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[硕士论文] 曹兆羽
材料学 暨南大学 2016(学位年度)
摘要:本研究从仿生学角度出发,首先对壳聚糖进行磷化学改性,制备一种兼有优良抗菌性和生物相容性的新型仿生高分子材料:磷酸二胆碱(PdC)化壳聚糖仿生衍生物(PdCCs);进而通过表面固定PdCCs,发展一种集成抗菌性和生物相容性的仿生表面改性方法。
  PdCCs的合成基于Atherton-Todd反应,利用二氯化胆碱膦酸酯与壳聚糖衍生物Cs-Tr的氨基反应偶联带双正电荷的PdC(细胞膜结构中两性磷酸胆碱的类似物),得到PdCCs。通过控制投料比,可调控其取代度。1H和31P NMR结果表明PdC基团以磷酰键方式与壳聚糖偶联,当Cs-Tr与二氯化胆碱膦酸酯的投料比为1:3和1:5时,由1H NMR谱确定取代度分别为32%和42%,且与电位滴定和元素分析的结果相一致。同时,采用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)与壳聚糖反应制备单正电荷的季铵化壳聚糖HTCC(1H NMR谱测得取代度为64%)作为对照。GPC结果表明:HTCC和PdCCs具有近似的聚合度(DP)。DSC结果表明:在含水量(0.5~2.5)范围内,与HTCC相比,PdCCs体系表现出明显的冷结晶峰现象,表明存在与生物相容性相关的冷冻结合水,且冷冻结合水含量与PdC基团取代度有关,可以预见PdCCs具有优于HTCC的生物相容性。
  分别以革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)为细菌模型,测定HTCC和PdCCs的最低抑菌浓度(MIC)和对细菌生长曲线的影响,及细菌内容物释放,表明其均具有优良的广谱抗菌性。细胞毒性实验表明,PdCCs对NIH/3T3的IC50值均大于2mg/mL,而HTCC64的IC50值约为0.5mg/mL;血液相容性实验表明,在浓度5mg/mL内,PdCCs和HTCC的溶血率均低于2%,但PdCCs不会像HTCC那样使红细胞发生形变和缩短凝血时间;与BSA相互作用结果表明,与HTCC相比,PdCCs可以有效抑制BSA构象变化。可见,PdCCs较HTCC具备更优异的生物相容性,其原因可能在于其支化的双电荷局域分布可以有效形成水屏蔽层,抑制其与蛋白和生物膜的非特异性相互作用。
  我们以静电纺丝聚己内酯(PCL)膜为基底,通过表面胺解及醛基化,进而表面固定PdCCs42,并以同样方法表面固定壳聚糖和HTCC64为对照。ATR-FTIR和SEM实验表明,壳聚糖、HTCC64和PdCCs42成功接枝到PCL膜表面,且表面形貌变化显著。接触角、抗菌、细胞毒性和蛋白吸附实验表明:与表面接枝HTCC的PCL膜相比,接枝PdCCs的PCL膜表面具有更佳的亲水性、抗菌性、细胞相容性和抗蛋白吸附能力。可见,基于仿生PdCCs的表面固定化可构建兼有抗菌性和生物相容性的材料表面。
  综上所述,我们制备的带双正电荷的磷酸二胆碱化壳聚糖仿生衍生物PdCCs具有优异的抗菌性能和生物相容性,且可用于表面改性,获得抗菌性和生物相容性的有效集成,有望在医疗卫生等领域得到应用。
[硕士论文] 宋升
生物工程 合肥工业大学 2016(学位年度)
摘要:本研究利用粒毛盘菌YM226,经深层发酵、黑色素提取及纯化,获得其胞内均一性黑色素(LM)。通过元素分析,紫外-可见吸收光谱,红外光谱,电子自旋共振谱,质谱及1D、2D核磁共振谱得出了LM可能的化学结构式。实验结果表明LM具有真菌黑色素的典型结构特征,是一种真黑色素。
  使用D-氨基葡萄糖对LM进行分子修饰,制备了LM的D-氨基葡萄糖衍生物(GLM),并在小鼠模型中研究了LM和GLM对急性酒精性肝损伤的保护作用。与模型组相比,LM和GLM预处理组小鼠血清中谷丙转氨酶(AlanineAminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspertate Aminotransferase,AST)含量显著降低,肝脏中细胞色素P4502E1(CYP2E1)合成明显受到抑制,抗氧化酶活性显著较高。此外,LM和GLM预处理可以有效降低模型小鼠肝脏核转录因子kappa B(NF-κB)和NF-κB激活相关细胞因子,白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)水平以及诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)活性。实验结果表明LM和GLM可以通过降低酒精诱导的急性肝的氧化和免疫应激对肝脏起保护作用,可用于急性酒精性肝损伤的预防。
  通过给予低铁饮食建立缺铁性贫血(Iron Deficiency Anemia,IDA)小鼠模型,并比较了补充黑色素-铁复合物(LM-Fe)和无机铁(FeSO4、FeCl3)对IDA小鼠的保护作用。LM-Fe和无机铁均能剂量依赖性地提高IDA小鼠血清血红蛋白(Haemoglobin,Hb)、血清铁(Serum Iron,SI)和血清铁蛋白(Serum Ferritin,SF)水平,降低总铁结合力(Total Iron-Binding Capacity,TIBC)。与补充无机铁相比,补充LM-Fe能显著增加IDA小鼠血清超氧化物歧化酶(SuperoxidaseDismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GlutathionePeroxidase,GSH-Px)活性。此外,与无机铁组相比,LM-Fe组小鼠血清肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)明显下降,而白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)水平显著升高。实验结果表明,与无机铁相比,LM-Fe可以更有效地改善IDA小鼠贫血症状、提高其血清抗氧化酶活性并改善其免疫功能紊乱,可以作为多功能的铁强化剂用于改善和治疗IDA。
[硕士论文] 宋玛丽
生物工程 山西大学 2015(学位年度)
摘要:植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸。在食品和饲料中添加植酸酶可促进营养物质的利用,降低磷排出,对减少环境污染有重要意义。来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶之一,然而如何提高植酸酶的热稳定性是植酸酶规模化生产所面临的一个主要问题。
  本实验室利用基因工程手段,对大肠杆菌植酸酶基因appA进行了定点突变,得到植酸酶基因突变体appAM8。前期结果显示,在酵母中表达后与野生型appA相比,appAM8热稳定性有明显提高。为了进一步探讨植酸酶耐热机理,本研究将该突变体基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达,将获得的蛋白与酵母表达的植酸酶进行了酶学性质研究与比较。结果显示:1)在大肠杆菌中表达的 appAM8(E-appAM8)和酵母中表达的appAM8(P-appAM8)两个植酸酶的最适pH值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的appA的最适pH无明显区别,比appA的最适温度高了5℃;2)经SDS-PAGE检测,E-appAM8分子量大小为47 kDa,而P-appAM8为53 kDa左右,并且由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;3)在60℃-80℃之间,E-appAM8的耐热性明显下降。而且在70℃处理15 min后, E-appAM8残余活性仅为4%,而P-appAM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了它的热稳定性;4)E-appAM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196U/mg,而P-appAM8的Km=0.36mmol/L,Vmax=3333U/mg。本研究通过比较不同宿主中表达的植酸酶的性质,表明糖基化修饰对植酸酶appAM8的热稳定性起重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起一定作用。
  另一方面,对来源于大肠杆菌的植酸酶基因 appA进行突变,获得植酸酶基因突变体 appA-2QN。利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,本研究对表达该酶的重组酵母菌GS115/appA-2QN进行了高密度发酵研究。通过控制发酵过程中的碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,本实验利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度经检测,OD600 nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L;酶活性(发酵效价)为2.03×105 U/mL。这些数据说明,通过高密度发酵提高了产植酸酶appA-2QN的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。
[硕士论文] 魏亚庆
生物工程 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:热休克转录因子(HSFs)或称为热休克因子,广泛存在于真核生物细胞中,是在功能和结构上同源性很高的一种转录因子。当细胞遭受热休克或其他环境压力时,HSFs激活热休克蛋白(HSPs)的表达,从而维持细胞内稳态,帮助细胞存活。HSFs家族有四个成员,其中 HSF1在哺乳动物中非常保守,是调控热休克蛋白表达的主要因子。HSF1直接参与了许多生理过程的调节,例如:生长发育、细胞凋亡、细胞分化、炎症以及肿瘤发生等。
  研究表明,在HSF1敲除的小鼠的晶状体上皮细胞中,HSF1与HSF4可竞争性地结合于靶基因的启动子,共同调控晶状体的发育,提示HSF1在晶状体发育过程中扮演着极其重要的作用。另外 HSF1敲低的斑马鱼模型表明 HSF1可能通过激活HSP70而调控晶状体的发育。斑马鱼胚胎透明,在眼睛发育初期即可对其进行观察,相对于小鼠更适合研究眼睛早期的发育。目前尚无HSF1敲除的斑马鱼模型的报道,因此有必要构建HSF1敲除的斑马鱼模型。
  TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)技术是一种新的基因敲除技术。它利用TALE(Transcription activator-like effector)家族的蛋白结构单元特异性识别DNA靶序列之间的能力和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割靶序列,造成DNA双链断裂,诱发DNA修复机制,从而有很高几率诱导靶序列产生突变。
  本论文中,首先应用半定量RT-PCR技术检测了HSF1在斑马鱼中体内的时空表达。发现在斑马鱼胚胎发育过程中,HSF1在6hr时达到最高峰,48hr降至低谷,72hr后 HSF1的表达量有所上升,但仍低于胚胎发育早期,表明该基因存在母源性表达。HSF1在成年斑马鱼各组织中普遍表达,在眼、卵巢、精巢中高表达,而在心脏、脾等组织中的表达比较低,这提示HSF1可能在多种组织器官中具有生理功能,在眼、卵巢和精巢等组织中发挥重要作用。
  应用TALEN技术进一步构建了HSF1缺陷的斑马鱼模型。通过TALEN在线软件设计选择HSF1外显子一的TALEN靶位点后,采用Golden Gate的方法成功构建出了TALEN表达质粒。应用RNA体外转录的方法合成TALEN的mRNA,将其注射到一细胞期的斑马鱼受精卵中。应用PCR-RFLP的方法检测TALEN效果,表明获得了F0嵌合突变体。通过F0和野生型斑马鱼杂交,成功获得了三种类型的F1代斑马鱼,分别是:c.90_98delGGATCCGGA(p.Glu30_Pro32del),c.78_81delGACG(p.Trp26Cysfs*10)和c.91delG(p.Asp31Ilefs*6)。
  本论文应用TALEN技术,首次在斑马鱼中敲除hsf1基因,得到三种HSF1缺陷的斑马鱼模型,为以后研究HSF1的功能,特别是在斑马鱼眼睛发育过程中的作用,及其具体的分子机制奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 宋凯
科学技术哲学 武汉理工大学 2013(学位年度)
摘要:新世纪合成生物技术的繁荣与发展,逐渐成为推动世界新技术革命的重要力量。近年来,随着合成生物技术产业化步伐的加快,其对人类社会的影响远不止于生态系统、自然环境以及人类健康等方面的潜在风险,任何改变人类物理循环状态和自然繁衍规律,及其影响人类社会关系的技术产业发展过程,都将对人类社会秩序和伦理构成深远影响。同其他科技产业发展一样,合成生物技术产业一方面在给人类带来巨大社会经济利益的同时,也让人们看到了解决诸多人类社会发展困境的希望,看到了合成生物技术在解决人类社会能源问题、人口问题、粮食问题、健康问题和环境问题等方面的能力和优势;另一方面合成生物技术也无法掩饰其内在和外在的负效应,其在技术研究过程中、产业化进程中无法保障人类健康与生命安全性问题,也无法保证生态多样性不被侵害,这其中存在的知情权问题、隐私权问题、基因歧视问题以及该技术发展侵犯人类生存尊严问题等,需要引起广泛的关注。
  本文着眼于产业哲学的维度,对我国合成生物技术产业发展战略与政策应用可能产生的诸多问题发出思考。分析了合成生物技术的研究机理及其相关领域,对该项技术的发展过程进行了梳理,并系统地阐述了合成生物技术的发展趋势,及该技术的国内外研究现状。主要针对我国合成生物技术产业发展态势,从技术成长路径、产业演化特征及其产业培育模式三个方面入手,对我国合成生物技术产业发展进行系统评估,着力剖析技术成果转化中产业化运作的方式方法,为具体的产业开发提供理论分析依据。
  本文主体部分全面论述我国合成生物技术产业的发展环境,运用马克思主义方法论从我国特定的产业背景中分析得出适合我国国情的合成生物技术产业发展的价值定位。立足于我国经济社会发展现状制定相关产业政策战略,针对上述对我国产业现状的分析,提出适应我国合成生物技术产业政策的目标与原则。具体问题具体分析,提出具有可操作性和针对性的对策建议:一是建立合成生物技术产业政策评估体系,二是完善政府职能加强政策引导,三是推进体制机制创新健全市场化模式,四是实施人才培育发展战略,五是构建成熟的金融体系和财税政策,六是坚持技术创新培育产业竞争力走新兴产业可持续发展道路。从而有效的提升我国新兴技术成果产业化的能力。使合成生物技术产业化发展更好的服务于社会,更好地服务于我国的国民经济建设。
[硕士论文] 许守英
生物化工 齐鲁工业大学 2013(学位年度)
摘要:深海热液和浅海热泉是嗜热氢酶最主要的发源地。微生物发酵是氢气生产的一种重要技术,在深海热液环境中产氢的微生物是嗜热的和耐盐的,目前已经调查和研究的嗜热环境均分布着嗜热的氢还原或者氢氧化的细菌,因此热泉仍然蕴藏着大量未知的、有可能培养的产氢酶微生物。
  本论文对印度洋卡利安达岛海洋热泉周边的微生物群落进行了分析,采集了热泉周边的海水样品、菌苔和沉积物,通过扩增构建热泉微生物的总16SrRNA基因库,分析热泉微生物的多样性。结果表明热泉周围不同样品具有很高的微生物类群多样性,大部分序列与已知细菌16S rDNA序列相似性较高(88%~100%),归属于变形细菌的α-变形菌纲、β-变形菌纲、δ-变形菌纲、γ-变形菌纲,壁厚菌门的梭菌纲、芽孢杆菌纲,脱铁杆菌纲,疣微菌纲,蓝细菌等系统分类群,其中变形细菌的γ-变形菌纲(占总克隆的41.88%)、β-变形菌纲(占总克隆的19.23%)、α-变形菌纲(占总克隆的8.97%)为热泉周边海水的优势细菌类群。蓝细菌的Chroobacteria(占总克隆的55.29%)、拟杆菌门的拟杆菌纲(占总克隆的13.53%)、α-变形菌纲(占总克隆的10%)是菌苔微生物群落中的优势细菌类群。脱铁杆菌纲(占总克隆的28.21%)、变形细菌的α-变形菌纲(占总克隆的12.85%)、γ-变形菌纲(占总克隆的10.03%)、β-变形菌纲(占总克隆的8.78%)、δ-变形菌纲(占总克隆的8.78%)是海洋热泉沉积物的优势细菌类群。
  利用不同氢酶引物,以环境DNA为模板进行扩增,构建氢酶基因文库,分析热泉微生物氢酶的多样性。利用三对引物以菌苔DNA和沉积物DNA为模板都得到了目的扩增片段,对目的片段进行回收连接转化。以HydA?F/HydA?R为引物得到的基因库,经过比对,HKM样品中得到了6个不同的基因型,HKS样品中得到了4个不同的基因型,样品HKM和样品HKS所获基因的覆盖率分别是98.04%和97.62%,都与Ignavibacterium albumJCM16511FeFe氢酶类群的菌氨基酸序列有75%-96%的相似性。Ignavibacterium album是在陆地温泉的微生物藻床分离得到的嗜温化学异养的细菌。这些FeFe氢酶类群的菌氨基酸序列之间的进化关系在72%-99%。以FeFe-272F/FeFe-427R为引物得到的基因库,经过比对,泥样有14种基因型,其覆盖率为62.3%;菌苔(FeM)样品中得到24个基因型,其覆盖率达到65.2%。以HoxH-f/HoxH-r为引物得到的基因库,结果得到菌苔样品中有7种基因型,其覆盖率达到65%;泥样样品中有1种基因型,其覆盖率为95%。
  目前还没有对利用Fe–Fe氢酶产氢的嗜热菌环境的报道。本论文对从温泉海藻床的几个菌群利用全营养培养基进行富集培养,并对其产氢进行分析。通过对16S rRNA基因分析得到了产氢群,并对富集菌群的Fe–Fe氢酶的多样性进行了分析。基于16S rRNA基因序列系统发育分析:在产氢菌群中有10个类群与梭菌属(Clostridia)、Gammaproteobacteria和芽孢杆菌目(Bacillales)中的的已知种属有90-99.5%的相似性。梭菌属是最多的的一组,其中有已知的产氢种属三个梭菌类群(Anaerovorax odorimutans(94.0%相似性),Clostridium papyrosolvens(98.4%相似性)和Clostridiumtepidiprofundi(93.1%相似性)。Fe–Fe氢酶系统发育分析:有7个类群和已知Fe–Fe氢酶有63-97%的相似性,分为不同的四个簇,HW55-3和HM55-1分别是是嗜热和耐盐的梭菌属,基于16S rRNA和Fe–Fe氢酶基因序列的分析都表明了嗜热、耐盐的热泉海藻床产氢菌群都是从未发现的产氢微生物来源,在氢气生产方面有着很大的潜力。
[硕士论文] 尹海畅
生物工程 东北农业大学 2013(学位年度)
摘要:随着抗生素药物的滥用,细菌耐药性、过敏反应和抗生素在畜禽类产品中的残留等问题对人类健康和畜牧业的发展产生了严重影响,迫使人类开始寻找新型的抗生素替代药物。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类由宿主先天免疫系统产生的对抗外来病原微生物的小分子阳离子多肽类物质。AMPs不仅能够直接杀伤病原微生物,而且能够诱导宿主细胞的炎症反应、趋性反应等,在保护生物体免受病原微生物侵害方面发挥了重要作用。单核细胞增生性李斯菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。本研究在前人制备的转基因小鼠的基础上,运用不同检测方法对转基因小鼠进行了鉴定评价,建立ICR小鼠感染单增李斯特菌的感染模型,完成了Ceeropin-XJ抗菌肽转基因小鼠抗单增李斯特菌感染评价的研究。
   分子生物学检测确定整合外源cecropin-XJ基因的转基因小鼠;经PCR检测证实在鼠尾、肺、肝、心脏和脾脏均有外源基因的整合;RT-PCR证实抗菌肽基因在小鼠各组织细胞中转录;血清样品中Western blot同样证实了外源基因在转基因小鼠体内表达;共获得21只F0代小鼠,其中有5只小鼠在DNA、RNA以及蛋白水平的检测为阳性;选取1只F0代DNA、RNA以及蛋白水平均检测分析清楚的Cecropin-XJ转基因鼠与TW野生型小鼠杂交繁育后代转基因鼠,用于后续的感染试验。
   为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以106、107、108、109、1010 CFU/mouse的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;其中10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD50;另取40只小鼠,平均分为两组,公母各半,以测定的半数致死量的剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化以及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21菌株对ICR小鼠的LD50为109.25 CFU;感染周期为10d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出、体重下降等临床症状;组织病理学分析:肝脏先后出现实质内见灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维索性肺炎:通过菌落计数和Real-time PCR的检测方法发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。本试验结果表明,ICR小鼠能够作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。
   30只Cecropin-XJ转基因小鼠和30只WT野生型小鼠分别接种109 CFU剂量的LM。感染后10天,Cecropin-XJ转基因小鼠的成活率为81.25%,而WT野生型小鼠的成活率为50%;转基因小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量显著低于野生型小鼠,并且肝脏和脾脏的组织病理学病变均弱于野生型小鼠的组织病理学病变;分别给15只转基因小鼠和15只野生型小鼠口腔接种6.25×107CFU的单增李斯特菌,感染后发现转基因小鼠的体重恢复到初始体重,而WT小鼠只有初始体重的96.3%;血清抑菌试验表明,转基因小鼠血清的抑菌效果明显强于野生型小鼠的血清的抑菌效果;
   本研究探讨了转基因动物的检测方法、建立了ICR小鼠感染单增李斯特菌的感染模型,完成了Cecropin-XJ抗菌肽转基因小鼠抗单增李斯特菌感染评价的工作,为研究抗菌肽的抗菌机制及转基因动物抗病育种的发展奠定了基础。
[硕士论文] 张东丽
生物工程 郑州大学 2013(学位年度)
摘要:目的:
   构建含绿色荧光蛋白(GFP)标记、β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi重组腺病毒表达载体,利用包装好的重组腺病毒感染羊膜间充质干细胞(AMSC),在转录后水平有效的抑制β-catenin的表达,探讨siRNA干扰β-catenin对AMSC增殖的影响。
   方法:
   利用脂质体将设计合成好的三个β-cateninsiRNA干扰片段瞬时转染AMSC,利用免疫印迹(WesternBlot)筛选最优的β-cateninsiRNA干扰片段;然后编码针对最优干扰片段,即CTNNB1短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的单链DNA,并通过退火反应获得目的基因双链DNA,将目的基因连接至腺病毒穿梭质粒中构建阳性重组质粒pAdTrack-si-β-catenin,经PmeI酶切线性化后使其在BJ5183菌中与腺病毒骨架质粒进行同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-si-β-catenin,利用脂质体将经PacⅠ酶切线性化后的重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒、空斑实验测定病毒滴度。重组腺病毒感染AMSC,WesternBlot法检测AMSC中β-catenin及GSK-3β的表达情况,CKK-8法检测β-catenin沉默表达对AMSC增殖的影响。
   结果:
   1.β-cateninsiRNA干扰片段瞬时转染AMSC可以有效抑制β-catenin的表达,通过WesternBlot成功的筛选出了最优的目的基因靶序列,设计并合成了shRNA的DNA双链,并成功构建出重组腺病毒表达载体pAd-si-β-catenin;成功的包装、扩增出重组腺病毒,获得高滴度重组腺病毒。
   2.重组腺病毒感染AMSC后,在荧光倒置显微镜下可以观察到GFP表达,通过WesternBlot检测到重组腺病毒感染AMSC后可以有效的抑制β-catenin基因的表达,感染组β-catenin明显少于对照组。
   3.重组腺病毒感染AMSC后,通过CKK-8法检测细胞生长曲线,与对照组相比,感染组细胞的增殖受到明显抑制。
   结论:
   构建的特异RNAi重组腺病毒能够有效的抑制β-catenin基因的表达,减少了细胞内β-catenin的水平,且β-catenin的沉默表达可以明显抑制AMSC的增殖。
[硕士论文] 耿涛华
生物化工 河北科技大学 2013(学位年度)
摘要:谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)是厌氧发酵VB12常用的产生菌株。发酵过程中,氨基酸充当着重要的有机氮源和生长因子,能够有效促进了谢氏丙酸杆菌的生长及其VB12生物合成。本文通过高效液相色谱检测了谢氏丙酸杆菌VB12发酵过程中氨基酸、有机酸、VB12的变化情况,找到了几种影响VB12产量的关键氨基酸,优化了培养基配方,达到增加谢氏丙酸杆菌VB12产量的目的。
   主要研究成果总结如下:
   (1)建立了一种反相高效液相色谱法,可以同时测定多种游离氨基酸,以DNFB作为氨基酸柱前衍生试剂,通过优化色谱条件,使19种氨基酸在30min内分离效果良好。利用该方法检测了谢氏丙酸菌发酵液中游离氨基酸的含量,获得了同样良好的分离效果,说明该分析方法准确、可靠,满足分析要求。
   (2)建立了同时检测几种有机酸的高效液相色谱法,采用阳离子交换树脂预处理发酵液,去除杂质峰,处理后样品直接进行液相分析,有机酸组分无损失,获得了同时检测发酵液乙酸、丙酸、琥珀酸的良好效果。
   (3)建立了一种不需转化氰钴胺,直接测定发酵过程中腺苷钴胺素的液相色谱分析方法。采用萃取法提取丙酸菌胞内VB12,提取物不需转化可以直接进行液相分析。
   (4)基于液相分析方法,通过对谢氏丙酸杆菌VB12发酵过程中氨基酸、有机酸和腺苷钴胺素含量的检测,对谢氏丙酸杆菌VB12发酵过程有了更深入的了解,特别是发酵过程发现了多种优先利用的氨基酸。单因素实验表明Tyr、Asn、Asp和Met四种氨基酸单独添加都可以提高10%VB12产量,进一步进行正交试验,考察了这几种关键氨基酸对VB12产生的影响,结果显示四种氨基酸对VB12产量影响顺序为:Tyr>Asn>Asp>Met,发酵培养基中添加Tyr600μg/mL、Asn400μg/mL、Met600μg/mL和Asp400μg/mL,可以使VB12产量较对照组提高了17%。
[硕士论文] 付玉平
临床医学;外科学 中国医科大学 2013(学位年度)
摘要:目的:
   研究β-TCP涂层镁合金(β-TCP/Mg-AI-Zn)评价材料表面的特性及体外的细胞生物适应性。
   方法:
   制备β-TCP镁合金(β-TCP-Mg-AI-Zn);观测金属材料表面微观结构特性和能谱分析,小鼠颅骨源成骨细胞与材料直接接触培养,荧光染色观察材料表面细胞生长状况,检测成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性。
   结果:
   β-TCP涂层Mg-AI-Zn材料表面呈多孔状,材料表面含镁、钙和磷等元素;成骨细胞与材料直接接触培养24 h及48 h后,材料表面有大量的成骨细胞粘附、伸展、汇合;与Mg-AI-Zn材料比较,β-TCP-Mg-AI-Zn材料明显地促进细胞增殖、显著地增加成骨细胞中ALP活性(P<0.05)。
   结论:
   β-TCP涂层改善了Mg-AI-Zn镁合金材料表面特性及体外的细胞相容性,有望成为新一代可降解医用金属材料。
[硕士论文] 王赫
外科学 中国医科大学 2013(学位年度)
摘要:目的:
   研究软骨源性形态发生蛋白-1(Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1)联合碱性成纤维生长因子(basic fibroblast Growth Factor,bFGF)体外诱导脂肪干细胞(adipose derived stem cell,ADSCs)向软骨细胞分化的协同作用。
   方法:
   ADSCs(cyagen oricell)用含10%胎牛血清L-DMEM培养至第三代,按添加生长因子的不同分为4个实验组,组A:对照组(不加任何生长因子);组B:50ug/lCDMP-1;组C:10ng/ml BFGF;D组:50ug/l CDMP-1+10ng/ml bFGF,倒置显微镜镜观察细胞形态的变化,培养4、7、14d的细胞用MTT法测定各组间增殖和分化能力,14天后分别于观察各组间细胞形态学变化,行阿尔新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色
   结果:
   MTT法检测CDMP-1与bFGF对细胞增殖的影响中CDMP-1+bFGF组>bFGF组>CDMP-1>对照组,ColⅡ免疫细胞化学染色证实CDMP-1+bFGF组细胞阳性率最高(p<0.05)。阿尔新兰染色A组阿尔新蓝染色阴性,B、C组呈淡蓝色,D组呈蓝色。
   结论:
   细胞因子CDMP-1和bFGF联合应用较单个细胞因子可以明显促进脂肪干细胞增殖,并能诱导其向软骨细胞表型分化。
[硕士论文] 杨敏
测试计量技术及仪器 杭州电子科技大学 2012(学位年度)
摘要:生物制造是生命科学、材料科学、制造科学交叉融合的新兴产物。生物制造的研究前沿是细胞三维打印,它是在组织器官的解剖学数字模型直接驱动下,定位装配活细胞/材料单元,制造组织或器官前体的新技术。细胞三维打印为组织工程、再生医学和药物开发等领域提供了全新的技术可能。由于器官是由不同细胞组成并具有复杂微观结构的三维结构体,因而体外构建具有生物活性的组织器官,必然需要细胞三维打印技术能够在空间上实现多种细胞材料的精确定位打印,因此,多细胞高精度打印是三维细胞打印技术成熟应用的关键。
  本文首先系统介绍了细胞三维打印技术的原理和发展,分析了细胞打印对细胞喷射的技术要求,深入探讨了现有三维细胞打印喷头的喷射方式、动力供给和控制。在此基础上,研究和设计适用于多细胞三维打印的喷头结构和使能技术,在实验分析基于活塞挤出的混流多细胞喷头优缺点基础上,确定了基于气动控制的多细胞打印喷头技术设计方案。
  然后,面向多细胞打印,设计并构建了非水平排列的气动多喷头,完成了空气动力提供装置和气密性空气通路设计,并对气动喷头的启停响应进行了分析。在此基础上基于PMAC2-104运动控制平台、联合DMC1380运动控制卡,搭建气阀驱动电路和系统硬件,采用VC++开发喷头控制系统上层应用程序控制软件,实现多喷头的喷射、切换以及运动的精确控制。最后,基于该系统进行了3种颜色基质材料的打印和2种活细胞的打印实验。
  研究结果证明,本系统可实现3个喷头的准确切换和打印,打印过程中喷头喷射的启停响应迅速,启停响应延迟小于5 ms;成型精度小于30μm、喷头间不易发生干扰;系统易于实现多喷头扩展和控制。该系统在三维空间内可完成3种材料的阶梯结构、圆环形腔结构、多边形结构等多种有重要生物应用价值结构的成形打印,并完成2种活细胞打印。CD34和Oil red O染色实验结果显示,打印的细胞在结构内生长良好,细胞定位准确并保持细胞性状。本研究为制造复杂的人体组织和器官提供了新的技术。
[硕士论文] 刘婧
化学工程 中国石油大学(华东) 2012(学位年度)
摘要:卵黄高磷蛋白(Phosvitin,PV)是已知蛋白质中磷酸化程度最高的一种蛋白质,它能够促进金属离子的吸收,具有较高的热稳定性、抗氧化性、乳化性及杀菌作用,广泛应用于食品、医药等行业。
   本论文研究了一种从鸡蛋黄中分离卵黄高磷蛋白的新型提取工艺,避免了使用有机溶剂及多价金属离子。基于蛋黄中不同蛋白质的性质(尤其是溶解性及热稳定性)不同,新型生物分离过程主要包括NaCl溶解、热处理和透析。通过实验考察了影响卵黄高磷蛋白纯度的关键工艺参数,最佳分离条件为:0.17 M NaCl溶液稀释蛋黄;0.5 M NaCl溶液溶解沉淀;加热温度80℃,加热时间30 min;离心力6000×g;4℃下对蒸馏水透析24 h。在最优条件下,卵黄高磷蛋白的回收率为87.1%,N/P值为2.8±0.2。
   提取的卵黄高磷蛋白产品的等电点为4.0-4.2。SDS-PAGE分析结果显示,卵黄高磷蛋白的分子量约为35 kDa;Native-PAGE分析结果显示,它由α和β两种卵黄高磷蛋白构成,本实验得到的产品主要成分为α-卵黄高磷蛋白。卵黄高磷蛋白产品在pH2.0时,β折叠约占78.5%;在pH7.0时,α螺旋约占36%,β折叠约占28%,无规则卷曲约占36%,均与文献数值吻合。这表明,纯化的卵黄高磷蛋白以合理的二级结构折叠。
[硕士论文] 卫萌
包装材料与工程 郑州大学 2012(学位年度)
摘要:中国经济的快速发展推动了人民生活质量的迅速提高,一方面,居民的生态环保意识越来越强,另一方面,家庭布置居室对绿色环境的情趣追求也在不断增长。传统的植物生长箱可以提供高精度的温度、湿度、光照等条件,实现人工对自然环境的模拟,是一种科研仪器,主要应用于农林渔牧、环境科学、生命科学、生物工程等领域,生产和出口先进设备的制造商有德国Sartorius、美国ISCO、加拿大AVVOR、日本SANYO及中国宁波江南仪器厂、上海比朗仪器有限公司等。仪器类植物箱主要依靠微电子技术来实现自动控制,但价格昂贵,控制精度十分严格,对操作环境有特殊要求。本文基于传统植物生长箱的科学原理,研发适于家居环境和满足城市居民对绿色追求的家用植物生长箱新产品。
   城市的飞速发展,在为人们生活带来现代化的同时,也产生了一系列负效应。拥挤的居民楼中,日渐普及的空调系统和相对封闭的居室环境使室内空气浑浊难耐。居室环境质量是影响人体健康的重要环境因素之一,长期生活在空气质量欠佳的居室环境中,对不少身体处于亚健康状态的都市居民来说无疑是雪上加霜。如何改善居室环境,提高居室空气质量,已成为城市居民十分关心,以及当前工业设计师与室内设计师必须面对和解决的现实棘手问题。然而,传统的家庭盆栽方式具有一定的弊端,如花盆沉重不宜搬运、浇水施肥易弄脏地面、培育打理费时费工、品种数量受空间限制、植物生长严重依赖自然条件而不易在室内环境中很好生长等。在这种情况下,开发一种可将植物综合培养、整体操作、方便省时、美观整洁的植物生长箱新产品,成为一个具有市场潜力的课题,它一方面为城市居民对绿色空间的追求提供新的途径,另一方面对陶冶人们的生活情操和改善精神面貌具有一定的现实意义。
   本文从城市居民对自然生态和绿色环境的情趣追求出发,提出家用植物生长箱的产品概念,以开发经济型、家居型植物生长箱新产品为目标,并将此作为研究的创新点。从分析传统植物生长箱的功能着手,研发家居型植物生长箱的功能,通过对其功能分析,包括生态对象及生态能量的容装功能等进行容器结构设计。本课题研发不同的生长箱功能(种植型、花卉性、山水型等),并选择一种典型类别分析和设计其功能概念,同时对其进行结构设计和工业造型设计。从家居空间和休闲生活的协调性出发,通过工业造型理念,把造型、色彩、表面装饰和材料等要素综合在一起赋予产品美学形态和造型,实现工程技术与美学艺术的和谐统一,然后进行虚拟造型设计,为产品加工制造建立设计基础。本课题研发的生长箱易操作、安全、经济,适于工业生产和推广,把自然生态概念和人的绿色情趣结合在一起,为城市居民日益增长的家居环境需求和环保追求提供了一条新的途径。
   人们消费观念的更新和天然环保意识的觉醒,刺激和引导了人们对健康生活和工作环境的迫切需求。家用植物生长箱基于人机工程的科学原理,结合社会、生理、心理、技术、艺术的角度,从结构、造型、色彩、材料等方面进行设计,旨在创造一种符合城市居民物质精神生活双重追求的新产品。科技的进步、新材料的创新和先进加工工艺的提高,为新产品的制造提供了物质基础和技术可能,市场的巨大需求又成为新产品创新的不竭动力。相对于人们日益增长的精神需求,家用植物生长箱的设计适应和把握了市场的变化发展,及时迎合了人们的需求导向,将优美的造型设计与优良的质量相结合,具有可观的市场空间和广阔的发展潜力。
  
[硕士论文] 秦艳
环境工程 重庆大学 2009(学位年度)
摘要:本文结合固氮酶产氢机理和紫膜蛋白光照质子泵的功能,以类球红细菌与盐生盐杆菌混合培养产氢为研究对象。在对类球红细菌生长和产氢条件进行优化试验后,将盐生盐杆菌以不同存在形式(浓缩细胞、紫膜碎片、固定型浓缩细胞、固定型紫膜碎片)与类球红细菌混合培养,以期寻找到合适的盐生盐杆菌存在形式,为生物制氢提供具有较高产氢能力的混合混合体系。并对20%NaCl下生长良好的盐生盐杆菌进行减盐量驯化,将耐低盐浓度的驯化菌与类球红细菌混合培养研究。结论归纳如下:
   ①选取不同碳源、温度、光照和初始pH值4个重要环境影响因子进行3个水平的正交试验,初步确定类球红细菌生长的最佳条件。丙酮酸钠和琥珀酸钠是细菌生长合适的底物;乙酸钠不是类球红细菌的最佳碳源。该菌在pH7.0~8.0、光照强度约20001x、温度30℃~35℃的范围内均能较好生长。通过biolog技术研究发现类球红细菌好氧光照在48小时内具有高代谢活性,能利用大量碳源;厌氧光照下在48~72h之间具有较高活性,72h时利用的碳源多于好氧培养。
   ②初步考察类球红细菌间歇式培养时,菌种的产氢动力学以及不同碳源、光照强度、温度和交替光源对产氢的影响。随着生物量的增加,细菌产氢量得到提高。琥珀酸钠、丙酮酸钠和葡萄糖都是类球红细菌生长和产氢的良好碳源和氢供体,最大产氢速率在10.3~22.1mL/h/L之间,底物转化效率达到26.2%~40.5%。单一污水作为基质时,没有氢气产生。类球红细菌在50001x~90001x光照强度范围内,随强度增大产氢能力增强;增加到一定程度后细菌产氢活性降低。在30℃~35℃范围内,类球红细菌的产氢活性较高;当温度大于38℃时产氢能力下降。光照/黑暗环境下,总的产氢量略有提高,但细菌在黑暗阶段没有氢气生成。
   ③将类球红细菌与游离的浓缩细胞(PC)、紫膜碎片(PM)混合培养发现,PC形式存在的BR对类球红细菌产氢有明显促进作用,在一定范围内随着BR浓度的增加,产氢能力提高。当BR量为80nmol时,累计产氢量为217ml,最高产氢速率17.9 ml/h/L,单位体积产氢量1085 ml/L。以PM形式存在的BR对类球红细菌产氢几乎没有影响。光照厌氧下,BR向反应器混合液中进发质子,不仅可以被固氮酶用于产氢,还可以调节混合液pH值,延长产氢时间。
   ④选取海藻酸钠(SA)对PC、PM进行包埋固定,将SA-PC、SA-PM与类球红细菌混合产氢培养发现,SA-PC可以提高PC的稳定性,提高了质子泵效率,增强了类球红细菌的产氢能力。当BR含量为40nmol时,最大产氢速率为16.3mL/h/L,单位体积产氢量达到1165 mL/L。包埋后的SA-PM光敏性强于SA-PC,更能促进类球红细菌产氢。当BR量为20nmol时,SA-PM把产氢速率提高为14.6mL/h/L,单位体积产氢量达到1085 mL/L。含等量BR的情况下,不同存在形式的盐生盐杆菌对类球红细菌产氢的促进能力依次为:SA-PM>SA-PC>PC>PM。将类球红细菌和SA-PC(BR为160nmol)半连通培养时,SA-PC产生的质子通过两室间的阳离子交换膜发生转移,提高类球红细菌产氢量。
   ⑤对盐生盐杆菌进行减盐量驯化,使其能在14%NaCl的环境下良好生长。从驯化后的菌体内分离得到PC、PM仍具有光敏性。PC(BR为160nmol)对类球红细菌产氢有促进作用,累计产氢量提高到234ml;PM则没有明显的促进作用。与未驯化的菌株相比,以PC、PM形式存在的光敏性并没有得到大幅度提高。
[硕士论文] 冯旭华
情报学 山东省医学科学院 2009(学位年度)
摘要:目的:调查研究我省目前生物经济发展的总体现状、整体布局、重点领域,查找发展过程中的问题和不足;分析我省生物经济占据的优势、存在的劣势、外部的机会和威胁,并提出发展对策与建议,为我省生物经济发展决策和政策制定提供参考。 方法:根据研究目的,通过文献回顾综述了国内外及山东省生物经济发展的现状、重点领域等情况;通过网络调研查询了山东省17地市生物经济发展的总体布局,借助信息计量学的统计方法分析山东省生物经济发展的情况等。 结果: 一、文献回顾结果1、世界生物经济发展现况:生物技术研究超前,全球生物技术主要应用领域是在医药和农业,60%以上的生物技术成果用于医药工业,用来开发特色新药或改良传统医药,由此引发了医药工业的重大变革,但是在环保、食品、化工等行业也有广阔的应用前景。另外,生物技术产业发展迅猛,生物技术企业数量,从业人员数量、生物产业产值都在增长,很多国家都制定了生物经济发展战略以促进它的发展,生物经济发展方兴未艾。 2、我国生物经济发展现况:自80年代起,我国开始实施高新计划,生物技术亦列入其中。随着科研基础的不断加强,生物技术产业发展规模也日益壮大,为了促进生物经济的发展,国家和一些省市出台了生物产业发展规划。然而,我国生物经济发展亦面临着自主创新能力不足、缺乏专门的组织管理机构、资本市场不完善、融资税收政策缺位等问题,导致行业发展无序,重复建设严重,发展资金缺乏,税收负担重较重。这些都是生物经济发展的阻碍。 3、山东省生物经济现况:山东省生物技术研究开始较早,在生物医药、生物农业、海洋生物等方面都有较好的基础。丰富的自然资源和科研人才贮备保证了生物产业的持续发展,近年来,生物产业的产值、销售收入、利税等指标都有所增长,生物经济初具规模。 二、网络调研结果山东省有独立网站的生物经济类企业、研究机构、高等院校和职业技术类学校共计374家/所,其中企业274家,研究机构50家,高等院校和职业技术类学校50家,山东省生物济类企业、生物经济类研究机构、生物经济类人力资源具体分布现况的结果如下: 1、274家生物经济类企业中,济南市占22.26%,青岛市占21.17%,烟台市占10.95%,分别占据前三位;在发展领域中,生物制造类占45.26%,生物农业类占26.28%,生物医药类占17.88%: 2、网络调研结果中,聊城市和日照市的未见有独立网站建设的生物经济类研究机构;50家研究机构中,济南市、青岛市分别占30.00%和20.00%;研究方向中,生物制造类、生物农业类分别占42.00%和40.00%; 3、除莱芜市和日照市外,其它15城市均有生物经济类专业的高校或职业技术学校。高等院校或职业技术学校的城市分布中,济南市、烟台市、青岛市、潍坊市共计27所,占高校或学校总数的54.00%;生物经济类专业数的城市分布中,济南市、青岛市、泰安市、烟台市共计100个,占专业总数的58.82%。研究方向中,生物制造类占专业总数的44.12%,生物农业、生物医药分别占21.76%。 结论: 今后一段时期,将是我省乃至我国生物经济发展的重要战略机遇期,是我省加快生物技术产业化,并在某些领域实现跨越式发展的重要时期。通过SWOT分析,我们把好山东生物经济发展的脉搏,提出有针对性的措施,促进生物经济的发展。 1、优势:山东省具有发展生物经济的资源优势,且在生物农业、生物医药、生物制造等领域有较好的研究基础,生物经济相关人才聚集,发展生物经济具有较好的资源和科研支撑。 2、劣势:山东省生物经济发展面临自主创新能力不足、企业规模偏小、政策法规不完善等问题,这也是我国生物经济发展较为普遍的问题。 3、机遇:山东省政府对生物经济的重视力度不断加强,出台了《山东省生物产业发展规划(2008-2012)》,为生物经济发展创造良好的环境,生物经济整体发展态势良好,经过十几年的发展已经初具规模。 4、威胁:与发达国家及国内的先进省市相比,我省生物经济发展面临挑战和激烈的竞争,资本市场的不完善也限制了生物企业的发展,战略引导亟待提升。 5、对策:制定和实施生物经济发展战略,抢占生物经济的制高点;提高认识和重视程度,注重生物经济发展初期政府的引导作用;加强生物技术与生物产业链结,提升生物经济科学研究水平;成立生物经济专管机构,加强对外合作交流;加强资本市场、人才市场和产业环境建设与完善,促进生物经济的全面发展;整合生物技术产业资源、组织调研和统计;加强源头创新,提高自主创新能力。
[硕士论文] 吴娜
生物工程 内蒙古大学 2008(学位年度)
摘要:核桃系胡桃科核桃属柿物,原产于欧洲东南部、东亚及北美地区,是人类种植最古老的树生坚果之一。核桃又名胡桃、羌桃,它与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。在我国分布范围广阔。核桃仁中的主要营养成分脂肪和蛋白质,核桃的经济价值很高。本文研究了以核桃早实类群的无性系品种“元丰”为试验材料,分别研究了不同包装(透明聚乙烯袋密封包装、铝箔密封包装、黑色塑料袋散装)处理和不同贮藏条件(温度)对核桃仁的过氧化值、酸价以及核桃中有关酶(SOD、CAT、脂肪酶)活性的变化对核桃仁品质的影响,以及与氧化酸败之间的关系。 试验结果表明:在贮藏过程中,核桃仁自身抗氧化物质如:SOD、CMT与核桃仁氧化酸败的指标酸价之间呈负相关,且常温避光、隔氧或者二者的结合方式以及低温贮藏、气调贮藏均可保持较高的酶活性,延长核桃的贮藏期,深入研究核桃仁贮藏过程中有关抗氧化物质的变化与其氧化酸败的关系,这有助于我们了解其氧化酸败的机理,为核桃仁进行加工、销售前的大规模贮藏提供理论上的依据。
[硕士论文] 元向东
生物工程 内蒙古大学 2008(学位年度)
摘要:HACCP体系是一种科学、简便、实用的预防性食品安全体系,它在预防与控制从食品原料生产、加工到贮运、销售等全过程可能存在的潜在危害、最大限度的降低风险等方面具有明显的效果。 本研究结合搅拌型果粒酸牛乳系列产品生产实际,以某酸牛乳生产厂为研究对象,对搅拌型果粒酸牛乳生产的HACCP体系建立进行了研究。在GMP和SSOP基础上,以HACCP的七个原理为依据,对生产工艺过程进行危害分析,通过试验和文献资料确认了五个生产关键控制点,设计了HACCP的程序体系在工厂实际生产过程中的应用,制订了HACCP的实施计划。对生产过程进行危害分析及确定关键控制点,并对对该产品生产的主要质量控制点进行调查和研究。依靠基于HACCP的有效运作程序和操作规范,可以纠正现行体系中存在的偏离和缺陷,提出有预防性的改进措施,消除潜在的隐患,提高酸乳的质量并降低其成本。 通过基于HACCP的食品安全管理体系的完整运行,进行了产品质量的阶段性对比。从实际运行来看HACCP提高了产品质量的控制水平,减少了产品损耗,起到了良好效果。
[博士论文] 王永忠
工程热物理 重庆大学 2008(学位年度)
摘要:当前能源持续紧张,国际石油价格大幅振荡,不断攀升,能源短缺问题成为困扰社会和经济发展的首要问题,同时化石能源的开采和应用对环境造成了严重破坏,特别是产生的CO2引起的温室效应带来的极端和异常气候变化、氮氧化物和SO2带来的酸雨等问题严重地威胁着地球和人类的可持续发展。我国是一个能源资源相对贫乏的国家,特别是石油、天然气人均资源量仅为世界平均水平的7.7%和7.1%。因此开发可再生的生物能源对于促进可持续社会的发展具有重要意义。在可再生能源中氢能是21世纪的可再生“能源之星”和最有前景的能源,并广泛地被认同为化石燃料的潜在替代能源,2007年4月国家颁布能源发展“十一五规划”更明确指出将氢能开发作为我国今后重点的前沿发展技术之一。目前广泛采用的传统制氢方法一方面仍消耗化石能源,另一方面对环境造成破坏,而利用光合细菌将有机废弃物转化为氢能是一种可持续发展的制氢方式。
  固定化技术是当今生物工程领域中的研究热点,但关于固定化细胞生物制氢反应器中传输特性的研究还极少进行,这方面的研究对于解决固定化细胞技术中的传输限制性问题和光生物制氢中光能利用率低、产氢率低等问题具有重要的理论和实践意义,为固定化技术在生物能源领域的应用奠定一定基础。
  本课题主要是研究固定化光合细菌在光产氢过程中的底物传输特性及产氢特性。实验创新性地采用双层平板法从长期排放污水的水沟淤泥中筛选、分离纯化出一株具有高产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株(Rhodoseudomonas palustris),进行了光波长、光照强度、底物浓度、培养液pH值和培养温度影响下的序批式培养光合细菌产氢动力学实验,根据实验数据拟合得到最大比生长速率关于不同培养条件参数影响的经验关系式,并建立光合细菌生长、底物消耗和产氢动力学模型,模型较好地反映了操作参数对光合细菌生长、底物消耗和产氢动力学的限制性和抑制性影响。
  实验研究了固定化包埋颗粒产氢和底物消耗特性,建立了固定化包埋颗粒内底物传输与消耗动力学模型,模型预测结果反映了包埋颗粒内底物传输特性,研究结果表明底物主要以扩散方式进入包埋颗粒内,并且沿颗粒半径方向变化底物浓度逐渐减小,包埋颗粒内控制过程主要为生化反应控制过程,提高光合细菌菌种的生化反应速率是提高底物消耗速率的关键。
  固定化包埋颗粒填充床研究结果表明随进口底物浓度增加,底物在填充床反应器内的代谢逐渐由传输控制转化为生化反应控制的过程,随进口流量增加,传质边界层逐渐减小,外扩散传质阻力逐渐消除,主要由以传输控制为主的过程向生化反应控制的过程转化;随入射光照强度的增加,光能供应逐渐由限制性条件向抑制性条件转变;不同光波长激发光合色素天线系统所引起的激发态不同,产生的光化学效应不同,及最佳产氢速率和底物消耗效率所对应的光照强度不完全相同;随培养液pH值和培养温度升高,填充床反应器产氢和底物消耗行为表现为先增加后抑制现象。
  固定化生物膜光生物制氢填充床实验研究表明其它条件一定,光照强度较低时,为限制性条件时,光照强度较高时,为抑制性条件。底物浓度为限制性条件时,属于传质控制过程;进口底物浓度为抑制性条件时,为生化反应控制过程。进口流量较低时,主要为传输控制过程;进口流量和进口底物浓度较高时,主要为反应控制过程。本课题在实验研究基础上建立了生物膜光生物制氢中底物传输与消耗动力学模型,分析了影响填充床内质量传递的外界操作因素,模型预测与实验结果取得了较好吻合。
  同时本课题研究结果表明一定条件下,不同尺度下光合细菌产氢行为表现为以温度为30?C左右或pH值为7.0时产氢速率和底物消耗速率较快,说明温度及pH值主要影响细胞内酶活性。
[博士论文] 成勇
遗传学 南京农业大学 2007(学位年度)
摘要:由于高质量生物药品和医学诊断的需求,转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点之一;成为高效、高质量生产昂贵生物活性蛋白的有效途径之一。应用乳腺生物反应器生产人的重组蛋白较其他的生物学制备系统有产品活性高、成本低的优点,因而某些人的重组蛋白更适宜用乳腺生物反应器来生产。 外源基因在转基因动物乳腺中特异性表达是转基因动物乳腺生物反应器的根本目的。有许多生物活性蛋白基因在乳蛋白调控序列的指导下已经在转基因动物乳腺中表达,其中应用较多的调控元件有:牛αs1-酪蛋白(bovine αs1-casein)、山羊β-酪蛋白(β-casein)、绵羊β-乳球蛋白(BLG)、小鼠的乳清酸蛋白(WAP)等。尽管已有应用这些调控序列实现乳腺特异性表达成功的事例,但大多数实验研究中,乳腺特异性表达的成功率低、乳汁中的表达水平低。 已经发现某些非乳蛋白调控元件对乳腺特异性表达有明显的作用,如绝缘子、染色质开启子、增强子、核基质附着区和内含子等,其中起到重要作用的是转录和翻译调控因子。近年来,尽管乳蛋白启动子及其它表达调控元件已广泛应用于乳腺特异性表达,但相对低的表达水平和不稳定表达案例也较多。 人巨细胞病毒(CMV)启动/增强子是广泛用于真核细胞表达的调控元件,早期的研究证明有提高转录水平的作用,但未见报道用于激活乳腺特异性表达。本研究应用人巨细胞病毒启动/增强子(Pcmv)与乳蛋白调控元件构建复合启动/增强子和人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。 为了鉴定复合启动/增强子对转基因动物乳腺特异性表达水平的作用,我们构建了单一乳蛋白启动子与乳蛋白/Pcmv复合启动子两种不同类型的乳腺特异性表达载体。应用山羊β-酪蛋白、山羊β-乳球蛋白、αs1-牛酪蛋白为乳蛋白调控序列为乳蛋白调控序列;鸡β-珠蛋白(β-globin,隔离元件)、CMV启动/增强子和SV40polyA为非乳蛋白启动/增强子。以不同的乳蛋白调控序列与启动/增强子组合构建乳腺特异性表达复合启动/增强子(chimeric promoter/enhancer),单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。共构建了7个乳腺特异性表达载体(BnF95,pBnCL14,pBnLC2G,pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36),其中4个为复合启动/增强子型载体,另3个为单一乳蛋白启动子型载体。BnF95、pBnCL14和pBnLC2G载体用于转染山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithetical cells,GMECs);pgCNCG/LF25和pbCNCS/LF36为复合启动/增强子型,其中pgCN/LF/g和pbCN/LF为单一酪蛋白启动子作为对照,用于制备转基因小鼠。泌乳山羊乳腺组织经I型胶原酶消化分离乳腺上皮细胞,DMEM/F12培养液(10%FCS)传代培养,获得的乳腺上皮细胞最多可培养25代以上。采用分步胰酶消化法去除上皮细胞中所含的成纤维细胞,从而乳腺上皮细胞得到纯化。通过电转染法将含NEOr标记基因的BnF95、pBnCL14和pBnLC2G外源基因导入23个山羊乳腺上皮细胞系,经G418筛选三周后,得到有抗性的转染细胞株,挑取单克隆细胞株进行增殖培养。共获得242株转染外源基因的细胞,有118株转染pBnCL14,82株转染BnF95,42株转染pBnLC2G基因构件。有3株转染pBnCL14基因的细胞进行nestedPCR整合检测,结果均为外源基因整合阳性。初步认为经G418抗性培养后获得细胞为整合细胞。对抗性培养阳性的细胞株应用催乳素进行诱导表达,收集48和72小时的诱导细胞培养液进行ELISA检测,其中有30株细胞的诱导液中检测出重组人乳铁蛋白,有4株转染pBnCL14基因细胞的表达水平达到10-50mg·L-1;另有22株细胞(9株/BnF95,7株/pBnLC2G)表达水平低于10 mg·L-1。通过G418筛选和诱导表达和ELISA检测验证具有表达功能的乳腺上皮将用于山羊体细胞克隆的供核细胞。 pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36四个构件应用胚胎显微注射的方法制备转基因小鼠。应用PCR初步筛选整合小鼠,获得14只原代转基因小鼠,PCR产物序列分析显示转基因小鼠PCR检测产物与模板的同源率为99.95%~99.75,在PCR正常正确率范围以上。原代鼠与C57或ICR正常鼠交配,在出生的后代鼠中检出37只F1代转基因小鼠。获得的转基因母鼠用ELISA检测乳汁中重组人乳铁蛋白,并繁殖传代,获得F1、F2代转基因小鼠。 复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白(rhLF)表达水平(2~8.1g·L-1)明显高于单一酪蛋白启动子构件(0~12mg·L-1),约10000倍。在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测(ELISA)出重组人乳铁蛋白(rhLF)。研究表明,酪蛋白/Pcmv复合启动/增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平,而且具有良好的乳腺组织表达定位性。 近年来,对基因表达调控机制提出了一些新的看法,认为几乎所有的哺乳动物基因表达是由多个环节调控的,其中包括了转录、转录后加工、核输出和定位、mRNA分子的成熟、翻译和稳定性等。生物信息学分析显示Pcmv含有多个uORF和CCAAT增强子结合位点。Lodhi等(2003)认为uORF能介导编码mRNA翻译的作用,而CCAAT序列是增强子结合蛋白结合的位点。有研究报道,CCAAT位点结合增强子结合蛋白也可介导功能基因的表达,这一过程可能意味着在5’-UTR顺式调控元件,包括复合启动子中乳蛋白和CMV启动子序列能激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞和转基因小鼠乳腺中表达。本领域的研究报道显示,尽管已有一些利用长片段调控元件获得高表达的事例,但更多的低表达案例使开发那些构建方便、片段长度短小、表达效率和表达水平高的乳腺特异性表达载体显得十分迫切。本研究的结果不仅实现了cDNA功能基因的高水平、高效乳腺特异性表达,而且其载体的构建简单方便。到目前为止,尚未见有应用乳蛋白/Pcmv复合启动子激活cDNA功能基因实现乳腺特异性高效表达的报道。
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