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[硕士论文] 张晓彤
皮肤科 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是来源自人类胚胎时期神经嵴黑色素细胞高度恶性肿瘤,起病隐匿、侵袭性高、易发生转移,其预后较差、死亡率极高。随着MM发病率的逐渐增高,其极大的危害了人们的健康生活。肿瘤的发生发展,与机体自身免疫状态、炎症微环境,甚至与肿瘤生长相关血管异常的表达,有着极为密切的相关性。我们实验室已经发现脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)可通过重塑肿瘤炎症微环境以及下调多种肿瘤相关血管生成相关因子的表达,来达到抗MM的作用。但脂氧素A4抗MM作用中的免疫机制,尚不清楚。本研究旨在通过观察研究脂氧素A4对MM小鼠T细胞的作用,阐明其抑制MM生长的免疫机制。
  方法:将鼠源性MM细胞B16通过腹腔接种至C57BL/6小鼠腹部,以此成功构建MM动物模型,并通过抽签法分为磷酸缓冲盐溶液(PBS)组(对照组)和5S,6R-7-三羟甲基庚酸(BML-111)组(实验组)各6例,其中BML-111组注射脂氧素A4类似物BML-111(1mg/kg)进行干预治疗,PBS组则注射PBS缓冲液(1mg/kg),两组均每两天治疗一次,共治疗5次,每天观察记录肿瘤生长情况,并计算体重增长率。终止试验时,手术剥离小鼠肿瘤,测量肿瘤体积并称重,分别计算两组小鼠肿瘤生长抑制率(tumor growth inhibition rate,IR)并绘制肿瘤生长曲线,通过免疫组织化学测定肿瘤组织内CD8+T、CD4+T细胞的数量。手术剥离小鼠脾脏并抽取小鼠血液,通过流式实验检测两组小鼠外周血及脾脏中淋巴细胞所占比。
  结果:BML-111组中肿瘤细胞生长抑制率明显高于PBS组。两组小鼠脾脏与外周血中CD8+T、CD4+T细胞的数量差异无统计学意义。两组小鼠肿瘤组织内CD8+T、CD4+T细胞的表达差异无统计学意义。
  结论:脂氧素A4对小鼠体内MM有明显的抑制作用,但未观察到脂氧素A4通过外周血、脾脏及肿瘤组织中T细胞免疫作用影响来发挥其抗MM作用。
[硕士论文] 苏雅
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究银杏外种皮提取物(Ginkgo biloba exocarp extracts,GBEE)体内外抗B16-F10黑色素瘤转移作用及相关机制。
  方法:
  建立C57BL/6J小鼠B16-F10黑色素瘤肺转移模型,将C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(不接种肿瘤细胞)、模型对照组、阳性对照组、GBEE各治疗组,每组10只。正常对照组和模型对照组灌胃(ig)给予0.1mL/10g生理盐水(NS),每天1次,连续17d;阳性对照组隔日腹腔注射(ip)给予5mg/kg顺铂(DDP),连续7d;GBEE各治疗组分别ig给予GBEE50、100、200mg/kg,每天1次,连续17d。给药结束后第2天,剥瘤称量移植瘤重量,计算抑瘤率;摘取肺组织,于解剖显微镜下观察肺转移灶,计算肺转移率和抗转移率;制备肺组织和移植瘤组织切片,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化;免疫组织化学法检测移植瘤组织CD34的表达并计算微血管密度(MVD),同时检测HIF-1α、VEGF、MMP-9的表达水平。体外培养B16-F10细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用MTT比色法检测GBEE对B16-F10细胞体外增殖的影响;通过细胞黏附实验观察GBEE对B16-F10细胞与HUVEC异质黏附作用的影响;采用细胞划痕法检测GBEE对B16-F10细胞迁移的影响。采用qRT-PCR法和Western Blot法检测GBEE在体内外对HIF-1α、VEGF、VEGFR2、NF-κB、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达水平的影响。
  结果:
  体内实验结果显示,GBEE(50、100、200mg/kg)可抑制B16-F10黑色素瘤移植瘤生长和肺转移,使移植瘤组织MMP-9表达减少,并抑制CD34表达、使MVD降低,且效应皆具有剂量依赖性;同时,可抑制B16-F10移植瘤组织HIF-1α、VEGF和VEGFR2mRNA和蛋白表达,且其抑制作用具有量效关系;还可使B16-F10移植瘤组织p-PI3K、p-Akt的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低,但对PI3K、Akt总蛋白表达水平无明显影响。体外实验结果表明,在5-320μg/mL浓度范围内,GBEE可显著抑制B16-F10细胞增殖,且随着药物浓度的增加其抑制率呈增长趋势;GBEE(10、20、40μg/mL)呈浓度依赖性抑制B16-F10细胞迁移及B16-F10细胞与HUVEC的异质黏附;在mRNA和蛋白水平,GBEE(10、20、40μg/mL)对B16-F10细胞NF-κB、MMP-9、p-PI3K、p-Akt的表达具有抑制作用,并呈浓度依赖效应,但对PI3K、Akt表达无明显影响。
  结论:
  GBEE抗B16-F10黑色素瘤转移的作用机制可能涉及影响PI3K/Akt/NF-κB/MMP-9信号通路而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、异质黏附、细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)降解以及干预PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF信号通路而抑制血管生成。
[硕士论文] 赵丹
病原生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:疫苗接种的原则在于产生针对抗原的保护性免疫应答,且疫苗本身是安全的。传统的减毒疫苗存在毒力回复的潜在风险和全病原体疫苗的低免疫反应限制了其应用。与传统疫苗相比,新型疫苗的安全性高,特异型强,但普遍存在免疫原性低的缺点。因此需要免疫佐剂的加入以充分发挥疫苗的功能。
  细菌菌影(Bacterial Ghost,BG)是革兰阴性菌通过噬菌体PhiX174裂解基因E的诱导形成不含核酸、核糖体等胞质内容物的细菌空壳。细菌菌影保留了天然细菌完整的外膜结构,含有天然的免疫刺激剂,可以作为天然的免疫佐剂。
  肿瘤一直威胁着人类健康,由于发病率和死亡率均较高,因此对肿瘤的发生机制和免疫学的研究有利于开发出有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学的不断进步,利用免疫系统的力量和特异性免疫治疗已成为肿瘤疫苗研究的重点。有效的肿瘤疫苗应增强体液免疫应答和细胞免疫应答来抑制肿瘤的生长。由于可溶性抗原引起低抗体滴度或无效的CTL反应,所以肿瘤疫苗需要佐剂的加入以发挥有效功能。
  本文旨在利用沙门菌菌影(SEG)的天然佐剂作用联合OVA抗原,评价其对抗原提呈细胞的免疫增强作用,并在细胞水平和动物水平上进一步考察SEG在启动体液免疫应答和细胞免疫应答中的作用。为促进临床疫苗佐剂及肿瘤免疫治疗的发展和进步提供思路。
  研究内容包括以下三部分:
  一、沙门菌菌影作为佐剂体外免疫功能的研究
  将重组沙门菌HA2-EBOX进行诱导制备出沙门菌菌影SEG。用透射电镜对SEG进行形态学观察。结果显示,诱导后的重组沙门菌内容物流出形成空壳结构,提示沙门菌菌影SEG成功制备。将SEG联合OVA与BMDC孵育48h后,流式检测BMDC表面分子CD86、CDS0、CD40和MHC-Ⅱ的表达,间接ELISA检测BMDC上清中的细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的分泌。同时,不同剂量的SEG联合OVA-FITC抗原与BMDC共孵育,不同时间点检测BMDC对抗原的摄取情况。结果显示,BMDC经SEG-OVA刺激后,高表达表面成熟分子CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ,高分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α。BMDC对抗原OVA的摄取量随着SEG剂量的增加而增加。同时,为了明确SEG在获得性免疫应答阶段所发挥的作用,检测其是否能够促进CD4+T细胞应答和涛导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答。我们选用转基因小鼠OT-Ⅱ的CD4+T细胞和OT-Ⅰ小鼠脾细胞分别与SEG刺激活化后的BMDC共孵育。结果显示,SEG不仅能够促进BMDC将抗原提呈给CD4+T细胞,同时将抗原交叉提呈给CD8+T细胞。
  二、SEG联合OVA诱导小鼠免疫应答的特性研究
  将不同剂量的SEG分别与BMDC和鼠巨噬细胞系RAW264.7孵育,CCK-8检测其安全性。同时,以一定剂量SEG免疫小鼠,观察小鼠两周内的生存状态。将48只6周龄左右BALB/c小鼠,随机分为6组:不同剂量的SEG联合OVA组(SEG分别为105、106、107CFU)、OVA组、SEG(107CFU)组和PBS对照组,其中OVA为50μg/只。通过皮下注射免疫接种。间接ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平,流式检测小鼠脾脏和外周血中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞频率变化。结果表明,与单独的OVA组相比,SEG-OVA免疫组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平均明显提高,脾脏和外周血CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞频率上调。SEG作为载体包裹OVA(SEG(OVA))免疫小鼠后,胞内染色检测脾脏CD4+T细胞亚群细胞因子IL-4、IFN-γ分泌情况。结果表明,与对照组相比,SEG(OVA)免疫组脾脏CD4+T细胞胞内高分泌IFN-γ,小鼠脾细胞增殖明显。
  三、SEG作为免疫佐剂对皮下黑色素瘤的抑制作用
  在预防肿瘤模型中,我们将6周龄BALB/c小鼠随机分为8组,每组10只,以铝佐剂(Alum)作为阳性对照,SEG组和PBS组作为阴性对照,实验组分别为:OVA组、SEG(OVA)组和SEG-OVA组(SEG分别为105、106、107CFU)。OVA为50μg/只。皮下免疫小鼠,在免疫后第7天,将黑色素瘤细胞B16-OVA制备成细胞悬液注射于小鼠右前肢皮下。肿瘤接种12天后,游标卡尺检测肿瘤大小,在第24天,处死小鼠,分离黑色素瘤。收集小鼠脾细胞,流式检测CD11b+Gr-1+细胞比例。结果显示,SEG作为免疫佐剂能够明显抑制小鼠肿瘤的生长。在治疗肿瘤模型中,我们用B16-OVA皮下接种小鼠,在接种后第7天,将小鼠分组并分别进行免疫:OVA组、SEG(OVA)组和SEG-OVA组(SEG分别为105、106、107CFU),OVA为50μg/只,同时以黑色素瘤(B16F10)作为阴性对照,检测SEG-OVA的特异性。收集小鼠脾细胞,流式检测CD11b+Gr-1+细胞比例。结果显示,SEG-OVA成功延缓了肿瘤的生长速度,且具有较好的特异性。
[硕士论文] 王鹏飞
放射医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  近些年来,由于人类生产生活中产生大量氟氯烃,并且这些化学气体都未经处理释放到空气之中,造成大气臭氧破坏加剧,大气层空洞变大,因此到达地面的紫外线增多,造成人类皮肤鳞癌的发病率增加。皮肤鳞癌的发病率在各种皮肤癌中位居第二,当前针对皮肤鳞癌的基础研究也很多,但皮肤鳞癌确切的发病机制尚不清楚。microRNA(miRNA)是近年发现的一类主要存在于胞质中的长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA,miRNA表达的改变已成为癌症相关功能障碍中的关键特征之一。研究发现miRNA主要参与调控细胞的增殖、分化和凋亡。肿瘤的发生发展受到多种miRNA的调控作用,同一种miRNA在不同的肿瘤中所发挥的作用可能完全不同。有研究发现miR-365可以抑制卵巢癌、胶质瘤、恶性黑色素瘤、结肠癌和非小细胞肺癌,而另有研究发现miR-365可以促进胃癌和胰腺癌的发生发展。我们的前期研究发现miR-365可以促进皮肤鳞癌的发展,这提示我们miR-365在皮肤鳞癌的发展过程中可能通过对上下游靶基因的调控来发挥促进癌症的作用。但是对miR-365促进皮肤鳞癌的发展机制尚不清楚,所以我们进一步对miR-365的下游靶基因进行探索。通过确定HOXA9在皮肤鳞癌中作为miR-365的靶基因,采用生物功能学实验以及检验HOXA9对皮肤鳞癌糖酵解影响来验证HOXA9在皮肤鳞癌进展中发挥的作用。
  方法:
  ①采用qPCR的方法检测miR-365和HOXA9在人正常皮肤细胞与皮肤鳞癌细胞系基因水平表达情况,采用Western Blot检测HOXA9在蛋白水平上的表达情况,IHC检测皮肤鳞癌组织中HOXA9蛋白表达水平并分析其与鳞癌分化程度之间的关系;②生物信息学预测miR-365的靶基因,并进行验证;③采用CCK-8实验检测沉默和过表达HOXA9后皮肤鳞癌HSC-1细胞的增殖能力变化;④采用Transwell实验检测沉默和过表达HOXA9后皮肤鳞癌HSC-1细胞迁移和侵袭能力变化;⑤采用流式细胞实验检测沉默和过表达HOXA9后皮肤鳞癌HSC-1细胞的凋亡变化;⑥采用Seahorse细胞外代谢检测系统检测沉默和过表达HOXA9后细胞代谢方式的改变。
  结果:
  ①相比于正常皮肤细胞,miR-365在皮肤鳞癌细胞中高表达(P<0.05),HOXA9在基因和蛋白水平低表达,HOXA9表达水平越低,皮肤鳞癌分化程度越低;②沉默HOXA9之后,人皮肤鳞癌HSC-1细胞增殖能力增强(P<0.001),过表达HOXA9之后,人皮肤鳞癌HSC-1细胞增殖能力降低(P<0.001);③沉默HOXA9之后,人皮肤鳞癌HSC-1细胞迁移和侵袭能力增强(P<0.01),过表达HOXA9之后,人皮肤鳞癌HSC-1细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.01);④沉默HOXA9后HSC-1细胞凋亡减少(P<0.05),过表达HOXA9后HSC-1细胞凋亡增加(P<0.05);⑤下调HOXA9后HSC-1细胞OCR减少,ECAR增加;上调HOXA9后HSC-1细胞OCR增加ECAR减少。
  结论:
  HOXA9能够抑制人皮肤鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,通过调控糖酵解通路抑制皮肤鳞状细胞癌的发展。
[硕士论文] 黎美青
病理学与病理生理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨Pin1在黑色素瘤干细胞中的作用及Pin1靶向药物治疗的潜在作用,为黑色素瘤的治疗提供实验基础和开拓新的思路.
  研究方法:
  1.通过包装PIN1shRNA慢病毒、感染黑色素瘤细胞及药物筛选,获得稳定敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞株.用Western Blot和流式细胞术探索敲减黑色素瘤细胞Pin1基因后干细胞标志物的表达水平.
  2.敲减黑色素瘤细胞Pin1基因,利用软琼脂克隆形成实验探索黑色素瘤细胞克隆增殖和采用黑色素瘤干细胞微球形成方法探讨干细胞微球形成能力.
  3.在裸鼠后翼一侧皮下注射1*10^6个敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞,另一侧注射同数量的对照细胞,探讨敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞裸鼠体内致瘤性.
  4.敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞梯度稀释行裸鼠皮下成瘤实验探讨黑色素瘤干细胞的致瘤性.
  5.裸鼠随机分为实验组和对照组,实验组裸鼠尾静脉注射2*10^6个敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞,对照组注射同数量的对照细胞,探讨黑色素瘤细胞Pin1基因敲减后裸鼠肺部转移能力.
  6.黑色素瘤细胞注射裸鼠皮下,成瘤后随机分组,单药处理分2组,联合用药处理分4组,用Pin1抑制剂ATRA或联合Vemurafenib用药处理裸鼠,探讨Pin1抑制剂ATRA对黑色素瘤的治疗作用以及探讨联合Vemurafenib治疗黑色素瘤的研究.
  7.用免疫组织化学染色方法检测人临床样本和黑色素瘤组织芯片中Pin1蛋白的表达程度.
  研究结果:
  1.Western Blot显示与黑色素瘤细胞干性标志物NANOG在Pin1基因敲减后下调,分化相关标志物MITF在Pin1基因敲减后上调.
  2.流式细胞术显示Pin1基因敲减后下调黑色素瘤干细胞相关的标志物CD271和ALDH1表达.
  3.软琼脂克隆形成实验显示黑色素瘤细胞克隆增殖能力在敲减Pin1基因后降低;黑色素瘤干细胞微球形成实验显示相比对照组,敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞微球数少且体积小.
  4.裸鼠皮下异种移植黑色素瘤细胞的肿瘤生长和裸鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞的肺部转移能力在黑色素瘤细胞敲减Pin1基因后受到抑制.
  5.黑色素瘤细胞敲减Pin1基因后梯度稀释裸鼠皮下成瘤实验显示在1*10^3、1*10^4、1*10^5个细胞梯度中没有观察到肿瘤的形成.
  6.ATRA单药处理裸鼠皮下黑色素瘤细胞荷瘤,实验显示与对照组相比,Pin1抑制剂ATRA单药能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长.
  7.免疫组织化学染色人临床样本和黑色素瘤组织芯片显示156例病人中有22例高表达(+++),43例中表达(++),46例低表达(+),45例不表达(-).
  研究结论:
  研究的结果显示有14.1%黑色素瘤病人肿瘤组织高表达Pin1.在黑色素瘤细胞中敲减Pin1基因后细胞克隆增殖降低,与干性或分化相关的标志物表达异常,黑色素瘤干细胞标志物及干细胞微球形成能力均下调.裸鼠黑色素瘤细胞的肿瘤生长和肺部转移的能力均在黑色素瘤细胞Pin1基因敲减后得到抑制.Pin1抑制剂ATRA能够抑制裸鼠皮下黑色素瘤细胞的肿瘤生长.因此,认为Pin1通过调控黑色素瘤干细胞而促进黑色素瘤发展,其抑制剂的应用有可能为临床上治疗黑色素瘤提供一个新的思路.
[博士论文] 李媛
皮肤性病学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一类长度约为19~24个核苷酸的内源性非编码RNA分子,它可通过直接与其靶向调控基因的3'-非翻译区(3'-untranslated regions,3'-UTR)的互补序列结合而在转录后水平上调节基因的表达,从而最终导致靶标基因降解或翻译抑制。研究表明,单个miRNA可以调控超过100个基因的表达,同时,一个基因也可能被几个miRNA进行靶向调控。目前,已有大量的miRNAs已被注释,并预测大约有30%~80%的人类基因受到miRNA的调控。近年来,大量研究显示:在多种实体癌症患者的肿瘤组织与其相对应的毗邻肿瘤组织的正常组织之间存在miRNA表达谱的失调,这可能是miRNA的改变而诱发的表观遗传学改变、转录因子的活性改变或与miRNA生物发生相关的酶改变而造成的结果。此外,已有证据表明,异常miRNA的表达可通过下调肿瘤抑制基因或上调肿瘤促癌基因而促成许多癌症的发生,发展与进展。因此,miRNA也被认为是黑色素瘤发展过程中的关键调控因子。
  在人类许多实体癌症中,如:胃癌、肺癌、乳腺癌、大肠癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等,胶原三股螺旋重复蛋白1(Collagen triple helix repeat containing,CTHRC1)均被检测到其可呈现异常的表达,CTHRC1最初是在球囊受损与正常大鼠动脉中差异表达的基因的筛选中被发现,随后,CTHRC1才逐渐地被人们所认识到其为一种大小为28kDa的保守性分泌型的致癌蛋白,然而,
  CTHRC1在黑色素瘤中的详细作用尚未阐明。而且,在前期研究中已经表明,通过生物信息学分析的方法可以预测到microRNA-155(miR-155)可能为CTHRC1上游调控的关键因子。miR-155是由B细胞整合簇(BIC)的加工产生的,它在各种生理和病理过程中发挥重要作用,特别是在许多实体肿瘤的发生发展中。因此,在本研究中,旨在进一步探索miR-155和CTHCR1之间的相互作用,阐明miR-155和CTHCR1在恶性黑色素瘤发病机制和进展中的作用,为恶性黑色素瘤提供新的生物标志物,也为治疗黑色素瘤提供新的目标。
  第一部分:miR-155与CTHRC1在黑色素瘤患者组织中的表达鉴定
  研究目的:
  鉴定miR-155是CTHRC1基因的上游调控miRNA,探讨miR-155与CTHRC1在黑色素瘤患者组织中的表达情况。
  研究方法:
  采用生物信息学的方法预测CTHRC1基因的上游miRNAs,找出最可能调控CTHRC1的上游miRNAs;采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)对生物信息学中预测的CTHRC1上游miRNAs进行检测,通过2例黑色素瘤患者的癌组织和癌旁组织中miR-134、miR-155、miR-30c与miR-630表达情况的检测来验证;最后,采用qRT-PCR进一步检测黑色素瘤患者癌组织和癌旁组织中miR-155与CTHRC1的表达情况。
  研究结果:
  生物信息学分析结果表明,使用7个miRNAs预测数据库可以共同预测到有4个关键的miRNAs能够靶向调控CTHRC1,即:miR-134、miR-155、miR-30c与miR-630。随后,选取2例黑色素瘤患者的癌组织和癌旁组织进行qRT-PCR检测,结果发现,miR-134、miR-30c与miR-630的相对表达量在其中1例患者的癌组织中上调,其癌旁组织中下调,而在另1例患者的癌组织中下调,其癌旁组织中上调,即说明这三个miRNAs在不同患者的癌组织和癌旁组织中表达存在不一致的现象;然而,miR-155的相对表达量在2例患者的癌组织中均下调,而在其癌旁组织中均上调,即说明miR-155在不同患者的癌组织和癌旁组织中表达是呈现一致现象,于是,miR-155被认为是最可能参与调控CTHRC1的上游miRNA。最后,进一步选取了18例黑色素瘤患者的癌组织和癌旁组织再次进行qRT-PCR检测,结果发现,除了4例患者外,其余14例患者的癌组织中miR-155的相对表达量均呈现下调,而在其癌旁组织中miR-155的相对表达量均呈现上调;同时,将这14例患者的癌组织与癌旁组织继续进行qRT-PCR检测,结果发现,CTHRC1的相对表达量在患者的癌组织中呈现明显地上调,而在其癌旁组织中呈现明显地下调。
  研究结论:
  miR-155在黑色素瘤患者癌组织中的低表达说明了miR-155在黑色素瘤的发病机制中的占据着重要的地位,且miR-155与CTHRC1在黑色素瘤患者癌组织与癌旁组织中的表达趋势是相反的,进一步暗示miR-155与CTHRC1之间可能存在潜在的靶向调控关系。
  第二部分:miR-155对CTHRC1的靶向调控作用
  研究目的:
  探讨miR-155与CTHRC1之间的靶向调控关系。
  研究方法:
  采用psiCHECKTM-2vector构建CTHRC1野生型的报告质粒与突变型的报告质粒;采用凝胶电泳和测序方法鉴定所构建的psiCHECK-CTHRCl-WT报告质粒与psiCHECK-CTHRC1-Mutant报告质粒是否正确;采用双荧光素酶报告系统检测miR-155与CTHRC1之间是否存在直接的靶向调控关系;采用qRT-PCR与免疫印迹(Western Blotting,WB)进一步检测miR-155调控下CTHRC1的mRNA(Messenger RNA,信使核糖核酸)与蛋白水平表达情况,从而验证miR-155对CTHRC1的靶向调控作用。
  研究结果:
  通过采用特异性的引物对CTHRC1-3'-UTR片段进行特异性的扩增、随后跑胶,在明确胶片上的CTHRC1-3'-UTR片段为416bp大小的条带后进行切胶回收,再对该片段进行XhoⅠ与NotⅠ位点的双酶切,继而将该酶切片段连接至psiCHECK载体上,并将其置于DH5α大肠杆菌中转化,经过Amp+筛选后挑菌培养,次日将过夜培养的细菌进行质粒抽提、酶切鉴定、测序,从而成功地获得psiCHECK-CTHRC1-WT报告质粒;在获取psiCHECK-CTHRC1-WT报告质粒的基础上,再针对CTHRC1-3'-UTR片段中与miR-155互补结合的那些碱基进行定点突变步骤,之后再行转化、挑菌培养、质粒抽提、酶切鉴定、与测序等实验步骤后,psiCHECK-CTHRC1-Mutant报告质粒也被成功地获取;双荧光素酶报告结果显示,miR-155+CTHRC1-WT组的荧光强度较Blank+CTHRC1-WT组的荧光强度显著性地降低(P<0.01),而在miR-155inhibitor+CTHRC1-WT组的荧光强度较miR-155+CTHRC1-WT组的荧光强度显著性地上升(P<0.01),NC+CTHRC1-WT组与NC inhibitor+CTHRC1-WT组的荧光强度较Blank+CTHRC1-WT组的荧光强度均无明显改变;qRT-PCR与WB实验结果表明,在转染miR-155过表达质粒之后,CTHRC1的mRNA表达水平与蛋白表达水平都有显著性地降低,而在转染miR-155敲除质粒之后,CTHRC1的mRNA表达水平与蛋白表达水平都有显著性地升高。
  研究结论:
  miR-155可以直接靶向调控CTHRC1基因。
  第三部分:miR-155通过靶向于CTHRC1而参与调控黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、周期、迁移及浸润等生物学行为
  研究目的:
  探讨miR-155与CTHRC1对黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、周期、迁移及浸润等生物学行为的影响。
  研究方法:
  将miR-155mimic、CTHRC1mimic和si-CTHRC1转染入黑色素瘤细胞M21中,采用CCK8实验与平板克隆形成实验检测miR-155与CTHRC1对黑色素瘤细胞的增殖的影响;采用流式细胞术检测miR-155与CTHRC1对黑色素瘤细胞的凋亡与周期的影响;采用Transwell小室实验检测miR-155与CTHRC1对黑色素瘤细胞的迁移与侵袭的影响。
  研究结果:
  CCK8实验结果表明,各个组别中M21细胞随着培养时间的延长,其细胞增殖速率也会随之上升,但miR-155组与si-CTHRC1组则可显著性地降低M21细胞的增殖,而CTHRC1组却可显著性地提升M21细胞的增殖;平板克隆实验结果表明,miR-155组与si-CTHRC1组可显著性地降低M21细胞的克隆数,而CTHRC1组却可显著性地提升M21细胞的克隆数;流式细胞术实验结果表明,miR-155组与si-CTHRC1组可显著性地增加M21细胞的凋亡,并延缓M21细胞的周期,而C THRC1组却可显著性地降低M21细胞的凋亡,且促进M21细胞的周期;Transwell小室实验结果表明,miR-155组与si-CTHRC1组可显著性地抑制M21细胞向Transwell小室下迁移与侵袭的细胞个数,而CTHRC1组却可显著性地提升M21细胞向Transwell小室下迁移与侵袭的细胞个数。
  研究结论:
  miR-155可能通过靶向调控CTHRC1而参与到黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、周期、迁移及浸润等生物学行为的调控。
[博士论文] 单秀英
外科学(整形) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  拟用课题组前期制备的Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒,通过尾静脉给药方式注射入小鼠及大鼠体内,观察该复合微粒的安全性及毒理性,构建恶性黑色素瘤的裸鼠模型,通过尾静脉注射的方式将复合微粒注入荷瘤裸鼠体内,观察复合微粒在裸鼠体内的靶向性及对移植瘤的血管生成和生长抑制作用,为将来恶性黑色素瘤的基因靶向治疗提供新的途径和研究依据。
  方法:
  1、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验
  以KM小鼠作为急性毒性实验的实验对象,通过尾静脉注射的方式给各组小鼠分别一次性注射400ul五种浓度(91.6mg/kg、152.8mg/kg、254.6mg/kg、424.2mg/kg、707.0mg/kg)的Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒和生理盐水,持续观察2周小鼠的一般情况,2周后处死小鼠,对重要脏器进行病理组织学检查,HE染色和普鲁士染色观察脏器是否受损。
  2、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验研究
  以SD大鼠作为慢性毒性实验的实验对象,共分为低、中、高浓度剂量组(35.35mg/kg、70.70mg/kg、353.50mg/kg)及对照组,连续2周通过尾静脉注射各实验组和对照组大鼠1ml复合微粒和生理盐水,第15d停药,再继续观察7d,观察给药后各组大鼠的一般表现和体重变化,随后处死大鼠,取眼球血送检血常规和生化,对重要脏器进行病理学检查,HE染色和普鲁士染色观察脏器是否受损。
  3、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性研究
  构建裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤动物模型,将对数生长期的人恶性黑色素瘤细胞(A375细胞)制成细胞悬液,随后接种于裸鼠右腋部皮下组织内,待裸鼠右腋部皮下肿瘤长至约6×6mm2时,将其随机分成靶向组,非靶向组以及空白对照组。靶向组裸鼠通过尾静脉给药方式注射Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒400ul,右腋部臵于4000GS的稳定磁场作用60分钟,非靶向组和对照组裸鼠分别给予400ul的复合微粒和生理盐水,不加磁场,60分钟后处死各组裸鼠,对各组移植瘤组织进HE染色及普鲁士蓝染色观察复合微粒在裸鼠体内的分布情况。
  4、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒抑制裸鼠移植性恶性黑色素瘤生长的实验研究
  将构建好的裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤模型分为两组,每组10只。对照组采用尾静脉注射方法向裸鼠体内注射400ul生理盐水溶液;实验组注射400ul复合微粒,随后紧贴裸鼠右腋皮下荷瘤处外加4000GS的稳定磁场,作用60min,每3天一次,共8次。观察并记录各组裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤的增殖及体积变化情况,统计并分析两组之间移植瘤的体积差异,绘制各组肿瘤生长曲线。采用实时荧光定量RT-PCR检测法检测各组裸鼠移植瘤组织中Ang2基因的相对表达量,统计并分析两组之间Ang2基因的表达差异和移植瘤增殖程度之间的关系。采用免疫组织化学法检测各组裸鼠移植瘤的微血管密度,统计并分析两组之间的差异及其与肿瘤生长增殖的关系。用Tunel染色法检测各组裸鼠移植瘤的细胞凋亡率。
  结果:
  1、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验
  各组小鼠给药后均未出现死亡情况,给药前后各组小鼠的一般情况无变化,高浓度组裸鼠肺组织病理学检查提示肺淤血征象,其余各组重要脏器病理组织学检查未见明显改变,复合微粒的小鼠LD50>707.0mg/kg,表明其急性毒性相对较低。
  2、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验
  给药前后各组大鼠的一般活动和肝肾功能无明显变化,低剂量组大鼠主要脏器病理组织切片检查未见明显异常,中、高剂量组大鼠肺部病理组织切片检查显示慢性肺淤血及纤维化改变,其余脏器未见明显异常,本实验的最低剂量35.35mg/(kg.d)×14d,对大鼠基本无毒性,说明在一定的浓度范围内长期应用该药物是安全的。
  3、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性试验
  成功构建了人恶性黑色素瘤裸鼠移植瘤动物模型,各组裸鼠给药后均未出现死亡情况。对照组、非靶向组和靶向组裸鼠移植瘤组织普鲁士蓝染色分别为阴性、弱阳性和强阳性,此结果说明,Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒注射入裸鼠体内后在磁场作用下,可以定向地聚集在移植瘤组织内。
  4、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒抑制裸鼠移植性恶性黑色素瘤生长的实验
  各组荷瘤裸鼠给药后均未出现死亡情况。实验组裸鼠移植瘤平均体积为1200.81±267.32mm3,显著小于对照组裸鼠移植瘤平均体积6312.01±914.62mm3,差异有统计学意义;实时荧光定量RT-PCR结果显示,Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒对裸鼠移植瘤组织中Ang2基因的抑制率达37.33%;MVD计数结果显示,实验组裸鼠的肿瘤微血管密度为11.52±0.93个/HP,显著低于对照组裸鼠的肿瘤微血管密度为15.67±1.51个/HP,差异有统计学意义;Tunel染色结果显示,实验组裸鼠移植瘤细胞凋亡率为5.35±1.81%,显著高于对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡率为3.32±0.97%,差异有统计学意义。
  结论:
  Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒在一定剂量范围内使用是安全的,具有靶向给药系统载体的特性,在裸鼠体内可以抑制移植性恶性黑色素瘤血管的发生、生长,可以抑制恶性黑色素瘤的增殖、发展。
[硕士论文] 薛晓彤
皮肤病与性病学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:恶性黑素瘤(Malignant Melanoma,MM)是一种由黑素细胞衍生而来的高度恶性肿瘤,多发生于皮肤,其转移率高且预后较差,早期可经血液转移和淋巴转移扩散至全身各器官,是皮肤恶性肿瘤中重要死亡原因之一,且发病率呈逐年上升的趋势。G蛋白信号转导是将细胞外信号经由G蛋白偶联受体传入细胞内的动态过程,其主要环节是鸟苷酸循环。G蛋白偶联的信号转导通路与人体许多重要生理功能的调节有关。近几年研究表明,它在恶性肿瘤的发生发展过程中也起到重要作用。
  RGS(Regulator of G-protein Signaling)蛋白是一组具有多种功能的蛋白质大家族,是GPCR重要的负性调节因子,其家族中有许多分子在恶性肿瘤的发生发展过程中扮演了重要角色。因此,很多研究者推断,RGS基因可以作为恶性肿瘤诊疗及预测的潜在重要靶点,并有待于进一步应用。RGS蛋白主要分为R4、R7和R12三个大家族,而RGS4从属于RGS家族中的R4亚类,在各种生理过程中具有重要功能。作为一种支架蛋白,RGS4可以组装相关的信号分子,从而调控信号传导。近期研究表明,RGS4与非小细胞肺癌细胞及乳腺癌的迁移和侵袭均密切相关。因此,研究RGS4在恶性肿瘤中的作用及其具体机制对于肿瘤的诊断、治疗和预测都是非常重要的。以RGS4与癌症的相关性为出发点,研究RGS4基因在黑色素瘤中的调控表达,并且在前期工作中发现,相比于色素痣组织而言,RGS4在黑色素瘤组织中低表达,但其在恶性黑色素瘤发生发展中的具体作用及机制尚不明确,需要进一步研究。
  本课题拟研究RGS4基因在恶性黑素瘤组织和细胞中的表达及其与相关临床病理参数的关系,同时研究RGS4基因对恶性黑素瘤细胞体外增殖、迁移和侵袭的作用和机制,将有助于进一步明确RGS4基因在MM发生发展中所发挥的作用,对进一步研究MM的预防和治疗具有重要的理论意义和实际应用前景。
  目的:
  为研究RGS4在恶性黑素瘤发生发展中的作用,通过免疫组化法检测恶性黑素瘤组织和色素痣组织中RGS4的表达,并分析在黑素瘤组织中RGS4的表达水平与常见一些临床病理参数的相关性。同时,利用westem blot法检测恶性黑素瘤细胞和正常黑素细胞中RGS4的表达差异,比较是否与免疫组化结果一致。然后,通过调控恶性黑素瘤细胞株中RGS4的表达,检测RGS4对恶性黑素瘤细胞体外增殖、迁移和侵袭等方面的影响;并进行下游分子信号通路的筛选验证,进一步揭示RGS4在黑素瘤中发挥调控作用的初步分子作用机制,为探索RGS4基因可否作为黑素瘤诊疗的新靶点提供初步理论基础。
  方法:
  1、通过免疫组化方法检测色素痣和MM组织中RGS4的表达,并分析其与年龄、性别、TNM分期等相关临床病理参数之间的关系。
  2、Western blot法检测RGS4在正常黑素细胞株(HEM)和恶性黑素瘤细胞株(M14、A375、UACC257、UACC62)中的表达水平,同时筛选出适合于本实验的黑素瘤细胞株,通过转染高表达质粒建立稳定过表达RGS4的细胞株,并通过转染siRNA建立稳定低表达RGS4的细胞株。
  3、CCK8和克隆形成实验检测RGS4对黑素瘤细胞体外增殖能力的影响。TUNEL实验检测RGS4对黑素瘤细胞凋亡能力的影响。Western blot法检测RGS4对凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved caspase3)的调节作用。
  4、Transwell迁移和侵袭实验检测RGS4对黑素瘤细胞体外迁移侵袭能力的影响。Westemblot法检测RGS4对上皮间质转化(EMT)指标蛋白(E-cadherin、N-cadherin)和基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)的调节作用。
  5、Westemblot法检测RGS4对PI3K/AKT信号通路的相关信号分子表达水平的影响;通过在实验过程中加入PI3K抑制剂LY294002,观察RGS4调节黑素瘤细胞中信号通路相关蛋白表达水平的变化。
  结果:
  1.RGS4在恶性黑素瘤组织和细胞中呈低表达。
  RGS4在正常对照的8例色素痣组织和40例恶性黑素瘤组织中的阳性率分别为75%和27.5%。与色素痣组织作比较,RGS4在恶性黑素瘤组织中明显低表达;且RGS4的表达与TNM分期呈显著负相关。Westem blot法检测结果显示,RGS4在正常黑素细胞株HEM中的表达水平显著高于在恶性黑素瘤细胞株(M14、A375、UACC62、UACC257)的表达。
  2.RGS4抑制A375细胞的体外增殖能力。
  选取A375细胞株转染pcDNA3.1-RGS4质粒,使RGS4过表达后,CCK8和克隆形成实验表明,其增殖能力明显受到抑制;而western blot法检测部分凋亡相关蛋白显示,Bcl-2的表达水平明显降低,同时Bax的表达水平明显升高。A375细胞株转染siRNA干扰片段使RGS4低表达后,CCK8和克隆形成实验表明,其增殖能力明显增强,而TUNEL实验显示其凋亡细胞比例减少;同时westernblot法检测部分凋亡相关蛋白结果显示,Bcl-2的表达水平显著升高,而Bax和Cleaved caspase3的表达水平显著降低。
  3.RGS4抑制A375细胞体外迁移和侵袭的能力。
  Transwell实验表明:高表达RGS4后,A375细胞的迁移和侵袭能力受到抑制;而RGS4低表达后,A375细胞的迁移侵袭能力显著增强。Western blot法检测结果显示:敲高RGS4后,A375细胞上皮标志物E-cadherin的表达水平显著升高,而基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达水平显著降低;敲低RGS4后,A375细胞间质标志物N-cadherin的表达水平显著升高,而上皮标志物E-cadherin的表达水平显著降低,MMP2和MMP9的表达水平也显著升高。
  4.RGS4通过抑制PI3K/AKT通路使Cyclin D1和E2F1的表达水平降低,从而抑制A375细胞增殖、迁移等生物学行为。
  Westem blot检测结果显示:过表达RGS4后,A375细胞中p-Akt的表达水平显著降低,同时Cyclin D1和E2F1的表达水平也显著降低;RGS4低表达后,A375细胞中p-Akt的表达水平显著升高,同时Cyclin D1和E2F1的表达水平也显著升高。加入PI3K通路抑制剂LY294002后,在A375细胞中,LY294002部分抵消了下调RGS4引起的p-Akt、Cyclin D1和E2F1表达水平的增高。
  5.RGS4抑制恶性黑素瘤细胞株M14的体外增殖、迁移和侵袭。
  为进一步验证RGS4在恶性黑素瘤细胞中的作用,另选M14细胞株进行功能实验。结果显示:RGS4表达水平降低后,克隆形成实验显示其增殖能力明显增强,Transwell实验显示其侵袭迁移能力明显提高。Western blot结果显示,RGS4低表达后,基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达水平明显升高;凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平明显升高,而Bax的表达水平明显降低。
  结论:
  1、RGS4在恶性黑素瘤组织和细胞中低表达,且与TNM分期呈显著负相关。
  2、RGS4能够抑制黑素瘤细胞的体外增殖、侵袭和迁移等多种恶性生物学行为。
  3、RGS4可能通过抑制黑素瘤细胞中PI3K/AKT信号通路,使Cyclin D1和E2F1的表达水平降低,从而抑制黑素瘤细胞的增殖、迁移等生物学行为,进而抑制恶性黑素瘤的发生发展。
[硕士论文] 耿忆薇
中西医结合临床·外科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  阐明疏风活血方在体外对黑素代谢的影响;探索自噬在黑素代谢中的作用;探寻自噬在疏风活血方调节黑素代谢的作用。
  方法:
  使用L-Dopa法染色鉴定黑素细胞,每日观察细胞形态;使用CCK-8法测定细胞增殖;使用NaOH法测定黑素合成;使用细胞裂解法检测TYR活性;使用Western blot法细胞检测自噬相关蛋白Beclin1和LC-3Ⅱ表达。
  结果:
  1.与C组相比,疏风活血方对体外培养的B16细胞增殖有抑制作用(P<0.05),同浓度RS组与R组相比,B16的细胞增殖率更低,但两者没有统计学差异(P>0.05);疏风活血方对酪氨酸酶活性及黑素合成起促进作用(P<0.05),同浓度RS组与R组相比,B16的酪氨酸酶活性及黑素黑素含量更高,但两者没有统计学差异(P>0.05);雷帕霉素对体外培养的B16细胞增殖有抑制作用(P<0.05);对酪氨酸酶活性及黑素合成起促进作用(P<0.05);疏风活血方及雷帕霉素组均能上调自噬相关蛋白LC3B及Beclin1的含量,上调两蛋白的作用依次为0.98mg/ml S组、0.98mg/ml RS组及Rap50组。
  2.与C组相比,疏风活血方对体外培养的正常人表皮黑素细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),同浓度RS组与R组相比,黑素细胞的细胞增殖率更高,但两者没有统计学差异(P>0.05);S组各浓度药物对酪氨酸酶活性在低浓度时呈促进作用(P<0.05);在中高浓度时呈抑制作用,但无统计学意义(P>0.05);中低浓度S组对黑素细胞黑素合成有促进作用(P<0.05),中浓度(0.49mg/ml)S组对黑素合成无明显影响(P>0.05),高浓度(0.98mg/ml)S组对黑素合成呈抑制作用(P<0.05)。同浓度RS组与R组相比,黑素含量较S组增加,但两者没有统计学差异(P>0.05);各浓度雷帕霉素对体外培养的正常人表皮黑素细胞的细胞增殖有促进作用(P>0.05);对酪氨酸酶活性及黑素合成均起促进作用(P<0.05);疏风活血方及雷帕霉素均能上调自噬相关蛋白LC3B及Beclin1,上调两蛋白的作用依次为0.25mg/mlS组、0.25mg/ml RS组Rap50组。
  结论:
  1.疏风活血方可能通过自噬途径对体外培养的鼠B16黑素瘤细胞黑素代谢起调节作用,对其细胞增殖有抑制作用;对酪氨酸酶活性及黑素合成起促进作用;能上调自噬相关蛋白LC3B、Beclin1。
  2.疏风活血方能通过自噬途径对体外培养的正常人表皮黑素细胞黑素代谢起调节作用,对其细胞增殖有抑制作用;对酪氨酸酶活性及黑素合成主要起促进作用;能上调自噬相关蛋白LC3B及Beclin1。
  3.自噬诱导剂雷帕霉素能对两细胞模型黑素代谢起调节作用,对B16细胞增殖起抑制作用,对正常人表皮黑素细胞增殖起促进作用;对两细胞模型的酪氨酸酶活性和黑素合成均起促进作用,并能上调自噬相关蛋白LC3B和Beclin1。
[硕士论文] 王亚兰
中医外科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究刺蒺藜不同浓度对人黑色素瘤SK-Mel-23细胞黑素代谢的影响,并探讨刺蒺藜调节色素代谢的分子机制。
  方法:
  以刺蒺藜水提取物为实验药物,人黑色素瘤SK-Mel-23细胞为模型,实验分为刺蒺藜组、H-89+刺蒺藜组、空白对照组,MTT法检测SK-Mel-23细胞活性,NaOH裂解法测定黑素含量,多巴速率氧化法测定酪氨酸酶活性,Western Blot法检测蛋白表达。
  结果:
  1.刺蒺藜组对黑素代谢的影响和作用机制
  1.1 对细胞活性的影响不同浓度刺蒺藜作用SK-Mel-23细胞24、48、72小时后,均对细胞活性有统计学意义(F=19.623,P<0.001;F=5.49,P<0.01;F=2.04,P<0.01),在低浓度的时促进细胞活性,随着浓度增加呈抑制作用。
  1.2 对黑素合成的影响不同浓度刺蒺藜作用SK-Mel-23细胞24、48、72小时后,均对黑素合成有统计学意义(F=11.927,P<0.001;F=9.03,P<0.001;F=16.5,P<0.001),在低浓度时对黑素合成呈抑制作用,随着浓度增加呈促进作用。
  1.3 对酪氨酸酶活性的影响不同浓度刺蒺藜作用SK-Mel-23细胞24、48、72小时后,对酪氨酸酶活性有统计学意义(F=5.74,P<0.001;F=3.97,P<0.001;F=21.55,P<0.001),低浓度的时对SK-Mel-23细胞酪氨酸酶活性呈抑制作用,随着浓度增加呈促进作用。
  1.4 对蛋白表达的影响不同浓度刺蒺藜作用SK-Mel-23细胞48h后,与对照组比对TYR、TRP-1、MITF、p-CREB蛋白的影响有统计学意义(F=23.97,P<0.001;F=11.37,P<0.001;F=1.53,P<0.05;F=2.67,P<0.05),低浓度的时候抑制蛋白表达,随着浓度增加促进蛋白表达。
  2.H-89+刺蒺藜组对黑素代谢及蛋白表达的影响
  2.1 对黑素合成的影响H-89处理后加入刺蒺藜培养48h,不同浓度组与加入H-89对照组比对黑素合成的影响无统计学意义(F=0.683,P=0.61),不同浓度组与不加入H-89对照组比对黑素合成的影响有统计学意义(F=2915,P<0.001)。
  2.2 对酪氨酸酶活性的影响H-89处理后加入刺蒺藜培养48h,不同浓度组与加入H-89对照组比对酪氨酸酶活性的影响无统计学意义(F=0.416,P=0.822),不同浓度组与不加入H-89对照组比对酪氨酸酶活性的影响有统计学意义(F=354.9,P<0.001)。
  2.3 对蛋白表达的影响H-89处理后加入刺蒺藜培养48h,各浓度组与加H-89对照组对比对TYR、TRP-1、MITF、p-CREB表达无统计学意义(F=2.499,P=0.9;F=3.062,P=0.89;F=0.76,P=0.61;F=0.89,=0.51),蛋白的表达不随浓度的改变而变化,各浓度组与不加H-89对照组对比对蛋白表达有统计学意义(F=7.324,P<0.05;F=2.927.P<0.05;F=10.41,P<0.01;F=7.233,P<0.001)。
  讨论:
  本实验证实刺蒺藜能双向调节色素代谢,实验最佳时间为48h。刺蒺藜在低浓度时对细胞活性有抑制作用,在高浓度时对细胞活性有促进作用;对黑素合成和酪氨酸酶活性呈相反作用,其作用机制可能是在低浓度时抑制TYR、TRP-1、MITF、p-CREB蛋白的表达,而在高浓度时促进蛋白的表达。加入PKA通路抑制剂后刺蒺藜不同浓度对色素代谢基本无改变,说明刺蒺藜是通过调控cAMP/PKA通路来调控色素代谢的。
[硕士论文] 高菲
皮肤病与性病学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肢端恶性黑色素瘤(ALM)是中国人最常见的恶性黑素瘤的类型,同时此部位的色素痣发病率也较高,由于黑色素瘤早期并未形成明显的恶性黑色素瘤所具有的典型临床特征,因此早期很难和色素痣相鉴别,从而常因漏诊或误诊导致ALM失去最佳治疗时机或对肢端色素痣(AMN)进行了过度治疗,因此ALM的早期诊断和早期治疗就成为了一个急需解决的问题。皮肤镜作为皮肤疾病的诊断辅助工具,其优势不仅是无创、非侵入性,还体现在其在色素性疾病诊断中的价值。本研究旨在评价皮肤镜在肢端黑素细胞性疾病诊断与鉴别诊断的价值,验证其诊断ALM的灵敏度、特异度,并分析总结我国AMN及ALM的皮肤镜特征与国外现存的皮肤镜征象之间的共同与差异,并初步探索皮肤镜在诊断早期ALM中的图像特征与应用价值。
  方法:
  于2015年10月至2018年1月我科门诊就诊的患者中,筛选出84例获得性肢端黑素细胞性疾病,入选标准为发生于手掌、足跖及手指、足趾掌侧面的获得性黑素细胞性疾病,患者其他客观条件均不限。对所有入选患者行皮肤镜检查及组织病理学检查,同时保留临床及皮肤镜照片,由经验丰富的临床医师做出皮肤镜诊断并对其图像特征进行分析,然后以组织病理学为金标准,统计分析皮肤镜诊断ALM的特异度、灵敏度,Youden指数,Kappa值及与病理诊断结果的一致性,并统计出AMN及ALM的每一皮损中所存在的各皮肤镜征象出现的频次,计算其发生率,并与国外相关研究结果进行分析、比较。
  结果:
  1.入选84例患者,临床拟诊为AMN者70例,拟诊为ALM者14例;经病理学检查后,确诊为AMN者共68例,男性20例,女性48例,发病年龄为8-73岁,平均为32岁;其中有5例发病部位为手掌,而63例部位为足跖。病理确诊为ALM者共16例(其中肢端原位黑素瘤2例),男性9例,女性7例,发病年龄为52-85岁,平均63岁,且全部发生于足跖。
  2.皮肤镜诊断AMN的灵敏度为91.2%,特异度为81.2%,Youden指数为72.4%,Kappa值为0.676(>0.6),皮肤镜与组织病理学在诊断结果上相对一致。
  3.皮肤镜诊断ALM的灵敏度为81.2%,特异度为91.2%,Youden指数为72.4%,Kappa值为0.676(>0.6),即皮肤镜与组织病理在诊断ALM上结果也相对一致。
  4.AMN中最常见的皮肤镜模式分别为:皮沟平行模式26例(38.2%)、纤维模式18例(26.5%)和球状结构11例(16.2%);ALM中最常见的皮肤镜模式分别为:平行嵴模式13例(81.25%)、弥漫性不规则色素沉着11例(68.75%)以及多组分模式10例(62.5%)。
  结论:
  1.AMN的发病率以女性居多,而ALM发病率男女相差不大;无论是AMN还是ALM,发病部位均以足跖为主。
  2.皮肤镜在诊断AMN和ALM上有较高的灵敏度与特异度,同时二者的皮肤镜诊断与组织病理学上的诊断均具有良好的一致性。
  3.AMN与ALM都有其特征性的皮肤镜诊断模式,可以作为二者及与其他肢端色素性疾病的诊断与鉴别诊断的辅助工具。
  4.本研究中AMN与ALM的皮肤镜征象总体上基本符合国外研究结果,但仍略有出入,还需要进一步大样本、多地域的研究。
[博士论文] 陈菲
影像医学与核医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:消融治疗是肿瘤综合治疗的重要组成部分,高强度聚焦超声(HIFU)消融热效应、空化效应及机械效应消融靶区,射频(RF)消融是临床应用最广的热消融技术之一。肿瘤消融后的影像学观察在疗效评估及随访观察过程中发挥重要作用。各种影像学方法中,超声检查具备实时性及价格低廉等优势,但常规超声仅能提供灰阶信息及血流参数,无法综合反应消融对肿瘤的影响。本研究拟以PET/CT及病理为对照,联合应用常规二维超声、彩色多普勒超声、声学造影及超声弹性成像等多种超声手段,筛选用于消融后疗效评估及随访观察的最佳超声指标,分析多模态超声(常规超声、声学造影以及超声剪切波弹性成像技术)在兔VX2皮下移植瘤HIFU及RF消融后疗效评估及随访观察中的应用价值。
  目的:
  以病理为对照,探讨应用多模态超声技术进行HIFU及RF消融兔VX2皮下移植瘤疗效评估及随访观察的可行性,并筛选用于肿瘤消融后疗效评估及随访观察的敏感超声指标。
  方法:
  建立兔VX2皮下移植瘤模型,行HIFU及RF消融,消融后不同时间点分别进行二维超声、彩色多普勒超声、声学造影及剪切波弹性成像(SWE)观察,观察消融区声学参数变化;与18F-FDG PET/CT及病理进行对照分析,筛选用于肿瘤消融后疗效评估及随访观察的超声指标。
  结果:
  HIFU及RF消融后消融区SWE测值呈现规律性,其测值先升后降,至消融后30天或14天,SWE测值达稳定,SWE测值高峰出现在消融后1天,Emean分别为(97.44±23.09)kpa、(176.31±9.70)kpa,二者差异有统计学意义(p<0.05),与消融前比较差异有统计学意义(p<0.05)。对照病理结果,SWE测值高峰与消融区纤维化高峰期不完全同步,应谨慎使用单一微观硬度指标解释宏观硬度。声学造影评估RF消融残留灶灵敏度为100%,特异度为76.92%,诊断符合率为80.00%。根据病理结果确定RF消融后残余肿瘤,根据PET/CT确定残留区位置,分析消融前、消融区与残留区SWE测值差异,消融区Emax大于消融前及残留区(p<0.05),说明Emax在鉴别肿瘤消融后残留中可能较其他SWE参数敏感。针对消融区Emax,进行ROC曲线分析,确定Emax诊断界值为17.50kpa,其尤登指数约为0.90。
  结论:
  二维超声是消融术中监控的首选超声指标,声学造影在消融后疗效评估方面存在优势,消融区SWE测值存在差异,SWE可用于HIFU及RF消融兔VX2皮下移植瘤的随访观察。Emax在消融后随访及残余灶鉴别中具有重要参考价值,并可能成为进一步复查的初筛指标。
[硕士论文] 林鑫
整形美容外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:毛发上皮瘤是一种比较罕见的皮肤良性肿瘤,临床上可分为单发性和多发性两种。常好发于面部,影响着患者的容貌。目前国内外对毛发上皮瘤(Trichoepithelioma,TE)多为发病机制研究和个案报道。而对毛发上皮瘤治疗的文献却很少,特别是对大面积毛发上皮瘤治疗的报道比较罕见。本文通过我院收治一例多发性毛发上皮瘤患者结合文献探讨毛发上皮瘤治疗方法,以提高外科医生对毛发上皮瘤治疗上的认识。
  方法:结合我院收治的1例额面部多发性毛发上皮瘤患者采用额面部皮肤软组织扩张术治疗并复习相关文献。
  结果:对该患者额面部毛发上皮瘤予以额面部皮肤软组织扩张术治疗,手术过程顺利,术后患者面部毛发上皮瘤大大减少,且切口无感染、出血、切口裂开等情况。出院后门诊随访1年,患者鼻唇沟、下颌、鼻翼缘切口可见线性瘢痕,无瘢痕增生。左侧面部移植皮瓣远端微微臃肿,未见复发。
  结论:国内外学者对毛发上皮瘤治疗多采用激光、射频消融、药物及手术治疗等,但是都有不同程度的残留,效果不佳。而我院收治这例患者采用额面部皮肤软组织扩张术治疗额面部多发性毛发上皮瘤,术后供区的皮肤、色泽、质地均与受区相似,而且未增加供区新的缺损及严重瘢痕。患者术后1年未见复发,手术效果确切。可见皮肤软组织扩张术对治疗多发性毛发上皮瘤不失为一种有效的方法。
[硕士论文] 何国慧
皮肤病与性病学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是最具侵袭性的皮肤肿瘤之一,其大约占全部肿瘤病例的1%,但却是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的,年增长率达3%-7%[1]。目前,关于黑色素瘤的治疗方法众多,其中主要以手术切除为主,其它治疗包括放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等,但这些方法多存在毒副作用大、耐药性高且对已转移的病灶治疗效果欠佳等不足。因此,寻求低毒、高效的药物和治疗手段成为研究热点。近年来,一些天然植物提取物因其分布广泛、取材方便、毒副作用小、价格低廉、药理作用广而在肿瘤的治疗方面展现了广阔的应用前景。白藜芦醇(Resveratrol,Res)作为一种天然多酚类植物提取物,被证实具有抗肿瘤、调节免疫、抑制血管生成等多种生物学功效。同时,许多学者通过细胞实验及动物实验证实白藜芦醇能对抗黑色素瘤、肝细胞癌、白血病、乳腺癌、卵巢肿瘤等肿瘤细胞增殖,并可以诱导肿瘤细胞的凋亡,但其具体的作用机制未被完全认识。PI3K/AKT/mTOR作为重要的信号通路之一,被证实在多种人类肿瘤如恶性黑色素瘤、胃癌、白血病等中存在异常激活,其异常激活导致通路中的某些组分的突变进而引起下游调控细胞周期、细胞增殖、凋亡、转化等过程相关蛋白的表达失调,最终引起肿瘤的发生及发展。目前,针对该通路的靶向治疗药物有限,且多局限于体外研究阶段,其有效性及毒副作用仍需进一步探索。雷军荣[2]等曾报道白藜芦醇可以通过PI3K/Akt/mTOR信号通路降低小鼠心肌细胞的缺血再灌注损失;Jiang H[3]等研究显示白藜芦醇能通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制胶质瘤的增殖;本课题组推测白藜芦醇的抗黑色素瘤作用可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关,作了关于白藜芦醇通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对人黑色素瘤A375细胞系(简称A375细胞)增殖的调控的研究,为该药物被应用于黑色素瘤的治疗提供依据。
  目的:
  研究白藜芦醇对A375细胞增殖的作用及对细胞周期的影响,以及可能存在的作用机制,是否存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的参与,及该通路相关蛋白及下游蛋白PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR、cyclinD1、P21的表达情况,从而为白藜芦醇应用于黑色素瘤的治疗提供理论和实验依据。
  方法:
  1.分别用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h,观察各组细胞形态的变化情况;采用CCK8法检测各组细胞的增殖抑制率。
  2.分别用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h后,应用流式PI染色法检测各组的细胞周期变化情况。
  3.应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR和下游周期蛋白cyclinD1、细胞周期调控因子P21的变化情况。
  结果:
  1.采用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h后,发现各组细胞形态表现为随着药物浓度的增加,细胞逐渐缩小变圆变亮,细胞间隙增宽。运用CCK8法检测细胞的增殖抑制率,发现细胞的增殖抑制率随着药物浓度的增加而增加(P<0.05),具有统计学差异。
  2.经不同浓度白藜芦醇处理后,处于G2/M期、S期的A375细胞随着药物浓度的升高而逐渐减少,而处于G0/G1期细胞的百分比增多。24h时A375细胞G2/M时相的比例,在空白对照组(0μmol/l)占23.18±2.14%,实验组(25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l和200μmol/l)分别占19.73±1.92%,15.47±2.01%,11.61±1.82%,5.63±0.89%。各实验组的不同时相与对照组相比,P均<0.05,差异有统计学意义。
  3.Western blot显示:24h时,A375细胞中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达随着药物浓度的增加呈现出逐渐降低的趋势(P<0.05),有统计学差异;Akt的表达未见明显趋势(P>0.05)。周期蛋白cyclinD1的表达随着药物浓度的增加,表现出逐渐降低的趋势(P<0.05),有统计学差异;周期蛋白调控因子P21的表达逐渐增多,高浓度白藜芦醇处理组的P21蛋白表达明显较低浓度组高(P<0.05)。
  结论:
  1.白藜芦醇通过药物浓度依赖性趋势抑制A375细胞增殖。
  2.白藜芦醇抑制A375细胞增殖的作用机制可能与其抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性密切相关。
  3.白藜芦醇抑制A375细胞增殖的作用机制与其调节PI3K/Akt/mTOR信号通路下游周期抑制因子P21和周期蛋白cyclinD1的表达存在相关性。
[硕士论文] 杨洪秋
皮肤病与性病学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)具有极强的侵袭性、恶性程度高、容易产生耐药,治愈率及预后极差,是目前肿瘤领域研究的热点及难点。其发病机制、治疗及治疗抵抗均与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信号通路息息相关。目前针对黑色素瘤的治疗方式仍以手术为主,但黑色素瘤早期即迅速转移,后期仍以放疗、化疗、免疫治疗等方式为主,以上治疗方式均存在副作用大、治疗抵抗、耐药率高、费用昂贵等缺点。因此,许多廉价、有效、副作用低且具有抗肿瘤效应的天然植物提取物逐渐走进了研究者们的视野。其中,白藜芦醇因具有对抗黑色素瘤、胃癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤的作用成为目前研究较为广泛的一类天然植物抗毒素。研究证实白藜芦醇可通过介导PI3K/AKT/mTOR信号通路而对抗胃癌、肝癌、软骨肉瘤等肿瘤。白藜芦醇是否亦通过介导PI3K/AKT/mTOR信号通路从而对抗黑色素瘤?目前尚无相关研究报道。
  目的:基于PI3K/AKT/mTOR信号通路途径探讨白藜芦醇诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的作用及分子机制,为其应用于临床治疗黑色素瘤提供实验依据。
  方法:本实验应用体外人黑色素瘤A375细胞培养技术,分别以浓度为0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L和200umol/L的白藜芦醇作用于人黑色素瘤A375细胞24小时后,采用CCK8法检测白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用,计算24小时的IC50值;光学显微镜观察白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞生长状态的影响;流式细胞术检测白藜芦醇对Annexin V/PI染色后细胞凋亡的影响;Western Blot检测白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PTEN、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax等的影响。
  结果:1.白藜芦醇(0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L和200umol/L)作用于人黑色素瘤A375细胞24小时后,CCK8结果显示白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞增殖有明显抑制作用,且呈剂量依赖关系,24小时IC50值为:81.41μmol/L。倒置相差显微镜观察细胞生长状态,可见随着白藜芦醇浓度的增加,人黑色素瘤A375细胞数量显著减少,悬浮细胞增加,折光性变差。应用Annexin V-FIT C/PI双标法流式细胞仪进行检测,随着白藜芦醇浓度的增加,细胞凋亡率从(3.38±3.92)%逐渐增加至(62.94±4.67)%,且呈剂量依赖性。2.Western Blot检测结果显示,随着白藜芦醇浓度的增加,促凋亡蛋白Bax表达升高、凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降,Bcl-2/Bax比值降低。随着白藜芦醇浓度的增加,PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白PTEN表达上调,p-AKT、p-mTOR表达下降,而AKT、mTOR蛋白表达无明显变化
  结论:1.白藜芦醇可明显抑制人黑色素瘤A375细胞增殖,诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性。2.白藜芦醇可能通过介导PI3K/AKT-/mTOR信号通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡。
[硕士论文] 张婷婷
微生物与生化药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:一直以来,二甲双胍(Metformin)是2型糖尿病临床预防治疗药物中公认的有效药物之一。早期研究发现,糖尿病患者恶性肿瘤的发病率会明显增加。在长期使用胰岛素或促胰岛分泌素的糖尿病患者中,这种现象尤其明显。而当糖尿病患者利用二甲双胍来控制血糖时,发现其多种肿瘤的患病率明显降低,且许多癌症患者的预后情况也得到明显改善。因此,越来越多的研究将二甲双胍的治疗与降低糖尿病患者罹患癌症的风险以及癌症患者预后改善联系起来。但二甲双胍对非糖尿病癌症患者的作用及其抑制癌症发生发展的具体分子机制尚不清楚。
  假性蛋白激酶Tribble3(TRIB3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一,在多种肿瘤细胞系和人肿瘤组织中高表达,能参与肿瘤的发生发展,发挥重要的调节作用。有文献报道,TRIB3作为关键蛋白连接胰岛素和胰岛素样生长因子促进肿瘤的发生发展,其具体机制是与P62发生相互作用以及抑制自噬和泛素蛋白酶体降解途径,而基因水平敲除TRIB3明显抑制癌症的发生发展。同时还有文献指出,TRIB3主要通过与其转录因子SMAD3相互作用促进肿瘤的发生;转录因子SMAD3位于TGF-β1信号通路下游,作为关键的调控蛋白分子参与了多种生理和病理过程。综上TRIB3能够与多种信号分子相互作用,从而促进肿瘤的发生发展,是抗肿瘤的潜在靶点。
  本文主要探宄的是二甲双胍在抑制黑色素瘤发生发展过程中的具体分子机制,找到了二甲双胍抗肿瘤的新靶点——TRIB3,发现了TRIB3新的乙酰化酶——赖氨酸乙酰基转移酶Tip60(KAT5)。旨在为TRIB3作为靶点的肿瘤临床治疗提供实验数据,为肿瘤药物的开发提供新策略,为二甲双胍应用于肿瘤临床治疗提供新思路。
  我们的实验结果表明二甲双胍能够抑制糖尿病小鼠(KK-Ay)和非糖尿病小鼠(C57BL/6)黑色素瘤的生长和转移,并且降低黑色素瘤中TRIB3的表达。过表达TRIB3可以反转二甲双胍激活自噬流,清除高表达的促肿瘤因子以及逆转其抑制肿瘤发生发展的作用。随后,我们进一步发现,二甲双胍能够抑制SMAD3的磷酸化和乙酰化,从而降低TRIB3的转录水平,并分别从细胞水平和动物水平进行了验证。但是,有趣的是二甲双胍抑制SMAD3乙酰化的方式,并非通过经典的P300途径;而是通过抑制SMAD3新的乙酰化酶KAT5与SMAD3的相互作用,抑制SMAD3的乙酰化。简而言之,TRIB3作为接头蛋白,能够募集KAT5到SMAD3并且以磷酸化依赖的方式介导SMAD3的K333乙酰化,从而维持了SMAD3的转录活性,进而增加TRIB3自身的转录水平。二甲双胍通过抑制SMAD3的磷酸化以及减弱SMAD3与KAT5的相互作用,进而减弱KAT5介导的SMAD3的K333乙酰化,降低SMAD3的转录活性以及TRIB3的转录水平,从而抑制黑色素瘤的发生发展。
  综上所述,我们可得以下结论,二甲双胍能够打断KAT5/TRIB3/SMAD3三者之间相互作用,抑制黑色素瘤中TRIB3累积的正反馈回路,从而抑制糖尿病和非糖尿病小鼠黑色素瘤的发生发展。
[硕士论文] 刘璐
皮肤病与性病学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨低氧环境、Nodal抑制剂(SB-431542)对黑色素瘤细胞增殖的影响;探讨低氧环境、SB-431542对黑色素瘤细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亚基(LDH-A、LDH-B)、Nodal(Nodal growth differentiation factor)及其受体ALK4(Activin receptor-like kinase4)、ALK7(Activin receptor-like kinase7)蛋白的表达及LDH同工酶谱的影响;探讨低氧环境、SB-431542是否通过影响LDH、Nodal及其受体的表达来影响黑色素瘤(Malignant melonoma,MM)的发生发展过程;以及探讨LDH、Nodal在黑色素瘤能量代谢方面是否具有相关性;从而为黑色素瘤在临床上的诊断及治疗提供新的思路。
  方法:在体外使用氯化钴诱导黑色素瘤细胞A375低氧,构建低氧模型,模拟其在人体内生存的微环境。用SB-431542干预细胞,通过MTT法检测低氧环境、SB-431542对A375细胞增殖活性的影响,探索细胞增殖的最适作用浓度及最佳作用时间。采用Western Blot的方法检测低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF-1α)蛋白表达水平,根据其表达水平的高低以明确低氧模型是否制造成功,并检测低氧环境及SB-431542对LDH-A、LDH-B、Nodal及其受体ALK4、ALK7蛋白表达的影响;采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测低氧环境、SB-431542对乳酸脱氢酶同工酶谱活性的影响。
  结果:1.MTT法检测CoCl2诱导形成的低氧环境对黑色素瘤A375细胞的增殖的影响:CoCl2在适宜浓度范围内(50-200uM)对细胞增殖无明显抑制作用(P>0.05),当超过一定的浓度范围(250uM)后随着其作用浓度和作用时间的的增加,表现出抑制作用。当CoCl2的浓度为150uM时,细胞增殖在48h达高峰。SB-431542对MM细胞增殖的影响:当SB-431542作用浓度逐渐增加,作用时间逐渐延长,细胞的增殖能力呈现下降的趋势。浓度小于10uM抑制作用较弱;浓度为10-20uM表现出一定的抑制作用;当浓度超过30uM后呈现出明显的抑制作用。CoCl2与SB-431542共同作用对细胞增殖的影响:当SB'-431542作用浓度为10uM恒定不变时,CoCl2的浓度在50-150uM范围内对细胞增殖无抑制作用(P>0.05),当CoCl2浓度超过200uM后表现出明显抑制作用。当SB-431542作用浓度为10uM,同时CoCl2作用浓度为150uM时,细胞的增殖在48h达最高峰。
  2.Western Blot技术检测结果显示:适宜浓度的CoCl2成功诱导A375细胞形成低氧模型后,HIF-1α呈现高表达,同时可见LDH-A、Nodal、_ALK4、ALK7蛋白的高表达,LDH-B蛋白低表达(P<0.05),SB-431542可上调LDH-B蛋白表达,下调LDH-A、Nodal、ALK4、ALK7蛋白的表达(P<0.05)。
  3.琼脂糖凝胶电泳结果显示:低氧环境可增加LDH同工酶谱中LDH5的活性,而SB-431542可降低LDH5的活性(P<0.05)。
  结论:1.适宜浓度的CoCl2在适宜时间可成功诱导黑色素瘤细胞低氧环境模型。低氧环境具有促进黑色素瘤细胞增殖及能量代谢的作用,其机制可能与HIF-1α、LDH-A、Nodal及其受体的高表达,LDH-B的低表达有关。
  2.SB-431542具有抑制黑色素瘤细胞增殖及能量代谢的作用,其机制可能与LDH-A、Nodal及其受体表达下调,LDH-B表达上调有关。因此,SB-431542有可能成为一种新型的抗黑色素瘤的药物。
[硕士论文] 薛超越
细胞生物学 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是一种近年来发展起来的治疗浅表性肿瘤的有效方法。PDT不仅能直接杀伤肿瘤,还可以诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。PDT作用于肿瘤组织,使部分肿瘤细胞发生凋亡并且释放损伤关联模式分子(Damage-associated molecular patterns,DAMPs),DAMPs可以被未成熟树突状细胞(Dendritic cell,DC)识别,使未成熟的DC活化为成熟的DC。成熟DC将特异性抗原呈递给T细胞从而引发对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤。因此,DC细胞在PDT引发的抗肿瘤免疫反应中处于非常关键的位置,而DC成熟是DC发挥功能的前提。然而影响DC成熟的因素及机制目前还不十分清楚,因此研究影响PDT诱导DC成熟的因素和机制对于增强PDT引发的抗肿瘤免疫反应具有重要意义。
  在探讨影响PDT诱导DC成熟的因素与机制方面,蛋白4.1R是本研究关注的重点。蛋白4.1R因首先发现于红细胞并且因处于红细胞膜蛋白凝胶电泳的第4.1个条带处而得名。作为大小为80KD的膜骨架蛋白,蛋白4.1R对于维持红细胞的结构、生理功能及机械稳定性具有重要作用。虽然蛋白4.1R在红细胞中的功能研究已经比较清晰,但是在有核细胞中蛋白4.1R的作用还不十分清楚。有研究证实,蛋白4.1R通过参与有丝分裂体的形成而影响恶性肿瘤的发生和发展。前期研究发现与蛋白4.1R结构极为相似的蛋白4.1N参与乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭;另外,本课题组发现蛋白4.1R通过与转运体GAT1和GAT2相互作用影响光敏剂5-ALA的跨膜转运进而影响PDT杀伤肿瘤的效果;同时本课题组还发现蛋白4.1R通过抑制T细胞活化连接子LAT磷酸化对T细胞受体介导的信号通路发挥负调控作用而影响机体的免疫应答。鉴于前期发现的蛋白4.1R直接参与了免疫细胞信号活化的环节,而PDT发挥杀伤肿瘤细胞的机制之一就是通过诱导DC成熟进而使机体产生抗肿瘤免疫反应,因此有理由猜测蛋白4.1R可能在PDT诱导DC成熟的过程中起着重要作用进而影响PDT的免疫效应。然而关于这方面的研究目前还未见报道。
  研究目的:
  本课题以野生型(4.1R+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R-/-)DC为研究对象,探讨蛋白4.1R对PDT诱导DC成熟及抗黑色素瘤免疫的影响。本课题可以为蛋白4.1R的功能及PDT杀伤肿瘤机制的研究提供更多的理论依据。
  研究方法:
  1.分别取野生型(4.1R+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R-/-)小鼠股骨和胫骨的骨髓,体外加入含细胞因子(GM-CSF和IL-4)的1640培养基培养,诱导为4.1R+/+DC和4.1R-/--DC;利用流式细胞术检测诱导所获得两种DC的纯度;PCR和Western blot技术检测蛋白4.1R在两种DC中的表达。
  2.利用荧光分光光度计测量不同5-ALA孵育浓度和孵育时间条件下B16细胞内PpⅨ的积累量,确定5-ALA最佳孵育浓度和最佳孵育时间;利用FITCAnnexinⅤ凋亡试剂盒检测不同光剂量照射下B16细胞的凋亡情况,流式细胞术检测B16细胞表面的钙网蛋白的表达,ELISA法检测上清中HMGB1的分泌,确定能促使B16细胞凋亡的最佳光剂量。
  3.利用PDT处理过的B16细胞刺激未成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC,诱导为成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC;流式检测成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC表面CD80和CD86的表达情况;荧光定量PCR检测成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC中IL-12p35、IFN-γ的基因表达情况;电子显微镜下观察PDT诱导成熟的两种DC形态的差异。
  4.利用荧光定量PCR和流式、Western blot技术检测PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC膜表面相关受体的表达情况。
  5.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC分别活化CD8+T细胞,流式检测CD8+T细胞表面CD69的表达;CCK8法检测两种DC活化的CD8+T细胞增殖能力;LDH法检测两种DC活化的CD8+T细胞对B16黑色素瘤的杀伤效应。
  6.将B16-F10尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内建立肺转移模型。分别利用PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC免疫模型小鼠。ELISA技术检测模型小鼠血清中IFN-γ和IL-12的分泌情况;统计并比较两组小鼠形成的肺转移灶;统计不同处理组小鼠的生存期制作生存曲线。
  研究结果:
  1.体外诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC纯度均达到80%左右,可以用于后续实验;PCR和Western blot检测结果表明蛋白4.1R在4.1R+/+DC中表达,在4.1R-/-DC中不表达。
  2.B16细胞孵育4mM5-ALA5小时,0.25J/cm2剂量照射下,B16细胞凋亡率最高(28.45±3.04)%,且随着凋亡水平的提高,细胞表达钙网蛋白(calreticulin)的水平升高,最高达(80.73±6.09)%,上清中分泌HMGB1的量越多,最高达(7909.16±537.84)pg/mL。
  3.B16细胞经过PDT处理后,分别与4.1R+/+DC和4.1R-/-DC以50∶1的比例共培养24小时,流式结果显示DC细胞表面CD80在4.1R+/+DC表达比例(73.70±8.13)%明显高于4.1R-/-DC(47.33±14.50)%,P<0.01;流式结果显示DC细胞表面CD86在4.1R+/+DC表达比例(66.00±10.64)%明显高于4.1R-/-DC(42.57±5.60)%,P<0.01。qRT-PCR结果表明IL-12p35在4.1R+/+DC中相对表达量(15.99±3.81)明显高于4.1R-/-DC(9.19±0.83),P<0.01;IFN-γ在4.1R+/+DC中相对表达量(8.66±0.61)高于4.1R-/-DC(5.33±0.95),P<0.01;透射电镜结果表明PDT诱导成熟的4.1R+/+DC比4.1R-/-DC形成的树突更丰富。上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调PDT对DC成熟的诱导。
  4.PDT诱导4.1R+/+DC和4.1R-/-DC成熟过程中的第8小时,荧光定量PCR测得TLR4在4.1R+/+DC中基因表达量(3.92±0.68)显著高于4.1R-/-DC(2.97±0.34),P<0.05;流式结果显示TLR4在4.1R+/+DC膜上表达量(82.33±4.58)%显著高于在4.1R-/-DC表达量(45.50±18.92)%,P<0.01;Western blot结果显示TLR4在4.1R+/+DC内的总表达量(1.88±0.28)显著高于在4.1R-/-DC表达量(0.61±0.14),P<0.01。上述实验结果表明在PDT诱导DC成熟过程中,蛋白4.1R下调TLR4在DC中的表达。
  研究结论:
  1.蛋白4.1R参与PDT对DC成熟的诱导;蛋白4.1R缺失会导致PDT诱导DC成熟的能力下降,进而下调DC介导的CD8+T细胞的活化和增殖;
  2.蛋白4.1R缺失下调PDT诱导成熟的DC介导的抗黑色素瘤效果。
[硕士论文] 李姗姗
特种医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  皮肤鳞癌(CSCC)是起源于角质形成细胞、仅次于基底细胞癌的第二常见的皮肤恶性肿瘤。引起发病的原因有:紫外线照射、电离辐射、化学致癌物以及慢性刺激等,其中主要原因是日光紫外线的照射。据报道,在世界范围内,皮肤鳞癌的发病率在逐年递增。CSCC的发病率在我国并不高,但是患病后,极大的影响患者的生存质量。长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸、不能编码产生蛋白质、没有明显开放阅读框的、具有基因表达调节功能的一类RNA分子。许多研究表明,在肿瘤细胞中,LncRNA通过调节其增殖、迁移等生物学功能从而影响肿瘤的发生发展。人类肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1),又称为核富集常染色体转录产物2(NEAT2),长度约为8000nt,定位于染色体11q13.1,是2003年首次报道的一种LncRNA。据文献报道,MALAT1基因与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关。但是在皮肤鳞癌中,关于MALAT1的功能和分子机制方面的报道很少。本文主要研究长链非编码RNA MALAT1在皮肤鳞癌中的表达情况及其在皮肤鳞癌的发展过程中所起的作用,以及与EMT的关系。从而为皮肤鳞癌的临床治疗提供基础理论依据。
  方法:
  ①采用qRT-PCR的方法来检测正常皮肤组织和皮肤鳞癌组织中MALAT1的表达情况。
  ②采用原位杂交方法检测正常皮肤组织和皮肤鳞癌临床组织样本中MALAT1的表达情况。
  ③在人皮肤鳞状细胞癌细胞株(A431)中,在使用小干扰RNA对MALAT1进行敲减后,采用Transwell实验,细胞划痕实验,CCK增殖实验检测A431的迁移侵袭能力,运动能力和增殖能力的变化。
  ④采用qRT-PCR和western blot方法检测A431中MALAT1与上皮-间质转化(EMT)样转化相关因子(E-cadherin,Vimentin,β-catenin)的变化
  结果:
  ①与正常组织相比,皮肤鳞癌组织中MALAT1的表达显著升高(P<0.05)。
  ②正常组织中,MALAT1仅表达于表皮细胞中,而在不同分化的皮肤鳞癌组织中,则几乎遍布整个组织;相比正常组织,皮肤鳞癌组织的不同分化水平上(高分化,中分化,低分化),MALAT1的表达率均升高(P<0.001)。
  ③在皮肤鳞癌细胞A431中,转染MALAT1siRNAs下调其表达后,与对照相比,其增殖能力(P<0.001),迁移能力(P<0.01),侵袭能力(P<0.01),划痕运动能力(P<0.01)均下降。
  ④在A431中,采用siRNAs对MALAT1进行敲减后,与对照组相比,EMT相关因子中上皮表型标志物Ecadherin,β-catenin的表达升高(P<0.01),间质表型分子vimentin表达降低(P<0.01)。
  结论:
  ①MALAT1在皮肤鳞癌组织中是高表达的。
  ②在A431中,MALAT1能促进细胞的增殖、迁移、侵袭与运动能力。
  ③MALAT1可能通过EMT从而促进肿瘤细胞的迁移与侵袭。
[硕士论文] 刘梅
临床医学 河北工程大学 2018(学位年度)
摘要:背景及目的:
  鲍恩病是一种表皮内鳞状细胞癌,又称为原位鳞状细胞癌。病变可长期局限于表皮内,但皮损一旦进一步发展可能会突破基底膜,呈侵袭性生长,进展为鳞状细胞癌,且转移率可高达37%。因此,早诊断、早治疗非常重要。
  本研究拟从鲍恩病的临床特点、性质、病理特征等方面入手,对鲍恩病的患病情况进行统计分析,并分析其临床诊治情况,进一步了解鲍恩病的发病特点、组织病理学等特征,以便提高临床医师对鲍恩病的认知及早期诊治水平,降低误诊率,为如何结合病人的不同情况合理选择治疗手段提供一定的临床参考依据。
  方法:
  收集2007年-2016年间就诊于本院皮肤科并经组织病理学检查确诊为鲍恩病的患者的临床及病理资料,采用系统性回顾的方法对资料保存完整的60例鲍恩病患者,从患者的发病年龄、皮损发生部位、皮损颜色及表面情况、误诊情况等方面进行统计学分析。
  结果:
  60例Bowen病患者,发病年龄范围在28~86岁,平均为56.85岁;病程长短不一,最长者可达40年;以单发皮损最为常见,占比高达81.7%,其中43例发生于非暴露部位,5例发生于暴露部位;皮损呈红色者占33.33%、呈褐色至黑色者占63.33%,且皮损多表现为丘疹或斑片,在此基础上有2例其表面表现为疣状损害,10例伴有鳞屑、结痂,7例有破损伴渗出。因其临床表现多样,易与脂溢性角化病和鳞状细胞癌等疾病相混淆,误诊率达30%。
  结论:
  本次研究发现Bowen病发病仍以50岁以上中老年人为主,但40岁以下年轻患者人数占本次研究的20%,本病发病呈现出一定的年轻化趋势。皮损发生于非暴露部位与暴露部位的比值为7.57:1,与本病好发于头面部等曝光部位的特点有所不同,可能与研究样本量的代表性存在局限性有一定关系。30%患者初诊时的临床诊断与组织病理诊断不相符,误诊率较高,可能与皮损表现缺乏特异性、医师对Bowen病警惕性不足等因素有密切关联。本病的治疗目前选用最多的仍是手术切除,光动力疗法正逐步在临床开展,患者的治疗方式需结合多种因素综合考虑。
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