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[博士论文] 杨正飞
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:腈水合酶(EC4.2.1.84)是微生物体内代谢腈类物质的关键酶之一,可以催化腈水合成相应的酰胺。由于其催化效率高、反应条件温和、环境友好等特点,腈水合酶已经成功的应用于化学工业中合成酰胺类物质。
  腈水合酶基因一般以基因簇形式存在,包含α亚基,β亚基和激活蛋白。本实验室前期将来源于Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶基因NH08克隆并构建在重组大肠杆菌中。然而,β亚基的表达量远远低于α亚基,激活蛋白表达量也偏低。本文首先通过融合标签策略、双质粒策略、多顺反子策略等一系列研究,使激活蛋白的表达量提高了5.14倍,酶活提高了44.6%,达到120U/mL。其次,通过同义突变策略,使β亚基的表达量提高了33%,最终酶活达到160U/mL。比酶活达到了620.2U/mg,提高了52.9%。再次,通过摇瓶培养条件优化,酶活达到了1531.2U/mL,OD600达到了15.6。最后在15L罐中进行高密度发酵,酶活达到了9080U/mL,OD600达到123。
  目前谷氨酸棒杆菌被广泛的应用于代谢工程研究中,利用其为宿主进行蛋白表达的研究相对较少。本文首先通过不同组成型启动子与诱导型启动子比较、密码子优化、RBS序列设计和新型mmp诱导系统的应用等表达策略研究,实现腈水合酶在谷氨酸棒杆菌中的高效诱导表达,最终蛋白表达量占总蛋白的29.9%,酶活达到52.4U/mL。其次,通过摇瓶优化,酶活达到了143.1U/mL,OD600达到了15.6。最后,在10L发酵罐中进行高密度发酵,酶活达到了1420U/mL,OD600达到了200。
  使用重组大肠杆菌全细胞进行烟酰胺和2,6-二氟苯甲酰胺的制备,最终产物浓度分别达到了439.2g/L和314g/L,转化率都大于99%,具有潜在的应用价值。此外,使用重组谷氨酸棒杆菌全细胞进行烟酰胺的制备,最终烟酰胺的浓度达到了292.8g/L,转化率大于99%,证明了利用重组谷氨酸棒杆菌生产烟酰胺的应用潜力。
[博士论文] 王庆玲
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:在最近的二十年中,作为一个筛分比率逐年增加的海产品腐败菌及鱼类致病菌,嗜麦芽单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)对水产养殖业具有潜在的危害性,其低温下较强的蛋白酶水解能力是导致海产品腐败和鱼类致病的重要因素。S.maltophilia低温诱导产生的蛋白酶种类和特性,还没有文献详细报道,而且温度诱导蛋白酶产生的调控机制也不清楚。本课题针对以上两个问题进行初步的研究与探索:一是对低温诱导产生的蛋白酶分离纯化,详细了解该酶的特性及一级结构特征;二是对温度响应蛋白酶的调控机制进行初步探索。
  (1)通过富集培养的方法从冷冻的南极磷虾中分离得到一株低温下高产蛋白酶的菌株,通过16S rDNA和生理生化分析鉴定为嗜麦芽单胞菌,命名为S.maltophilia FF11。菌株在低温(15℃和25℃)下产生胞外蛋白酶活性高,而37℃下几乎检测不到蛋白酶活性。酶谱分析表明,S.maltophilia FF11主要的蛋白酶仅在低温下产生,在37℃并不产生,此蛋白酶命名为SmtP(S.maltophilia temperature-responsive protease)。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析(Q-Sepharose Fast Flow chromatography)和凝胶筛分层析(Superdex75),从S.maltophilia FF11发酵液中分离纯化出电泳纯的蛋白酶SmtP;该酶在高盐(4M)和有机溶剂(50%)环境下具有较高的活性及较强的耐受性。肽指纹图谱分析及基因克隆测序获得了编码该酶的全基因序列,基因全长为1854bp,编码617氨基酸蛋白酶的前体(GeneBank序列号为KP399635)。N端测序(LVPND)和质谱分子量(37.4kDa),确定成熟酶由368个氨基酸组成,获得了该酶的一级结构序列。
  (2)实时定量PCR和启动子融合分析表明,温度影响SmtP的产生至少发生在转录水平上。利用自杀载体pEX18Tc,采用双亲结合的方法,敲除S.maltophilia FF11一个cAMP受体类似蛋白(cAMP receptor protein-like,Clp),获得Δclp菌株。clp的敲除显著减少了S.maltophilia FF11在15℃和25℃下的蛋白酶活性,酶谱结果显示,Δclp菌株不再产生SmtP。实时定量PCR和启动子活性分析表明,Clp能够正向调控smtP的表达。同时,clp的表达同样具有温度依赖性的特征。
  (3)生物信息学分析显示,在S.maltophilia中,四个双组份系统Sm3706/Sm3705、Sm1829/Sm1828、Sm1911/Sm1912和Sm0737/0738涉及胞内第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)代谢。分别敲除4个响应蛋白发现,Sm3705减少菌株FF11低温下78-82%胞外酶活性,Sm1828减少50-53%,Sm1912减少了10-15%,Sm0737无影响。酶谱分析显示,敲除Sm3705完全消除了SmtP的产生,与Δclp菌株具有相似的性状,敲除Sm1828明显减少了SmtP的产生。Sm3706/Sm3705是一个新的未被鉴定的双组份系统,能够响应低温的刺激,命名为LotS/LotR(low temperature sensor and regulator);LotS是一个非经典的感应激酶,LotR是一个响应蛋白,此蛋白包含了与c-di-GMP代谢有关的GGDEF和EAL结构域及信号接收的REC结构域。LotS/LotR与Clp都能够调控smtP的表达,表明LotS/LotR与Clp处在同一个调控smtP表达的信号传导系统中;ΔlotR和ΔlotS菌株中clp启动子活性及表达分析表明,Clp是LotS/LotR下游的调控蛋白。重组表达LotR体外检测发现,LotR不能合成,也不能降解c-di-GMP。胞内c-di-GMP检测表明,高温生长增加S.maltophilia FF11中的c-di-GMP的水平,而ΔlotR菌株中的c-di-GMP的浓度并不表现明显的高温依赖性的特征,表明LotR参与了温度调控的c-di-GMP水平。ITC结果显示,S.maltophilia FF11中的Clp与c-di-GMP亲和常数在25℃下为Kd=20.3±0.9nM,37C下Kd=22.7±1.1nM,表明嗜麦芽单胞菌中的Clp与c-di-GMP能够结合,而且温度对两者的结合能力没有明显影响。
  (4)生物信息学分析显示,Sm1829/Sm1828与黄单胞菌中的双组份系统RpfC/RpfG具有较高的序列同源性。构建rpfF、rpfC及rpfG敲除菌株及各自的回补菌株,验证S.maltophilia FF11中RpfC/RpfG同样响应DSF分子调控胞外酶的活性。rpfC及rpfG的敲除对菌株的生长没有影响,却显著减少了菌株FF11在低温下胞外蛋白酶的活性,酶谱结果显示,敲除菌株显著减少了SmtP的产生,表明RpfC/RpfG能够响应温度变化调控胞外蛋白酶的产生。在低温培养下,缺失信号分子DSF明显减少了胞外蛋白酶的活性,在37℃下外源添加DSF或者过表达RpfF蛋白均不能增加胞外蛋白酶的活性,表明DSF仅在低温下能够调控胞外蛋白酶的表达。RpfG酶活性表明,S.maltophilia FF11中RpfG的活性依赖于DSF信号分子和低的生长温度两种信号。
  综上,本论文分析了S.maltophilia FF11中外泌蛋白酶SmtP的主要特性,并解析了SmtP的一级结构序列;发现调控smtP表达的转录因子Clp及其上游调控因子LotS/LotR,并对LotS/LotR/Clp信号传导系统响应温度变化的机制进行了初步研究;发现S.maltophilia FF11中,RpfC/RpfG作为感应群体信号分子DSF的双组份系统,可同时响应温度刺激,共同调控胞外酶的产生。
[硕士论文] 吴蔷梅
计算机科学与技术 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质是生物体的重要组成部分,也是生命的物质基础,参与和控制了生物体内的大部分生命活动。蛋白质在生命体中并不是单独存在的,而是通过蛋白质之间的相互作用关系来实现生命体的具体功能。随着高通量实验方法的发展,可获得的蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络数据逐渐增多,为系统地研究蛋白质之间的相互作用关系,进而识别网络中有重要意义的功能模块和关键蛋白质提供了可能。在PPI网络基础上研究功能模块和关键蛋白质不仅可以促进生命科学的研究,而且在疾病诊治和药物靶细胞设计等方面都具有重要的应用价值。本文对PPI网络中的分析算法进行研究,在深入分析网络层次结构的基础上,主要致力于PPI网络中的功能模块挖掘以及关键蛋白质的预测等研究,具体内容包括以下三个方面:
  (1)提出了基于PPI网络层次结构划分的功能模块挖掘算法FM-HS。该方法首先使用遗传算法找到一棵与PPI网络相对应的具有最大似然的层次结构树,然后通过对该树进行层次划分得到若干功能模块,最后根据模块度的值选择最佳的划分方案;同时,通过节点间在树中的公共祖先信息可以得到它们存在相互作用的可能性。该方法在挖掘功能模块的同时还可以对蛋白质之间的相互作用进行预测。通过在标准数据集上进行实验,结果表明本文提出的FM-HS算法能够更加准确地挖掘出PPI网络中的功能模块。
  (2)提出了基于Markov随机游走的关键蛋白质识别算法EPM。该方法同时考虑了生物信息和网络拓扑结构信息,进而克服了数据噪声高带来的负面影响。EPM使用Markov随机游走的思想:首先对PPI网络中的每一个顶点赋予表示其重要程度的得分,所有顶点的得分构成了一个n列的向量,给出其初始分值;然后根据一定的概率让分值在网络中随机游走并在传递中进行修改;最终按分值由大到小排列,输出分值最大的k个蛋白质即为关键蛋白质。在标准数据集上的实验结果表明,本文提出的EPM算法能够更加准确地识别较多的关键蛋白质。
  (3)提出了在PPI网络中基于遗传算法的关键蛋白质识别算法EPGA。该算法选取m个初始个体,每个个体由P个蛋白质组成,通过遗传算法对top-P个蛋白质的关键性进行整体度量,选取关键性最高(即最大适应度函数值)的个体,最后对个体解进行局部优化。在适应度函数中,本文融入了基因表达数据和域交互程度等多源生物信息,而且考虑到了蛋白质的二阶邻居对蛋白质关键性的影响。在标准数据集上的实验也表明,实验结果与其他经典算法相比,本文提出的EPGA算法识别关键蛋白质的准确率更高。
[硕士论文] 刘九
生物物理学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:α-螺旋蛋白质中特殊的非线性孤子激发成为一种能够传播由三磷酸腺苷(ATP)水解过程中所产生的能量的有效载体。孤子具有在传递过程中保持其能量、动量和速度等不变的特性,因此孤子能把生物能量和信息无损失地传到目的地,从而可保证人和动物等生命体能够正确感受到外界的能量和信息的刺激,并且把大脑的信息和能量正确地传送到相应的目的地和组织,以保证正确地感受到环境的刺激以及正确地回应外界对它的作用,以维持生命体自生的生存。
  本论文建立描述三氢链α-螺旋蛋白质中能量和信息传递的非线性模型,即非均匀耦合非线性薛定谔方程,运用现代发展完善的非线性孤子研究方法(如相似变换方法、双线性方法等解析方法和分裂步长快速傅立叶变换方法等数值方法)来分析在三氢链α-螺旋蛋白质中非均匀因素对孤子激发情况的影响,讨论存在时变紊乱性的情况下孤子是否能稳定的传播的问题,探讨在不同分子结构和环境条件下双孤子和三孤子的碰撞及其相互作用的动力学行为,发现了一些在时变抛物外势下孤子演化的新现象。基于耦合非线性薛定谔方程的解析结果,研究了周期系统和指数系统的α-螺旋蛋白质中孤子的传播行为,并且对时变抛物外势对孤子激发产生的影响进行了研究,主要研究结果如下:
  1、孤子在传播的过程中,它的传播方向受到外势的影响,孤子传播到较强的外势位置时会改变它的传播方向,即外势的密度增大处,孤子会沿着相反的传播方向传播。
  2、当孤子传播到外势密度较高的位置时,外势对孤子的传播影响越大并且可以改变孤子的传播方向。由于初始振幅的增大,孤子传播方向与水平方向上的夹角越来越小,因此在横向上的传播距离自然也就增大。若传播方向需要改变的越大,就需要越大的抛物密度。
  3、结合能系统的能量增益/损失效应可以影响孤子的寿命,甚至可以将孤子的寿命延长到生物过程所需的更长时间。
  这些结果为进一步阐释生物能量的分布结构和传播机制的研究奠定理论基础。
[硕士论文] 金玲玲
蛋白质工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:胶原蛋白作为细胞外基质中重要的结构蛋白,是人体中含量最多的蛋白质,占人体干重的30%,不仅为细胞提供了生理环境,维持生命体组织形态,还参与影响细胞粘附、增殖、迁移以及信号传导等生化活动,具有促进组织或器官的修复及再生等生物学功能。但由于动物组织提取胶原蛋白存在动物源疾病风险,限制了动物源提取胶原蛋白的应用。近年来,一种来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的的三螺旋结构类胶原蛋白引起了科学家们的兴趣,但由于这种原核来源的Scl2胶原蛋白缺乏与哺乳动物细胞结合的功能位点,在改造之前并不具有生物学功能,故本研究意在通过替换和插入的方式给Scl2重组胶原蛋白增加功能位点,并探索其在生物材料领域的应用。
  首先本文从分子层面上展开了对Scl2重组胶原蛋白骨架上功能位点的改造,通过PCR引物设计将不同数量的RGD(Arg-Gly-Asp)序列以定点突变的方式引入Scl2胶原蛋白骨架上。再采用同源重组的方式将天然Ⅰ型胶原蛋白与整合素的结合位点(GFPGER)取代Scl2骨架中对应的氨基酸序列,从而获得两组不同整合素位点功能化的Scl2胶原蛋白。并通过SDS-PAGE验证了各目标蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,2×YT摇瓶上的表达量为1.2 g/L。
  接下来本文根据Scl2胶原蛋白特殊的(Gly-Xaa-Yaa)n三螺旋结构可以抵抗多种蛋白酶水解的特性,实现了一种免除色谱柱繁琐操作便于大规模生产的新型纯化方式,并总结了一套基于胃蛋白酶高效纯化Scl2系列胶原蛋白的工艺流程。在酶法水解实验过程中,胃蛋白酶不仅可以消化去除大部分宿主细胞杂质蛋白,切除前端结构蛋白V-domain,同时能够检验胶原蛋白三螺旋结构稳定性,将编码错误的胶原蛋白进行降解,仅保留正确构象的Cl-domain。最终,通过一系列纯化得到了电泳纯化级别的5种胶原蛋白冻干粉。
  最后,本文通过用Scl2系列改造胶原蛋白对细胞培养材料进行表面处理的方式,初步验证了Scl2系列改造胶原蛋白的生物学活性,Scl2-R-Ⅰ和Scl2-5R-Ⅰ对于L929细胞具有促进其贴壁生长的效果(效果优于鼠尾Ⅰ型胶原蛋白),而Scl2-R则表现出抑制L929细胞贴壁的特性(与空白对照相比),说明可以通过改变蛋白质的作用位点来影响蛋白质间的相互作用,从而影响细胞行为,证明了实验思路的可行性及有效性,为Scl2系列蛋白发展成为特定功能性生物材料提供探索思路。
[硕士论文] 张丽洁
微生物与生化药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶,具有广泛的底物谱,能够氧化多种有机物质,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。
  本研究从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因lac1,其全长1803bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将lac1基因克隆入大肠杆菌表达载体pET30a时,构建重组表达载体pET30a-lac1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组酶并没有表现出酶活,且为不溶性表达,经优化培养条件,结果显示酶活没有提高,未改善可溶性表达的情况;将lac1的基因片段克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-lac1,酶活测定结果和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3L发酵罐中发酵培养,Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3U/mL发酵液,是摇瓶发酵酶活结果的10倍。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH值为4.5,且在pH6-11的范围内酶的相对活力均在70%以上。为从真菌中发掘酶学性质优良的新的漆酶奠定了基础。
  为了提高地衣芽孢杆菌来源漆酶CotA的表达水平,本文从稀有密码子的同义突变方向对目标基因自身进行了优化。通过改善序列中精氨酸的密码子使用,将cotA基因中的使用精氨酸稀有密码子的位点进行密码子的同义突变,将CGT/CGA突变为CGA/CGT。cotA基因序列的第534/747/1317/1533位的T突变为A,以及第738/918位的A突变为T,同时将这些突变体基因克隆入表达载体pET30a,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,测定漆酶酶活,与野生型相比,第534位点突变体的酶活下降,第738位点的突变酶活没有改变,其它的突变体酶活均有所提高,突变位点越接近基因的C端酶活越高,最末尾的第1533位点突变体的酶活是野生型的2倍。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
  此外,有报道称分子伴侣可以改善外源蛋白的分泌表达情况,为了改善毕赤酵母中漆酶的表达,将能够影响外源蛋白表达及分泌的分子伴侣与漆酶基因共表达。本研究中在已有报道的分子伴侣中筛选出8种功能型分子伴侣基因(GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1/PDI),分别克隆入载体pGAPZA或者pPICZA上,分别构建了10种重组载体(pGAPZA-GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1和pPICZA-GCN4/BMH2/PDI)。转入本实验室已成功构建的含有漆酶基因cueo的酵母菌株GS115/pPIC9-cueo中实现共表达,获得10种重组工程菌株,在培养的过程中,分别共表达载体pPICZA-GCN4/BMH2/PDI的菌株转化子多且有酶活,其它菌株转化子较少,并且没有检测到酶活。将有酶活的菌株发酵培养,并测定培养上清的酶活性,结果显示共表达分子伴侣BMH2和PDI的漆酶酶活分别提高了80%和20%。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
  本研究首先筛选到了一株新的漆酶基因,并发现了该酶的最适温度、最适pH及稳定性的酶学性质,另外还得到了两种能够提高漆酶表达量的思路,一方面可以通过突变漆酶中精氨酸的稀有密码子,另一方面可以通过与分子伴侣共表达。为漆酶的应用奠定基础。
[博士论文] 杜奎
化学工程与技术 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:Zn2+和H2PO4-离子作为重要的生命活动相关的离子,在如金属酶调控、基因转录和临床疾病诊断等方面起到关键性作用。近年来,尽管大量的Zn2+和H2PO4-离子荧光探针被报道和应用,但是设计制备出高选择性串联识别Zn2+和H2PO4-离子的比率计量型荧光探针,对于实现荧光探针在生物活体成像、环境检测等方面的高效利用具有重要意义。本文基于分子内电荷转移机理(ICT),结合理论计算设计制备了一系列新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针,研究了这一类探针在中性溶液中的离子识别能力和荧光性质,以及在肿瘤细胞成像造影中的应用。主要内容如下:
  1.通过在喹啉酰胺上引入杂环片段,基于光诱导转移机理(PET),设计合成了一类新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针识别基团(2a-1)。该类荧光探针识别基团具有离子选择性高、“off-on-off”荧光特点明显和可改造能力强等优点。荧光探针2a-5表现出较好的生物相容性,被成功用于HeLa细胞中Zn2+离子荧光造影成像。
  2.基于分子内电荷转移机理(ICT),结合理论计算,提出了三氮唑和炔烃作为电子给体(Donor)提高识别基团2a-1荧光检测性能的策略。开展了一锅法制备这两类荧光探针新方法的研究,通过对反应催化剂、反应底物和反应条件的设计和优化,简单、快速制备了一系列串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针(3a-1~3a-6,4a-1~4a-7)。研究发现,三氮唑和炔烃作为电子给体时,相比于识别基团2a-1,荧光发射光谱发生较大红移、荧光量子产率明显提高和双波长比率计量特点得到明显改善。3a-1和4a-1表现出较好的生物相容性,被成功用于肿瘤细胞A549、HuH7和HepG2中Zn2+离子细胞成像造影,表现出明显的双波长荧光成像效果。
  3.在前期不同电子给体修饰的荧光探针的合成方法和荧光性能研究的基础上,通过引入埃罗替尼和半乳糖这两类靶向分子,设计合成了具有细胞靶向的新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针。结果表明,埃罗替尼靶向基团的引入,探针5a-1表现出对表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)高度特异性结合能力,能够较好的在A549细胞中实现Zn2+离子荧光成像,而在HuH7细胞中几乎观察不到荧光信号。半乳糖靶向基团的引入(5a-2,5a-3),极大的提高的第三章和第四章中荧光探针的水溶性,可以很好的实现纯水中串联识别Zn2+和H2PO4-离子。同时,荧光探针5a-2和5a-3表现出对细胞膜表面的ASGP受体很好的特异性结合能力,能够较好的实现HepG2细胞中Zn2+离子荧光成像,而在A549细胞中几乎观察不到荧光信号。
[硕士论文] 魏东东
农产品加工及贮藏工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)具有抑菌谱广、对热稳定、不易产生耐药性等优点,有望成为化学防腐剂的替代品,在食品加工、贮藏等方面具有广阔的应用前景。然而在实验室研究、生产实践及安全性评价过程中,抗菌肽还存在定量测定方法不统一,结果重复性差,缺乏比较依据,与抗生素不易区分等一系列问题。
  以琼脂扩散法为基础,对相关因素进行优化,确定了抗菌肽定量测定方法的最优条件。本研究以硫酸多黏菌素B为代表,以铜绿假单胞菌ATCC9027为指示菌,采用琼脂扩散法建立了抗菌肽浓度对数值与抑菌圈直径之间的线性关系(以下简称“线性关系”)。以代表线性关系重复性的斜率、截距和代表线性关系精密度的决定系数R2为指标,对指示菌菌龄、菌浓,琼脂浓度和培养基厚度等影响因素进行优化,确定琼脂扩散法测定抗菌肽效价的最佳测定条件为:指示菌的最佳培养时期为稳定期,浓度为106cfu/mL,培养基厚度为3.15mm(Φ90mm,20mL),琼脂浓度为1.5%。在此条件下,选用其它抗菌肽和指示菌进行验证,结果重复性好,精密度高(R2=0.997)。
  通过多种抗菌肽与指示菌的相互作用,确定抗菌肽与指示菌之间存在相关性。本研究以杆菌肽、硫酸多粘菌素B、乳酸链球菌素(Nisin)为抗菌肽,以大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC9027、蜡样芽孢杆菌ATCC10876为指示菌,采用抗菌肽定量试验中确定的试验条件,进行琼脂扩散试验,探究线性关系中斜率和截距的变化情况。研究发现当抗菌肽相同而指示菌不同时,其斜率和截距均存在显著性差异;当指示菌相同而抗菌肽不同时,斜率和截距也不相同,即线性关系中斜率和截距能够反映抗菌肽与指示菌间的相关性。故当指示菌及影响因素一致时,线性关系中斜率和截距可作为抗菌肽性质变化的评价指标;当抗菌肽的性质发生变化时,斜率和截距的变化规律可作为抗菌肽定性方法的判别依据。
  通过对影响抗菌肽与指示菌相关性因素进行研究,探讨了区分抗菌肽与抗生素的相关方法。以硫酸多粘菌素B为抗菌肽,以铜绿假单孢菌ATCC9027为指示菌,采用抗菌肽定量试验所确定的方法,以线性关系中斜率、截距的变化情况为分析对象,对影响抗菌肽性质的相关因素,如溶剂pH、盐离子的种类及浓度、热处理时间以及酶处理对抗菌肽定性试验的影响进行研究。结果表明,抗菌肽在经过不同时间热处理和不同种类酶处理后,对抗菌肽定性试验影响较小、干扰少,能够反映抗菌肽性质的变化情况。在定性方面,将抗菌肽(硫酸多粘菌素B、杆菌肽)和抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素)分别热处理不同的时间和经不同种类的酶处理。结果显示抗生素在热处理过程中,斜率没有显著性变化(p>0.05),截距变化显著或不发生变化;酶处理对斜率和截距均无显著性影响(p>0.05)。抗菌肽使用热处理斜率无显著性变化(p>0.05),截距有下降趋势;部分酶处理后斜率和截距均无显著性(p<0.05)。
  本研究确定了基于琼脂扩散法的抗菌肽定量测定方法的最优条件,同时以所发现的抗菌肽与指示菌的相关性规律为依据,对抗菌肽定性相关工作进行研究。为抗菌肽的实际应用提供了参考和依据,为相关标准的制定提供了数据支持。
[硕士论文] 吴燃峰
计算机科学与技术;计算机应用技术 华北电力大学;华北电力大学(北京) 2018(学位年度)
摘要:随着科学技术的飞速发展,传统计算逐渐无法满足科学计算所需解决日益复杂的科学问题。因此,有望打破摩尔定律,并且突破传统基于“硅技术”计算包括量子计算、光子计算、纳米计算以及生物计算等在内的全新的革命性非传统计算应运而生,成为各国政府关注和资助的重点。
  本论文结合前沿热点领域中的DNA自组装技术,荧光探针技术,链置换技术,围绕DNA计算和荧光分子检测等多个交叉领域,同时利用高性能计算机,以及NUPACK等设计软件,对纳米计算中基于DNA核酶调控的分子计算模型展开多角度研究。
  一、基于纳米金颗粒自组装的分子计算逻辑门。在此分子计算模型中,成功设计并实现一种可编程的策略,能通过多个DNA输入信号链来控制纳米金颗粒与特定DNA结构的结合。其中输入操作通过加入对应DNA链来进行,输出信号通过琼脂糖电泳来检测确认。该策略利用链置换原理和近距离效应,通过不同DNA链的调控以及级联的特性实现了各种逻辑门功能(是门,两层级联是门,或门)。此外,为了进一步探究级联电路,建立了一种更复杂的催化偶联系统(与门)。
  二、DNA核酶调控的分子计算模型的研究。在此,设计并实现了一个由DNA核酶调控的分子逻辑计算系统。在该计算系统中,结合了两种机制:DNA核酶催化和熵驱动的链置换。在我们的设计中,DNA核酶扮演了一个输入信号和一个输出报告的多重角色。首先,DNA核酶将初始的基板激活到活性DNA基质状态。随后,DNA催化剂促进了熵驱动机制,从而触发了链置换,从而产生了一种新的DNA核酶产物。在熵驱动链置换机制的帮助下,输入DNA催化剂能够重新生成,从而触发生成另一个输出DNA核酶产物,这个生成DNA核酶产物可以作为驱动下一目标反应的输入驱动,从而实现DNA核酶调控的级联催化电路。同时也成功构建了一系列的逻辑门(是门,或门门和与门等)。此外,还建立了两层级联电路和反馈自催化逻辑电路。结果经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和实时荧光检测得到证实。
[硕士论文] 李春雨
发酵工程 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:过氧化物酶(POD)可用于催化过氧化氢氧化有机化合物。天然POD在处理工业废水、分析食品中微量酚、医学临床分析和合成酚类聚合物等许多领域被广泛应用。目前应用最广泛的是辣根过氧化物酶(HRP),天然HRP价格昂贵,而且容易失活,由于其分子较大,所以在酶联免疫分析过程中,抗原和抗体很难结合,难以被标记。因此在酶催化反应中,寻找一种模拟酶和催化体系来代替HRP,并提高模拟酶催化反应灵敏度是当代科学家们关注的焦点。本论文借助甲烷氧化菌素(Mb)的铜配合物具有过氧化物酶活性及纳米金大的比表面积和高的电子翻转速度等特点,采用甲烷氧化菌素功能化纳米金的铜配位组装来设计合成高效POD模拟酶。主要研究内容如下:
  利用甲基弯菌IMV(Methylosinus trichosporium IMV3011)产生的Mb,通过Cu(Ⅱ)添加过程中Mb的UV-可见光谱及荧光光谱变化,发现配合物中的配体4-羟基-5-硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰-5羟基咪唑(THI)可能在金属配合物的高氧化态Mbn-Cu*稳定性中起着至关重要的作用,推测Cu(Ⅱ)与Mb可能存在Mb-Cu、Mb2-Cu和Mb4-Cu三种不同的配位形式,并对三种配位形式的催化能力进行研究,结果发现三种Mb/Cu配合物都具有较强的过氧化物酶活性,而且Mb/Cu不同配位形式影响其酶活性,Kobs分别为6.11×10-4s-1,8.28×10-4s-1和4.16×10-4s-1,不同配位的反应速率常数提高了400~800倍。其中过氧化物酶活性最高的是二配位,这可能是因为Mb2-Cu配合物结构可能更有利于在氧化剂作用下形成过渡态Mb2-Cu*,因此它活性表现为最高,由此确定Mb/Cu的最佳配位方式为Mb2-Cu。
  利用Mb和Cu之间的不同金属配位作用介导Mb功能化纳米金粒子的组装,构建纳米酶复合体系。向Mb修饰的纳米金中加入适量Cu(Ⅱ)或Mb-Cu诱导,发现Cu(Ⅱ)和Mb-Cu都在AuNPs表面形成了Mb2-Cu配位,这可能是由于Mb2-Cu形式的Cu(Ⅱ)和Mb之间具有高亲和力。对两种组装形式进行过氧化物酶活性的检测,结果发现它们的Kobs比直接加入Cu(Ⅱ)或Mb-Cu时分别快3个和1个数量级,这说明纳米金的高电子传递能力和纳米簇中多活性中心产生的协同效应可以大大提高模拟酶的催化效率。在此基础上,对Mb2-Cu稳定的纳米簇结构进行动力学研究,确定了最佳反应条件:最适pH为7.0,最适过氧化氢浓度为6×10-3mol/L,对苯二酚最适浓度为4×10-4mol/L,反应温度最适为70℃。实验结果表明构建的纳米酶比天然POD稳定性更高,符合一般生物催化剂的催化规律,可以用来作为天然POD的替代物。
  主要对甲烷氧化菌素功能化纳米金粒子的铜配位组装进行直接电化学研究,讨论了扫速、pH、修饰时间等因素对酶修饰电极的影响,确定最佳电化学反应条件。研究结果表明对于Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极,当扫速在100mV/s,pH7.0,修饰时间16h时是修饰电极的最适组装条件。对Mb2-Cu稳定的纳米金和Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极进行计时电流响应测试,结果发现两种修饰电极在5.0×10-5~5.0×10-4mol/L浓度范围内,电流与H2O2浓度之间线性关系良好,表观米氏常数分别为0.805mmol/L和0.793mmol/L,该数值较小,说明两种自组装电极对于H2O2的还原都具有高亲和力,对H2O2的检出限分别为1.1×10-5mol/L和0.9×10-5mol/L。综上所述,有理由认为Mb2-Cu介导的纳米金簇比Mb2-Cu稳定的纳米金具有更高的过氧化物酶催化活性,该结果与溶液中得到的结论一致。
[硕士论文] 卢靖坤
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:MSTN作为肌肉生长抑制因子,属于TGF-β超家族成员。有大量研究报道,MSTN突变将引起肌肉过度增长,出现“双肌”表型。本研究以具有明显双肌表型的MSTN突变牛为实验材料,利用生物信息学技术在mRNA水平上和蛋白水平上确认MSTN其结构发生改变,同时利用荧光定量PCR和Western Blotting在mRNA水平和蛋白水平检测突变牛的MSTN表达情况,另外利用iCELLigence动态细胞分析仪检测MSTN突变细胞的生长状况。结果表明:(1)测序结果显示,MSTN突变牛突变位点为952bp-962bp处,缺失“TGAACACTCCA”11个碱基;(2)mRNA及蛋白结构预测情况表明,MSTN基因突变造成其mRNA及蛋白结构上的改变,可能影响了MSTN蛋白的功能;(3)荧光定量PCR及Western Blotting结果显示,野生型MSTN基因表达量高于突变型牛;(4)iCELLigence检测细胞生长情况,结果显示MSTN蛋白的突变抑制了肌肉细胞的增殖,从而促进了肌肉细胞的分化及肌管的形成。综上,引起实验动物出现双肌性状的MSTN蛋白不仅在结构上发生了改变,而且其蛋白的表达量也发生了显著改变。
[博士论文] 申翠翠
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:PPR(pentatricopeptide repeat protein)蛋白是近年发现的一类RNA结合蛋白家族,从原生生物、藻类到陆生植物和哺乳动物等均有分布,尤其在陆生植物中分布最多,例如拟南芥中含有450多种。PPR蛋白由核基因编码并主要定位到线粒体或叶绿体中发挥作用,参与RNA的转录、剪接、编辑和翻译等多种代谢途径。它们在植物的电子呼吸链传递、光合作用、生长发育以及育性恢复等过程中发挥着重要作用;在人类中,PPR蛋白还与各类神经衰退疾病相关。
  PPR蛋白由2-30个数目不等的重复基序串联而成,每个基序一般长35个氨基酸,这类基序称为P型基序,研究表明PPR蛋白与靶标RNA序列之间存在模块化识别,即每个重复序列可以特异性地识别一个RNA碱基,基序中第5位和第35位的氨基酸在识别过程中发挥关键作用,这两个位置氨基酸组合称为识别密码。PPR具有应用于RNA操作的潜力,但是由于PPR基序特异性识别RNA碱基的分子机理尚不清楚,限制了PPR作为RNA操作工具的开发进程。为了揭示PPR基序与RNA碱基之间的识别机制,本研究的主要结果如下:
  1、人工设计出一系列性质均一且可溶的dPPR蛋白。
  本课题组对拟南芥中所有P型PPR蛋白的基序进行保守性分析,基序上第1-35位上均存在一个最保守的氨基酸,由这些保守氨基酸组成的序列称为dPPR(designer PPR)基序。我们固定其他位置上的氨基酸不变,只改变第5位和第35位,于是得到携带不同识别密码的dPPR基序。我们将10个dPPR基序串联并分别在N端和C端加上一段促进水溶性的NTD和CTD结构域,得到一系列人工设计的dPPR蛋白。实验证明,这些蛋白性质均一稳定,可溶性好。
  2、揭示了PPR基序与RNA碱基之间互作的对应关系
  通过EMSA实验,我们筛选到可以分别特异识别四种RNA碱基的dPPR基序:当dPPR基序的第5位和第35位分别为天冬酰胺N和天冬氨酸D时(简称ND),该dPPR基序特异识别RNA碱基U;当dPPR基序的第5位和第35位分别为天冬酰胺N和丝氨酸S时(简称NS),该dPPR基序特异识别RNA碱基C;当dPPR基序的第5位和第35位分别为丝氨酸S和天冬酰胺N时(简称SN),dPPR基序特异识别RNA碱基A;当dPPR基序的第5位和第35位分别为苏氨酸T和天冬氨酸D时(简称TD),该dPPR基序特异识别RNA碱基G。
  3、解析了dPPR-RNA复合物的晶体结构,揭示dPPR基序与RNA碱基之间的识别机制。
  为了揭示dPPR基序与RNA碱基之间的识别机制,我们获得了四种dPPR-RNA复合物的结构,其中dPPR蛋白分别识别四条含不同碱基的RNA系列。结构显示dPPR蛋白呈现右手超螺旋构象将RNA包裹在内部,在原子水平上揭示了识别密码与对应RNA碱基之间的特异识别模式。另外非密码氨基酸如第2位的缬氨酸和第13位的赖氨酸分别通过范德华力和静电力在RNA结合过程中发挥重要作用。
  这一系列研究成果为准确预测自然界中PPR蛋白的靶标序列和研究新PPR蛋白的功能提供了参考,同时对开发特异识别RNA序列的蛋白质工具具有重要意义。
[博士论文] 吴望华
控制科学与工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:癌症的过程研究阐明了癌症的发生、发展及其演变过程中的相关机理,对癌症的诊断、干预和治疗具有指导性作用,其中,对癌症的相关生物标志物的检测是癌症的过程研究中最有效的途径之一。核酸是一种非常重要的癌症标志物,对其进行有效筛查和高灵敏检测对癌症的过程研究和控制具有十分重要的意义。因此,对复杂样品中的痕量核酸进行扩增和检测受到了越来越多的关注,尤其是核酸等温扩增技术。自1990年以来,大量的核酸等温扩增方法被陆续开发出来,并且被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等的检测。其中,基于切口内切酶(Nicking Endonucleases,NEases)的等温扩增方法,如链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、指数等温扩增反应(Exponential Isothermal Amplification Reaction,EXPAR)和切口内切酶信号放大(Nicking Endonuclease Signal Amplification,NESA)等由于简单、快速、高效等优点始终是近年来的研究热点。但是,NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖构成了这类方法的瓶颈,因此,如何向扩增体系中引入NEases的特异性识别位点仍是这些方法面临的共同挑战;另外,对制约等温扩增方法检测灵敏度的非特异性扩增效应的有效抑制也是非常棘手的难题。针对上述问题,本论文首先发展了一种DNA定位探针(DNA-Aligner,DA)介导剪切技术(Aligner-Mediated Cleavage,AMC),克服了NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖问题;在此基础上,提出了基于AMC的两种新型等温指数扩增方法,并对新方法中存在的非特异性扩增效应进行研究和抑制,进一步提高了方法的稳定性和灵敏度;此外,还利用DA介导的等温扩增反应和空间位阻效应建立了一种简便、快速和均相的蛋白检测方法。主要研究内容包括以下几个方面:
  第一章概述了近年来发展的主要等温扩增方法。重点阐述、分析了基于NEases的等温扩增方法的原理、应用和存在的问题,并在此基础上提出了本论文的研究内容。
  第二章发展了一种定位探针介导剪切技术(AMC)。定位探针(DA)包括茎-环结构和两单链侧臂,其中茎上含有NEases的识别位点;NEases首先结合在DA茎的识别位点上,再通过DA两侧臂与目标序列的杂交被定位至待剪切位点处进而实施剪切。该方法克服了NEases对目标核酸分子中特异性识别位点的依赖,仅使用一种NEase,通过调节DA在目标序列上的杂交位置就可以实现在任一位置处的精确剪切,且剪切位点可以逐个碱基调节。
  第三章采用AMC技术发展了一种新型等温链置换扩增方法(Aligner-Mediated Cleavage-Based Strand Displacement Amplification,AMC-SDA)。相较于传统的SDA,AMC-SDA具有以下特点:由于AMC优异的通用性,该方法也具备很强的通用性,理论上可以实现对目标序列中的任一片段的扩增和检测;引物的3'封端处理在一定程度上抑制了“引物二聚体”效应,可以获得较高的灵敏度,此外引物设计也因此大幅简化。对质粒和实际HBVDNA良好的检测性能证明了AMC-SDA具有很好的应用前景。
  第四章对AMC-SDA进行了优化,进一步提高了方法的检测灵敏度和重现性。通过对DA的改进和在引物中引入硫化和脱碱基位点等手段,消除了DA/引物沿着目标序列延伸对阳性扩增的不利影响、抑制了DA/引物3'封端的降解和体系的非特异性扩增效应,可将AMC-SDA的检测下限降低至10-17M水平,且方法的重现性也大幅提高。
  第五章采用AMC技术发展了一种新型指数等温扩增方法(AMC-Triggercd Exponential Amplification,AMCEA)。相较于传统EXPAR,由于AMC可以在任一位点处将目标序列剪切以产生触发引物,因此AMCEA具有十分优异的通用性,可以更灵活地应用于各种核酸片段的扩增和检测,其对血清中目标DNA的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。
  第六章将DA可调节等温扩增反应速率的特性与空间位阻效应相结合,提出了一种空间位阻效应调节的等温扩增方法(Steric Effect-Regulated EXPAR,SER-EXPAR)并用于蛋白质的检测。SER-EXPAR可以高特异性地检测纳摩尔浓度的目标蛋白,是一种一步、快速和均相的蛋白检测方法,其对血清中目标蛋白的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。
  第七章对本论文的创新点进行总结并对以后的研究提出了展望。
[硕士论文] 陶蓓蓓
生物工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本研究通过使用标准品结合三重四极杆质谱的针泵模式建立了氨基酸、肉碱、以及一些氨基代谢物的质谱检测方法。并且优化了液相色谱使用的色谱柱、流动相、梯度模式、柱温等参数,建立了最优的液相色谱分离方法。脂质靶向代谢组学使用的是液相色谱联用高分辨质谱平台。代谢物使用了脂质相关数据库并根据二级结构进行定性。并且使用了部分标准品进行验证。最终定性了300多种脂质代谢物。液相分离方法同样进行了优化。
  本研究针对建立的三种靶向组学检测方法,分别选用几种生物基质中不含有的所测代谢物的同位素或是同系物进行了随机的方法学验证。主要从检测限,定量限,线性,稳定性,精密度,回收率等方面验证方法的准确性与可靠性。结果显示,线性相关系数R2均大于0.999,日间日内精密度均小于5%。稳定性、精密度、回收率等也均满足靶向代谢组学实验要求。证明所建方法灵敏度高,准确性好,可以用于靶向组学研究。
  为了验证所建靶向组学方法的应用性,本研究使用建立的方法进行了生物基质的代谢组学分析。选用的生物基质为正常人与代谢综合征病人的血浆。仪器采集的数据使用相关软件进行数据处理与统计学分析。结果显示,代谢物检测结果有很好的稳定性与准确性。正常组与疾病组在氨基酸类、脂质类代谢物中有较大差异。
  综上所述,基于液相色谱-质谱联用平台,本研究建立了不同类型代谢物的靶向分析平台,并对建立的方法进行了实际生物基质的应用性研究。本研究所建立的靶向分析方法覆盖了氨基酸、肉碱、脂质等超过400种代谢物。这些代谢物涉及多条代谢通路,在生物体生长繁殖、保持它们的结构以及对外界环境做出反应等过程中都有重要作用。
[硕士论文] 张伟
食品科学 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:通过光谱法和电化学方法分析甲烷氧化菌素(Methanobactin,Mb)与铜的配合物模拟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,并进一步应用于电化学生物传感器。
  Mb是由甲烷氧化菌分泌到细胞外捕获和运输Cu2+的小分子荧光肽,它具有配合Cu2+等金属离子的能力,其铜配合物(Mb-Cu)可以清除超氧阴离子。实验第一部分从ethylosinus trichosporium3011发酵液中提取Mb并与Cu2+配合成Mb-Cu,分别采用紫外光谱和荧光光谱考察了邻苯三酚自氧化的线性时间以及有Mb-Cu参与的荧光激发波长,确定邻苯三酚的自氧化线性时间是90s,荧光激发波长为446nm。进一步考察了不同条件(EDTA-Na2的浓度、缓冲溶液的pH值、Tris-HAc缓冲溶液浓度、邻苯三酚浓度、温度和Mb-Cu浓度)对邻苯三酚自氧化的影响,从而评价Mb-Cu模拟SOD的活性。讨论认为,当EDTA-Na2的浓度为2mmol/L,溶液的pH值为8.2,Tris-HAc缓冲溶液浓度为0.05mol/L,温度为20℃,邻苯三酚浓度为0.363mmol/L时,浓度为0.8mg/L的Mb-Cu表现出良好的SOD生物活性,能有效抑制超氧阴离子(O2-)。在此光谱分析条件下Mb-Cu模拟SOD活性稳定。
  实验第二部分按照柠檬酸钠还原法制备了粒径大小在10~50(11.5、15、35、42、50)nm的纳米金(AuNps),并对其进行了TEM扫描,可以观察到制得的纳米金颗粒表面光滑、大小均匀。将粒径为15nm的AuNps依次组装Mb和Cu2+并进行了红外光谱的表征,证明Mb与Cu(Ⅱ)是通过Mb结构中的-OH或酚-OH配合。又将15nm的AuNps与具有不同类型官能团的交联剂缔合,并利用紫外光谱、荧光光谱、红外光谱和TEM透射电镜表征,其中β-巯基乙胺可与AuNps与Mb-Cu之间建立更紧密的结合,形成树状纳米簇结构。分别考察了AuNps粒径、AuNps∶Mb-Cu摩尔比、交联剂种类和Mb-Cu.交联剂摩尔比对邻苯三酚自氧化的影响,并通过光谱分析认为当AuNps粒径为15nm、AuNps Mb-Cu摩尔比为1∶150、交联剂选择β-巯基乙胺、Mb-Cu·β-巯基乙胺摩尔比为1∶3时,Mb-Cu-Au模拟酶活性最高。改变SOD活性测定体系发现,与黄嘌呤氧化酶法相比,模拟酶活性基本一致且方法稳定。
  实验最后一部分在01M的Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的探针溶液中对空白、Au/β-巯基乙胺/AuNps、Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb和Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极进行了比较,通过循环伏安(CV)和交流阻抗(EIS)扫描得出Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极是以单层膜组装到金电极上,AuNps的存在可以加速异相电子传递,Cu2+反之。在研究SOD模拟酶自组装膜时,分别讨论了邻苯三酚自氧化基质作为探针溶液时,不同电解质、电解质浓度、邻苯三酚反应时间、邻苯三酚添加量和扫速对电极感应电流的影响,讨论认为当电解质KCl的浓度为0.3mol/L、超氧阴离子积累时间为3min、邻苯三酚添加量为20μL及扫速为300mV/s时,电极对电流的感应程度最高。并考察了不同模拟酶及组装方式、不同交联剂种类对模拟酶在电化学中对抑制邻苯三酚自氧化的影响,认为以β-巯基乙胺作为交联剂,以层层组装的形式组装的Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极的SOD模拟酶活性最强。该自组装膜检验测定电流的重现性较好,且有良好的稳定性和使用寿命。
  本文利用Mb-Cu模拟SOD,通过光谱法和电化学方法确定了模拟酶的活性。建立的SOD模拟酶自组装体系具有良好的重现性、稳定性,在检验O2-浓度方面有较好的应用前景。
[硕士论文] 戴丹
计算机技术 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,长非编码RNA(lncRNA)因其潜在的生物学功能而备受关注。借助高通量转录组测序技术(RNA-Seq),研究者已经在包括人、小鼠等哺乳动物在内的多种生物中发现了数以十万计的lncRNA。研究表明,lncRNA普遍具有低序列保守性和低表达水平的特点,因此难以直接建立序列与功能之间的联系。鉴于功能性非编码RNA(ncRNA)在二级结构层面具有保守性,由此推断功能相近的lncRNA的二级结构也同样具有一定程度的保守性。本文主要借助生物信息学方法,围绕lncRNA二级结构预测问题展开研究和开发。主要工作如下:
  (1)研究了主流的RNA二级结构预测方法(主要包括比较序列分析法、动态规划算法和基于机器学习的分类预测方法等类别),分析并比较了这些方法的优缺点。综述了主要的ncRNA序列和结构数据库,包括miRBase、GtRNAdb、RNase P数据库、Rfam、GENCODE、lncRNAdb和NONCODE等。
  (2)在此基础上,提出RNA二级结构预测的评估系统(lncRScan-Fold-Assess),其主要功能包括:报告利用RNA二级结构预测方法预测得到的RNA二级结构信息、计算RNA二级结构预测方法的预测精度和比较不同的RNA二级结构预测方法的性能等。lncRScan-Fold-Assess提供了RNAfold、MARNA、Mfold、Pfold、Sfold、RNAstructure和CentroidFold七种主流的RNA二级结构预测方法的预测功能。
  (3)为了更好地将我们设计的RNA二级结构预测的评估系统用于科学研究。我们设计实验将lncRScan-Fold-Assess应用于miRNA、tRNA、RNase P RNA、ncRNA和lncRNA,结果表明:在预测一组同源序列时,基于比较分析法的Pfold和质心法CentroidFold的效果明显优于基于最小自由能的RNAfold、mfold、Sfold和RNAStructure。但是,预测一条单个序列的时候,基于不同原理的预测方法得到的结果没有明显的差异。
  综上,用户利用lncRScan-Fold-Assess可以同时对多种RNA二级结构预测方法的性能进行评估,进而可以选择性能较好的方法输出结果,因此lncRScan-Fold-Assess可以帮助提高当前lncRNA二级结构预测的效率。
[博士论文] 田甜
结构生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:在有丝分裂的过程中,偶联的姐妹染色单体准确平均分配到两个子细胞中,完成遗传物质的传递,对于维持遗传稳定性和物种连续性至关重要。姐妹染色单体的平均分离主要依赖于动粒在着丝粒区的组装。着丝粒是染色质上一段结构和功能都高度特化的区域,在该区域H3被其变体CENP-A所替代。动粒是在着丝粒区组装的一个大的蛋白复合体,负责为姐妹染色单体与纺锤体微管的连接建立承载区。动粒主要包括:内层CCAN蛋白质网络和外层KMN蛋白质网络。CCAN蛋白网络又可划分成五组亚复合物:CENP-C、CENP-LN、CENP-HIKM、CENP-TWSX和CENP-OPQUR。其中,CENP-N能够特异性识别CENP-A核小体,招募CENP-L,完成CENP-A所携带遗传信息的解码和起始动粒蛋白的招募。
  在本文第一篇中,我们解析了CENP-LN/CENP-A-NCP复合物的冷冻电镜结构,整体分辨率为5.8(A)。CENP-N通过其C端约100个氨基酸与CENP-L相互作用,形成一个异二聚体,与溶液中聚集状态相吻合;通过其N端约200个氨基酸与CENP-A核小体直接相互作用,其中,CENP-A L1 loop上的R80、G81和D83对CENP-N特异性识别CENP-A核小体具有重要作用,另外,CENP-N氨基端的碱性氨基酸还可以与核小体DNA上的四个位点的磷酸骨架直接相互作用,进一步稳定两者的结合。DNA上的这四个位点分别为:第+37/+36位核苷酸、第-32/-31位核苷酸、第+26/+25位核苷酸和第-22/-21位核苷酸。我们通过体外结合实验验证了CENP-N上与DNA结合的关键氨基酸残基有K10A、R11A、R44A和H77A。在体内,与DNA相互作用的关键氨基酸位点的突变,显著减弱了CENP-N自身及CENP-L等动粒蛋白的定位,说明CENP-N与核小体DNA的结合,对CENP-N在动粒上的定位和其他动粒蛋白的招募至关重要。而且,在不同物种中,为了维持这种“解码”机制的保守性,CENP-N可与CENP-A共同进化。
  糖酵解过程是所有生物体进行葡萄糖代谢产生ATP供能的必经阶段。在糖酵解过程中,己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶被认为是关键酶,有它们催化的反应是不可逆的。其中,磷酸果糖激酶的催化效率较低,是最为重要的调控关键酶,功能单位为四聚体,以ATP为磷酸供体,催化F6P转变为FBP,并产生一分子ADP。它是一种经典的别构酶,通过R-state和T-state的构象转变来调节自身的催化活性。
  在本文的第二篇中,我们利用E.coli表达了金黄色葡萄球菌的Pfk,它在溶液中存在二聚体和四聚体两种状态,且蛋白浓度越高四聚体越多,而且这种四聚体状态可以被低pH,或ADP,或ATP,或AMP-PNP诱导解离为二聚体形式,但是也可以被其底物F6P所稳定。我们通过解析Pfk及其与不同配体复合物的结构发现:Sa_ Pfk、Sa_Pfk/ADP、Sa_Pfk/ATP和Sa_Pfk/AMP-PNP的结构为二聚体,Sa_Pfk/F6P和Sa_Pfk/F6P/AMP-PNP的结构为四聚体。通过结构分析,我们认为Sa_Pfk所特有的G150-L151 motif的柔性赋予了α7-helix“开关”的功能,在F6P的协同作用下,调节自身二聚体-四聚体间的转换,从而调控酶的催化活性。
[硕士论文] 刘云霞
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:虽然携带遗传信息的DNA序列在人类各组织细胞中几乎是不变的,但其上的表观遗传特征却表现出极大的差异性,这也被认为是导致基因表达细胞特异性的主要原因。在众多表观遗传特征中,DNA甲基化被认为是当前研究较为透彻的表观修饰现象之一。DNA甲基化水平的改变与基因的选择性表达与调控具有密不可分的关系,并且在基因印记、X染色体失活等过程中扮演关键作用。研究表明,基因的重要调控元件区域(如启动子)的非正常甲基化状态与包括癌症在内的各种疾病的发生密切相关,所以准确识别给定区域的甲基化水平,不仅有助于解析基因转录调控机制,而且还能为人类认识各种复杂疾病的形成机制提供帮助。
  早期研究者主要依赖各类实验方法测定DNA甲基化位点,但实验方法一方面耗时耗财,另一方面无法覆盖到全基因组层面。一个替代的策略是利用计算方法来推断目标位点的DNA甲基化水平。鉴于近年来机器学习的广泛应用,研究者们开始考虑利用机器学习算法对DNA甲基化位点构建预测模型。然而,基于机器学习的预测方法的成败非常依赖有效的特征提取算法。本研究提出一种称为“阿贝尔复杂度”的新颖的DNA序列特征提取算法,并基于此构建人类全基因组DNA甲基化的预测模型。
  我们首次将“词的组合”领域中一个新颖的数学概念—阿贝尔复杂度,应用于DNA序列的特征提取中。首先,考虑到以DNA甲基化位点为中心的窗口大小对预测准确性的影响,我们分染色体测试了100bp-2000bp(步长100bp,bp即base pair,碱基对)范围内的所有窗口大小,结合各条染色体上的预测结果发现窗口大小在1300bp时预测效果最佳。进一步,我们利用卡方统计量和互信息两个指标对1301维初始阿贝尔复杂度特征进行特征筛选,发现第14-50维是对模型贡献最大的阿贝尔复杂度特征。另外,DNA组分特征可以被定义为DNA序列的基础特征,而当综合阿贝尔复杂度特征和DNA组分特征时模型的预测能力得到了进一步的提升。最后,为了选择最适合的机器学习方法,本研究比较了支持向量机(support vector machine,SVM)、随机森林算法(Random Forest)、最邻近算法(K-nearest neighbors)和朴素贝叶斯算法(Na(i)ve Bayes)四种机器学习算法。在5类细胞系数据的测试中,结果发现SVM具有更高更稳定的预测效果。
  综上,本文首次应用阿贝尔复杂度方法提取DNA甲基化序列特征,并通过窗口大小选取、特征筛选过程选取第14-50维阿贝尔特征,最后结合SVM构建DNA甲基化预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小或降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关实验提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[博士论文] 特发叶·沃酷
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文试验研究由三部分组成。第一部分分析肝配蛋白A5(EphrinA5)在小鼠颗粒细胞中的生理作用和信号转导途径;第二部分探讨肝配蛋白A5的全基因组效应;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受体蛋白结构。
  实验Ⅰ:肝配蛋白A5对小鼠原代颗粒细胞凋亡和增殖的调控作用及新的信号通路
  最新研究结果表明,肝配蛋白A5除了作为神经发生因子发挥生理作用外,还在雌性小鼠繁殖过程中具有重要生物学作用,但在颗粒细胞(GC)中的生物学作用尚不清楚。GC是研究卵泡发育基因功能和调控网络的理想模型。本研究结果表明,肝配蛋白A5的表达在各年龄组小鼠GC中有差异。干扰肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白质水平表达下调,同时抑制E游受体EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表达。在体外水平,肝配蛋白A5的下调表达抑制小鼠GC细胞凋亡过程。为了揭示肝配蛋白A5在调控GC凋亡中的作用,本研究进一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表达情况,发现Bax、Tnfα、Caspase-8和Caspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调。这些结果表明,肝配蛋白A5通过Caspase-8介导的内源性途径参与细胞凋亡。进一步敲低肝配蛋白A5的表达水平,引起Pcna表达上调,随后激活p-Akt和p-ERK途径来,促进GC增殖。此外,抑制肝配蛋白A5可增强BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表达水平,并且在不影响孕酮表达水平的情况下抑制GDF9表达,说明其参与卵泡血管生成和卵母细胞发育调控。综上所述,肝配蛋白A5调节雌性小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇生成过程,因此是雌性生育障碍的潜在治疗靶标。
  实验Ⅱ:小鼠颗粒细胞肝配蛋白A5干扰后的转录组分析
  肝配蛋白A5是一种肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信号分子,主要是神经元因子。但最近的研究表明其生理作用超过了神经发生,其在雌性生殖功能中尤其在卵泡发育中的作用日益受到关注。肝配蛋白A5与繁殖相关的研究处于初始阶段,目前尚未从转录组水平报道肝配蛋白A5在卵巢颗粒细胞中的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA处理小鼠颗粒细胞,然后进行转录组测序(RNA-Seq),以探索肝配蛋白A5干扰后颗粒细胞的全基因组图谱。RNA-Seq分析结果表明,在小鼠颗粒细胞中检测到16389个基因,与阴性对照相比,siRNA处理的细胞中有208个基因失调。其中,149个基因下调,59个基因上调。失调的基因主要富集在细胞外过程、钙结合和细胞粘附。此外,它们主要参与了PI3K-Akt信号转导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性粘附和Rap1信号转导途径等过程。总体而言,干扰肝配蛋白A5改变了调节卵泡发生的十多种基因的转录水平、调控网络和生物学过程。本研究为肝配蛋白A5在神经生物学外的雌性生殖中的作用研究提供了新的线索和研究思路。
  实验Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受体的结构分析
  蛋白质结构对于细胞功能至关重要,因此结构的缺陷可能导致细胞功能紊乱。肝配蛋白A5受体属于介导细胞通讯过程中最大的一类酪氨酸激酶家族。通过NCBI和蛋白质资源数据库中检索肝配蛋白A5(Efna5)、肝配蛋白A5受体3(Epha3)、肝配蛋白A5受体5(Epha5)和肝配蛋白A5受体B2(Ephb2)的氨基酸序列,评价和鉴定其蛋白质结构并预测候选蛋白的三维(3D)结构。候选蛋白预测结构存在轻微的构象变化,采用ProSA软件3D分数进一步分析预测模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分数分别为92.75%、94.77%、89.87%和85.96%,说明预测模型结构在可接受质量范围内。蛋白质结果无序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分别存在32.89%、25.4%和27.07%的残基紊乱。配体结合位点分析结果表明,Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分别存在3、5、4和2个不同的氨基酸残疾数目的配体分子。此外,预测到候选蛋白非结合区的3个结合位点。距离波动分析发现一些氨基酸残基在下降和上升的波动中均存在。应用互相关函数进一步分析发现这些候选蛋白均存在突变结构。相互作用和通路分析发现鉴定的40个蛋白中有15个蛋白不属于肝配蛋白A5受体家族。CpG岛分析结果表明,候选靶蛋白存在甲基化位点,其中Ephb2预测分数最高。计算机模拟分析靶蛋白的3D结构,为进一步结构分析提供直观信息。此外,候选蛋白一些已经证实结合位点区域为分子嵌合和新药物分子设计提供有力的证据。
[硕士论文] 王俊美
软件工程 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质是生命活动的物质基础,对其功能的预测至关重要。目前主要有两种方法测定蛋白质功能:生物实验方法和基于数据的计算方法。生物实验法存在耗时长,成本高的问题,因此基于数据的方法是目前对蛋白质功能预测的研究热点。本课题使用基于数据的方法对蛋白质功能进行预测,研究内容主要包括以下三个方面:
  (1)构筑基于结构域和改进MIMLSVM的蛋白质功能预测模型。针对现有MIML算法预测精度不高的问题,设计一种基于改进MIMLSVM预测蛋白质功能模型。首先,采用改进的Hausdorff方法计算包之间的空间距离,并结合K-Medoids方法将MIML(多示例多标签)问题退化为多标签问题,以提高预测精度;然后,利用SVM算法将多标签问题转化为多个独立的二分类问题,结合蛋白质数据的特点,建立蛋白质功能预测模型,并利用粒子群算法优化模型参数;最后,通过对七种生物蛋白质功能预测的实验,证明所建模型的优越性。
  (2)设计基于AVC-SVM的芋螺毒素离子通道类型预测模型。针对现有方法对离子通道预测中存在的信息冗余问题,设计一种基于AVC(Analysis of Variance and Correlation)和SVM的芋螺毒素离子通道类型预测模型。首先用F值衡量特征对于结果的显著性影响水平,通过粗选的方式过滤F值较小的属性;然后引入Pearson Correlation Coefficient衡量属性间互相的冗余度,通过设置阈值过滤相关性较强的属性得到细选的结果;最后使用SVM预测芋螺毒素的离子通道类型。对比实验表明:AVC-SVM模型在交叉验证下得到总体预测精度91.98%和平均预测精度92.17%,使用氨基酸组合和二肽组合作为特征的个数为68,与其它模型相比,保证较高精度的情况下运行时间由8至11秒缩短为0.085s。
  (3)实现芋螺毒素离子通道类型的在线预测。为方便其他研究者进行芋螺毒素的相关研究,使用C#和matlab混合编程技术,在AVC-SVM模型的基础上开发芋螺毒素离子通道类型的在线预测系统。该系统输入是芋螺毒素蛋白质的氨基酸序列,输出是对应的离子通道类型。同时,该系统提供容错提示功能。当输入特殊字符、代表模糊不清的氨基酸残基的不合法字符、标点符号或者氨基酸序列长度小于3bp时,可以返回错误提示,方便用户及时改正输入。此外,该系统提供下载功能,供其他研究者下载相关论文和实验数据。
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