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[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[博士论文] 汤雨潇
劳动卫生与环境卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过比较肝癌转移患者与未转移患者的肝癌组织铁含量,以及体内外实验明确缺铁与肝癌转移的关系和机制,为系统了解肝癌铁代谢特点及其在肝癌细胞转移中的作用,同时为今后肝癌转移防治措施的完善,尤其是铁螯合剂在肝癌治疗中的应用提供科学依据。
  方法:
  一、肝癌组织铁含量的检测
  1.磁共振成像检测铁含量
  采用GE Signa HDx1.5T MR扫描仪对肝癌患者进行术前扫描,按设定参数扫描后利用自带的工作站软件建立R2*图,随后在R2*图手动标出目标区域,通过软件分析得到R2*值。
  2.火焰原子吸收法检测组织铁含量
  剪下适量组织,烘干后称重,置于玻璃消化管中,加入1ml硝酸和高氯酸混合酸(硝酸/高氯酸=1/4)。放入高温消化炉消化至组织溶解,溶液澄清,随后定容至10ml,作为待测液。以铁标准贮备液(100μg/mL)为标准品配置标准曲线测定液,随后与待测样本同时进原子吸收分光光度计检测,根据标准曲线计算出溶液中铁含量,再比上各组织重量得到组织中铁含量(μg/g)。
  二、细胞实验
  1.细胞培养与处理
  Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养液中,SMMC-7721细胞和H22细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液中。DFO的使用浓度为100μM,Dp44mT的使用浓度为10μM,处理时间为24小时。HIF1α抑制剂PX478的使用浓度为20μM,SP1抑制剂Mithramycin A的使用浓度为100nM,在添加铁螯合剂的同时加入培养液中。
  2.原代肝细胞提取
  人原代肝细胞购于Sciencell公司并附鉴定报告。小鼠原代肝细胞提取:消化酶灌流后取出肝,重悬细胞过400目筛网过滤,随后通过Percoll分离液分离细胞,转移细胞至细胞培养瓶培养并洗去未贴壁细胞。
  3.细胞增殖检测
  采用ThermoFisher Click-iT(@)Plus EdU Alexa Fluor(@)488Flow Cytometry Assay Kit检测细胞增殖。
  4.细胞迁移侵袭实验
  采用transwell小室定性检测肝癌细胞迁移能力,采用Cell Biolabs迁移能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞迁移能力变化。侵袭能力定性检测采用预包被基质胶的transwell小室,采用Cell Biolabs侵袭能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞侵袭能力变化。
  5.细胞转染
  采用lipo3000进行siRNA转染,siRNA浓度为100μM,lipo3000用量及操作参照试剂说明书,隔天换液,转染48小时后进行后续操作。
  6.荧光素酶标记
  细胞荧光素酶标记使用荧光素酶标记试剂盒(上海中乔新舟,货号A1001-8),该试剂盒内含慢病毒介导的萤光素酶标记液及辅助感染的polybrene,通过CAG启动子过表达萤光素酶从而作为报告基因,感染后可在细胞中稳定表达。
  7.细胞TFRC基因敲降
  使用携带TFRC shRNA的慢病毒敲降Huh7细胞和H22细胞的转铁蛋白受体,将shRNA序列克隆进pLVX-shRNA1慢病毒载体后进行包装和生产,得到病毒感染液后感染细胞并筛选稳定细胞系进行后续成瘤实验。
  8.荧光淬灭法检测细胞内铁含量
  使用Phen GreenTM FL试剂(Thermo Fisher)检测细胞内铁含量。细胞内二价铁与荧光试剂结合使其荧光淬灭,通过荧光显微镜观察细胞内荧光强度定性检测细胞内铁含量的变化。
  9.转录因子活性芯片
  DFO干预Huh7细胞24h后提取核蛋白,与对照组核蛋白一起分别与TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒中345种特异性与转录因子结合的探针孵育结合,随后洗去未结合的探针,接着分离探针/核蛋白复合体得到探针,与transignal芯片杂交,检测每种探针产生的信号变化,以此反应各探针对应的转录因子结合活性的变化。
  10.染色质免疫共沉淀
  采用CST的酶解法染色质免疫共沉淀试剂盒检测三种转录因子HIF1α、SP1和YY1对SPNS2转录活性的变化
  。
  结果:
  一、肝癌转移患者癌组织铁含量显著低于未转移患者
  1.与正常组织或癌旁组织相比,肝癌组织铁含量下降
  10例肝癌患者肝癌组织的R2*值显著低于癌旁组织和远处正常肝组织的R2*值。由于R2*值与铁含量呈正相关,提示肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  火焰原子吸收法定量检测29位肝癌患者手术标本癌旁组织和癌组织,发现肝癌组织铁含量显著低于癌旁组织,与磁共振扫描的结果一致。
  与癌旁组织相比,肝癌组织铁稳态分子TFRC、HAMP、Ferritin的表达显著改变,符合肝癌组织缺铁的表现。上述结果表明,肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  2.发生转移肝癌患者的癌组织铁含量显著低于未发生转移肝癌患者
  收集术后5年内发生转移复发的肝癌患者15例,未发生转移复发患者15例,通过检测手术标本(5年前首次手术的标本)的铁含量及铁稳态分子表达,发现发生转移的肝癌患者其肝癌组织铁含量显著低于未发生转移的肝癌患者,提示铁含量下降在肝癌转移中可能发挥一定作用。
  二、体内外实验证实缺铁促进肝癌细胞转移
  1.缺铁抑制人肝癌细胞增殖,但促进人肝癌细胞迁移和侵袭
  通过添加DFO(100μM)和Dp44mT(10μM)两种铁螯合剂造成细胞缺铁模型。采用EdU标记方法观察缺铁对三种人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721增殖的影响,结果发现缺铁时三种肝癌细胞增殖均受到显著抑制。
  但是,定性及定量检测结果显示,在两种铁螯合剂的作用下,Huh7、HepG2、SMMC-7721三种肝癌细胞均表现出显著的迁移侵袭增强。
  2.缺铁促进人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内转移
  2.1系统性缺铁模型
  在体内缺铁是否促进肝癌转移尚不清楚。首先通过给裸鼠喂食缺铁饲料造成裸鼠系统性缺铁模型,观察人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内的转移情况。通过检测肝组织、肺组织铁含量和血清铁含量、铁蛋白含量、转铁蛋白饱和度等指标以及免疫荧光检测肝组织、肺组织的铁蛋白表达,确认喂食缺铁饲料后裸鼠缺铁模型制作成功。
  为了更好地观察肝癌细胞在体内转移的情况,采用活体成像技术定期观察肝癌细胞在体内的生长、扩散。Huh7细胞进行荧光素酶标记(Huh7-fluc),扩增到足够数量后通过肝脏原位种瘤和尾静脉注射种瘤两种方式进行体内荷瘤实验。每10天进行一次活体成像拍照,并利用软件分析肝癌细胞在体内的增殖数量与转移面积。结果发现,与正常组相比,在两种荷瘤模型中缺铁组均表现出明显的肝癌细胞转移范围增大和肺部转移增强。提示缺铁会促进Huh7细胞的体内转移。
  2.2肝癌细胞(Huh7)缺铁模型
  为了更贴合人肝癌组织铁含量下降而整体并不缺铁的情况,通过敲降Huh7细胞转铁蛋白受体,限制其摄入铁的能力而造成细胞内缺铁。检测TFRC mRNA表达和TfR1蛋白表达显示,敲降Huh7-fluc细胞TfR1成功,同时细胞内铁含量低于未敲降组。
  Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞与Huh7-fluc细胞扩增足量后以同样细胞量通过原位种植和尾静脉注射两种方式进行裸鼠荷瘤实验,敲降组与未敲降组裸鼠喂食同样的正常饲料。相比于Huh7-fluc细胞,Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞在裸鼠体内转移显著增强,肺部转移显著。
  3.缺铁促进小鼠肝癌细胞H22在C57小鼠体内转移
  系统性缺铁模型
  为了排除免疫系统缺陷对肝癌细胞转移的影响,在C57小鼠体内种植小鼠肝癌细胞H22,观察缺铁对H22在体内转移的影响。通过检测铁相关指标,确认喂食缺铁饲料后C57小鼠系统性缺铁。
  同样,H22细胞标记荧光素酶(H22-fluc)后,以肝原位种瘤和尾静脉注射两种方式荷瘤。活体成像拍照分析结果显示缺铁组小鼠比正常组小鼠成瘤面积大,肺部转移肿瘤面积增大。
  结论:
  本研究通过检测肝癌转移患者和未转移患者癌组织铁含量,并在整体和细胞水平制作多种缺铁模型,观察缺铁对肝癌细胞转移的作用及其机制。从所取得的实验结果上得出以下结论:
  1.发生转移肝癌患者癌组织铁含量明显降低;
  2.在体内和体外,缺铁均促进肝癌细胞转移;
  2.SPNS2上调是缺铁促进肝癌细胞转移的关键环节;
  3.HIF1α和SP1在缺铁引起SPNS2上调中发挥重要作用。
[硕士论文] 刘文迪
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:近年来,肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)的发病率和死亡率在全球范围内大多数国家和地区呈上升趋势。虽然ICC的发病率比肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)低,但由于ICC的预后较差,对ICC进行准确的分期十分重要。虽然目前已存十余种分期系统,但应用最广泛的是美国癌症委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)提出的TNM分期系统。但由于AJCC分期系统是在西方患者数据基础上提出的,能否准确的为中国ICC术后患者进行生存预测还需进一步验证。本研究旨在分析中国ICC术后患者的不良预后危险因素,进一步对第8版AJCC分期系统进行外部验证,评估其预测效能。
  方法:对828例行部分肝切除手术的ICC患者进行回顾性分析研究,以第7、8版AJCC分期系统、LCSGJ分期系统、NCCJ分期系统、Uenishi分期系统、NMU分期系统作为标准分别对患者进行分期。对所有患者的临床特征和手术病理资料进行统计分析,采用Kaplan-Meier法和Cox风险回归模型计算分析长期生存状况,进一步通过计算对数似然比值(-2log likelihood)和线性趋势卡方检验(Linear trend x2test)以及C指数(C-index)、赤池准则(Akaike information criterion,AIC)、受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under the curve,AUC)来评估不同分期系统的检验效能大小。
  结果:最终纳入研究的780例患者的整体中位生存时间是15.18个月,1年、3年、5年生存率分别是50%、26%、16%。其中死亡632人,存活148人。男性有505例(64.7%),女性275例(35.3%),男∶女=1.84∶1,中位发病年龄为55.56(范围:23-85)岁。
  (1)多因素Cox风险回归模型结果显示:肿瘤多发(HR1.688;95%CI1.412-2.018),区域淋巴结转移(1.631;1.333-1.994),CEA>10μg/L(1.460;1.147-1.858),CA199>39U/ml(1.456;1.214-1.745),PreALB<170mg/L(1.454;1.192-1.773),AFP>20μg/L(1.441;1.133-1.832),肝内胆管结石(1.403;1.020-1.932),肿瘤直径≥5cm(1.319;1.079-1.613),血管侵犯(1.317;1.078-1.609)是不良预后的独立危险因素。
  (2)第8版AJCC分期系统TNM分期的Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期的中位生存时间分别为46.90、27.53、12.43、15.07、9.00、7.10个月。各分期分别与Ⅰa期对比计算HR值,依次为:1.424(95%CI1.071-1.893),2.647(2.076-3.375),2.985(1.506-5.914),3.840(2.976-4.953),4.545(3.428-6.027)。第8版AJCC分期系统总体上具有显著差异(P<0.001),但只能区分Ⅰa和Ⅰb、Ⅰb和Ⅱ期。
  (3)第8版AJCC分期的T分期包括的T1a、T1b、T2、T3和T4期,对应的中位生存时间分别为46.9、27.53、12.4、15.07、10.2个月。各分期逐一与T1a期对比后的HR分别为:1.438(95%CI1.081-1.911),2.727(2.137-3.479),3.128(1.577-6.203),3.572(2.507-5.090)。整体的T分期具有显著的统计学差异(P<0.001),能够显著区分T1a和T1b、T1b和T2期。
  (4)与第7版AJCC、LCSGJ、NCCJ、Uenishi分期系统相比较,第8版AJCCTNM分期的C-旨数、Linear trend x2test值、AUC值高于上述4个分期的对应值(0.660、88.953、0.754),而AIC值以及-2Log Likelihood值则小于他们的对应值(7444.89、7430.094)。第8版AJCC T分期的C-于旨数、Linear trend x2test值、AUC值也均大于这4个系统的对应值(0.632、57.025、0.716),而AIC值以及-2Log Likelihood值小于他们的对应值(4836.79、4823.992)。但是,NMU分期系统的C哥旨数、Linear trend x2test值、AUC值在所有系统中最高,而AIC值以及-2Log Likelihood值最小。
  结论:第8版AJCC分期系统可能优于第7版AJCC分期系统、LCSGJ分期系统、NCCJ分期系统、Uenishi分期系统,但可能要劣于NMU分期系统,仍无法对每期患者进行准确分层,仍需进一步优化,并需多中心的大样本研究进一步外部验证。
[硕士论文] 李腾达
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 PANC-1及HPDE6-C7细胞系外泌体的分离鉴定及特征性因子的检测
  本部分实验采用常规培养方法分别培养胰腺癌细胞系PANC-1和正常细胞系HPDE6-C7。外泌体分离采用超高速密度梯度离心法。分离得到的外泌体于透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)下进行粒径和大小的观察。外泌体计数采用纳米分子追踪分析(Nanosight Tracking Analysis,NTA)技术,经计算五次实验得到均值作为其最终浓度。外泌体表面分子的鉴定采用磁珠捕获结合流式分析法和流式纳米分析法,蛋白定量采用BCA法,ZETA电位经Zetasizer Nano仪器测得。经实验,透射电镜结果显示,PANC-1与HPDE6-C7细胞系来源的外泌体(以下简称EXO-PANC1,EXO-HPDE6-C7)直径在30-180nm之间;NTA分析得到EXO-PANC1溶液的浓度为2.72*1010±2.05*109个/ml,EXO-HPDE6-C7溶液的浓度为2.43*1010±2.21*109个/ml;BCA法测定EXO-PANC1溶液的蛋白浓度为111.31μg/ml,EXO-HPDE6-C7溶液为109.89μg/ml;Zeta电位分析得到EXO-HPDE6-C7的ZETA电位为-25.4mV,EXO-PANC1为-10.1mV。磁珠结合流式分析结果显示,CD9,CD63不能显著地将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7区别开,而磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)可明显将两者区别开来,流式纳米分析结果显示EXO-PANC1表面高表达MIF与GPC1抗原。本部分结果证明PANC-1与HPDE6-C7得到的外泌体符合目前文献规定的相关特性(粒径大小,CD9,CD63分子的表达),在胰腺癌细胞系来源的外泌体中高标达的GPC1与MIF分子可作为后续实验检测的靶向分子。
  第二部分 包被抗体的多巴胺芯片及SERS探针相关制备条件的摸索
  本部分实验中我们初步拟定了多巴胺芯片的制备步骤并探讨了多巴胺溶液浓度对芯片合成效果的影响。对用于表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)技术检测的纳米探针的合成,我们首先采用经典途径合成18nm AuNPs作为核心,进而逐渐形成Au@Ag@pATP材料结构。为了保护较为脆弱的银层,我们在银表面添加了一层保护性牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)。为将检测抗体连接到纳米颗粒表面同时不影响其稳定性和生物相容性,我们利用多巴胺的聚合作用将抗体黏附到纳米颗粒表面,从而形成了多层包被的纳米球SERS探针结构。我们对SERS探针的TEM镜下成像、紫外光谱、SERS光谱等特性进行了鉴定,并对探针合成过程中关键性影响因子-AgNO3溶液浓度及pATP溶液浓度进行了摸索。经实验,我们得知在多巴胺溶液浓度为33mM时芯片合成聚合效果最佳。SERS探针合成过程中AgNO3溶液为0.096mM,pATP溶液为9.6mM时效果最佳。TEM电镜下观察到Ag层的厚度为1nm左右,多巴胺为3nm左右,紫外可见吸收光谱观察到金纳米颗粒仅有一个吸收峰(521nm),而SERS探针有两个吸收峰(400nm与500nm),分别来源于银与金纳米颗粒。拉曼光谱显示SERS探针有较强的拉曼信号峰(1072-1076cm-1)。在低功率(0.05mW)和短扫描时间(10ms)的条件下,拉曼信号依旧可以获得。经本部分实验摸索得到的上述多巴胺芯片-SERS体系的优化条件将用于进一步实验体系的建立。
  第三部分 多巴胺芯片-SERS检测系统用于细胞系外泌体的检测及其体系优化
  本部分实验我们分别以不同抗原为靶点,利用前期建立的多巴胺芯片-SERS体系对EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行了检测。结果表明以GPC1或MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系能够将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行区分,以CD9,CD63为检测位点不能有效地将两者区分。我们进一步加入表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR),对分别以MIF,GPC1,EGFR,CD63这四种抗原为靶点的多巴胺芯片-SERS体系的检测效能进行了评价,发现MIF/GPC1/EGFR组具有相同的最低检测限(9.0*10-19mol//L),而CD63组不能检测到该最低浓度下的外泌体。从各组得到的线性方程式来看,MIF组线性方程式的斜率最高,证明其检测灵敏度更高。接下来,我们以MIF为检测靶点对EXO-PANC1进行了检测,并对其进行了标准曲线绘制,低浓度外泌体溶液条件下的线性拟合方程公式为y=-2.4152+1.2392x。该体系可检测到2μl浓度为5.44*102个/ml外泌体溶液中的EXO-PANC1,相比较于商业化ELISA试剂盒灵敏度大大提高。本部分结果显示以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系其诊断效能远高于其他体系,可用于后续临床标本的测定。
  第四部分 多巴胺芯片-SERS检测系统用于胰腺癌患者血清标本的检测及检测效能的评价
  本部分实验中我们首先以MIF/GPC1/EGFR为靶点利用多巴胺芯片-SERS体系对胰腺癌患者和健康人血清标本进行了检测,结果表明仅MIF-SERS体系能够将胰腺癌患者与正常人、胰腺癌患者P1~2与P3期、胰腺癌患者转移与未转移组进行区分(P<0.05)。我们进一步将MIF-SERS体系检测结果与临床检测指标癌抗原(cancer antigen19-9,CA19-9),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)及MIF-ELISA商品化试剂盒检测结果进行了比较,发现CA199能够将胰腺癌患者与健康人区别开(P<0.05),但不能将胰腺癌患者P1~2与P3期、转移与未转移组进行区分(P>0.05),其与MIF-SERS体系有相似的灵敏度(68.2%vs62.5%)与特异性(72.7%vs76.2%)。对CEA的结果分析显示,该指标不能将上述三组进行区分(P>0.05),其灵敏度较MIF-SERS体系降低了21.6%,特异性降低了12.6%。ELISA法的灵敏度与特异性相比较于MIF-SERS体系分别降低了21.6%,16.2%。此外,与上述经典方法比较,MIF-SERS体系的血清用量大大减少(1-2mL vs2μL)。根据标本检测值我们初步制定以MIF为靶点的log(拉曼信号)的临床参考值范围为胰腺癌vs正常:3.77±0.15vs2.67±0.80,cutoff值为3.55,拉曼信号成像点的扫描信号强度阈值为20。接下来,我们用统计学方法对MIF,GPC1,EGFR三组的检测结果进行了联合分析,发现联合诊断的灵敏度较单独的MIF-SERS体系提高了12.5%,特异性与MIF-SERS体系相当(75.0%vs76.2%),经计算其cutoff值(胰腺癌患者vs健康人)为0.27。通过本部分实验,我们基本上构建了以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系,该体系结合GPC1,EGFR等检测指标,有希望应用于临床检测与胰腺癌的辅助诊断。
[硕士论文] 李江
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨长链非编码RNA XIST(lncRNA-XIST)在胃癌组织及血浆中表达水平与临床意义。原代培养人胃粘膜成纤维细胞(Human gastric mucosa fibroblast,HGMF),并在缺氧条件下刺激其活化。在此基础上验证长链非编码RNA-XIST基因(Long non-coding RNA,lncRNA-XIST)是否与胃癌相关成纤维细胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化相关。并寻找可能与RNA-XIST促GCAF活化相关的差异表达基因与信号通路(Pathway)。
  方法:
  收集40例胃癌患者手术切除的胃癌组织及癌旁组织标本,抽取90例胃癌患者术前血浆样本和90例健康体检者血浆样本。利用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测上述标本中lncRNA-XIST的表达水平。进行统计学分析并判断lncRNA-XIST表达水平与胃癌患者临床病理参数(年龄、性别、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、Ki-67阳性率)的关系。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价血浆lncRNA-XIST在诊断胃癌时的效能。
  收集胃癌患者术中切除的正常胃粘膜组织,用组织块培养法对胃粘膜成纤维细胞进行原代培养。成功培养后,光学显微镜下鉴定其形态特征,同时用免疫荧光染色鉴定确认细胞来源及纯度;将HGMF与胃癌细胞(SGC-7901和MGC-803)共培养,通过间隙性缺氧处理构建GCAF的体外活化模型。
  建模成功后,用ELISA法检测细胞培养液中α-SMA、FAP的表达情况,利用CCK-8试验、Transwell迁移试验及流式细胞技术分别检测细胞增殖、迁移及抗凋亡能力,验证是否建模成功;
  利用qPCR检测GCAF活化前后的lncRNA-XIST基因表达变化情况,验证lncRNA-XIST与GCAF的活化是否存在相关性。利用siRNA干扰GCAF中的lncRNA-XIST基因表达,用ELISA法检测相关活化因子表达水平。利用CCK-8法、Transwell侵袭试验及流式细胞技术分别检测siRNA转染后GCAF的增殖、侵袭及抗凋亡能力,证实lncRNA-XIST与GCAF活化明确相关;用转录组测序技术(RNASequencing,RNA-seq)检测和分析出siRNA转染GCAF后的差异基因和相关通路,探寻LncRNA-XIST参与GCAF活化的具体机制。
  结果:
  胃癌组织中lncRNA-XIST表达较癌旁组织升高,胃癌组血浆lncRNA-XIST表达高于健康体检组;差异均有统计学意义(P均<0.05)。胃癌组织及血浆中的lncRNA-XIST表达水平与胃癌TNM分期、淋巴结转移、分化程度相关(P均<0.05)。
  培养出的细胞贴壁生长,大小一致,呈长条形或梭状,排列方向大体一致,符合成纤维细胞形态特点。免疫荧光鉴定结果显示细胞结蛋白(Desmin)表达阴性,而波形丝蛋白(Vimentin)表达阳性,符合HGMF的蛋白特征,证明原代培养成功。
  建立GCAF活化模型后,细胞培养液中CXCL12、IL-6、TGF-β1及HGF表达水平均明显高于对照组(HGMF),差异均有统计学意义(P<0.05)。GCAF中α-SMA、FAP相关mRNA较对照组表达明显上调(P<0.05);GCAF活化后的细胞增殖、迁徙、抗凋亡能力较HGMF明显增强(P<0.05);GCAF的lncRNA-XIST表达量较HGMF显著上调(P<0.05)。
  慢病毒转染后,培养液中前述活化效应分子表达水平均低于空白组和阴性对照组(P<0.05),且细胞的增殖、迁移及抗凋亡能力下降(P<0.05);干扰lncRNA-XIST表达后,H19、PTP4A1、EIF3E、KLF5、ALB、CYP24A1等基因差异表达,主要参与组织细胞组成和生物合成的调节、有丝分裂细胞周期等生物过程;参与的细胞组织有囊泡、细胞骨架、膜组织等,参与粘附斑激酶信号通路、FcγR介导巨噬细胞吞噬作用等信号通路。
  结论:
  lncRNA-XIST在胃癌组织及血浆中表达升高,并可以促进GCAF的活化过程;下调LncRNA-XIST表达可以抑制GCAF的增殖与迁移能力,并促进其凋亡,提示LncRNA-XIST有可能成为胃癌新的肿瘤标志物和治疗靶点。
[博士论文] 王慧
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌是消化道常见肿瘤,近年来发病率有上升趋势。虽然粪隐血实验、结肠镜检等检查提高了结直肠癌的诊断率,但是,非侵入性的液体活检技术仍是早期发现结直肠癌、降低结直肠癌相关死亡率的预期诊断策略。目前大多数筛查方法都不足以取代传统的结直肠癌诊断方法(直肠指诊、影像学检查、结肠镜检查、病理检查),且癌胚抗原(CEA)作为疾病诊断标志物,对早期肿瘤的诊断价值不大。随着技术的进步及对癌症相关分子的深入研究,外泌体被认为是一种潜在的新型生物标志物。外泌体是一种直径30-200nm的微囊泡,细胞通过内质网传递、胞吐等过程将外泌体释放到外周血、尿液、唾液、组织液等体液中。外泌体因其囊泡样结构携带大量生物分子,其中包括能够反映和代表宿主细胞来源的核酸和蛋白质。而且,癌细胞释放出的外泌体具有特异性的遗传信息和表观遗传修饰,使其在信号传递、肿瘤转移等方面发挥重要作用。结直肠癌肿瘤细胞在分泌外泌体的过程中,在外泌体表面、囊泡内都组装了结直肠癌细胞特异性的分子,如A33(vaccinia virus antigen)、上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CEA等。从临床检测角度分析,携带有肿瘤特异性分子的外泌体,因其广泛分布于各种体液中,因此可以作为液体活检的新型检测标志物,应用于非侵入性的临床诊断操作。但是外泌体为纳米级结构,且肿瘤早期其在外周血中的数量相对较少,现有的常规临床检测方法很难对外泌体进行分离、富集和精确的定量检测,因此,建立快速、灵敏的外泌体检测方法是目前的研究需要。
  (一)新型纳米材料在微量检测中的应用越来越广,其中氧化石墨烯因其良好的生物相容性、比表面积大等特性,已被大量用于生物分子、活细胞检测。适配体是寡核苷酸单链,能够特异性地与检测目标(包括小分子化合物、蛋白、活细胞及外泌体等)结合,具有亲和力高、特异性强、可对其进行多种化学修饰等优点,氧化石墨烯能够与适配体通过分子间相互作用力结合,从而引起相关化学特性的改变。目前已有多项研究利用GO及适配体进行小分子化合物及活细胞的检测。但是,氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的方法在外泌体检测中还未有报道。本文在第一部分建立了一个基于氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的结直肠癌外泌体快速荧光检测方法,以结直肠癌外泌体特异性蛋白CD63和EpCAM为联合检测靶点,该体系利用荧光DNA单链适配体-GO复合体为探针,在与结直肠癌外泌体相互作用的过程中,复合体发生构象变化,GO对荧光DNA单链适配体的吸附和解离导致荧光猝灭和荧光恢复,通过荧光强度变化可对结直肠癌外泌体进行定量检测。实验过程中我们对反应条件及体系进行了优化,并以脱氧核糖核酸酶为工具酶,对荧光信号进行放大,最终得到对结直肠癌外泌体检测灵敏度达到2.1×104particles/μl的检测方法,该检测可在30分钟内完成。用19例临床血清样本(5μl)对该方法进行验证,其可有效区分健康对照和结直肠癌患者(P<0.05),证明该方法在临床实验室检测中具有潜在的应用价值。但是,该检测体系选择的检测靶点为EpCAM,EpCAM在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤外泌体中也过量表达,因此该方法的特异性有待进一步提高。在下一步研究中,本课题将针对检测的特异性及灵敏度进行改进。
  (二)质谱检测具有灵敏度高、检测动态范围广、特异性强等特性,目前已被广泛应用于疾病诊断、微生物检测、药物分析等领域。为简化质谱检测方法,一些新型的常压电离方法已被开发出来,如纸喷雾电离技术。纸喷雾电离质谱检测具有高效、简便、无需对样品进行前处理等优点,但是在对生物样本进行检测时,因无样本前处理步骤,而生物样本内容物复杂,其他离子或蛋白质等分子会抑制待测物的信号,导致灵敏度较差。生物大分子因其分子量大,直接进行质谱分析时所得数据量大,不易分析。若在生物大分子上标记反应可逆的小分子化合物,通过检测小分子化合物间接对生物大分子进行定量分析,可极大提高检测效果。为进一步提高结直肠癌外泌体的检测灵敏度,本文在第二部分建立了一种基于免疫反应的接触式纸喷雾离子化质谱检测方法,用于检测样品中的结直肠癌外泌体。该方法构建了一个双层纸芯片用于样品前处理,用免疫方法对外泌体进行捕获,捕获抗体为抗CD63抗体,从而实现外泌体的纯化与富集;并且构建了两种可裂解的小分子离子探针(DMG-probe,DPA-probe),用离子探针对外泌体特异性检测抗体抗A33抗体进行标记,离子探针被裂解后进入质谱仪完成检测。本实验利用纸芯片实现了免疫反应与纸喷雾检测小分子离子探针的集成分析,DMG-probe和DPA-probe对结直肠癌外泌体的最低检测浓度分别为1.7×102particles/μl和2.5×102particles/μl,其灵敏度是第一部分氧化石墨烯方法的100倍。而且,该纸芯片可对捕获的外泌体样本进行长期有效保存(30天),因此可用于患者自助式分析,即患者在家中或其他场所完成纸芯片上的免疫反应,然后将纸芯片送至质谱检测机构进行检测。
  本文分别利用新型纳米材料和纸喷雾离子化质谱方法建立了两种结直肠癌外泌体快速检测平台,两种方法均具有快速、方便、高灵敏度的特点,在肿瘤外泌体的临床诊断中具有很大的应用前景。
[博士论文] 丁凯
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题即着重于研究表达SOX9的肝细胞和SOX9基因在肝细胞癌发生中的作用,并进一步探究其机制。
  方法:
  一、小鼠原发性肝细胞癌模型诱导
  为明确SOX9对肝癌发生的影响,本研究共使用三种方法诱导小鼠发生原发性肝细胞癌,并选择不同时间点处死小鼠。
  二、探究小鼠原发性肝癌是否来自表达过SOX9的肝细胞
  1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠的构建
  利用基因打靶技术,将IRES-Flp-polyA基因敲入到SOX9第3外显子后的终止序列和UTR之间,建立Sox9-Flp小鼠。将该品系小鼠与受Flp和Cre双酶调控的红色荧光蛋白TdTomato(TdTom)示踪小鼠Ai65D小鼠杂交,抽提鼠尾DNA,普通PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳,鉴定其基因型,获得双基因杂合小鼠即可用于示踪实验。
  2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠肝脏中TdTom的表达情况检测
  Sox9-Flp/Ai65D小鼠经尾静脉注射特异性作用于肝细胞的腺相关病毒AAV8-TBG-Cre后,将肝脏中表达过SOX9的肝细胞标记为红色荧光阳性。
  3、Sox9-Flp/Ai65D小鼠示踪肝癌细胞的起源
  AAV8-TBG-Cre处理Sox9-Flp/Ai65D小鼠,并按照上述STZ-HFD和DEN×1次的造模方式,诱导小鼠发生肝癌,检测肝癌细胞表达TdTom的情况。
  三、肝脏特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用
  1、Sox9LKO小鼠肝脏中SOX9表达情况的检测
  将Sox9f/f小鼠与白蛋白驱动Cre重组酶表达的Alb-Cre小鼠杂交获得肝脏特异性敲除SOX9的Sox9LKO小鼠。提取Sox9f/f和Sox9LKO两组小鼠肝脏组织蛋白,Western blotting检测肝脏组织中SOX9的表达量;免疫组化检测肝组织中SOX9的原位表达情况。
  2、观察肝脏特异性敲除SOX9对小鼠肝癌发生的影响
  选择对照组Sox9f/f小鼠和肝脏特异性敲除SOX9的Sox9LKO小鼠,按上述三种方式诱导小鼠发生肝癌。在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤数量和肿瘤大小等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。
  四、肝细胞特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用
  1、Sox9HKO小鼠肝脏中SOX9的表达情况的检测
  腺相关病毒AAV8-TBG-Cre处理雄性Sox9f/f小鼠后,特异性敲除肝细胞Sox9基因获得Sox9HKO小鼠,对照病毒AAV8-TBG-Control处理的Sox9f/f小鼠为对照小鼠。STZ-HFD造模后,分离小鼠原代肝细胞,提取mRNA和蛋白。RT-PCR和Western blotting检测两组小鼠SOX9的表达。
  2、肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生的影响
  选择雄性Sox9f/f小鼠经AAV8-TBG-Cre或AAV8-TBG处理后,获得Sox9HKO小鼠和对照小鼠,以STZ-HFD和DEN×1次的方法诱导小鼠原发性肝癌。并在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤大小、数量等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。
  3、肝脏特异性敲除SOX9与肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生作用的对比
  在STZ-HFD和DEN×1次两种肝癌模型中,对比Sox9HKO小鼠和Sox9LKO小鼠在同种肝癌模型中造模相同时间后,小鼠肝癌的发生情况。
  五、SOX9敲除后促进肝癌发生的机制研究
  1、RNA-seq检测SOX9基因敲除对肝癌发生过程中基因表达的影响
  DEN×25次模型中,Sox9f/f组和Sox9LKO组小鼠DEN注射13次后,抽提肝脏RNA,检测RNA质量,RT-PCR检测两组SOX9的表达,确定Sox9LKO组SOX9表达下调后,委托生物公司测序分析,寻找SOX9敲除组与对照组差异表达的基因。
  2、根据RNA-seq分析结果,选择Wnt通路发生变化的基因,用测序样本的RNA对RNA-seq结果进行验证。
  3、进一步在STZ-HFD模型的Sox9f/f和Sox9HKO小鼠(高脂喂养8周)的原代肝细胞和肝组织RNA中验证上述Wnt通路变化的基因。
  4、Western blotting检测不同模型的Sox9LKO小鼠和Sox9HKO小鼠中,与肝癌发生相关的信号通路的变化。
  结果:
  一、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件
  1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠成功构建
  抽取Sox9-Flp/Ai65D小鼠的鼠尾基因组DNA行普通PCR,琼脂糖凝胶电泳观察突变条带,选择双基因阳性的即可作为示踪小鼠。
  2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠注射AAV8-TBG-Cre后,表达过SOX9的肝细胞特异性表达TdTom,并保持数量稳定
  3、表达过SOX9的肝细胞不是肝癌细胞的唯一来源
  二、肝脏特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  1、Sox9LKO小鼠肝脏中胆管细胞和肝细胞中SOX9表达都显著减少
  2、肝脏特异性敲除SOX9促进小鼠发生肝癌
  肝功能指标检测:与对照组小鼠相比,Sox9LKO组小鼠血清转氨酶ALT、AST升高约2倍、总胆红素升高约3倍,总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三脂(TG)也升高,胆汁淤积指标碱性磷酸酶(ALP)和总胆汁酸(TBA)分别升高约4倍和30倍。
  三、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  1、Sox9HKO小鼠肝细胞中SOX9显著减少
  RT-PCR及Western blotting检测STZ-HFD造模后的对照组和Sox9HKO组原代肝细胞中SOX9的表达量,可见Sox9HKO组SOX9表达较对照显著降低。
  2、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生
  (1)STZ-HFD模型
  病理学染色发现:Sox9HKO组和Sox9LKO组脂肪变程度较对照组更轻,Sox9LKO组小鼠肝脏汇管区胆管细胞增生明显,且有显著的纤维化,而Sox9f/f组和Sox9HKO组则未见明显增生,亦无纤维化发生。CK19染色显示Sox9f/f组和Sox9HKO组无明显CK19阳性细胞增多和胆管反应,而Sox9LKO组胆管细胞显著增多,汇管区胆管反应明显增强。
  分析各组小鼠血清肝功能指标发现:Sox9HKO组与对照组相比,ALT、AST、Tbil、TBA、ALP都无明显差异,而Sox9LKO组小鼠以上各项指标均较Sox9HKO组和对照组升高。
  (2)DEN×1次模型
  肝脏组织学分析可见到与STZ-HFD模型一致的结果。天狼猩红染色示Sox9HKO组和Sox9f/f组无明显纤维化,Sox9LKO组汇管区出现轻度的纤维化。CK19染色显示Sox9f/f组和Sox9HKO组无明显胆管反应,而Sox9LKO组胆管反应增加。
  与对照组相比,Sox9HKO组各项肝功能指标无明显变化,而Sox9LKO组则较Sox9HKO组和对照组升高。
  3.胆管细胞SOX9缺失引起胆管反应和肝纤维化对肝癌发生具有促进作用
  Sox9HKO组和Sox9LKO组在STZ-HFD和DEN×1次两种模型中,可见造模至相同时间,Sox9LKO组较Sox9HKO组发生肿瘤更早,肿瘤更多,更大。组织病理学染色显示Sox9LKO组较Sox9HKO组出现显著的肝纤维化和胆管反应。
  四、SOX9敲除后促进肿瘤发生的机制可能与Wnt通路、AKT通路和ERK通路的活化相关。
  (1)利用RNA-Seq技术寻找造模后Sox9f/f组和Sox9LKO组差异表达的基因并进行分析后发现:SOX9敲除后的差异基因以表达上调的基因为主,KEGG分析发现Sox9LKO组肿瘤相关信号通络基因表达上调,GSEA分析可见Wnt、Hedgehog、趋化因子和肿瘤相关信号通路活化。
  (2)RT-PCR法验证RNA-seq结果:检测所用测序样本(DEN×13次肝组织RNA)中Wnt通路上调基因:wnt5a、wnt7a、wnt7b、FZD2、FZD6等,RT-PCR结果与RNA-seq一致。
  (3)Wnt通路表达上调的基因,在STZ-HFD模型Sox9HKO小鼠的原代肝细胞和肝组织RNA中的表达和对照组相比也明显上调。
  (4)Western blotting检测发现,不同的肝癌模型中,肝脏特异性敲除SOX9和肝细胞特异性敲除SOX9都可见p-AKT和p-ERK表达上调。
  结论:
  1、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件。
  2、肝脏特异性敲除SOX9导致胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。
  3、肝细胞特异性敲除SOX9不会引起胆管反应和肝纤维化,但仍然促进HCC发生。
  4、胆管细胞缺失SOX9可能引起胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。
  5、敲除SOX9后,Wnt、AKT和ERK等通路活化,参与促进肝癌发生。SOX9在肝癌的发生和发展中可能起不同的作用。
[硕士论文] 黄磊
外科学(胸心外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,手术是治疗食管癌最重要的手段。经颈胸腹三切口食管癌根治术(McKeown术式)是治疗食管癌的一种主要的手术方式。McKeown术式基本过程包括食管次全切除,颈、胸、腹区域淋巴结清扫及消化道重建,手术包括颈胸腹三切口。其中颈部切口主要进行颈部淋巴结清扫及消化道吻合操作。传统上外科医师施行McKeown手术多采用左颈切口,我们在临床应用中发现施行McKeown手术时采用右颈切口具有一定优势,但目前尚缺少经右颈部与经左颈部McKeown手术治疗食管癌疗效的比较。本研究通过对经右颈部与经左颈部吻合McKeown手术治疗的食管癌患者进行观察对比,比较两组患者围手术期临床病理特征及近期、中期预后,以评估经右颈McKeown手术的围手术期安全性、有效性、根治性以及近中期临床疗效,为未来食管癌手术颈部入路选择提供依据。
  方法:
  本研究为回顾性分析。回顾2012年10月01日至2016年12月31日之间在长海医院胸外科进行McKeown手术的食管癌病例,经过纳入排除标准筛选后,按颈部吻合部位分为右颈组与左颈组。采用倾向性评分匹配法进行选择,最后每组各纳入患者141例共282例进行研究。收集两组患者的临床病理资料并进行随访,获得预后资料。通过比较两组患者一般临床资料、手术相关资料、术后病理资料、围手术期并发症及死亡情况、术后治疗及近中期预后情况,总结经右颈与经左颈吻合McKeown手术治疗食管癌的优缺点。
  结果:
  1、右颈组与左颈组的性别构成、年龄、身体质量指数(Body mass index,BMI)、既往合并症、术前生理指标、肿瘤位置、分期等基线资料差异均无统计学意义,两组患者具有可比性。
  2、两组患者之间的手术时间、出血量、颈部引流管放置时间、胸管放置时间、术后住院时间差异无统计学意义。但右颈组颈部引流量更少,右颈组平均引流101.31±110.93ml,左颈组平均引流147.26±239.41ml,差异有统计学意义(P=0.047)。
  3、两组患者的瘤体长度、R0切除率、肿瘤浸润深度、清扫淋巴结数目、阳性淋巴结数目差异均无统计学意义。
  4、术后总的并发症发生率右颈组为30.50%,左颈组为36.88%,差异不具有统计学意义(P=0.257)。其中右颈组吻合口瘘发生率低于左颈组,右颈组吻合口瘘发生率4.26%,左颈组吻合口瘘发生率10.64%,差异具有统计学意义(P=0.041)。其余围手术期消化系统、呼吸系统、心血管循环系统并发症及喉返神经损伤等并发症差异均不具有统计学意义。
  5、两组患者术后近期、中期预后相似,右颈组1年无病生存率83.7%,3年无病生存率78.4%,左颈组1年无病生存率87.8%,3年无病生存率75.4%,无病生存曲线差异不具有统计学意义(P=0.936)。右颈组1年总生存率93.8%,3年总生存率80.5%,左颈组1年总生存率93.5%,3年总生存率80.8%,总生存曲线差异也不具有统计学意义(P=0.652)。
  结论:
  经右颈吻合McKeown术式治疗食管癌围手术期安全性、有效性、根治性与经左颈吻合McKeown术式相当。相比经左颈吻合,经右颈吻合McKeown术式吻合口瘘发生率更低。经右颈吻合与经左颈吻合McKeown术式近中期预后相似。经右颈吻合McKeown术式治疗食管癌安全可行,具有一定优势。
[博士论文] 刘文斌
特种医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中国最重要的死亡原因之一。体细胞变异是HCC进化的基础,而HBV基因整合是HBV-HCC特有的突变类型,也是HBV直接损伤人体基因组的方式。大量研究发现HBV整合事件在HCC基因组中积累,提示这类突变可以赋予变异细胞生存优势,进而促进癌症发生。目前该领域的研究存在以下局限性:首先,关于HBV整合的研究都局限在基因组水平,缺乏转录组水平的研究。基因组水平的HBV整合突变影响基因转录的方式和程度尚不明确;前基因组RNA的合成与逆转录是HBV复制的关键步骤,目前不能确定在相关过程中病毒RNA是否可以直接整合到人体RNA链。其次,个体间的HBV突变谱差异较大,阻碍了HBV整合突变的有效检测和全面分析。第三,目前仅有TERT和MLL4基因被证实为常见的HBV整合基因,上述2种基因中的HBV整合突变仅占此类突变总量的2%以下;其余大量HBV整合突变的促癌功能尚待研究。最后,HBV整合的发生机制也不明确。载脂蛋白BmRNA编辑多肽3家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide3,APOBECE3)是诱导体细胞突变和病毒突变产生的重要分子,可以诱导人体和病毒核酸链断裂,但是尚无研究阐明APOBEC3对HBV整合的作用。HBV-HCC的发生发展是遗传、免疫和病毒因素共同作用的进化过程。研究APOBEC3的单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)在病毒突变和癌症发生中的作用对明确HBV致癌过程有重要意义。
  研究目的:
  明确HBV整合在基因组和转录组水平的分布规律;研究HBV整合的发生机制以及这类突变在肝细胞癌进化过程中的作用;阐明APOBEC3致突变基因与HBV整合的关系;分析APOBEC3遗传多态性与病毒清除、病毒突变和HCC风险的相关性;为HBV感染者的癌症防治提供新靶点。
  研究方法:
  应用50例HCC患者的癌和癌旁组织进行HBV-捕获测序以及RNA测序。以HBV各基因型的标准序列为基础,利用患者体内的HBV突变信息进行校正,生成每个患者个体化的病毒参考序列。将测序片段与人核基因组、线粒体基因组以及病毒基因组参考序列进行比对,确定HBV整合突变。随机挑选80个DNA和RNA水平的整合位点,以巢式PCR和Sanger测序的方法进行验证。分别利用标准化配对测序片段数(support PE-assembled reads,NNSS)和嵌合测序片段数(reads)评价DNA和RNA水平的整合突变信号强度。在DNA水平,NNSS≥1的HBV整合突变纳入分析;在RNA水平,reads≥2的HBV整合突变纳入分析。以x2检验分析HBV整合突变在人基因组、病毒基因组以及人群间的分布特征。为排除低频随机整合的影响,以HBV整合突变信号强度的上四分位点为界值,筛选高强度的整合突变,重复验证HBV整合突变分布规律。采用Wilcoxon非参数秩和检验分析HBV整合突变的数量差异;以t检验或方差分析评价基因表达水平的差异;以Pearson相关性检验分析APOBEC3表达与HBV整合突变的相关性;以Log-Rank检验评价HBV整合突变对HCC患者预后及复发的影响;以KEGG和GSEA分析确定HBV整合突变显著影响的信号通路和生物功能。P<0.05则判定差异具有统计学意义。下载HCC人群的高通量测序和表达谱公共数据库,包括HBV捕获测序数据库(SRP068532,426例样本)、癌症基因组联盟(The Cancer Genome Atlas,TCGA)的HCC随访队列数据库(LIHC,366例)以及基因表达数据集(Gene Expression Omnibus,GEO)的HCC表达谱数据库(GSE14520,242例)。利用上述数据库对本研究发现的HBV整合突变规律及功能进行验证。挑选APOBEC3A、APOBEC3B、以及DNA修复基因UNG的4个SNP位点进行研究。使用荧光定量PCR的方法对1449例健康对照和3772例HBV感染者(包括1271例HCC患者)进行SNP分型,使用巢式PCR扩增病毒preS和BCP区片段,使用MEGA软件分析病毒突变。用logistic回归计算SNP基因型与病毒清除、病毒突变以及HCC风险的相关性。
  研究结果:
  1.DNA和RNA水平的HBV整合规律有显著差异
  以HBV突变信息校正参考序列,可以提高HBV整合事件的检出率。本研究在基因组和转录组水平分别检测到HBV整合突变2777个和2918个。在DNA水平,癌症组织中的HBV整合数量显著高于癌旁组织(P=1.0×10-4);HCC术后未复发人群→HCC术后晚期复发人群(大于2年)→HCC术后早期复发人群(小于等于2年)的癌症组织中,HBV整合突变数量逐渐升高。在RNA水平,癌症组织中的HBV整合数量显著少于癌旁组织(P=1.2×10-3);各HCC进化阶段的人群之间,HBV整合突变数量没有显著差别。DNA水平的HBV整合突变仅有0.5%分布在线粒体基因组,而RNA水平的HBV整合突变则有19.43%分布在线粒体基因组。这一差别在验证队列中得到重复。
  2、HBV X片段是整合入人体基因组的主要片段
  HBV X区(nt1374-nt1835)的整合事件数在DNA水平、RNA线粒体基因组水平以及RNA核基因组水平的比例分别为31.6%,35.1%,以及58.0%,显著高于随机整合率(14%)。在高信号强度的HBV整合突变中,HBV X片段的比例更高。
  3、HBV高频整合基因
  在DNA水平,292个基因在≥2个样本中均检测到HBV整合突变,定义为重复整合基因;其中仅有11个(3%)在RNA水平也被鉴定为重复整合基因;只有2个(MLL4和TERT,0.6%)可以在同一样本的DNA和RNA数据中发现高度一致的HBV整合突变。在DNA水平,TERT的HBV整合突变检出率最高(16%),全部分布在启动子区。在RNA水平,ALB的HBV整合检出率最高(51%);同时,全部13个线粒体编码基因均发生了HBV整合突变,而且重复检出率均在13.2%-43%。
  4、HBV整合与基因表达的相关性
  在DNA水平,TERT启动子区的HBV整合与TERT基因在癌症组织中的表达升高有关(P=3.89×10-8);同时TERT上游3kb区域中HBV X片段的反向插入也有促进TERT表达的趋势;MLL4、MT-ND4等重复整合基因的表达水平与HBV在DNA链的整合无关。在RNA水平,MLL4、ALB、HP、MT-CO2和MT-CYB上的HBV整合突变与基因表达水平升高有显著相关性。
  5、HBV整合突变相关的信号通路
  DNA水平的整合突变显著富集于PI3K-mTOR通路和染色质重塑通路,通路整体整合突变率分别为30%和20%。RNA水平的整合突变显著富集于IL2-STAT5和IL6-STAT3等炎症通路。
  6、HBV整合对HCC预后的影响
  癌旁组织中DNA水平的HBV整合总数过高预示早期复发(P=0.012),该作用在验证队列中得到重复(P=0.014)。RNA水平上,癌旁组织中核基因组以及线粒体基因组上的整合突变总数过高,均可以预示HCC患者整体生存预后不良(P=0.027,0.033)。
  研究结论:
  1、HBV整合突变的分布规律在DNA和RNA水平存在显著差异,绝大多数RNA水平的HBV整合突变不是由DNA的整合突变转录而来,而是在RNA链上直接插入病毒片段导致。
  2、RNA水平的HBV整合显著影响线粒体有氧氧化呼吸链的相关基因,DNA水平的HBV整合基因显著富集致癌通路;基因组和转录组水平的HBV整合事件数量过高均与预后不良有显著相关性,初步明确了HBV整合的促癌作用。
  3、发现RNA水平整合突变的发生与致突变基因APOBEC3A、APOBEC3B的表达呈正相关,同时也与体内炎症免疫通路密切相关;初步证明炎症通路刺激下诱变分子表达升高可以促进HBV整合突变的产生。
  4、APOBEC3A、APOBEC3B以及UNG的表达水平可以影响HCC患者预后,但APOBEC特征性的突变仅在非HBV感染导致的HCC患者中与预后相关;APOBEC3B和UNG的SNP位点(rs2267401和rs3890995)可以通过促进高危HBV突变产生,进而增加癌症风险;提示在HBV-HCC中,APOBEC3A、APOBEC3B和UNG不是通过直接损伤人体基因组致癌,而是通过与HBV相互作用导致癌症发生。
[硕士论文] 李风伟
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,高居于癌症相关死亡率第三位1,2。全球超过一半的肝细胞癌死亡病例发生在中国1。目前肝细胞癌的治疗方法包括手术切除、肝移植、介入治疗、放化疗及靶向治疗。手术切除仍是治疗肝细胞癌的主要治疗方法,然而根治性切除后复发率高、转移率高仍是影响肝细胞癌患者术后预后的主要因素。因此,探索影响肝细胞癌生长、侵袭、转移的因素并针对此开发新的治疗措施,是当今肝细胞癌研究中的重点和难点。
  腺苷(Adenosine)是合成三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的前体物质,同时,作为腺嘌呤核苷酸代谢的中间产物,腺苷几乎产生于所有的细胞,普遍存在于机体的各个系统。腺苷通过A1、A2A、A2B和A3四种腺苷受体作用于人体各个系统,参与多种生理病理过程的调节。越来越多的证据表明,腺苷对人体的多种疾病的发生过程都有十分重要的调节作用3。目前的研究发现,腺苷通过腺苷A2A受体参与了体内的多个病理生理过程的调节,在肿瘤微环境中亦起到了非常重要的调节作用。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体抑制了免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。大量研究报道了选择性腺苷A2A受体拮抗剂可以重新激活肿瘤组织中的免疫细胞的免疫作用,因此,选择性腺苷A2A受体拮抗剂有望用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体在胸腺瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、人头颈部鳞状细胞癌中促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用已有相关研究报道4-7。
  目前,国内外尚无有关腺苷A2A受体在肝细胞癌中的表达及作用的研究报道。本研究拟通过实验研究腺苷A2A受体在肝癌组织及肝癌细胞中的表达状况,对肝细胞癌的增殖、凋亡、血管生成、侵袭的影响,并结合临床,对腺苷A2A受体表达水平与患者预后的关系作出分析,并初步探索腺苷A2A受体的下游信号通路,通过研究,初步探索腺苷A2A受体在肝细胞癌的发生、进展过程中的作用。
  方法:
  一、肝癌组织和癌旁组织中腺苷A2A受体的表达水平
  1、肝癌组织及癌旁组织的收集:所有标本均采集自东方肝胆外科医院手术切除的肝癌及癌旁组织。(经东方肝胆外科医院伦理委员会批准,患者及家属知情并同意)
  2、肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平的检测:运用qRT-PCR、Western Blot免疫印迹检测每一组肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平。
  二、体外检测肝癌细胞株和正常肝细胞株中腺苷A2A受体表达的水平
  运用实时定量PCR技术检测腺苷A2A受体在人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02中的mRNA的表达水平。
  三、构建腺苷A2A受体的干扰慢病毒载体并包装慢病毒
  通过在线软件设计腺苷A2A受体的基因序列,体外合成后经酶切连接到pds019-p16.3-SHRNA-BSD质粒载体上,获得质粒CL810_PDS19-shADORA2A,经验证,酶切验证测序结果正确。用构建好的腺苷A2A干扰慢病毒载体CL810_PDS19-ADORA2A和包装质粒共转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒液并测定滴度。获得滴度合格的腺苷A2A受体干扰慢病毒LV478_PDS19-ADORA2A。
  四、建立腺苷A2A受体稳定低表达肝癌细胞株
  用包装好的腺苷A2A受体干扰慢病毒感染HepG2靶细胞,感染72小时后观察到荧光比例分布达到90%以上,同时未观察到大面积细胞死亡的现象,用qRT-PCR技术检测腺苷A2A受体在两组中的表达水平,结果表明,实验组的腺苷A2A受体mRNA水平较对照组明显降低,沉默效率>70%。说明所构建的慢病毒对腺苷A2A受体表达的干扰效果好,可以用于研究腺苷A2A受体的功能及机制的实验。
  五、体外检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响
  为了检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响将通过质粒转染沉默表达腺苷A2A受体的肝癌细胞设置为实验组(shA2A组),将转染无序序列质粒的肝癌细胞设置为阴性对照组(NC组),将没有转染任何序列和质粒的肝癌细胞设置为空白对照组(KB组)。我们的预实验结果显示,腺苷在100μM浓度时,对肝癌细胞的促增殖、促侵袭、抗凋亡等作用最强,因此为研究腺苷对肝癌细胞生物学行为的影响,同时将三组细胞加入到100μM浓度的腺苷中,观察在100μM的腺苷环境中,肝癌细胞各种生物学行为的变化。因此同时设置了shA2A+adenosine组、NC+adenosine组和KB+adenosine组。一共有6组细胞进行体外细胞实验。
  1、腺苷A2A受体沉默对肝癌细胞株增殖的影响:CCK-8法检测六组细胞在培养24小时、48小时、72小时和96小时480nm处的相对吸光度值(OD值),并绘制相对吸光度曲线。
  2、腺苷A2A受体沉默对细胞凋亡的影响:将六组细胞AnnexinⅤ和7-AAD细胞染色后,用流式细胞仪检测其凋亡发生的比例。
  3、腺苷A2A受体沉默后对VEGF表达的影响:qRT-PCR检测六组细胞VEGFmRNA的表达量。
  4、腺苷A2A受体沉默对血管生成能力的影响:取等量六组细胞分别与HUVECs细胞共培养24小时后,在倒置200倍显微镜下观察HUVECs在基质胶上的管样结构生成数量,并随机取三个视野计算血管生成长度。
  5、腺苷A2A受体沉默后对肝癌细胞侵袭能力的影响:将等量的六组的细胞分别接种于有胶质的transwell小室,24小时后结晶紫染色,随机选取3个高倍镜(×400)视野,计数下室的细胞数即为穿透胶的细胞数。
  六、腺苷A2A受体高表达与肝癌患者预后的关系
  采用SPSS23.0软件进行数据分析。应用Kaplan-Meier法绘制总生存期(overall survival,OS)和无瘤生存期(disease free survival,DFS)曲线,应用Log-rank检验比较不同组生存曲线的差异。应用Cox比例风险回归模型行OS和DFS影响因素的单因素分析和多因素分析。采用X-tile软件确定腺苷A2A受体表达水平的最佳截断值为57.7,使2组患者进行术后生存期比较时P值最小(Pmin=0.0023),检验水准(α)为0.05。
  七、腺苷A2A受体介导的下游信号转导通路初探
  运用Western Blot免疫印迹的检测方法,检测六组细胞中AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达水平在腺苷A2A受体沉默前后的变化。
  结果:
  1、qRT-PCR的结果表明,腺苷A2A受体在肝癌组织中的相对表达量为2.015±0.078,在癌旁组织中的相对表达量为1.329±0.071,肝癌组织中腺苷A2A受体的表达量高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)。Western-blot结果也显示,与癌旁组织相比,肝癌组织内的腺苷A2A受体的表达水平升高。
  2、qRT-PCR的结果表明,HepG2细胞株的腺苷A2A受体的表达量明显高于L02细胞系,差异有统计学意义。
  3、CCK-8细胞增殖实验检测腺苷A2A受体表达沉默后,腺苷对肝癌细胞株的促增殖作用基本消失。
  4、流式细胞仪的结果显示,腺苷A2A受体沉默抑制了腺苷的抗凋亡作用。
  5、qRT-PCR的结果表明,腺苷A2A受体沉默减弱了腺苷促进VEGF表达的作用。
  6、HUVECs血管生成实验的结果表明,腺苷A2A受体沉默后腺苷促血管生成作用减弱。
  7、Transwell细胞侵袭实验表明,腺苷A2A受体沉默后腺苷促肝细胞癌侵袭能力减弱。
  8、腺苷A2A受体高表达患者的术后1年、3年OS率低于腺苷A2A受体低表达患者。多因素分析的结果表明,腺苷A2A高表达为影响肝癌患者OS的独立危险因素。
  9、Western Blot的初步结果表明,腺苷能够促进p-AKT和p-ERK蛋白的表达,腺苷A2A受体沉默抑制p-AKT和p-ERK蛋白表达。
  结论:
  我们的研究发现,腺苷A2A受体在肝癌组织和肝癌细胞中高表达。腺苷具有促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡、促进血管生成、促进肝癌细胞的侵袭的作用。腺苷A2A受体沉默后,腺苷对肝癌细胞生长的正向调节作用明显减弱。腺苷A2A受体高表达是影响肝细胞癌患者OS的独立危险因素。对腺苷A2A受体的下游信号通路的初步研究表明,腺苷A2A受体可能介导了PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK两条信号通路。
[博士论文] 王蒙蒙
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝癌是目前威胁人类健康的主要恶性肿瘤类型之一。在我国,肝癌的发病率处于所有恶性肿瘤的第四位,死亡率位居第三位。由于大部分患者确诊时肿瘤已处于中晚期,手术治疗后复发率、转移率高,因而远期生存质量差,五年生存率低。早期诊断、早期干预对肝癌患者的预后改善至关重要。血清甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌诊断标志物。但其敏感性仅为60~70%,且在部分肝脏良性疾病中表达上升,诊断效能不能满足临床需要。因此,寻找更加理想的生物标志物或多参数诊断模型是肝癌诊疗研究的重要方向。此外,对于影响肝癌预后的重要病理因素,采用血清无创性检测方法做出预测,对患者的个体化诊疗和临床医生治疗方案的制定具有重要价值。
  既往的肿瘤生物标志物研究主要集中在蛋白及核酸研究中,忽略了糖链或聚糖这类重要的生物大分子。糖链通过共价结合的方式连接在蛋白多肽骨架的特定氨基酸上的过程称为蛋白质糖基化。N-糖基化和O-糖基化是两种主要的糖基化类型。人体内大约70%的蛋白质是糖蛋白。糖基化是最常见、最复杂的蛋白质翻译后修饰形式,对蛋白的结构和功能具有重要的调节作用。糖链的功能涉及细胞粘附、细胞间相互作用、信号转导、免疫调节等一系列生物学过程。大量研究表明:聚糖直接参与了人类几乎所有重大疾病包括肿瘤的病理生理学过程。因此,对糖科学知识的了解为疾病相关的基础和临床研究提供了一个新的角度,糖组学、糖蛋白质组学、糖生物学逐渐受到关注。目前临床使用的肿瘤标志物大部分是糖蛋白,包括AFP、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等。研究癌症相关的特征性糖链对肿瘤的诊断、病程监测、预后评估及靶向治疗具有重要价值。但是糖链的复杂性及多样性为相关结构与功能研究带来巨大挑战,糖科学的发展远远落后于基因组学及蛋白组学。
  本研究采用目前主流的糖基化研究技术包括质谱、毛细管电泳等对血清特定蛋白来源的N-糖链、总血清池N-糖链结构进行分析,探究其对肝癌的诊疗价值。尝试建立位点特异的N-糖肽分析方法,对糖基化的微观不均一性进行表征。同时,通过转录组测序对异常糖基化相关的调控机制进行初步探索。
  第一部分:血清IgG来源的N-糖链结构分析及其在原发性肝癌中的诊断价值研究
  本部分采用基于基质辅助激光解吸电离-质谱的分析方法对对不同病因来源的肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)患者血清中IgG来源的糖链进行鉴定与比较。结果表明:肝癌发生过程中,血清IgG上主要的糖链结构会发生改变。总体上,与LC患者相比,HCC患者血清IgG上N-糖链的半乳糖基化水平呈下降趋势。不同的糖链结构在HCC和LC中是否存在显著性差异与病因学因素有关。对于HCV相关的HCC患者,部分糖链结构与临床病理指标如肿瘤大小、TNM分期等存在相关性。此外,血清IgG来源的N-糖链对HCC特别是AFP阴性的HCC患者具有重要的补充诊断价值。
  第二部分:血清蛋白N-糖谱与HBV相关HCC患者临床病理特征的相关性研究
  本部分采用快速、高通量的DSA-FACE技术对HBV相关的HCC患者血清蛋白N-糖表达谱进行分析,并探讨与临床病理指标间的关系。结果表明:血清聚糖结构的丰度与微血管侵犯(MVI)、肿瘤大小、门静脉癌栓(PVTT)、肝硬化、分化情况等重要的临床病理因素具有相关性。同时,尽管N-糖结构和相应的诊断模型对MVI的预测能力并不理想,但其诊断效能并不低于经典的标志物AFP。通过病例随访及数据分析发现,Peak12(NA4Fb,含一个分支岩藻糖的四天线聚糖结构)是患者术后复发的独立危险因素,Peak9'(NA3F,核心岩藻糖基化的三天线聚糖结构)、Peak12是术后死亡的独立危险因素。
  第三部分:基于LC-MS的位点特异的N-糖肽分析方法研究
  本部分以血清Alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)和纤连蛋白(Fibronectin)为研究靶蛋白,采用液相色谱-质谱技术探索建立血清糖蛋白位点特异的N-糖肽分析方法,实现对A1AT和Fibronectin糖基化的微观不均一性的表征。同时,采用免疫沉淀的方法纯化HCC和LC患者血清A1AT并进行位点特异的N-糖肽分析,发现三种差异糖肽结构,为更加精确的揭示肿瘤发生发展过程中蛋白的糖基化异常提供参考。
  第四部分肝癌细胞株(SMMC-7721)中Alpha-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除及转录组测序
  本部分在肝癌细胞株SMMC-7721中对核心岩藻糖结构形成的关键酶Alpha-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)进行敲除及验证。同时,对敲除前后的细胞采用Illumina Hiseq平台进行转录组测序,采用荧光定量PCR对测序数据进行验证。通过生物信息学分析对211个差异基因的功能进行注释并对涉及的主要信号通路(PI3K/AKT通路等)进行富集,为肝癌异常糖基化调控的分子机制研究提供线索。
  综上,本课题综合采用多种研究方法,在多个层面对血清特定蛋白的N-糖链、血清总蛋白N-糖表达谱及完整的N-糖肽进行分析,寻找与肝癌相关的异常糖基化结构,为糖科学在肿瘤临床诊疗中的应用提供依据。此外,通过转录组测序对异常糖基化的调控网络进行了初步探索,相关机制还需要进一步研究。
[硕士论文] 李善心
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的与背景:
  近年来,结肠癌的发病率与死亡率不断升高,已成为导致我国癌症病人死亡的主要原因之一。结肠癌患者的死亡多是由于发生了肝转移,约有60%以上的晚期结肠癌病人均伴有不同程度的肝转移。结肠癌的发病机理十分复杂,干细胞理论认为肿瘤组织中具有干细胞样特性的细胞才是导致结肠癌发生的原因。
  不同于一般的肿瘤细胞,肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)可以在增殖过程中保持自我更新,同时还具有较强免疫逃逸能力;虽然CSC数目很少,但可引起肿瘤的发生或者转移;而且CSC对传统的治疗手段有着相当高的抗性,容易导致肿瘤复发。因此,靶向CSC被认为是新的、有效的治疗包括结肠癌在内的大多数肿瘤的重要手段之一。
  肿瘤的发生除了伴有重要功能基因的突变以外,还与一些特定基因的表观遗传学修饰有关系。表观遗传学修饰中甲基化修饰方面的报道居多,且机制比较明确。异常的DNA甲基化,会引起一些重要的基因表达发生变化,不断累积后会使细胞功能发生改变,进而导致细胞分化或增殖异常,致使各类疾病甚至是肿瘤发生。
  有趣的是,DNA甲基化是一种特殊的、可逆的生化修饰方式,通过DNA甲基转移酶(DNMT)进行调控。研究表明,DNMT的异常表达会导致肿瘤的发生或恶化。最近的研究发现,DNMT抑制剂可通过抑制肿瘤细胞内抑癌基因的DNA甲基化使其重新表达,从而有效抑制肿瘤细胞的生长。此外,DNMT抑制剂还能靶向肿瘤内的CSC从而降低肿瘤细胞的成瘤能力。因此,抑制DNMT可能是治疗结肠癌的有效策略。然而,关于DNMT在结肠癌细胞干性维持和肝转移中的作用与机制尚不清楚。
  在本文的研究中,我们检测了DNMT抑制剂对结肠癌干性相关特征与肝转移瘤生长的影响,并全面探讨了其作用机制。
  方法与结果:
  第一部分:首先,我们通过DNMT活性检测、生长计数、克隆形成、成球实验、皮下成瘤实验和transwell侵袭实验等检测了DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-AzaDC)对结肠癌HCT116和SW620细胞生长与干性特征的影响;同时,我们通过流式细胞术和Westen blot(WB)的方法检测了5-AzaDC对结肠癌细胞CD44和CD133表达的影响,从而研究DNMT在结肠癌细胞HCT116和SW620干性维持中的作用;采用HCT116细胞裸鼠肝转移瘤模型以及HE和IHC染色等方法检测了结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,从而对体外相关结果进行验证。
  第二部分:我们采用了免疫荧光、WB、Q-PCR、MSP及IHC等方法,结合TCGA数据库研究了Wnt通路抑制基因甲基化在结肠癌细胞干性维持中的相关分子机制进行的探索;同时,通过基因过表达的方法研究了Wnt/β-catenin通路抑制基因SFRP1在HCT116细胞干性维持中的作用。结果表明:SFRP1在结肠癌临床样本和细胞株中的表达都非常低,且其mRNA的表达受甲基化的调控,而SFRP1去甲基化后可降低β-catenin的蛋白水平并抑制其入核,从而抑制Wnt通路下游靶基C-myc,CyclinD1与MMP7的转录和表达;IHC结果显示经DNMT抑制剂处理后,肝转移瘤组织细胞内的β-catenin的表达分布发生了明显的变化,β-catenin在核内和胞浆内的表达显著降低;SFRP1过表达后抑制了β-catenin的表达并降低了HCT116细胞的自我更新能力,使CD44阳性细胞比例显著减少。
  结论:
  我们的研究结果表明,DNMT可通过甲基化特异性抑制Wnt通路抑制基因SFRP1的表达,在结肠癌细胞的干性维持中发挥作用,DNMT抑制剂可以有效抑制结肠癌细胞的干性和肝转瘤的生长。因此,抑制DNMT有可能成新的对抗结肠癌的重要方法和手段之一。
[硕士论文] 卢浩
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在中国是癌症相关性死亡的第三大原因。结直肠癌的预后与肿瘤侵袭和转移的程度直接相关。尽管目前在早期诊断、根治性手术、放疗和新辅助化疗等几个方面对结直肠癌的治疗取得了可观的进展,但仍然没有令人满意的治疗方法,而且结肠癌患者的死亡由于患者的复发或转移而有所增加。对肿瘤复发和早期肿瘤转移的诊断和预防至关重要,因此有必要探索新型分子标志物对结肠癌预后的作用。但迄今为止,结直肠癌发生、复发或转移潜在的调控机制尚不清楚,很少有新的预后生物标志物被发现和鉴定。转录因子HNF3β(肝细胞核因子3β)又称FOXA2(forkhead box A2),属于肝细胞核因子(HNF)家族。由HNF1,HNF3,HNF4,HNF6和CCAAT/增强子结合蛋白(CEBPs)组成的肝细胞核因子(HNF)家族在发育中起关键作用。之前有研究表明,HNF3转录因子,特别是HNF3α/FOXA1,HNF3β/FOXA2和HNF3γ/FOXA3在胃肠道分化中起重要作用。HNF3βmRNA在胚胎发生时首先表达,并在前原条和节间的原肠期中观察到,随后在肠中表达。由于会导致节点和脊索发育失败,HNF3β缺陷可导致胚胎死亡。它不仅在胚胎发育(包括节点,神经系统和内胚层衍生结构的形成)中起着关键作用,还通过调节正常胆汁酸和脂质体内平衡调节出生后发育。许多研究表明,HNF3β低表达与肿瘤发生、进展和转移密切相关,这在几种肿瘤包括肝细胞癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和甲状腺癌中都有报道。然而,HNF3β在结直肠癌中的作用尚未见有研究,HNF3β在结直肠癌进展中的作用仍不明确。在本研究中,我们分析了HNF3β在174例结肠癌患者中的表达水平及其对患者的预后作用以及对结肠癌细胞的肿瘤生物学功能的影响。
  第一部分 HNF3β在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义
  目的:研究结直肠癌组织标本中HNF3β的表达情况,分析其表达与患者临床参数之间的关系,并研究其对患者预后的影响。
  方法:取8例结直肠炎症组织、14例结直肠低级别上皮内瘤变、18例结直肠高级别上皮内瘤变、174例结直肠肿瘤切除标本和3例正常结直肠组织,通过免疫组化染色方法检测HNF3β蛋白在各组织中的表达情况。以上所有组织标本均来源于海军军医大学第二附属医院长征医院普通外科在2010年10月-2011年9月收治采集的患者标本。这些患者在术前均未接受新辅助化疗或放疗,术后Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者按Xelox化疗方案(奥沙利铂和卡培他滨)进行化疗。通过从患者的电子病历中搜集和电话随访的方法整理出病人的临床资料和随访数据,采用Yates校正或Fisher精确概率法卡方(x2)检验分析和Spearman等级相关分析将NF3β与患者临床数据之间进行相关性统计学分析;Kaplan-Meier法绘制结直肠癌病人的生存曲线,Cox比例风险回归模型进行多变量分析,评价各个指标是否为患者的预后独立因素。
  结果:HNF3β蛋白在3例正常结直肠上皮组织、8例结肠直肠炎症组织、14例结直肠低级别上皮内瘤变组织和18例高级别上皮内瘤变组织中高表达,在174例结直肠癌组织中低表达或不表达。在174例结直肠癌组织标本中,56%的标本为低表达“+”或不表达“-”。并且统计分析后发现,HNF3β在结直肠癌和非癌性组织中的染色差异具有统计学意义,P小于0.0001。由此证明HNF3β在结直肠癌中低表达或不表达。HNF3β低表达与结直肠癌UICC临床分期、T分期、淋巴结转移数目、远处转移有无和患者预后密切相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、组织学分型、肿瘤分化程度、肿瘤所在部位无关(P>0.05)。单变量分析显示HNF3β低表达和UICC临床分期、侵袭程度、淋巴结转移和远处转移与否一样,都与患者预后密切相关(P<0.001)。用Cox比例风险回归模型进行多变量分析,结果显示:HNF3β低表达(HR:0.601,95%CI:0.387-0.933,P=0.023),远处转移(HR:5.890,95%CI:1.028-33.772,P=0.046)和UICC临床分期(HR:3.737,95%CI:1.611-8.668,P=0.002)都是患者总体生存期的独立预测因素,而HNF3β低表达(HR:0.606,95%CI:0.392-0.937,P=0.024),淋巴结转移(HR:0.171,95%CI:0.032-0.899,P=0.037)和UICC临床分期(HR:9.935,95%CI:2.214-44.574,P=0.003)是患者无进展生存期的独立预测因素。
  结论:从蛋白质水平证实HNF3β在结直肠癌组织中低表达或不表达,而在正常结直肠上皮组织、结直肠炎症组织、低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变等非癌组织中高表达。HNF3β的表达与结直肠癌UICC临床分期、T分期、淋巴结转移情况、远处转移和患者预后密切相关(P<0.05),低表达HNF3β的结直肠癌患者有着极差生存期,HNF3β蛋白的表达是结直肠癌患者预后的独立预测因素。
  第二部分 HNF3β对结直肠癌SW480细胞系增殖、侵袭和转移的影响及其可能机制
  目的:研究HNF3β对结直肠癌SW480细胞株细胞增殖、侵袭和转移的影响,并观察小鼠体外成瘤HNF3β对瘤体重量的影响,并对其可能机制进行初步探讨。
  方法:构建HNF3β慢病毒和空载病毒,分别转染sw480细胞,建立HNF3β过表达结直肠癌SW480细胞株及空载病毒SW480细胞株,利用蛋白印迹法(western blot)检测转染细胞中HNF3β的表达情况,从蛋白水平证实细胞模型构建成功。通过MTT法细胞增殖实验检测HNF3β过表达后细胞增殖能力的变化,通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验研究HNF3β过表达后细胞迁移能力的变化。裸鼠成瘤实验检测在动物体内HNF3β过表达后对结直肠癌肿瘤生长的影响。建立HNF3β过表达结直肠癌SW480细胞株及空载病毒SW480细胞株,利用蛋白印迹法(western blot)检测JAK/STA信号通路中的关键蛋白:IL6,JAK1和STAT3的表达情况。
  结果:与载体病毒SW480细胞系和正常SW480细胞株相比,SW480细胞株过表达HNF3β的细胞增殖明显减少,尤其是在第4,5,6天时(P<0.05)。结肠癌SW480细胞增殖,侵袭和迁移实验中也有类似现象(P<0.05)。结直肠癌SW480细胞系在裸鼠致瘤性实验中过表达显示,过表达组肿瘤重量显着低于正常组和负荷病毒组(P<0.05)。在体外结直肠癌SW480细胞HNF3β过表达后,发现JAK/STA信号通路中的关键蛋白:IL6、JAK1和STAT3表达下调。
  结论:HNF3β的低表达与结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移特性有关,体内裸鼠移植瘤模型也证实过表达HNF3β裸鼠的瘤体更轻,这提示HNF3β可能为结直肠癌的一个抑癌基因。HNF3β可能通过JAK/STA信号通路抑制结直肠癌细胞SW480的增殖、侵袭和转移,提示HNF3β可能是结直肠癌的一个抑癌基因,但对其机制以及上下游通路需进一步探讨。
[博士论文] 潘雪峰
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本课题共分为三个部分,首先研究了lncRNA PVT1在CRC组织中的异常表达与肿瘤患者临床病理特征之间的关系,然后探讨了该基因在CRC细胞中的功能以及对化疗敏感性的影响,最后评价了lncRNA PVT1表达对恶性肿瘤患者的预后价值。
  第一部分 LncRNA PVT1在CRC组织中的表达及其意义
  目的:研究lncRNA PVT1在CRC患者癌组织和癌旁正常组织中的表达差异及其表达水平和患者临床病理特征及预后之间的关系。
  方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,检测了130例CRC患者术后癌组织和癌旁正常组织标本中lncRNA PVT1的相对表达量,同时采集患者的临床病理特征信息及预后信息。
  结果:130例CRC患者中有94例患者的癌组织中lncRNA PVT1相对表达量高于癌旁正常组织,36例低于正常组织,高表达率为72.31%。预后分析结果表明lncRNA PVT1低表达和高表达患者1年、3年的DFS分别为93.8%和81.1%、69.3%和44.7%,中位DFS分别为44个月(95%CI:36.558-51.442)和26个月(95%CI:12.512-39.488),差异具有统计学意义(X2=5.307,p=0.021,log-rank test)。COX模型单变量分析和多变量分析结果表明患者的TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期vs.Ⅰ/Ⅱ期:RR=6.342,95%CI:2.994-13.433,p<0.001)和lncRNA PVT1表达水平(高表达组vs.低表达组:RR=3.744,95%CI:1.493-9.392,p=0.005)与CRC患者的DFS密切相关,LncRNA PVT1高表达是CRC患者预后不良因素,高表达患者预示着更短的DFS时间,LncRNA PVT1表达水平和肿瘤TNM分期均是CRC患者DFS预后的独立影响因子。以lncRNA PVT1做为CRC的诊断标志物制作了ROC曲线,ROC曲线下面积AUC(Area under the ROC)为0.628(95%CI:0.560-0.696,p<0.001),诊断CRC的敏感度和特异度分别是69.2%和58.5%。不同CRC分期患者中癌组织lncRNA PVT1高表达(fold change≥1.725)所占的患者比例均高于血浆CEA水平升高(>5ng/ml)的患者比例,尤其在Ⅰ期患者中二者之间存在显著性差异(X2=41.717,p<0.0001)。
  结论:LncRNA PVT1在CRC患者癌组织中相对于正常组织呈现高表达,高表达率72.31%,差异倍数(2-△△CT)均值为2.712倍。LncRNA PVT1表达水平和CRC患者的肿瘤TNM、组织分化程度、血浆CEA表达水平关系密切,其高表达预示着患者更晚的肿瘤分期、更差的组织分化以及更高的血浆CEA水平。另外,CRC患者lncRNAPVT1表达水平越高,越容易出现淋巴结转移和远处转移,而其表达水平与肿瘤侵润深度无关。LncRNA PVT1高表达是CRC患者不良预后因素,高表达患者预示着更短的DFS,LncRNA PVT1表达水平和肿瘤TNM分期均是CRC患者DFS预后的独立影响因子。LncRNA PVT1表达水平有助于CRC的诊断,尤其是在CRC患者早期其异常表达程度远远高于血浆CEA水平,这一结果预示lncRNA PVT1异常表达早于血浆CEA水平升高,具有早期诊断CRC的潜在价值。
  第二部分 LncRNA PVT1在CRC细胞中功能及对其化疗敏感性的影响
  目的:探讨lncRNA PVT1在CRC细胞中的表达、生物学功能以及沉默lncRNA PVT1与CRC化疗敏感性的影响。
  方法:首先RT-qPCR法检测RKO、HT-29、HCT-15、LoVo等8株CRC细胞中lncRNA PVT1的表达;我们以lncRNA PVT1相对表达量最高的的RKO细胞作为重点研究对象,通过siRNA干扰技术下调lncRNA PVT1的表达,应用FACSAriaⅡ流式细胞术、EdU细胞增殖实验、细胞划痕实验、CCK-8细胞增殖/毒性实验以及平板克隆形成实验,研究lncRNA PVT1表达对RKO结肠癌细胞生物学行为的影响以及沉默lncRNA PVT1表达对CRC化疗敏感性的影响。并且初步探讨了lncRNA PVT1表达与EMT途径相关蛋白表达的调控关系。
  结果:经RT-qPCR检测结果表明RKO、HT-29、SW480、HCT116细胞中lncRNA PVT1表达量高于正常肠粘膜上皮细胞NCM460,RKO表达量最高,为NCM460的5.174倍;HCT-15和LoVo细胞中表达量低于NCM460,差异具有统计学意义,而SW620和DLD-1细胞中lncRNA PVT1表达量与NCM460无显著差异。通过基因沉默技术下调RKO细胞中lncRNA PVT1表达后引起细胞凋亡增加,差异具有统计学意义(t=3.653,p=0.0035),并导致G0/1期细胞阻滞(p<0.001);EdU细胞增殖证实下调lncRNA PVT1的表达显著抑制肿瘤细胞的增殖过程,si-RNA组EdU染色阳性细胞为44.1%,而si-NC组为71.4%,差异具有统计学意义(t=15.40,p<0.001);另外下调lncRNA PVT1表达显著降低肿瘤细胞的迁移能力(p<0.001)和克隆形成率(p=0.0035)。CCK-8细胞毒性实验表明下调lncRNA PVT1可以降低5-FU和Oxaliplatin对RKO细胞的IC50,分别提高两种化疗药物敏感性1.82倍和2.29倍;进一步的EdU细胞增殖实验证实沉默lncRNA PVT1表达提高5-FU和Oxaliplatin对RKO肿瘤细胞的杀灭作用,差异具有统计学意义(p<0.001和p=0.0357)。并且下调lncRNA PVT1表达显著提高化疗药物5-FU对RKO细胞克隆形成的抑制作用,即降低肿瘤细胞的成瘤潜能,提高5-FU的抗肿瘤活性。另外,沉默RKO细胞中lncRNAPVT1的表达,能够上调EMT途径上皮标记物E-cadherin以及β-catentin的mRNA和蛋白表达,而下调间质标记物Vimentin的mRNA和蛋白表达水平。
  结论:本研究所检测的8株CRC细胞中RKO细胞的lncRNA PVT1表达量最高,下调lncRNA PVT1的表达能够促进细胞凋亡、阻滞细胞周期,降低RKO肿瘤细胞的增殖、迁移能力和克隆形成能力。同时,下调lncRNA PVT1能够降低5-FU和Oxaliplatin对RKO的IC50,提高这两种药物对RKO细胞的化疗敏感性和对肿瘤生长的抑制作用。另外,lncRNA PVT1的表达参与了EMT途径的调控过程,可能与肿瘤的化疗抵抗有关。因此,干预lncRNA PVT1表达有望为CRC治疗提供潜在的治疗靶点。
  第三部分 LncRNA PVT1与恶性肿瘤中的预后
  目的:定位于癌症高危区域-8q24的浆细胞瘤多样异位基因1/浆细胞瘤迁移转化基因1(PVT1)是一条重要的癌性lncRNA,大量研究表明PVT1在多种癌症中过表达并与患者的不良预后有关,该研究旨在评价PVT1表达在恶性肿瘤中的预后价值。
  方法:本meta-analysis检索Pubmed、Embase、Web of science以及万方、重庆维普等数据库中关于PVT1在恶性肿瘤中表达的相关文献,提取与患者预后相关数据,应用Stata12.0软件统计分析PVT1表达与患者临床特征及预后的关系。
  结果:通过检索纳入13篇相关文献共计1559例患者,统计结果显示过表达的PVT1预示着患者更短的总生存期(HR=1.91,95%CI:1.61-2.26,p<0.001)和无病生存期(HR=1.90,95%CI:1.46-2.48,p<0.001)或无复发生存期(HR=1.77,95%CI:1.24-2.52,p=0.002)或无进展生存期(HR=2.84,95%CI:1.67-4.82,p<0.001)。高表达的PVT1和患者的TNM分期密切相关(Ⅲ/Ⅳvs.Ⅰ/Ⅱ:OR=3.19,95%CI:2.43-4.18,p<0.001),并且这一相关性主要与肿瘤的T分期(T3/4vs.T1/2:OR=6.48,95%CI:2.93-14.31,p<0.001)和N分期(present vs.absent:OR=2.56,95%CI:1.36-4.80,p=0.003)有关,而与M分期关系不大(yes vs.no:OR=2.50,95%CI:0.72-8.66,p=0.15)。另外,本meta-analysis研究表明PVT1高表达提示患者的组织分化程度更差,差异具有统计学意义(undifferentiated/poorly vs.moderately/well:OR=1.48,95%CI:1.02-2.14,p=0.039)。
  结论:PVT1可以作为包括CRC在内的多种癌症患者不良预后的有效预测因子。
[硕士论文] 郭仲秋
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌KRAS基因突变的预测价值
  目的:探究18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌(CRC)患者KRAS基因突变的预测价值。
  方法:回顾性分析2011年11月至2017年8月在长海医院行18F-FDG PET/CT检查的150例CRC患者(男105例,女45例,中位年龄63岁)。入组条件:(1)所有CRC患者均为初诊患者,行PET/CT检查前均未行放化疗:(2)PET/CT检查后一个月内均行手术摘除原发灶并行基因检测,病理为腺癌或腺癌伴部分粘液腺癌。排除标准:(1)多原发癌;(2)其他病理类型(如神经内分泌肿瘤、鳞癌);(3)病例资料不完整者。测量18F-FDG PET/CT相关参数值包括SUVmax、MTV2.5、MTV20%、MTV30%、MTV40%、MTV50%、TLG2.5、TLG20%TLG30%、TLG40%、TLG50%。临床病理特征与KRAS基因突变关系采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义。PET/CT相关参数与KRAS基因突变的关系采用非参数检验(Mann-Whitney U test),P<0.05为差异有统计学意义。对于P<0.2的参数进行多因素回归分析,P<0.05为差异统计学意义。对于有意义的18F-FDG PET/CT参数通过ROC曲线获得最佳界值点并计算相应曲线下面积(area under the curve,AUC)。
  结果:(1)150例患者中KRAS基因突变78例,基因野生72例。150例患者基因突变率与年龄、性别、肿瘤位置、CEA、CA19-9、淋巴结转移、T分期、M分期、组织学类型均无显著统计学相关性。(2)基因突变型CRC患者的18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax(P<0.001)、MTV2.5(P=0.001)、TLG2.5(P<0.001)、TLG20%(P=0.001)、TLG30%(P=0.001)、TLG40%(P=0.001)、TLG50%(P=0.001)较野生型患者高。多因素logistics回归分析PET/CT相关参数SUVmax(OR,1.122:95%置信区间(CI),1.058-1.190,P<0.001)、淋巴结转移(OR,2.429:95%CI,1.183-4.989,P=0.016)、组织学类型(OR,2.778;95%CI,1.099-7.025,P=0.031)是基因突变的独立预测因素,以SUVmax=15.5为界值,准确率为67.33%(灵敏度:58.97%,特异度:76.39%,阳性预测值:73.02%,阴性预测值63.22%);在直肠及乙状结肠癌亚组中,SUVmax对KRAS基因突变的预测效能升高,以SUVmax=15.5为界值,准确率为70.79%。
  结论:SUVmax对CRC患者KRAS基因突变有一定的预测价值,参数值越高,患者基因突变的概率越大;在直肠及乙状结肠癌亚组中预测效能升高:而各界值下的MTV、TLG无法预测KRAS基因突变。
  第二部分 18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌术后预后的价值
  目的:探究18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌(CRC)根治术后的无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS)的预测价值。
  方法:回顾性分析2011年11月至2016年10月在长海医院行18F-FDG PET/CT检查的132例CRC患者的临床资料(男93例,女39例,中位年龄63岁),患者行PET/CT检查前未行放化疗,PET/CT检查后一个月内均行结直肠癌根治术,术后依据患者具体情况施行术后辅助化疗。观察指标: (1)测量18F-FDG PET/CT相关参数值包括SUVmax、MTV2.5、MTV20%、MTV30%、 MTV40%、 MTV50%、 TLG2.5、TLG20%、TLG30%、TLG40%、TLG50%; (2)治疗情况。随访情况:采用门诊和电话方式进行随访。DFS为术后第1天至首次发现肿瘤复发、进展、患者死亡或随访截止;OS为术后第1天至患者死亡或随访截止。本研究的随访截止时间为2017年10月。18F-FDG PET/CT相关参数与临床病理特征的关系采用非参数检验(Mann-Whitney U检验),P<0.05为差异有统计学意义。以肿瘤复发为阳性事件,采用受试者工作特征(ROC)曲线获得18F-FDG PET/CT相关参数预测DFS的最佳阈值并计算曲线下面积(AUC)。如果AUC值较小,则以中位数为界值点。根据界值将患者分成两组,采用Kaplan-Meier法进行生存分析,单因素分析采用Log-rank检验,多因素分析采用COX比例风险模型,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:(1) 18F-FDG PET/CT相关参数与临床病理特征的关系 MTV2.5与CEA有统计学相关性;MTV20%、 MTV30%、 MTV40%与原发肿瘤部位、组织学类型有统计学相关性;MTV50%与原发肿瘤部位、临床分期有统计学相关性;TLG2.5、 TLG20%与CEA、淋巴结转移有统计学相关性;TLG30%、 TLG40%、 TLG50%与CEA、淋巴结转移、临床分期有统计学相关性。 (2) DFS预后分析 通过ROC曲线获得18F-FDG PET/CT相关参数的曲线下面积(AUC),通过ROC曲线获得预测DFS最佳阈值分别为SUVmax=19.36(敏感性:66.67%,特异性:73.96%);MTV2.5=22.64 cm3(敏感性:48.61%,特异性:76.67%);TLG2.5 =117.78g(敏感性:49.32%,特异性:77.97%);TLG20%=129.74 g(敏感性:47.06%,特异性:73.44%);TLG30% =107.05 g(敏感性:48.48%,特异性:74.24%);TLG40% =73.22 g(敏感性:47.30%,特异性:75.86%);TLG50%=56.13g(敏感性:48.48%,特异性:75.00%)。由于MTV20%、 MTV30%、MTV40%、 MTV50%的AUC值较小,不能通过ROC曲线分析获得界值点,以其中位数MTV20%=21.00cm3、MTV30% =14.28cm3、MTV40% =10.15cm3、MTV50% =6.25cm3作为分组的界值点。单因素结果显示:CEA、CA 19-9、淋巴结转移、临床分期、化疗、SUVmax、MTV2.5、TLG2.5、TLG20%、 TLG30%、TLG40%、 TLG50%是CRC患者DFS的影响因素(P<0.05)。多因素分析结果显示:SUVmax(P<0.001,OR值=3.308,95%CI:1.882-5.815)、临床分期(P=0.008,OR值=2.164,95%CI: 1.226-3.819)、CA19-9(P=0.011,OR值=2.098,95%CI: 1.182-3.724)是影响CRC患者术后DFS的独立危险因素(P<0.05)。 (3) OS预后分析单因素结果显示:CEA、CA19-9、组织学类型、SUVmax、MTV2.5、 TLG2.5、 TLG20%、 TLG30%、 TLG40%、 TLG50%是CRC患者OS的影响因素(P<0.05)。多因素分析结果显示:SUVmax(P=0.026,OR值=2.735,95%CI: 1.129-6.624)、TLG50%(P=0.006, OR值=5.699, 95%CI: 1.640-19.801)、CA19-9(P=0.001,OR值=4.550,95%CI:1.868-11.084)是影响结CRC患者术后OS的独立危险因素(P<0.05)。
  结论:18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax是影响CRC患者术后DFS及OS的独立危险因素,TLG50%影响CRC患者术后OS的独立危险因素;18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax、TLG50%可以用于评估CRC患者的预后,参数值越高,预后越差。
[博士论文] 陈昕
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  原发性肝癌是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,其中,肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinomas,HCCs,简称肝癌)是最常见的原发性肝恶性肿瘤的类型之一,它在男性恶性肿瘤中死亡率中位居第二位。我国是乙肝高发区之一,肝癌患者占世界一半以上。但是,由于HCC早期在临床上无特征性表现,就诊时往往已是中晚期。肝癌最有效的治疗手段是根治性切除,但是目前根治性切除率较低,这是肝癌预后差的主要原因之一。因此,肝癌的早期预警和早期干预有着重要的意义,进一步深入研究肝癌早期发生的分子机制以及早期诊断的改进显得尤为重要。
  其中,肿瘤早期发生很可能受到ceRNA的调控。“ceRNA假说”于2011年被提出后,研究人员从生物信息学、细胞生物学和动物模型等不同水平验证了该假说。ceRNA分子,比如mRNA,lncRNA、假基因等,被认为能够通过microRNA(miRNA)应答元件(MicroRNA Response Element,MRE)竞争结合相同的miRNA来行使调节各自表达水平的作用。基因转录后调控得到了ceRNA假说的补充,在肿瘤等疾病发生发展中提供了转录组研究的新思路。环状RNA是ceRNA家族新成员,不同于线性RNA,环状RNA没有5'末端帽子结构和3'末端多聚腺苷酸(poly A)尾巴结构,而是以共价键形成首尾相连的闭合环形结构,天然并于广泛存在于不同种族的真核细胞系中。最近,一些circRNA已被证明含有多个保守的miRNA结合位点,可以调控基因的表达,肿瘤的发生和发展过程受到这些表观遗传学上的改变的调控。所以,深入研究HCC发生发展过程中重要信号通路以及节点分子的表达谱,将极大地促进HCC早期诊断及治疗手段的发展,具有较高的科研价值。
  近年来大量非编码RNA,特别是miRNA和长链非编码RNA(Long non-codingRNA,lncRNA),在肝癌生物学功能调控以及肝癌临床诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。近年来环状RNA的发现与进一步认知,丰富了转录后翻译水平调控家族。越来越多互相作用、互相影响并且在幕后控制分子修饰与表达的环状RNA分子参与了转录后翻译水平的调控。目前,研究已发现并证实circRNA参与多种肿瘤细胞生物学功能的调节,包括结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌和基底细胞癌等等。环状RNA表达失调与多种恶性肿瘤相关,在不同肿瘤类型中,环状RNA可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。但是,目前环状RNA参与调控肝癌早期发生及分子机理方面的报道甚少,肝癌早期相关环状RNA表达谱仍需要深入的研究。
  在本研究中,利用环状RNA芯片,我们对比了10对极早期(BCLC0期)肝癌与配对癌旁新鲜组织环状RNA表达谱,并通过大样本定量检测从早期肝癌样本中筛选与早期肝癌发生相关的环状RNA,建立肝癌早期发生表型相关特征环状RNA谱,最终选取肝癌组织比癌旁组织升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA,探讨其作为早期肝癌发生独立预警分子和治疗靶点的应用价值。
  基于以上背景,我们系统研究了环状RNA Circ-0008285这一与HCC早期发生相关的特异性环状RNA在肝癌起始过程中的作用,发现其可以通过竞争性结合miR-892a上调肝癌细胞中miR-892a的靶基因HDGF表达,从而促进HCC的发生,为预测HCC提供了新思路、新方法和早期肝癌潜在治疗靶点。
  方法:
  1.通过生物芯片筛选,建立肝细胞癌差异表达circRNA谱,确定重点研究circRNA,利用RT-PCR的方法,结合临床大样本筛选鉴定并规模验证肝癌早期发生相关差异circRNA;
  2.选取肝癌比癌旁升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA,进行后续功能验证;
  3.设计反向扩增PCR引物,产物扩增回收后结合一代测序技术明确Circ-0008285成环形式及成环序列的具体核酸信息,确认其来源母基因;
  4.荧光定量PCR检测现有10种肝癌细胞系(SMMU7721、Huh7、HepG2、HCCLM3、PLC/ARF5、97H、97L等),2种相对正常肝细胞系(L02和QSG7701)和2种免疫细胞系(THP-1和U-937)中Circ-0008285的表达水平,分别确定两株高低表达Circ-0008285的肝癌细胞系用于功能分析;
  5.通过慢病毒表达系统构建环状RNA Circ-0008285的干扰和过表达细胞系,并检测干扰和过表达的效果;
  6.通过细胞核质分离实验,确认环状RNA Circ-0008285在细胞中的定位,并根据其具体定位进行相应的功能学实验;
  7.分别对Circ-0008285高表达细胞系使用干扰慢病毒、对Circ-0008285低表达细胞系使用过表达慢病毒,观察干预Circ-0008285后细胞干性、增殖表型的变化;
  8.使用上述干预手段预处理干扰Circ-0008285细胞系,通过体外以及体内有限稀释实验,研究Circ-0008285对肿瘤发生过程的影响;
  9.通过RT-PCR及Western Blot技术检测干扰和过表达环状RNA Circ-0008285后对其母基因线性转录本表达是否具有影响;
  10.结合生物信息学分析可能与Circ-0008285相互作用的miRNA,使用RNA Pulldown实验确定预测的miRNA是否与Circ-0008285发生相互作用;
  11.利用建立的环状RNA Circ-0008285稳定干扰肝癌细胞系(HC CLM3)进行mRNA芯片分析筛选,以期验证在肝癌细胞中哪些理论上的miRNA靶基因的表达受到Circ-0008285的调控;
  12.使用荧光定量PCR、Western Blot和目的基因3'非翻译区报告双荧光素基因质粒确定Circ-0008285调控关键节点基因的主要方式;
  13.通过生物信息学分析的与Circ-0008285相互作用的miRNA潜在靶基因中寻找可能调节关键信号通路活性的分子,干扰或过表达后通过干性表型分析确认Circ-0008285是否通过竞争性吸附miRNA、恢复相应基因表达水平、调节细胞增殖、干性表型;
  14.通过Western Blot实验技术研究Circ-0008285引起的信号通路分子活性改变,确认这些信号通路是否参与Circ-0008285调控的肝癌早期发生过程;
  结果:
  1.完成10对极早期肝癌与配对癌旁新鲜组织circRNA异常表达分析,选取癌比癌旁升高表达最显著的Circ-0008285作为目标研究对象。
  2.大样本验证Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中表达情况,发现Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中普遍比相对应的癌旁组织中表达升高。
  3.Circ-0008285在肝癌细胞系中普遍表达较高,并主要分布于细胞质中,可以竞争性结合miR-892a,行使miRNA海绵的作用,影响其下游基因HDGF的表达。
  4.Circ-0008285可以促进细胞的自我更新和增殖。
  5.Circ-0008285在体内及体外均能够促进肝癌细胞的干性表型和肿瘤生长。
  6.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。
  7.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路,促进β-catenin的核转位。
  结论:
  本研究通过不同临床分期的肝癌及配对癌旁样本和不同的肝癌细胞系的表达验证实验,证实在早期肝癌中环状RNA Circ-0008285的表达异常升高。环状RNACirc-0008285可以作为miRNA海绵竞争性地结合miR-892a,促进miR-892a下游靶基因HDGF的表达升高。HDGF作为分泌性肝癌相关癌蛋白与其受体NCL结合后进入胞内,激活PI3K/AKT/mTOR通路以及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路,提高了EPCAM+的肝肿瘤起始细胞比例,并促进了肝癌细胞的自我更新和增殖,最终促使了肝癌的发生。这些是Circ-0008285实现对肝癌发生的重要调节机制。综上所述,本研究结果提示环状RNACirc-0008285是HCC早期诊断以及治疗的潜在干预靶点。
[硕士论文] 董骏峰
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的及背景:
  肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中其发病率及死亡率分别位居第5位和第3位,由于早期缺乏特异性症状体征,多数患者一旦诊断已属晚期,预后极差[1]。据报道统计显示我国肝癌的发病人数就已经占了全球肝癌新发病例的一半以上,严重的威胁着国民的生命健康[2,3]。目前肝癌的治疗方式仍然以手术切除局部病灶为主[4],术前或术后辅以肝动脉化疗栓塞术或放疗[5,6],对于无法行手术治疗的患者可行单纯的放疗或口服靶向药物索拉非尼[7],这些治疗方式患者收益较小,主要原因之一即是肝癌极易复发、转移[8],随着医学的发展,肝移植在治疗肝癌的应用中越来越广泛,肝癌被认为是行肝移植的主要适应症之一[9]。经过近几十年的探索,对肝癌肝移植术后的疗效进行分析,目前公认的肝癌肝移植标准有Up-to-seven标准(Up7),UCSF标准、Milan标准、上海复旦标准,对于符合标准的肝癌移植患者预后明显优于不符合标准的患者,因此,目前通常在术前进行评估,优先对符合标准的患者进行肝移植[10-13]。在以往的研究中,对肝癌患者接受肝移植前用以上标准可进行评估预后,而对于影响符合以上标准的肝移植患者的研究较少。Milan标准的应用使移植术后5年生存率达到70%,5年复发率低于15%[14,15]。而近年来有部分符合以上标准的病人在随访过程中发现肿瘤复发,部分患者肿瘤体积较小,且无明确的大血管侵犯,为我们的临床研究带来了新的方向。
  方法:
  收集251例符合Up7标准接受肝移植的患者作为研究对象,通过对基本临床信息的分析,建立了基于Up7标准肝癌肝移植长期生存的预测模型(ATMD),同时根据UCSF标准、Milan标准、上海复旦标准进行验证,发现此模型对于各标准的患者的生存预后同样具有较好的预测效能,并将此模型在不同肝移植标准中进行验证,检验其预测效能。
  结果:
  经过多因素COX回归分析发现术前甲胎蛋白(AFP),术前总胆红素(t-Bil),微血管侵犯(MVI),肿瘤直径(Diameter)是肝移植患者长期生存的独立预测因素,建立ATMD模型,并界定高/低危组。Kaplan-Meier分析发现,不同标准下的肝癌肝移植患者生存情况具有显著差异,Up7标准(P<0.001)及Up7标准下Milan标准(P<0.001)、UCSF标准(P=0.001)以及上海复旦标准(P=0.008);ATMD预测的肝癌肝移植患者三年生存的ROC曲线下面积分别是76.63%、69.41%、73.32%和75.87%。
  结论:
  ATMD模型对于符合Up7标准、UCSF标准、Milan标准及上海复旦标准的患者具有良好的生存预测能力,对符合以上标准的肝移植患者的术前决策以及术后风险的评估具有重要的意义。
  第一部分 基于Up7标准的肝癌肝移植后生存预测模型(ATMD)的建立
  通过我院联众病例调阅系统,收集近10年以来于我科因肝癌行原位肝移植术的病例,首要入组条件为患者的肿瘤数目、肿瘤最大径满足UP-to-seven标准,入组后收集患者的(1)一般信息,包括:年龄、性别、肝炎病史、肝功能评分(Child-Pug评分)、脾切除史、上消化道出血史、肿瘤治疗史(肝癌切除、肝癌微波消融、肝癌介入栓塞治疗)、是否已行抗病毒治疗;(2)移植信息:移植物存活情况、跨血型移植情况;(3)影像学特征:腹腔静脉曲张、肝癌特征表现(“快进快出”)、肿瘤数目;(4)术中情况:肿瘤包膜、腹水量、术中出血量、术中冷缺血时间、术中无肝期时间;(5)术前外周血检验指标:包括术前血小板计数、术前中性粒细胞计数、术前C反应蛋白、术前肌酐、术前GGT、术前ALT、术前甲胎蛋白、;(6)术后外周血检验指标:术后中性粒细胞计数、术后血小板计数、术后白细胞计数;(7)病理结果:病理类型、Edmondson分级、MVI、肿瘤包膜。将上述数据统计整合后,使用COX回归分析发现独立预测因素,建立ATMD模型,运用软件得到模型的截断值,将符合各标准下的病例再分为高危组及低危组,验证各标准下的生存曲线是否存在差异。
  第二部分 肝癌肝移植后生存预测模型(ATMD)的验证及应用
  通过第一部分建立的肝癌肝移植后生存预测模型(ATMD),以及患者术后口服免疫抑制剂、肝癌靶向药物使用的情况,再次选取、收集已行肝移植术、术后病理明确存在微血管侵犯的病例,依据ATMD模型,将上述病例进一步分为高危组,低危组。运用两独立样本的卡方检验,对口服Tac组、口服西罗莫司+索拉非尼组的第一年肿瘤复发率、第二年肿瘤复发率进行比较,评估不同免疫方案下,高危组之间、低危组之间是否存在差异,分析对于处于术后高危复发风险的患者及处于术后低危复发风险的患者,更加合适的免疫抑制方案。
[博士论文] 程玉强
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内死亡率占第三位的恶性肿瘤,预后极差,主要原因之一是其容易侵犯临近的门静脉系统而形成门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT)。肝癌门静脉癌栓已成为制约肝癌预后的最大瓶颈问题。血小板(platelet,PLT)作为近年来肿瘤相关研究的热点,其在肝癌发生中的作用被逐渐认识,几乎参与了诸如肝脏炎症的损伤与修复、肝纤维化直至肝癌等慢性肝脏疾病的各个过程。但是,血小板与门静脉癌栓形成这一特殊的肝癌转移方式之间的关系尚未见报道。分析血小板在肝癌门静脉癌栓形成过程中的作用,不仅能为癌栓的形成机制做以新的阐释,更能为其治疗开辟新的思路。
  目的:
  通过回顾性分析术前伴有不同血小板计数的肝癌门静脉癌栓患者的预后,建立血小板与门静脉癌检之间的初步联系。进一步通过分析门静脉癌栓患者血小板活化情况及癌栓组织特异表达的基因谱,探讨血小板在肝癌门静脉癌栓形成中的重要作用,从而为肝癌门静脉癌栓的治疗寻找新的治疗靶点和方法。
  方法:
  一、术前血小板计数与肝癌门静脉癌栓患者预后关系的分析
  以肝癌伴门静脉癌栓患者为研究对象,结合术前临床资料数据及预后生存状况,以术前血小板计数的高低将病人分为三组:血小板减少组(PLT<100×109/L)、正常组(100×109/L≤PLT≤300×109/L)和升高组(PLT>300×109/L)。回顾性分析患者的预后,以确定术前血小板计数对肝癌门静脉癌栓患者预后的影响。
  二、肝癌伴门静脉癌栓患者血小板活性检测
  分离提取肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,通过分析血小板的聚集能力差异,探讨肝癌门静脉癌栓患者的血小板活化状态改变情况。并进一步用血小板活化相关分子通过流式细胞技术加以验证。
  三、癌栓组织特异性mRNA表达谱分析
  取三例肝癌伴门静脉癌栓患者的配对新鲜组织样本,包括癌旁组织(pritumoral tumor,PT)、肝癌原发灶组织(parenchyma tumor,T)和门静脉癌栓组织(portal vein tumor thrombosis,PVTT/P),行基因芯片检测。分别分析不同病人间的个体化差异和各组织间的特异性表达差异。通过Metascape(http://metascape.org)分析差异基因参与的生物学功能及相关信号通路,并最终确定目的基因。
  四、目的基因诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的作用机制研究
  通过扩大样本量,确定目的基因在不同组织中的表达。进一步用不同肝癌细胞系与血小板共培养,建立体外“癌栓”形成模型,并结合细胞系的成栓能力及目的基因的表达水平确定体外研究的工具细胞系。再通过该模型对目的基因在门静脉癌栓形成中的机制做探讨。
  结果:
  第一部分:门静脉癌栓患者血小板降低的的伴发比例较高(20.9%)。不同血小板计数患者之间的临床病理特征不同,肝硬化伴发率(p<0.001)、肿瘤大小(p<0.001)以及肿瘤是否存在包膜(p=0.032)差异明显。门静脉癌栓患者伴有血小板计数减少者的无瘤生存期RFS(recurrence free survival)和总体生存期OS(overall survival)均优于血小板计数正常组(p均小于0.001)和升高组(p=0.008和0.046),但血小板计数正常组和升高组之间无明显的统计学差异(p=0.578和0.877)。进一步通过倾向性匹配评分(PSM)排除各组间的病历资料差异的影响并作亚组分层,结果表明:Ⅱ型门静脉癌栓患者中血小板减少组的患者的无瘤生存期明显优于血小板正常组(p=0.011),但Ⅰ型癌栓和Ⅲ型癌栓病人的不同血小板计数组之间无明显差别(p=0.154和0.142)。Ⅰ型和Ⅱ型癌栓中血小板减少组的患者的总体生存期的分析均优于血小板正常组(p=0.021和0.029),但Ⅲ型癌栓患者的两组间仍无差异(p=0.451)。多因素风险回归分析结果表明血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后相关的独立危险因素,包括无瘤生存期(hazard ratio[HR]0.602,95%CI0.444-0.836,p=0.001)和总体生存期(HR0.582,95%CI0.415-0.816,p=0.002)。
  第二部分:通过分析肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,结果表明肝癌伴门静脉癌栓患者的血小板聚集能力增强,血小板活化的比例增加。通过对肝癌伴门静脉癌栓患者配对的不同组织(癌栓组织、原发灶组织和癌旁组织)行基因芯片检测发现,病人之间存在交大的个体化差异;进一步汇总分析三例病人均有差异的基因显示:三种组织各自具有其独特的基因表达谱。将差异基因在基因功能网站进行分析发现,癌栓组织中特异表达的基因在细胞溶解、一元羧酸酸代谢、胰岛素样生长因子调节、小分子代谢以及有机羟基化合物运输等生物学功能上富集明显,且部分差异基因还与整合素信号通路和HNF3B信号通路等肿瘤相关的信号通路密切相关。进一步根据差异基因的表达水平及其生物学功能,最终将干细胞因子(SCF/KITLG)作为目的基因重点进行后续的机制研究。
  第三部分:通过扩大样本检测结果发现,目的基因KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中表达明显高于肝癌原发灶组织和癌旁组织,此外,KITLG的受体基因c-KIT表达水平与其相一致,在门静脉癌栓组织中表达升高。进一步检测肝癌相关的干细胞标志物发现,EpCAM、CD44、CD90和CD133在门静脉癌栓组织和肝癌原发灶组织中的表达均比癌旁组织高,除CD133在门静脉癌栓组织中与肝癌原发灶中表达水平相似外,EpCAM、CD44和CD90的表达水平在癌栓组织中最高。不同肝癌细胞系中KITLG的表达水平不一样,来源与肝癌门静脉癌栓的细胞系CSQT-2中KITLG的表达水平最高。通过将CSQT-2与血小板共培养建立体外“癌栓”模型的实验结果表明,细胞系中KITLG的表达水平与成栓能力有关,KITLG是肝癌门静脉癌栓形成中的重要分子。
  结论:
  1、血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后的独立危险因素。伴血小板计数减少的肝癌门静脉癌栓患者预后相对较好;
  2、肝癌门静脉癌栓患者血小板活化增强;
  3、门静脉癌栓组织、肝癌原发灶组织和癌旁组织的基因表达存在差异,各有自身特异的基因表达谱;
  4、KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中高表达,促进癌栓肿瘤细胞干性的维持,并可在体外诱导栓块形成而促进癌栓的发生。
  本课题创新点及潜在应用价值:
  确定了血小板计数与肝癌门静脉癌栓的预后关系,为肝癌门静脉癌栓的临床治疗提供指导。通过基因芯片分析明确了癌栓组织特异性基因表达谱,并分析其分子功能及相关信号通路,为癌栓形成机制的相关研究提供数据支持和参考;进一步分析明确KITLG通过诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的机制,为抗血小板治疗在肝癌门静脉癌栓的应用提供有力证据。
[硕士论文] 乔时
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)是指在特定环境下上皮组织细胞失去其极性向间充质细胞及相应表型转化的过程,其表现特征为细胞与细胞间粘附性降低或消失,极性丧失,细胞运动活性及转移侵袭能力提高。发生EMT后细胞由多边形转变为梭形,同时上皮细胞的特异分子标记物表达量减弱,而间充质细胞的特异分子标志物则获得了明显增强。Snail和Slug被认为是Snail家族中调节肿瘤细胞发生EMT的主要核转录因子,直接参与诱导间充质标志物的生成,比如Vimentin和N-cadherin,同时还能够抑制上皮细胞标志物E-cadherin的生成。TGF-β/Smads通路被认为是调节Snail生成的经典信号通路。TGF-β在进展期癌细胞中起到增进作用,同时也是被证明是癌细胞发生EMT的起因。随着对EMT研究的逐渐深入,近些年在多种肿瘤细胞中,包括乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤中,EMT均起重要作用。此外,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的病理进程中也会发现EMT现象,而且与癌细胞的转移和侵袭有密切关系。EMT相关分子机制的阐明,对于改善肝癌患者的预后,以及探索新的靶向治疗方案具有重大意义。
  CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)是一类参与调节多种组织功能的亮氨酸拉链转录因子。该家族成员C/EBPβ基因转录的mRNA可翻译出三种不同蛋白亚型,其38kDa肝脏高表达激活型蛋白(liver-enriched activator proteins1,LAP1)是主要表达于肝脏的转录因子,在肝细胞的炎症反应、肿瘤发生、分化、增殖和存活中都起关键作用。有文章指出LAP1在癌细胞所在区域中的表达量明显低于相应癌周组织。在本实验室前期工作中发现,LAP1可以有效抑制肝癌细胞的干细胞特性,包括癌细胞的生长速度及增殖能力,同时也发现提高LAP1的表达能够促进肝癌细胞向上皮样表型转变,并抑制转移和侵袭能力,说明LAP1很可能与肝癌细胞的EMT有关。
  本课题利用人肝癌细胞系Hep3B和SMMC-7721,通过细胞生物学及分子生物学等手段,探究C/EBPβ的亚型LAP1能否抑制肝癌细胞EMT表型及可能的分子机制,为今后肝癌患者的预后判断及靶向诊疗提供了新的方法和思路。
  方法:
  1、采用免疫组化和RT-Time PCR实验,测定肝癌患者癌及相应癌旁组织样品中C/EBPβ的表达状况。同时结合患者病例资料分析高转移肝癌患者肿瘤组织样品对比低转移组C/EBPβ的表达状况与明确C/EBPβ与肝癌转移之间存在关联性。
  2、建立过表达LAP1的Hep3B和SMMC-7721细胞,根据蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测LAP1是否成功过表达。光学显微镜下观察过表达LAP1后Hep3B和SMMC-7721细胞上皮样表型变化情况。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验迸一步确定过表达LAP1是否促进上皮标志物E-cadherin表达,同时抑制间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达。
  3、建立敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞,利用蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测C/EBPβ敲低情况。观察Hep3B和SMMC-7721细胞敲低后间充质样表型变化情况。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定敲低C/EBPβ是否抑制上皮标志物E-cadherin表达,并促进间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达。
  4、运用Transwell及含基质胶Transwell方法,检测过表达LAP1及敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞对比对照组,其转移和侵袭能力的变化。
  5、通过Western Blotting和RT-Time PCR实验,检测C/EBPβ对EMT相关转录因子Snail和Slug表达量的影响。通过Western Blotting实验,检测调节Snail和Slug表达的TGF-β/Smads信号通路中主要因子Smad3的表达量及磷酸化程度。
  6、通过6周龄雄性裸鼠尾静脉注射法建立肝癌肺转移模型,分别对比过表达LAP1及敲低C/EBPβ后SMMC-7721细胞相对于对照组在裸鼠肺内的肝癌细胞转移情况。
  结果:
  1、采用免疫组化和RT-Time PCR实验,测定肝癌患者癌及相应癌旁组织样品中C/EBPβ的表达状况。同时结合患者病例资料分析高转移肝癌患者肿瘤组织样品对比低转移组C/EBPβ的表达状况与明确C/EBPβ与肝癌转移之间存在关联性。
  2、建立过表达LAP1的Hep3B和SMMC-7721细胞,根据蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测LAP1成功过表达。光学显微镜下观察过表达LAP1后Hep3B和SMMC-7721细胞上皮样表型明显增多,并计数后统计分析。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定过表达LAP1促进上皮标志物E-cadherin表达,同时抑制间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达,证实过表达LAP1能够抑制肝癌细胞的EMT。
  3、建立敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞,利用蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测C/EBPβ被成功敲低。观察Hep3B和SMMC-7721细胞敲低后间充质样表型明显增多,并计数分析。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定敲低C/EBPβ抑制上皮标志物E-cadherin表达,同时促进间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达,证实敲低C/EBPβ能够促进肝癌细胞的EMT。
  4、干扰C/EBPβ的表达显著改变了EMT标记物的mRNA和蛋白的表达量,过表达LAP1能促进上皮标记物E-cadherin的表达,同时间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达被抑制。而敲低C/EBPβ则结果相反。
  5、在肝癌细胞中过表达LAP1可抑制TGF-β/Smads通路中Smad3的表达及磷酸化过程,进而抑制该通路下游靶基因Snail和Slug的表达。而敲低C/EBPβ则获得相反结果。
  6、通过裸鼠肝癌肺转移模型的对比研究发现过表达LAP1的肝癌细胞在裸鼠体内转移率明显低于对照组,而敲低C/EBPβ后其癌细胞转移效率明显提高。
  结论:
  C/EBPβ亚型LAP1表达量的降低能够促进肝癌细胞的EMT过程,进而导致肿瘤细胞的转移和侵入能力加强。这是由于LAP1能够抑制TGF-β/Smads细胞信号通路中关键转录因子Smad3的表达及其磷酸化过程,进而抑制下游的核转录因子Snail和Slug的表达,而LAP1的下调导致TGF-β/Snail轴的异常活跃致使肝癌细胞的EMT增强。
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