泵基因cDNA序列,设计特异性的引物和地高辛标记RNA探针,用于RT-PCR和ISH(原位杂交)试验。RT-PCR研究表明,随着胃的发育(0-40dph,孵化后0-40天),鳜3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因依次表达。PGA1基因于4dph开始微弱表达,先于胃腺的出现;PGA2和胃质子泵α、β亚基转录本在12dph同时出现;PGC的转录本于14dph被检测到,与此同时,胃粘膜层中的胃腺细胞首次出现。原位杂交结果表明,鳜成体胃粘膜和个体发生早期各阶段仔、稚鱼的3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因的表达均仅限于胃腺细胞中,表明鳜胃腺细胞同时具有分泌胃蛋白酶原和胃酸的功能,属于泌酸胃酶型细胞。鳜3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因的显著表达均在12-14dph,且均在胃粘膜层的泌酸胃酶细胞中表达,表现出二者之间明显的时间和空间协同表达关系。此外,10dph的仔鱼胃粘膜中未发现胃腺细胞,胃粘膜中的胃腺细胞从14dph到40dph开始出现且数量逐渐增加。HE染色和原位杂交结果还表明,在鳜胃粘膜层中存在另外2种细胞类型:表面粘膜细胞和粘膜颈细胞,但此2种细胞中都没有胃蛋白酶原或胃质子泵基因的表达。
   本研究首次获得了鳜胃质子泵α、β亚基的全长cDNA序列,分析了序列特征;揭示了鳜个体发生早期3种胃蛋白酶原和胃质子泵的次序表达;明确了鳜发育早期胃蛋白酶原、胃质子泵基因的协同表达关系;确定了鳜胃蛋白酶原和胃质子泵基因的细胞表达定位和鳜胃腺细胞类型(泌酸胃酶细胞);丰富了鱼类消化生理学的相关知识;加深了对鳜仔稚鱼消化系统早期发育过程的认识,为鳜的仔稚鱼培育和养殖管理提供了参考。
[硕士论文] 陶伟伟
生物学;发育生物学 南京师范大学 2010(学位年度)
摘要:哺乳动物的许多生理活动具有昼夜节律性,比如睡眠-觉醒、血压、血液激素水平以及能量代谢等都呈现出以24小时为周期的波动。这些机体内在的生物节律是由光线和饮食的周期变化所控制的。哺乳动物的生物钟可分为中枢性和外周性两大类,中枢性生物钟位于下丘脑视交叉上核神经元(suprachiasmatic nucleus.SCN)内,它接受光线刺激并产生主要的时钟信号,通过体液和神经内分泌通路传递到外周组织,来协调外周生物钟。通常情况下,这两大类生物钟的运作是同步的,然而饮食行为的改变却能够重新设定外周生物钟,使之与中枢生物钟解偶联,这说明营养信号在调节外周性生物钟中扮演了重要角色。
   近年来的研究证实,神经内分泌和代谢系统是受到精确节律控制的。在哺乳动物整个基因组中,大约有10%的基因呈现出昼夜节律性表达,其中很多基因编码在代谢过程中起关键作用的酶。更重要的是,啮齿类动物和人类的许多代谢活动也具有节律性,例如肝糖异生、胆酸合成以及肝脏的解毒过程。相反,生物钟系统中的一些核心调控因子本身也具有重要的代谢调控功能。
   至今,关于生物钟和能量代谢过程的整合机制远未明了。2007年,《自然》杂志上报道了PGC-1α可以整合生物钟与能量代谢。PGC-1α(过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子-1α)是能量代谢的关键调控因子,它能够和RORα/γ(视黄酸相关的孤儿受体α/γ)协同作用,从而在转录水平上整合外周生物钟和能量代谢两大途径。
   近期有研究报道,染色质重塑复合物SWI/SNF家族成员之一-BAF60a,能和PGC-1α相互作用,并且它能和PGC-1α一起协同调节肝脏的脂代谢。BAF60是SWI/SNF复合物的一个亚基,该复合物能通过水解ATP获能来调节核小体和染色质的结构。有趣的是,BAF60a在肝脏内也呈现昼夜节律性表达。我们设想BAF60a可能也参与到生物钟和能量代谢的整合过程中去,因此我们进行了一系列实验来验证我们的假说。
   我们的实验结果发现BAF60a在肝脏内确实呈现昼夜节律性表达,通过尾静脉注射BAF60a shRNA的腺病毒干扰肝脏中BAF60a的表达后发现,一些重要的生物钟和代谢基因的表达严重受损,并且血液中的一些代谢物的水平发生明显改变。在细胞水平上,当BAF60a的表达被抑制后,血清休克所诱导的生物钟基因的节律性表达严重受损,振荡幅度显著降低。在分子水平上,BAF60a可以协同RORα激活生物钟关键基因Bmall和糖异生关键基因G6Pase的转录。此外,ChIP实验证实BAF60a确实可以结合到Bmall和G6Pase启动子的RORE motif上,并将染色质结构转变为活化状态。最后,我们发现在一些生物钟基因突变的小鼠中,BAF60a的表达模式也被严重打乱。因此,我们的研究揭示了BAF60a在肝脏生物钟和能量代谢的整合过程中发挥着重要作用。
[硕士论文] 王磊
生物学、细胞生物学 河南师范大学 2010(学位年度)
摘要:klf4作为诱导iPS细胞的转录因子已成为研究领域的热点,其在调控细胞增殖、分化、胚胎发育等生命过程中均发挥重要作用。
   为了探讨klf4过量或降低表达对肝脏再生的作用,本文以大鼠再生肝为材料,参照klf4的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物,采用分子克隆技术得到klf4的克隆载体,测序证实正确后,以其为模板,进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建出表达载体pEGFP-N1-klf4;另外,同样参照klf4的mRNA序列信息,利用锐博、Genesil、Ambion和QIAGEN等网站的在线设计工具,查阅siRNA设计相关论文,针对klf4mRNA的2个区域合成寡聚核苷酸片段连接到干涉载体pGenesil-1.0上,构建出2个干涉klf4mRNA的干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082;同样,双酶切表达载体pEGFP-N1-klf4得到klf4的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4。测序证实正确后,将klf4构建到干涉载体中,完成干涉载体对应检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4的构建;利用构建的klf4的表达载体、干涉载体和检验载体,采用尾静脉液压转基因法,分别将构建的3组载体注入大鼠体内,荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术检测转klf4后大鼠死亡率、肝指数和肝组织形态结构的变化。
   经测序和电泳检测证实,本论文成功构建了klf4的表达载体、干涉载体和检验载体。运用尾静脉液压转基因法进行klf4基因添加或RNA干涉研究klf4在大鼠肝再生中作用发现,目的质粒的肝内表达动力学与载体作用检测结果一致,说明目的片段成功表达。转入pEGFP-N1-klf4质粒后大鼠死亡率正常,肝指数在120h略有升高,肝组织的显微结构无明显变化。转入pGenesil-1.0-k814、pGenesil-1.0-k1082质粒后,大鼠死亡率明显高于正常范围,肝指数在120h略有上升、168h略有下降,肝组织的显微结构无明显变化。本文克隆了klf4基因,构建其表达载体、干涉载体和检验载体,根据体内检测结果初步判断klf4与大鼠肝脏再生有关。本文积累的研究经验与数据将为今后对klf4与肝再生的进一步研究提供重要的参考和指导。
  
[硕士论文] 朱秋实
生物学·细胞生物学 河南师范大学 2010(学位年度)
摘要:性别决定基因家族成员-2sox2是SOX基因家族成员之一,与发育及细胞的分化与去分化相关。受sox2在诱导多能性干细胞相关方面研究的启发,本文以大鼠再生肝为材料,用液压转基因技术(hydrodynamics-based transgene,HDT),通过基因过表达和RNA干涉的方法,初步研究了sox2对大鼠肝再生过程的作用,为增加对sox2在大鼠肝再生中的作用和分子机理的认识提供了资料。
   本文根据已发布的信息对sox2进行了克隆,并从其基因序列上挑选了两处靶位点设计了两条干涉RNA片段,将这些经检测正确的片段分别连接在真核表达载体pEGFP-N1和干涉载体pGenesil-1.0上,构建了一条重组表达载体pEGFP-N1-sox2及两条重组干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370。而后,双酶切表达载体pEGFP-N1-sox2得到sox2的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2。将构建成功的各检验载体分别对再生肝模型大鼠进行液压转基因,并于转基因后0、6、12、24、36、48、60、72和84h观察转干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2后的绿色荧光蛋白阳性细胞率(转染率)与对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox2相比是否有明显下降,以此来判断设计的干涉片段是否对靶位点具有干涉作用。将表达载体和干涉载体分别进行液压转基因操作,通过各载体的转染率找出其在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,并结合sox2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,得出该基因在大鼠部分肝切除(partialhepatectomy,PH)后的最佳转基因时间。根据以上结果,利用大鼠肝再生模型和液压转基因技术展开了sox2对大鼠肝再生作用的研究。将转基因后的再生肝材料分别于PH后72、120和168h取出,用荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术对大鼠肝脏组织形态结构、表达动力学和肝指数等方面的结果进行观察与分析。
   经过检测sox2克隆成功,其表达载体、干涉载体和检验载体构建亦成功。经过对转干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2和对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox2后转染率的检测,针对两处靶位点设计的两条干涉片段均具有较明显的干涉作用,其中尤以干涉片段s370的干涉效果最佳。经过对转表达载体和干涉载体后转染率的检测,并结合sox2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点,在PH后0h进行转基因效果最佳。对大鼠死亡率、组织形态结构、表达动力学和再生肝肝指数等方面的结果统计分析后显示:转干涉载体pGenesil-1.0-s370后,大鼠再生肝肝指数与对照相比有一定变化。
[博士论文] 赵鹏
生理学 上海交通大学 2010(学位年度)
摘要:硫化氢(H2S)在哺乳动物的不同组织中产生,并在机体的生理以及病理过程中起了重要的调节作用。然而,关于硫化氢对胃肠道平滑肌动力的影响及其机制的研究报道甚少。因此,本文利用生理学以及电生理学方法探讨了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性运动的影响及其离子通道机制。本文包括以下三部分实验:(1)观察了硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌肌条自发性收缩影响以及毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱诱导的肌条收缩的影响;(2)通过全细胞模式膜片钳技术,记录和观察了新鲜分离的单个胃窦平滑肌细胞的膜电流,研究了硫化氢作用的离子通道机制;(3)为进一步研究硫化氢对胃肠起搏细胞Cajal间质细胞起搏功能的影响,在新鲜分离的小鼠胃Cajal间质细胞进行组织学鉴定和电生理特性的初步研究,为今后研究H2S对胃起搏功能的调控作用打下基础。
   结果:显示:①NaHS在高浓度时(0.3-1.0mM)抑制自发性收缩的幅度,而在较低浓度时(0.1-0.3mM),降低自发性收缩幅度的同时明显增加收缩的张力;②当用非选择性钾通道阻断剂TEA(10mM)或者电压依赖性钾通道阻断剂0.5mM的4-氨基吡啶(4-AP)预处理时,低浓度硫化氢引起的收缩张力增加效应完全被阻断。然而,单独使用低浓度TEA(1mM)时,不能完全阻断低浓度NaHS引起的张力增加效应,但与4-AP联合使用后则完全阻断其张力增加效应;③NaHS和KATP通道开放剂吡那西地(Pinacidil)均可明显抑制胃平滑肌自发收缩,而KATP通道阻断剂格列本脲(Glibenclamide)部分逆转NaHS和吡那西地的抑制效应;④低浓度NaHS对毒蕈碱M受体激动剂50μM卡巴胆碱(Carbachol,Cch)诱导的胃平滑肌自发性收缩具有双向作用,即明显抑制Cch诱发的收缩幅度并同时明显增加其张力;⑤毒蕈碱M受体阻断剂阿托品(Atropine,15μM)在未经Cch预处理的肌条上,削弱了低浓度NaHS引起的肌张力增加,也可完全消除Cch存在情况下低浓度NaHS引起的肌张力增加效应,并显著抑制收缩幅度;⑥NaHS可呈剂量依赖性的增加ATP敏感性钾通道(KATP通道)电流,但是抑制电压依赖性钾通道(KV通道)电流。低浓度NaHS对自发性瞬时外向电流(STOCs)无作用,而高浓度NaHS却显著抑制STOCs;⑦NaHS可呈剂量依赖性的增强Cch诱导的毒蕈碱电流;⑧新鲜分离小鼠胃平滑肌细胞中有c-Kit蛋白表达呈阳性的细胞,其形态呈短梭形并带有突起。在全细胞模式下,在c-Kit蛋白表达阳性的细胞上可以记录到自发并具有节律性的内向电流。钙调蛋白抑制剂W-7以及增加电极内液中EGTA的浓度都明显增强其电流幅度并引发明显的内向钳制电流。
   实验结果提示,(1)H2S对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩具有双重作用,即抑制作用和兴奋作用。兴奋性作用通过抑制KV通道所介导,而抑制性作用是通过激活KATP通道所介导;(2)H2S对毒蕈碱受体激动剂Cch引起的收缩也具有双重调控作用,即低浓度H2S对Cch诱导的收缩起兴奋作用,而这种兴奋性作用是通过增加毒蕈碱电流所介导,而对Cch诱导的收缩所起的抑制作用则是通过激活KATP通道来实现的;(3)新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞可以产生自发、自律性内向电流,而这种电流对胞内低钙或钙调蛋白抑制剂敏感。这种具有自发性电活动的ICC样细胞可能就是胃Caial间质细胞。
[硕士论文] 崔胜男
生物学、细胞生物学 河南师范大学 2010(学位年度)
摘要:脂质运载蛋白2基因lcn2编码的小分子分泌型蛋白是脂质运载蛋白家族的成员之一,在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中起调节作用。为探讨lcn2过量或降低表达对肝脏再生的作用,本文以大鼠再生肝为材料,参照lcn2的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物,采用分子克隆技术得到lcn2的克隆载体,测序证实正确后,以其为模板,进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建出表达载体pEGFP-N1-lcn2;另外,同样参照lcn2的mRNA序列信息,利用锐博、Genesil、Ambion和QIAGEN等网站的在线设计工具,查阅siRNA设计相关论文,针对lcn2mRNA的2个区域合成寡聚核苷酸片段连接到干涉载体pGenesil-1.0上,构建出2个干涉lcn2mRNA的干涉载体pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616;酶切上述的表达载体pEGFP-N1-lcn2得到lcn2的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-l.0-l616-lcn2。用尾静脉液压转基因法,分别将构建的表达载体pEGFP-N1-lcn2、干涉载体pGenesil-1.0-1292和pGenesil-1.0-1616及检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2注入大鼠体内,用荧光显微技术观察肝组织的阳性细胞(数),并检测转lcn2后大鼠死亡率、肝指数、肝再生率和组织形态结构的变化。电泳和测序检测表明,本论文构建的lcn2的表达载体、干涉载体和检验载体正确,有生物学作用。荧光显微检测表明,pEGFP-N1-lcn2、pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616载体的绿色荧光蛋白基因的表达高峰为12h,pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2载体的绿色荧光蛋白基因的表达高峰为6h。并且与对照载体pGenesil-1.0-hk-lcn2相比,检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2的绿色荧光蛋白阳性细胞率比对照低5%左右,初步说明设计合成的两个干涉片段均有一定干涉作用。肝指数检测表明,在转基因后120和168h,转pEGFP-N1-lcn2载体组肝指数比对照和PH组小;在转基因后72、120和168h,转pGenesil-1.0-l616-lcn2载体组肝指数均比PH组略大。肝再生率检测表明,在转基因后120h,转pEGFP-N1-lcn2载体组肝再生率比PH组略大,但在转基因后168h却明显比PH组和对照组小:在转基因后120h,转pGenesil-1.0-l616载体组肝再生率几乎与对照和PH组重合,在168h比两组肝再生率大。总之,本文克隆了lcn2基因,构建其表达载体、干涉载体和检验载体,根据体内检测结果初步判断lcn2与大鼠肝脏再生相关。
[硕士论文] 邵洛林
内科学(消化系病) 山东大学 2010(学位年度)
摘要:核因子相关因子-2(Nrf2)与机体的防御系统密切相关,是细胞防御氧化应激的重要调节因子,通过介导一系列抗氧化酶和2相解毒酶的表达,可以保护多种组织免受有害物质的攻击。研究表明Nrf2在肝脏的功能稳定中起着重要的作用,可以降低药物介导的肝脏毒性、减轻肝脏炎症和肝纤维化、抑制化学致癌作用、并与肝细胞凋亡有关。深入研究可为治疗疾病带来新的途径,故在本实验中,观察Nrf2在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)形成不同阶段表达的变化情况,为NAFLD的预防和治疗提供新的思路。
   目的:本实验通过喂养昆明小鼠高脂高胆固醇的方法建立NAFLD小鼠模型,研究在脂肪肝和脂肪性肝炎两个阶段,Nrf2的表达及血浆8-异前列腺素F2a的变化情况,探讨Nrf2在氧化应激所致炎症损伤中的作用,为进一步阐明NAFLD的发病机制及治疗提供新的线索。
   方法:健康成年昆明雌性小鼠26只,正常饲养适应环境1周后,随机分成2组:正常饮食组(对照组)10只,普通饲料喂养;高脂饮食组(实验组)16只,高脂饲料喂养。两组均自由饮水和进食分笼喂养于20-25℃明暗各12小时的动物实验室内,分别于8周末,12周末随机抓取5只对照组小鼠和8只实验组小鼠,处死前隔夜禁食,次日称重后以10%的水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉,心脏穿刺取血,迅速摘取肝脏称肝湿重,后用10%的甲醛固定,制作石蜡切片,常规HE染色,观察肝脏组织的病理学变化,心脏血离心后取血清,应用7170-AHITAC全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、血糖、甘油三酯、胆固醇;运用免疫酶联法检测血浆中8-异前列腺素F2a的含量,用免疫组化法检测Nrf2的表达。
   结果:
   1.对照组小鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形。8周模型组小鼠肝细胞中度细胞水肿,多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡(脂肪变性),以小叶中央区受累明显,伴有肝细胞水样变性。12周模型组小鼠出现弥漫性脂肪变性,呈现中至重度脂肪变性,小叶内炎症细胞浸润,浸润细胞以单核细胞、淋巴细胞为主,并有一些中性粒细胞浸润以及散在的点状坏死,汇管区炎症相对较轻但未见明显的纤维化改变。
   2.与对照组比较,8周模型组和12周模型组肝湿重量、肝指数、丙氨酸氨基转移酶、血糖、胆固醇均有显著升高(p<0.01),总胆红素、甘油三酯水平差异不显著。
   3.对照组小鼠正常肝细胞中,Nrf2在极少数肝细胞胞浆中表达,8周实验组小鼠肝细胞中,Nrf2在受损肝细胞胞浆中较强表达,12周实验组小鼠肝细胞中,Nrf2在受损肝细胞胞浆中强表达,实验组小鼠8,12周末肝细胞胞浆Nrf2表达明显强于同期对照组小鼠(p<0.05),且12周末明显强于8周末(p<0.05).4.与对照组比较,8周模型组和12周模型组血浆8-异前列腺素F2a明显升高,具有统计学意义(p<0.05)。
   结论:
   1.采用高脂饲料喂养可以成功复制小鼠NAFLD模型,造模方法简便易行,模型成功率高,是一种较为理想的造模方法。
   2.随着高脂饮食喂养时间的延长,出现脂质代谢紊乱,炎症反应氧化应激,小鼠表现出单纯脂肪肝和脂肪性肝炎,8-异前列腺素F2a水平升高,Nrf2在肝细胞表达增强,提示随着非酒精性脂肪性肝病的发生和发展,Nrf2对氧化应激所致炎症损伤的保护作用增强。
[硕士论文] 张永晶
生物学·细胞生物学 河南师范大学 2010(学位年度)
摘要:肝再生是一个复杂的过程,涉及细胞激活、去分化、增殖及增殖调控、再分化和组织结构功能重建等多种生理生化活动。细胞信号转导是生命活动的调控中心,细胞的生长、增殖、分化、凋亡、代谢等生理生化活动均要受到信号转导的调控。在大鼠肝再生中,多种生长因子通过自分泌(Autocrine)或旁分泌(Paracrine)方式激活各种生长因子信号通路参与肝再生。肝脏由肝细胞、胆管上皮细胞、肝星形细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、陷窝细胞、树突状细胞等多种细胞组成,以往对肝再生的研究多停留在组织水平。为在转录水平了解肝星形细胞的生长因子信号通路相关基因与肝再生的相关性,本文用门静脉两步灌流法分散肝脏细胞,用Percoll密度梯度离心和免疫磁珠分选方法分离再生肝的星形细胞,用RatGenome2302.0芯片检测大鼠2/3肝切除和手术对照后恢复2、6、12、24、30、36、72、120和168h时再生肝星形细胞生长因子信号通路相关基因的表达情况,用荧光实时定量PCR检测芯片分析结果的可靠性,用生物信息学和系统生物学等方法分析相关基因在大鼠再生肝星形细胞中的表达模式和作用。荧光实时定量PCR检验再生肝星形细胞的标志基因表达情况表明,芯片结果与荧光实时定量PCR检验结果基本一致,说明芯片检测结果可靠,用生物信息学和系统生物学等方法分析肝再生相关基因在大鼠再生肝星形细胞中表达变化及表达模式和作用表明,38个TGF-β信号通路相关基因与肝再生有关,肝再生启动和进展阶段,TGF-β信号通路抑制肝星形细胞生长和增殖,到终止阶段,相应的抑制作用减弱,此外,TGF-β信号通路还通过调控肝星形细胞分化、炎症反应、胞外基质合成等生理活动参与肝再生;68个WNT信号通路相关基因与大鼠肝再生相关,其中38、28和5个肝再生相关基因分属于WNT/β-catenin、WNT/Ca2+及PCP信号途径,WNT信号通路相关基因在调控肝星形细胞生存、代谢、增殖和分化等方面起作用;77个参与MAPK、PI3K和Ca2+介导的信号通路的生长因子及其受体基因与大鼠肝再生相关,除生长因子及其受体基因外,95、82和43个肝再生相关基因分属于MAPK信号通路、PI3K信号通路及Ca2+介导的信号通路,这些基因通过调控肝星形细胞炎症反应、存活、增殖、分化、迁移等生理活动参与肝再生。总的来看,生长因子信号通路相关基因表达模式多样、复杂,相关基因主要在肝再生启动阶段起始表达,总表达以上调表达为主,在整个肝再生中起作用。
  
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