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[硕士论文] 许智闻
神经外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  根据临床中手术实际应用需要,通过对经旁路椎板劈开复位术进行相关的解剖学研究,模拟手术入路,并在标本上进行相关手术操作,明确此径路实际可操作性;获取腰椎标本,观察此径路下进行椎板撑开时的椎体结构形变情况,探讨入路的安全性;获取单个椎体单元,测量此径路下手术相关的解剖数据及视野角度,确定经旁路椎板劈开入路行腰椎手术的自由度,并从解剖学角度评估其有效性,为临床实际运用提供指导;回顾性分析临床病例,探讨该入路的优势以及临床可推广性。
  方法:
  第一部分:1.选用6例经10%福尔马林固定的成人全身尸体标本,首先在标本上进行模拟手术入路实验,经相关操作后暴露第一、第二腰椎节段一侧棘突根部及椎板,以铣刀沿一侧棘突根部纵行铣开一条骨缝并延伸至第二腰椎。以专用的椎板撑开器将骨缝分别逐步扩大至0.6cm、0.8cm、1.0cm,记录不同撑开距离下可供观察和操作的解剖结构。在扩大至1.0cm时,对硬脊膜行牵拉、切开等操作,暴露脊髓神经,缝合硬脊膜。术后逐层关闭术腔,记录操作流程。2.截取腰椎椎体节段行离体实验。观察撑开过程中椎体结构形变及周围组织损伤情况;3.将腰椎节段截取成5个椎体单元进行单独实验,以橡皮泥等模拟皮肤、脂肪、椎旁肌肉等组织,设置撑开距离依次为:0.8cm(A组),1.0cm(B组),1.2cm(C组)。观察撑开过程中,椎体、椎板、椎弓等结构有无断裂,若有断裂则记录断裂位点及断裂时的撑开距离(d)。4.以克氏针模拟视线,自左右两侧在椎管底壁进行定位,记录克氏针交汇点,以及椎管底壁的视线定位点。测量相关解剖学数据,通过公式得出不同撑开距离下,克氏针的交叉角度即视线角度,对数据进行统计学分析。
  第二部分:回顾性分析江苏省苏北人民医院神经外科应用经旁路椎板劈开入路行腰椎椎管内肿瘤切除术的10例临床资料,记录手术用时、术中出血量、术后卧床时间及并发症等情况。结合解剖研究基础及文献回顾,探讨该入路的优势以及临床可推广性。
  结果:
  第一部分:1.选用经10%福尔马林固定的成人全身尸体标本进行模拟手术入路实验。撑开至10.0mm及以上时,可清晰地观察到硬脊膜及椎管内结构,并能顺利进行硬脊膜牵拉、切开、缝合,以及脊髓神经的剥离等操作。2.多腰椎节段离体环境下撑开过程中,椎体撑开侧及对侧上下关节囊均未见明显破损,上下关节突未见明显移位,双侧椎间孔内脊神经根未见骨性卡压。3.单腰椎节段撑开过程中,观察到形变主要发生在劈开对侧椎弓根,统计断裂距离(d)大小为(11.34±0.49)mm。4.以两根克氏针模拟视线,自A组到C组,椎管底壁视线观察范围依次为(10.64±0.89)mm、(13.44±0.36)mm、(17.76±0.76)mm;根据公式得出克氏针的交叉角度依次为(26.11±2.10)°、(33.02±1.10)°、(44.27±1.99)°。
  第二部分:回顾性分析江苏省苏北人民医院神经外科共10例腰椎椎管肿瘤病例,术后病理提示神经鞘瘤,均采用经旁路椎板劈开入路行腰椎椎管内肿瘤切除术,手术平均用时239.5min(150~335min),术中平均出血116ml(50~200)ml,治疗改善率达58%,术后均无术区出血、感染、顽固性疼痛等并发症,患者术前症状均有不同程度改善。
  结论:
  第一部分:通过对腰椎标本行相关解剖学研究我们发现,经旁路椎板劈开复位技术进路简便直接,操作空间良好,对椎体及周围组织创伤小,术后椎体可自然复位是其独特的优势。熟练掌握操作技巧、充分认识相关解剖、明确安全范围是保证手术安全的重要前提。
  第二部分:经旁路椎板劈开复位技术作为治疗腰椎椎管内病变的一种创新入路,具有组织创伤小、自然复位、术后康复快、并发症少等优势。适合临床推广。
[博士论文] 顾昊
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本课题拟在课题组前期研究的基础上,选择人胶质母细胞瘤U87和U251细胞株,通过体外研究探索COE对胶质母细胞瘤的抑制增殖、诱导凋亡的分子作用机制;以及COE对胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭的抑制作用和相关分子机制;模拟肿瘤微环境体外建立胶质母细胞与M2样巨噬细胞共培养模型,研究COE通过CSF-1/IL-34/CSF-1R信号通路对肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages TAMs)的作用,并通过TAMs而间接抑制了胶质母细胞瘤的增殖、诱导凋亡。通过本课题研究,将初次探索COE对胶质母细胞瘤的抗肿瘤作用机制,以及COE对肿瘤微环境中的TAMs的影响,为靶向肿瘤微环境,开发新型多靶点抗胶质瘤中医药提供新的治疗策略及理论依据。
  本课题将按照下列三个部分进行研究:
  第一部分:南蛇藤茎提取物对人胶质母细胞瘤U87和U251细胞迁移、侵袭性的影响和分子机制研究目的:研究南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extract,COE)对人胶质母细胞瘤U87和U251细胞的迁移侵袭的影响。
  方法:体外采用MTT法检测COE对细胞活力的影响;黏附实验方法检测细胞与细胞基质Ⅰ型胶原的黏附能力;Transwell小室法以及划痕实验检测COE对U87和U251细胞迁移和侵袭能力的影响;Western Blot法检测COE对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白表达的影响;明胶酶谱法检测COE对基质金属蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinases-2,9MMP-2,9)表达的影响;以及采用激光共聚焦显微镜来观察TRITC标记的COE对肌动蛋白装配的影响。研究结果均与阴性对照组比较。
  结果:1、COE具有抑制胶质母细胞瘤细胞活力的作用,且呈浓度、时间依赖;2、COE能明显抑制人U87和U251细胞的黏附、迁移和侵袭能力,呈剂量依赖;3、COE能降低U87和U251细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达,并抑制其对基底膜的水解;4、COE能下调EMT的标志蛋白N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平,同时能够上调E-钙黏蛋白的表达,COE能抑制胶质母细胞瘤EMT进程的作用,且存在明显的剂量相关依赖性;5、COE能显著抑制胶质母细胞瘤的肌动蛋白装配。
  结论:COE通过显著抑制人胶质母细胞瘤U87和U251的EMT进程,以及抑制基质水解酶MMPs的活力,影响胶质母细胞瘤肌动蛋白的装配,从而抑制GBM黏附、迁移和侵袭。
  第二部分:南蛇藤茎提取物影响人胶质母细胞瘤细胞株U251的增殖和凋亡及其机制的研究
  目的:通过对南蛇藤茎乙酸乙酯提取物COE抗人胶质母细胞瘤U251细胞株的增殖和凋亡作用的研究,初步探讨COE抗胶质瘤的分子作用机制,为寻找新型多靶点治疗胶质母细胞瘤的药物提供理论依据。
  方法:课题选择人胶质母细胞瘤细胞株U251为研究对象,分设空白对照组和COE药物干预组,应用噻唑蓝染色法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide,MTT)观察COE对细胞活力的抑制作用;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine BrdU)标记检测COE对U251细胞增殖的影响;采用Annexin Ⅴ/PI双标法观察COE对U251细胞凋亡的影响;在透射电镜下观察经过COE干预作用后U251细胞的超微结构变化;Western blot法检测COE对凋亡标志基因Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达的影响。
  结果:1、COE具有抑制U251细胞活力的作用,且呈浓度依赖性,U251细胞IC50浓度为107.1μg/mL。2、与空白对照组比较,当COE的质量浓度分别为40、80、160μg/mL时,可见COE组的细胞增殖明显受抑,随着COE浓度的递增对增殖的抑制作用亦递增,呈浓度依赖性;3、与空白对照组比较,质量浓度40、80、160μg/mL COE组早期凋亡率6.8%、20.1%、38.4%。而晚期凋亡率分别为5.4%、24.3%、43.6%,呈浓度依赖性。4、透射电镜下观察,COE干预组较对照组,细胞体积固缩,细胞核内染色质溶解,线粒体肿胀,空泡增多,部分细胞出现凋亡小体;5、随着COE的药物浓度增加,其Caspase-3表达量增加,结果与对照组比较,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。
  结论:COE有效抑制了胶质母细胞瘤U251细胞株的增殖,能促进肿瘤细胞凋亡,并呈浓度依赖性。其作用机制与通过调节Bcl-2、Bax和Caspase-3表达,激活线粒体的凋亡通路有关。COE具有抑制胶质母细胞瘤的增殖和诱导凋亡作用,故对控制肿瘤细胞生长,改善胶质母细胞瘤患者的预后具有及其重要的意义。
  第三部分:南蛇藤茎提取物通过CSF-1/IL-34/CSF-1R通路作用肿瘤相关巨噬细胞进而影响胶质母细胞瘤增殖及凋亡的机制研究
  目的:揭示CSF-1/IL-34/CSF-1R信号通路在人胶质母细胞组织中的表达,探索其作用机制及其临床意义;在体外共培养模型观察结果的基础上,研究COE能否作用于CSF-1/IL-34/CSF-1R通路靶向TAMs,进而影响U251细胞增殖和凋亡;并通过BALB/c裸鼠建立皮下异种移植瘤模型,探索COE是否作用于TAMs进而影响肿瘤相关巨噬细胞,从而干预COE的病理进程。
  方法:采用免疫组化及PR-PCR的方法检测45例临床手术切除后并经过病理证实的胶质母细胞瘤标本以及8例对照组标本,观察CSF-1R、IL-34、CSF-1在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况;通过PMA以及IL-4诱导THP-1细胞向具有TAMs极化分型特点的M2样巨噬细胞分化,并观察其细胞形态、细胞表面标记以证实;采用免疫荧光染色检测CSF-1R、IL-34、CSF-1在U251及M2样巨噬细胞表达和分布情况;以分别为20,40,80,160μg/mL不同质量浓度的COE作用于共培养体系中M2细胞作用24h后,采用实时荧光定量PCR技术检测CSF-1R、IL-34、CSF-1mRNA表达情况,找出COE对集落因子通路作用的可能靶点;应用CRISPR/CAS9双载体的慢病毒技术构建IL-34敲除THP-1的细胞株。PMA及IL-4诱导IL-34敲除THP-1细胞,分化为IL-34敲除M2巨噬细胞;予以COE80μg/mL及替莫唑胺40μM分别作用于不同分组的U251细胞24小时后,以流式细胞仪(FITC-PI双染及BrdU掺入法)检测U251细胞增殖和AnnexinⅤ凋亡的变化;按照2∶1的比例,分U251+野生M2、U251+IL-34 KO M2异种移植至裸鼠皮下建立模型鼠,成瘤后随机选取各组半数模型鼠予COE灌胃治疗3周,对照组给PBS灌胃,体内观察COE对胶质母细胞瘤的抑制作用。
  结果:临床组织标本免疫组织化学及RT-PCR结果显示CSF-1R、IL-34、CSF-1在瘤组织的表达远高于对照组非瘤组织,提示肿瘤相关巨噬细胞中CSF-1/IL-34/CSF-1R通路表达,肿瘤组织募集巨噬细胞。PMA及IL-4诱导后的THP-1细胞由悬浮细胞状态转变为贴壁细胞,细胞表面标记CD 68及CD163均呈阳性,提示THP-1转化为M2样巨噬细胞。
  将THP-1与胶质母细胞瘤U251经Transwell小室间接共培养后,免疫荧光染色结果显示出在该共培养体系中,CSF-1/IL-34/CSF-1R通路相关蛋白仅在M2样巨噬细胞表面表达,不同浓度的COE作用后,经RT-PCR检测显示COE抑制U251后,CSF-1/IL-34/CSF-1R通路活化,CSF-1R与CSF-1mRNA同步表达,而IL-34mRNA表达量与COE呈浓度依赖性,反映出IL-34是一种CSF-1R非依赖性配体。经COE干预共培养体系结果显示U251增殖细胞比例32%明显高于单U251组21%,说明M2巨噬细胞对肿瘤细胞具有保护作用。而U251+IL-34 KO共培养+COE组增殖细胞比例为19.4%,以及U251+IL-34KO共培养+TMZ增殖细胞比例为17.2%,两者间比较统计学意义不明显,说明COE不是通过IL-34影响胶质母细胞瘤的增殖。U251+COE组的凋亡比例22.85%与共培养U251 +COE组凋亡比例15.29%两者间存在显著性差异,说明COE能够通过TAMs间接影响U251细胞的凋亡;U251+IL34 KO M2共培养+COE组凋亡比例12.96%与U251 +M2+COE组凋亡比值15.9%存在统计学差异,以及U251 +IL-34 KO M2共培养+TMZ组凋亡比值8.26%,亦存在统计学差异,说明COE是通过该通路中的IL-34干预TAMs进而发挥靶向抗肿瘤作用。
  结论:COE通过影响CSF-1/IL-34/CSF-1R通路间接抑制和促进U251细胞凋亡,其作用靶点为IL-34。体内外实验结果均提示COE通过作用于肿瘤微环境中TAMs,而表现抗胶质母细胞瘤生长的药理作用。
[硕士论文] 王世鹏
软件工程 哈尔滨工程大学 2018(学位年度)
摘要:现今,通过计算机科学与技术,对其他领域进行数据分析已经变得广泛起来,尤其是在生物和医学领域上,存在着大量的亟需分析的数据,它们通过传统医学方法无法统一而有效的进行剖析,或是通过传统的计算机技术无法高效的发掘数据背后的专业信息,而许多对临床医学具有指导意义的生物信息隐藏在它们之下。同时,数据的规模发展之快亟需新的更加高效的处理方法来解决现今的实际问题,胶质母细胞瘤(GBM)是一种棘手的癌症,对于胶质母细胞瘤相关生物信息,本文力争使用模式识别相关技术进行分析,来探求基因背后的知识,设计并实现一种新的发现算法来找到可以对胶质母细胞瘤样本分类起到决定性作用的特征从而发现胶质母细胞瘤亚型。
  本文针对胶质母细胞瘤数据进行多方面的数据处理,包括首先对胶质母细胞瘤数据进行规范化使之便于数据分析,其次利用胶质母细胞瘤数据特征的密度信息来使样本分类更加友好而清晰的可视化,同时提出一种基于规范化线性判别分析算法和最大相关性最小冗余度算法的数据降维算法RELRED,通过RELRED算法对数据进行降维和冗余处理从而解决胶质母细胞瘤数据的高维特征问题,使胶质母细胞瘤亚型更容易的被发现。最终,为了清晰的发现胶质母细胞瘤亚型,即对胶质母细胞瘤样本分类具有指导意义的相关特征,本文提出了基于特征识别的监督学习下非负矩阵分解算法SJNMF,SJNMF算法通过将联合矩阵进行统一分解,同时在算法的迭代过程中将分解结果紧密的与数据的标签分类信息关联,最终不仅仅进一步降低数据维度,而且完成对重要的数据特征提取从而发现胶质母细胞瘤亚型。
  项目采用了TCGA癌症数据库中的相关数据集,按照胶质母细胞瘤数据处理流程,RELRED和SJNMF两部分算法对TCGA数据进行了数据分析,同时与其他常用算法进行了比照,结果表明了RELRED和SJNMF算法在计算速度与计算准确度上的所具有的优势。
[博士论文] 邓圣泽
外科学(神经外科) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,因其难根治和易复发的特性,一直以来都是神经外科医生的巨大挑战。“最大安全范围切除”的手术理念使胶质瘤患者的生存时间得到一定程度的改善,但复发仍难以避免。因为,胶质瘤作为高度浸润性生长的肿瘤,它与正常脑组织之间没有明确边界,其浸润性生长的范围远远超越了手术显微镜下所见到的胶质瘤假边界、影像学上的边界甚至病理切片上的边界,从而导致胶质瘤实际上无法达到真正意义上的全切除。这也是胶质瘤复发的根源,已经浸润到影像学边界以外的肿瘤细胞,而不是已经手术切除的肿瘤实质细胞,才是经历同步放化疗及辅助化疗之后依然不被消灭,伺机复发的关键所在。因此我们认为,胶质瘤这两种不同区域的细胞具有差异,而这种差异值得我们深入研究,正是这种差异性左右着肿瘤的生物学行为,最终影响患者的预后。
  课题组前期已经分离并培养出高级别胶质瘤两种不同区域的肿瘤细胞,从肿瘤中心实质部分(核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)T1增强相)取材、分离并培养出的肿瘤细胞命名为C细胞(C细胞提示肿瘤细胞位于中心Central、增强区域Contrast,是普遍存在的Common),而从瘤周水肿带甚至更外围区域(MRIT2/FLAIR相异常信号区及以远)取材、分离并培养出的肿瘤细胞命名为Q细胞(Q细胞提示这部分肿瘤细胞往往在治疗过程中长期处于静息状态Quiescent,是值得深入研究,充满未知挑战的问题细胞Question cell)。一共分离培养了30余对Q细胞和C细胞,细胞组化显示两种细胞GFAP染色阳性,裸鼠颅内原位成瘤实验两种细胞均可成瘤,以上鉴定实验证实Q细胞确实是肿瘤细胞。同时,对Q细胞、C细胞进行了细胞功能研究,发现:Q细胞的增殖慢于C细胞,凋亡少于C细胞,迁移、侵袭的能力弱于C细胞。
  两种不同区域的肿瘤细胞,在诸多生物特性上显示出了差异,本研究关注于它们在代谢、能量通路上的差异及意义,并探讨其可能的调控机制。
  细胞色素c氧化酶亚基7A2(Cytochrome c oxidase subunit7A2,COX7A2)是课题组前期通过随机选取6对Q细胞和C细胞,基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术的蛋白质组学研究发现的线粒体呼吸链相关蛋白,在Q细胞中表达显著上调。本研究提示COX7A2是线粒体呼吸链活性的关键调节因子,是造成Q细胞和C细胞在代谢、能量通路上差异的关键因子,可作为胶质瘤患者评判预后的独立预测因子。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞的代谢组学分析
  目的:本章节将分析Q细胞与C细胞在代谢产物上的差异性。
  方法:随机选取6对Q细胞与C细胞,经液相串联质谱实验得到LC-MS/MS的原始质谱数据。按照XCMS Online平台的工作流程,将原始质谱数据转换格式后上传,选取Pairwise Job模式,设置工作参数HPLC/Q-TOF,提交后软件自动运行分析数据,运行完毕后即可读取结果。当差异倍数达到1.5倍及以上,且经统计检验其P值小于或等于0.05时,视为差异代谢产物特征。结合METLINmetabolite database的资料搜索、鉴定差异的代谢产物。
  结果:XCMS Online使用非线性方法补偿样本之间保留时间的漂移,重叠显示保留时间校正之前的总离子流色谱图(TIC)、保留时间校正之后的TIC和保留时间校正曲线,使代谢产物数据得到严格的质量控制。Cloud Plot显示Q细胞与C细胞相比,有3249个差异的代谢产物特征,下调的特征数量显著多于上调的特征。PCA及MDS显示C细胞代谢产物分离度大,Q细胞代谢产物分离度小。MAS鉴定Q细胞与C细胞差异代谢产物:在Q细胞中表达下调的代谢产物前五名分别为:硫酸茚地那韦、苦木内酯M、苦木内酯N、翼伞甙Z、Secoeremopetasitolide B;在Q细胞中表达上调的代谢产物前五名分别为:N-(十六酰基)-鞘氨醇、(24R)-1α,24-二羟基-22-氧代硬脂醇缩酚醇、1α,25-二羟基-22-氧代胆钙化甾醇、硫代环丙沙星、Momordicilin。
  结论:Q细胞与C细胞在代谢产物上存在显著不同。C细胞的代谢产物多样化,证明肿瘤中心的细胞具显著异质性,且代谢水平较高;Q细胞位于瘤周边缘地带,其异质性较低,代谢水平也较低。
  第二部分 高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞线粒体代谢相关差异蛋白分析
  目的:本章节重点研究高级别胶质瘤不同区域肿瘤细胞——Q细胞与C细胞的差异,对线粒体代谢相关差异蛋白进行分析,鉴定线粒体呼吸链活性关键调节蛋白COX7A2是否是造成Q细胞与C细胞差异的关键因子。
  方法:利用生物信息学的分析手段,结合cBioportal、Uniprot、BioGrid在线软件和FunRich软件,对与COX7A2在mRNA水平共表达的基因、与COX7A2在蛋白水平相互作用的蛋白进行了GO分析(GeneOntology analysis)。回顾课题组前期通过液相串联质谱实验得到的6对Q细胞和C细胞的原始质谱数据,完整、系统地进行Q细胞、C细胞差异蛋白的分析,应用GO及Pathway分析,研究Q细胞与C细胞在哪些分子功能、生物过程上具有差异。
  结果:针对COX7A2的生物信息学分析表明其在胶质瘤细胞中发挥功能的场所主要集中于线粒体,主要参与代谢及能量通路,执行的最主要分子功能为:氧化还原酶活性。GO分析表明Q细胞和C细胞差异表达蛋白在催化活性、连接酶活性、氧化还原酶活性这三个分子功能上所占的比例最高;在代谢和能量通路的生物过程上具有广泛而显著的差异;细胞组成上,两者之间线粒体的差异排名第一。Pathway分析再次证明,Q细胞与C细胞在代谢上具有显著的差异性,有众多差异蛋白参与到了代谢通路的调节上。Q细胞与C细胞蛋白差异分析发现,6组差异蛋白聚类未能发现上调或下调的差异蛋白,5组差异蛋白聚类发现2个上调蛋白,1个下调蛋白。4组差异蛋白聚类发现17个上调蛋白,30个下调蛋白。
  结论:Q细胞与C细胞在代谢和能量通路上存在显著的差异,线粒体是具主导地位的细胞器,其中线粒体呼吸链活性关键调节蛋白COX7A2是5组、4组差异蛋白聚类共同发现的上调蛋白,是造成Q细胞与C细胞在代谢和能量通路上显著差异的关键因子,具有深入研究的意义。另外两个线粒体代谢相关差异蛋白:上调的NDUFS8、下调的PKM2也具有重要的功能。
  第三部分 线粒体呼吸链关键调节蛋白COX7A2对胶质瘤患者预后的影响及机制研究
  目的:本章节研究第二章筛选出的线粒体呼吸链关键调节蛋白COX7A2在胶质瘤不同级别、不同区域的表达情况,并分析COX7A2对胶质瘤患者预后的影响,探讨COX7A2作为预测胶质瘤患者预后指标的价值,以及研究造成COX7A2对预后产生影响的机制。
  方法:免疫组化检测COX7A2在126例胶质瘤临床样本的表达,其中83例同时包含MRI T1增强相(C细胞区域)和MRI T2/FLAIR相以外(Q细胞区域)的取材样本。126例患者术后随访资料完整,随访时间4-51个月(平均18.42±10.34个月)。结合患者的临床病理资料,进行Kaplan-Meier生存分析、单因素及多因素COX回归分析。R2在线软件分析TCGA、French、Kawaguchi等胶质瘤数据库资料。Western Blot、qPCR检测COX7A2在胶质瘤细胞系中的表达。CCK-8检测瞬时转染COX7A2 siRNA后胶质瘤细胞系细胞的增殖变化。同时,对另外两个线粒体代谢相关差异蛋白NDUFS8、PKM2,也利用R2在线软件进行Kaplan-Meier生存分析。
  结果:126例胶质瘤临床样本中86例(68.3%) COX7A2高表达,40例(31.7%)低表达。83例胶质瘤患者的Q细胞取材区标本中,68例(81.9%) COX7A2高表达,15例(18.1%)低表达。Q细胞区COX7A2高表达率高于C细胞区(P=0.028)。COX7A2的表达与胶质瘤WHO分级关联密切(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示COX7A2高表达的患者总生存时间更长,预后更好。R2在线软件分析TCGA、French、Kawaguchi等胶质瘤数据库资料均证实上述结果。单因素及多因素COX回归分析表明COX7A2高表达是胶质瘤患者预后的独立预测因子。胶质瘤细胞系中U87MG的COX7A2表达最低,其细胞的增殖率最高。瞬转COX7A2 siRNA后各胶质瘤细胞系细胞增殖率均下降。TMZ刺激1周,U87MG细胞NC siRNA组的增殖速率下降幅度显著大于COX7A2 siRNA组。另外,NDUFS8高表达的患者预后好,PKM2高表达的患者预后差。
  结论: COX7A2可作为胶质瘤患者评判预后的独立预测因子。COX7A2影响预后的机制可能与对TMZ敏感性的改变有关。结合COX7A2、NDUFS8、PKM2三者的表达情况,能更准确预测胶质瘤患者的预后。
[博士论文] 唐纯海
外科学(神经外科) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  脑胶质瘤是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤,目前各种治疗疗效均不理想。寻找和研究调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的相关基因将有助于进一步揭示胶质瘤的发病机理,为其基因治疗提供理想可靠的治疗靶标。
  microRNAs是一类长度为19-25个核苷酸内源性非编码的小分子单链RNA,研究表明,miR-130a可作为胶质瘤患者预后的预测指标。但其在胶质瘤中的体内功能及其作用机制尚未明确。
  高迁移率族蛋白-2属于HMG蛋白家族,其通过促进细胞增殖、侵袭和化疗耐药导致胶质瘤患者的预后差。
  本研究通过检测miR-130a在胶质瘤中的表达,并采用慢病毒构建miR-130a稳定过表达胶质瘤细胞株,检测细胞增殖、侵袭能力的变化以及EMT表型的改变,进一步探讨miR-130a介导的分子机制,同时研究EZH2抑制miR-130a转录的分子机制,为发现脑胶质瘤治疗新靶点提供依据。
  方法:
  1.胶质瘤中miR-130a基因表达特性的鉴定
  利用qRT-PCR检测胶质瘤细胞株及不同级别肿瘤组织中miR-130a的表达水平。
  2.miR-130a在胶质瘤中的功能初步研究
  用慢病毒构建miR-130a稳定过表达的胶质瘤细胞株将胶质瘤细胞U87中的miR-130a过表达,同时以si-Scrambled片段作为阴性对照。利用RT-PCR检测miR-130a过表达的效率。用噻唑蓝比色(MTT)实验检测miR-130a对胶质瘤细胞增殖功能的影响;运用平板克隆实验验证miR-130a抑制胶质瘤细胞克隆形成的能力;运用Boyden小室侵袭实验检测miR-130a可以抑制胶质瘤细胞的侵袭;采用裸鼠皮下成瘤实验验证miR-130a抑制胶质瘤细胞的增殖。
  3.miR-130a介导的分子机制初步研究
  miR-130a过表达后抑制了细胞的侵袭能力,故通过免疫荧光定性检测细胞侵袭相关的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、微丝蛋白的表达;通过Western blot定量检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达。由于过表达miR-130a后,细胞出现G1期向S期转化障碍并抑制细胞增殖,利用Western blot定量检测与细胞周期G1/S期相关的CDK4、c-myc、Cyclin D1蛋白的表达。生物信息学软件预测HMGB2可能为miR-130a的直接靶基因,采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达miR-130a可以抑制HMGB2的表达;双荧光素酶报告基因验证miR-130a可以靶向结合HMGB2mRNA的3'UTR区域进而抑制HMGB2基因的表达;MTT实验和克隆形成实验验证miR-130a通过靶向HMGB2抑制胶质瘤细胞的增殖;Boyden小室侵袭实验检测miR-130a通过靶向HMGB2来抑制胶质瘤细胞的侵袭。
  4.EZH2抑制miR-130a转录的分子机制研究
  利用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法检测细胞DNA甲基化水平;信息学分析EZH2可以结合miR-130a的启动子区域序列;染色质免疫共沉淀技术在体内进一步验证EZH2与miR-130a启动子区域结合;用RNA干扰技术将胶质瘤细胞U87中EZH2沉默表达,利用RT-PCR检测U87中miR-130a表达水平;进一步采用阿糖胞苷处理U87后检测miR-130a的表达水平。
  结果:
  在胶质瘤中miR-130a的表达下调且过表达miR-130a能抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭能力。动物体内进一步验证了miR-130a抑制胶质瘤细胞的增殖。生物信息学分析提示HMGB2mRNA的3'UTR含有miR-130a直接作用的靶序列,双荧光素酶报告基因系统进一步验证该靶序列能与miR-130a结合,组织及细胞水平进一步验证miR-130a对HMGB2蛋白表达的调控发生在转录后水平;过表达HMGB2能逆转miR-130a对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制。EZH2通过组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化(H3K27me3)来抑制miR-130a的表达。
  结论:
  miR-130a在胶质瘤中的表达降低;HMGB2介导了miR-130a对胶质瘤恶性生物学行为的抑制,miR-130a的表达受EZH2调控。
[硕士论文] 陈文
影像医学与核医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 松果体区肿瘤的临床及流行病学回顾性分析
  目的:
  回顾性分析我院2010年至2017年间经手术病理证实的113例松果体区肿瘤的临床资料,分析松果体区肿瘤的临床特征、年龄分布特点及性别差异,为松果体区肿瘤的流行病学研究及影像诊断提供参考依据。
  方法:
  1.研究对象与方法
  通过南方医院PACS系统搜集我院2010年至2017年间经手术病理证实的松果体区肿瘤113例,回顾性分析其临床资料。根据肿瘤组织学来源可将其分为生殖细胞肿瘤,松果体实质细胞肿瘤,神经胶质肿瘤以及脑膜肿瘤四大类。
  2.病理学检查方法
  所有病例均行手术切除治疗,将手术切除送检的标本用4%甲醛固定,经过8%盐酸甲酸脱钙后,用石蜡包埋切片,行常规HE染色,于光镜下观察组织学表现,大部分病例行免疫组化检查。
  3.统计学处理方法
  所有数据均采用SPSS23.0统计软件包进行统计分析,P<0.05认为差异有统计学意义。不同病理类型松果体区肿瘤性别的比较、年龄分布的比较及不同病理类型松果体区肿瘤中良性、交界性及恶性肿瘤的发病率比较均采用x2检验。
  结果:
  不同病理类型松果体区肿瘤在性别之间的差异有统计学意义(P<0.001);不同病理类型松果体区肿瘤的发病年龄差异有统计学意义(P<0.001);不同病理类型松果体区肿瘤良性、交界性及恶性肿瘤的发病率差异有统计学意义(P<0.001)。
  结论:
  1.松果体区肿瘤中,生殖细胞肿瘤最为常见,松果体实质细胞肿瘤及神经胶质肿瘤次之,脑膜肿瘤较为少见。恶性肿瘤发病率远远高于良性及交界性肿瘤。
  2.不同病理类型的松果体区肿瘤的发病年龄及性别具有一定特点,生殖细胞肿瘤以20岁以下男性多见;松果体实质细胞肿瘤及神经胶质肿瘤年龄跨度较大,可发生于不同年龄段;脑膜肿瘤总体发病年龄偏大。
  3.松果体区肿瘤临床表现缺乏特异性。实验室检查对生殖细胞肿瘤的诊断具有较高的特异性。
  第二部分 松果体区肿瘤的影像学表现与病理对照分析
  目的:
  回顾性分析113例经病理证实的松果体区肿瘤的影像及病理资料,进一步分析各类肿瘤及其不同病理亚型的影像学特征,提高松果体区肿瘤的影像诊断和鉴别诊断。
  方法:
  1.研究对象与方法
  搜集南方医院2010年至2017年间经手术病理证实的松果体区肿瘤113例,回顾性分析患者的影像学资料。74例患者行CT平扫,全部患者均行常规MRI平扫及增强扫描,其中76例行DWI扫描,21例行MRS扫描。
  肿瘤病理分型及分析方法同第一部分。
  所有影像资料均分别由一名低年资及一名高年资影像医师共同阅片。病变影像学分析主要包括以下方面:病变的大小、形态、边界、密度、有无囊变坏死出血、钙化、钙化位置、MRI信号特点、MRS表现、强化程度及强化方式等。
  2.病理检查方法
  同第一部分。
  3.统计学处理方法
  数据采用SPSS23.0统计软件包进行分析,P<0.05认为差异有统计学意义。不同病理类型松果体区肿瘤以及良性、交界性及恶性松果体区肿瘤的影像学特征比较均采用x2检验。
  结果:
  钙化在不病理类型松果体区肿瘤中出现率差异有统计学意义(P=0.001);钙化位置不同在生殖细胞肿瘤及松果体实质细胞肿瘤中差异有统计学意义(P=0.02);肿瘤形态差异在良性、交界性及恶性松果体区肿瘤中差异有统计学意义(P=0.003);肿瘤大小在良性、交界性及恶性松果体区肿瘤中差异无统计学意义(P=0.887);囊变坏死在不同病理类型松果体区肿瘤中出现的差异有统计学意义(P<0.001);囊变坏死率在良性、交界性及恶性松果体区肿瘤中差异有统计学意义(P=0.004);囊变形态在非生殖细胞瘤性生殖细胞肿瘤与其他病理亚型肿瘤中差异有统计学意义(P=0.002);不同病理类型松果体区肿瘤强化程度及强化方式差异有统计学意义(P=0.001,P<0.001);良性、交界性及恶性松果体区肿瘤强化程度及强化方式差异有统计学意义(P=0.003,P=0.008)。
  结论:
  1.钙化在松果体区肿瘤中常见于生殖细胞肿瘤及松果体实质细胞肿瘤。生殖细胞肿瘤钙化多位于肿瘤中心,松果体实质细胞肿瘤钙化多位于肿瘤边缘且多呈爆裂状。
  2.肿瘤大小在良恶性松果体区肿瘤中差异不明显。松果体区肿瘤边界多清晰,良性、交界性及低度恶性肿瘤(如生殖细胞瘤)多表现为形态规则,恶性程度较高肿瘤多呈不规则形或分叶状改变。
  3.“蝶形征”对于生殖细胞瘤的诊断具有特异性,松果体实质细胞肿瘤较大时可沿着脑室系统铸形生长。部分脑膜肿瘤可出现”脑膜尾征”。
  4.囊变坏死出现多见于生殖细胞肿瘤,多发小囊状改变对于非生殖细胞瘤性生殖细胞肿瘤具有较高特异性。恶性肿瘤囊变坏死率明显高于良性及交界性肿瘤。
  5.肿瘤内出血多见于绒毛膜癌及含有绒毛膜癌成分的混合性生殖细胞肿瘤,部分级别较高的神经胶质肿瘤及松果体实质细胞肿瘤亦可伴有瘤内出血。
  6.在松果体区肿瘤缺乏特征性影像学表现时,诊断上应密切结合松果体区肿瘤的流行病学及临床特点加以鉴别。
[硕士论文] 邓汉顺
外科学(神经外科) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:本研究通过对比开颅夹闭及血管内介入栓塞两种手术方式治疗前循环破裂颅内动脉瘤(Intracranial Aneurysm,IA)患者的预后,为前循环破裂IA患者的临床工作中提供选择何种手术方式的依据,从而提高患者的生存率及改善患者术后生活质量。
  方法:回顾性分析我院2011年1月到2016年12月在院的162例前循环破裂IA患者临床数据,其中32例行开颅夹闭术,130例行血管内介入栓塞术。从两种手术治疗的平均住院日、并发症发生率、术后半年GOS预后评分、复发率等方面比较预后差别。我们使用单因素分析明确前循环破裂IA预后不良的危险因素,再使用Logistic多因素回归分析明确其独立危险因素。
  结果:前循环破裂IA开颅夹闭平均住院时间为:44.60±7.84,介入栓塞平均住院时间为:21.46±1.57,选择血管内介入栓塞治疗的平均住院时间比开颅夹闭术更短(p=0.00<0.05)。开颅组及介入组脑血管痉挛发生率分别是50%及24.62%,脑积水发生率分别为21.88%和9.23%,再次出血发生率分别是3.13%及4.62%。再次出血发生率差异无统计学意义(P=0.710>0.05),而脑血管痉挛发生率(P=0.005<0.05)、脑积水发生率(P=0.046<0.05)、复发率(P=0.018<0.05)、术后半年GOS预后评分(P=0.002<0.05)差异有统计学意义,开颅夹闭脑血管痉挛、脑积水发生几率大,但复发率较低。将预后与入院时相关临床资料逐一进行单因素分析比较发现:术前Hunt-Hess分级(P=0.000)、术前CT Fisher分级(P=0.000)、手术方式(P=0.003)这些因素与患者预后相关。其中术前Hunt-Hess分级高(4、5级)(P=0.000,OR=0.050,95%CI=0.017~0.145)是前循环破裂IA预后不良的独立危险因素。
  结论:对于前循环破裂IA的患者而言,除非是合并颅内血肿有脑疝形成风险或已经脑疝形成的患者,血管内介入栓塞是恢复更快、并发症更少、术后神经功能恢复更好的选择,但其复发率高。无论选用开颅夹闭还是介入栓塞治疗前循环破裂IA,术前Hunt-Hess分级高是其预后不良的独立危险因素。
[博士论文] 卢凤飞
神经外科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:胶质瘤是常见的神经系统恶性肿瘤,虽然神经外科手术,化学治疗和放射治疗相结合的治疗策略成为临床治疗胶质瘤的重要手段,但神经胶质瘤患者的预后和生存率仍然较差,其5年生存率低于5%。因此,阐明神经胶质瘤发生发展的分子机制以及进一步探究胶质瘤的治疗的新策略是对临床胶质瘤的治疗意义重大。
  在过去的十年中,针对miRNA的研究一直是癌生物学领域热门研究内容之一。miRNA是长度为19-25个核苷酸的一类内源性非编码RNA。miRNA是细胞内信号通路重要的调控分子,主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区碱基互补配对并相互作用,从而影响靶mRNA分子的稳定性及翻译。这种mRNA干扰导致编码蛋白水平降低,从而影响一系列细胞过程,例如增殖,迁移和凋亡。有研究发现与相应的非肿瘤脑组织相比,部分miRNAs在恶性脑肿瘤中差异表达,这些miRNA发挥着靶向调控癌基因和抑制基因的功能,参与细胞迁移、细胞骨架重排、细胞侵袭侵袭性和血管生成的调控,从而阻断/促进肿瘤的发生发展。因此,miRNA可能在未来的肿瘤治疗中发挥巨大的作用,例如通过递送治疗性基因或微小RNA(miRNA)阻断肿瘤细胞增殖侵袭信号通路的重要靶标从而达到抑癌的目的。
  miR-497是位于17号染色体短臂13.1(17p13.1)的miRNA,属于miR-15/16/195/424/497家族miRNA中的一员,该家族成员的成熟miRNAs5,端均包含了AGCAGC序列,并在人组织中均有中-高丰度的表达,是一簇高度保守的miRNA。有文献报道,抑癌基因P53等蛋白能够上调该家族miRNAs的表达,相反,应激和创伤下调它们的表达,另外其启动子甲基化和MYC也可引起它们的低表达,它们在细胞分裂、血管生成、代谢和应激反应等方面具有非常重要的作用。最近很多研究表明miR-497和miR-195所在染色体17p13.1的删除或拷贝数减少、等位基因缺失、启动子上游CpG岛区域发生异常高甲基化均可引起miR-497和miR-195表达下调,这两个miRNA与乳腺癌、原发性腹膜癌、黑色素瘤、结肠直肠癌等多种肿瘤、缺血性疾病和神经退行性疾病的发生密切相关。
  miR-497在各种肿瘤中表达下调,如肝癌、非小细胞肺癌,原发性腹膜癌,胃癌和乳腺癌等,同时,miR-497在恶性肿瘤中发挥重要的抑癌基因的作用,miR-497的低表达可能促进了肿瘤的发生发展。在男性乳腺癌中,miR-497是表达下调最显的miRNA之一。DanLi等人的研究结果显示miR-195/497在乳腺癌组织中的表达水平与其恶性程度呈负相关。在乳腺癌中miR-497启动子区发生了异常CpG岛的高甲基化导致其表达下调。在乳腺癌细胞株MCF7以及ZR-75-30中通过过表达miR-497抑制其增殖和侵袭。miR-497通过靶向调控Raf-1和Ccnd1的表达抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。研究发现miR-497在非小细胞肺癌组织和细胞株中表达下调,在肺癌细胞株中过表达miR-497显著抑制细胞增殖和集落形成,miR-497通过靶向调控HDGF的表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。
  在神经系统中,miR-497同样发挥着重要的功能。例如,miR-497能够通过靶向负调控抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-w促进缺血性神经元的死亡。大鼠局灶性脑缺血后,敲除大鼠miR-497可有效增强缺血区bcl-2/-W蛋白水平,减弱缺血性脑梗塞。然而,miR-497在胶质瘤中的表达、对胶质瘤生物学行为的影响以及其潜在的分子机制仍有待进一步研究,阐明miR-497在胶质瘤发病机理中的作用具有较大的应用价值以及重要的科学意义。在本研究中,我们探讨了miR-497在胶质瘤细胞株及胶质瘤组织中的表达,miR-497在胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移过程中发挥的作用,并探讨了其潜在的作用机制。我们的研究发现在胶质瘤组织和细胞系中miR-497的表达显著下调。Wnt3a蛋白被鉴定为miR-497的下游靶标,并介导了miR-497在细胞生长和侵袭中所发挥的功能。此外,本研究还表明Wnt3a促进c-jun表达,从而负调控miR-497表达,总之,miR-497/Wnt3a/c-jun反馈环调控的失调是神经胶质瘤细胞异常生长增殖和发生上皮-间质转化的重要分子机制之一。
  1.miR-497在胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中表达下调
  我们使用荧光实时定量PCR方法测定胶质瘤组织和正常脑组织中miR-497的表达情况。检测结果显示与正常脑组织相比,胶质瘤组织中miR-497的表达显著下调。同时,与正常脑细胞株NBC相比,胶质瘤细胞株中miR-497的表达显著下调。统计学分析发现miR-497表达高的胶质瘤患者无病生存率和总生存率显著高于miR-497低表达的患者。
  2.Wnt3a是miR-497在胶质瘤中的直接靶点
  来自miRNA数据库TargetScan和miRanda的生物信息学分析结果提示Wnt3a是miR-497重要靶标之一。为了检测miR-497能否通过直接靶向Wnt3a3'-UTR调控其表达,我们将Wnt3a的3'-UTR克隆到荧光素酶报告质粒中,其中包括预测的miR-497与Wnt3a的3'-UTR野生型结合位点(WT)荧光素酶报告质粒以及突变序列(MUT)荧光素酶报告质粒。与突变型miR-497质粒转染的U251细胞相比,用野生型质粒转染的细胞的荧光素酶活性显著降低。随后,通过RT-PCR和Western Blot检测,我们发现miR-497能够在mRNA和蛋白水平抑制Wnt3a的表达。进一步研究表明,胶质瘤组织中miR-497和Wnt3a之间表达呈负相关关系。
  3.miR-497靶向Wnt3a在胶质瘤细胞中的作用
  我们使用慢病毒作为载体过表达miR-497建立稳定表达miR-497的U251细胞株。用对照慢病毒载体(LV-ctrl)转导的细胞作为阴性对照。我们使用RT-PCR检测细胞的转染效率。正如预期的那样, MTT检测结果提示过表达miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。类似地,用LV-miR-497处理的U251细胞比用LV-ctrl处理的细胞形成更小和更少的集落。接下来我们检测miR-497是否可以控制细胞周期进程。我们观察到过表达miR-497能够明显降低S期细胞的比例并增加G1期细胞的比例。我们还检测了转染LV-miR-497细胞后细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1,CDK4和E2F1的表达情况,发现过表达miR-497能够明显下调这些蛋白的表达。总之,上述实验结果提示miR-497能够通过调节细胞周期进程来减少神经胶质瘤细胞的生长。
  随后,我们通过实验检测miR-497对胶质瘤细胞迁移的影响。Transwell检测结果提示过表达miR-497后能够明显抑制胶质瘤细胞的迁移。大量研究表明上皮-间质转化(EMT)在参与促进癌细胞迁移中发挥的重要作用,我们检测了miR-497对胶质瘤细胞株EMT的影响。在LV-miR-497细胞中E-cadherin表达升高,而N-cadherin和Vimentin表达下调。上述实验结果提示恢复miR-497的表达可能逆转EMT并下调胶质瘤细胞的迁移能力。接下来我们通过进一步实验以确定miR-497是否主要通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株迁移的功能。实验结果表明当Wnt3a过表达时,通过过表达miR-497抑制Wnt3a对胶质瘤细胞株侵袭转移的抑制作用被消除。此外,我们的研究结果还揭示了Wnt3a的过表达逆转了miR-497对细胞生长,细胞周期分布,侵袭和EMT表型变化的影响。总之,上述实验结果表明miR-497通过靶向Wnt3a抑制神经胶质瘤细胞生长和迁移。
  4.Wnt3a通过c-jun负调控miR-497的表达
  我们进一步探究了miR-497在胶质瘤中下调的潜在分子机制。首先,我们使用UCSC和PROMO生物信息学软件寻找到了miR-497转录起始位点上游1000个碱基的区域。进一步生物信息学分析结果提示miR-497转录起始位点上游-978至-972和-952至-946启动子区域存在两个潜在的c-jun转录因子结合位点。上述转录因子结合位点被命名为A和B。染色质免疫沉淀(ChIP)检测结果提示c-jun蛋白能够结合上miR-497启动子中上述两个转录因子结合位点。启动子区荧光素酶报告基因检测结果发现下调c-jun蛋白表达能够提高miR-497转录活性并上调miR-497表达。
  有文献报导肿瘤细胞中Wnt3a能够上调c-jun的表达。我们通过进一步试验验证在胶质瘤细胞中Wnt3a能否通过c-jun调节miR-497的表达。首先,我们通过si-RNA下调Wnt3a表达,发现通过干扰Wnt3a的表达后能够下调c-jun同时增加miR-497表达。然而,当c-jun过表达时,在转染了si-Wnt3a的胶质瘤细胞株中发现miR-497表达升高。用质粒pcDNA-3.1-Wnt3a转染U251细胞后,发现过表达Wnt3a能够增加c-jun的表达水平,同时下调了miR-497的表达。然而,当c-jun表达被抑制时,在转染了pcDNA-3.1-Wnt3a的胶质瘤细胞中miR-497表达下调。总之,上述实验数据数据表明Wnt3a可能通过c-jun负调控miR-497的表达。
  5.miR-497在体内抑制细胞生长
  为了进一步确认miR-497能否在体内实验中抑制肿瘤的生长,我们分别将转染了LV-miR-497及LV-ctrl的胶质瘤细胞株U251注射到裸鼠的背部。与接种LV-ctrl细胞的异种移植肿瘤相比,接种LV-miR-497细胞株的裸鼠肿瘤生长得更缓慢。此外,接种LV-miR-497细胞的裸鼠体内异种移植肿瘤的平均重量显著低于接种LV-ctrl细胞的裸鼠。我们取下裸鼠体内的移植瘤进行固定脱水后石蜡包埋并进行切片,对肿瘤切片进行免疫组化增殖标记物Ki-67染色,结果表明miR-497在体内下调了胶质瘤细胞株的增殖速度。
  研究表明一部分miRNAs有助于胶质瘤的发生发展和侵袭转移,并被认为是治疗胶质瘤的潜在新型治疗靶点。有研究报导了miR-497在癌症发生发展过程中所发挥的作用。在非小细胞肺癌中,miR-497表达下调,而过表达miR-497能够通过其靶向VEGF和YAP1抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。在一系列的研究中发现了类似的结果,miR-497作为一种肿瘤抑癌基因发挥作用。研究表明microRNA-497的表达下调与胶质瘤患者的预后不良有关。然而,miR-497在神经胶质瘤中的生物学功能和潜在的分子机制目前尚不清楚。在本研究中,与之前文献所报道的结果一致,我们发现miR-497在胶质瘤组织和细胞系中表达下调。
  在本研究中,Wnt3a被鉴定为miR-497下游的靶基因。我们提出miR-497可能通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的功能。为了进一步证实这一观点,我们在稳定转染miR-497的胶质瘤细胞株中过表达Wnt3a,观察到Wnt3a过表达逆转了miR-497对胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的抑制作用。在胶质瘤组织中我们也发现miR-497和Wnt3a的表达呈负相关。
  随后,我们进行了细胞功能实验以探索miR-497在胶质瘤细胞中的作用。通过MTT和集落形成实验证实了miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。随后我们检测了miR-497对胶质瘤细胞周期分布的影响,我们观察到过表达miR-497后胶质瘤细胞周期分布从G1期阻滞到S期。该数据表明miR-497可能通过影响细胞周期来下调胶质瘤细胞的生长能力。与体外研究一致,体内研究结果显示miR-497能够抑制裸鼠皮下移植瘤细胞的生长。
  肿瘤侵袭转移是癌症发展进程的关键步骤之一。Boyden检测结果提示过表达miR-497能够下调胶质瘤细胞的侵袭转移能力。EMT与细胞侵袭能力密切相关,因此我们验证了miR-497对胶质瘤细胞株EMT表型的影响。如本研究Western Blot检测结果所示,在胶质瘤细胞株中过表达miR-497能够增加E-钙粘着蛋白表达,同时降低N-钙粘着蛋白和波形蛋白表达。上述实验结果提示miR-497可能通过抑制胶质瘤细胞株的上皮-间充质转化,最终下调神经胶质瘤细胞的侵袭转移能力。
  最后,我们探究了导致胶质瘤miR-497失调的潜在分子机制。转录因子的异常调控通常会导致miRNA在遗传或表观遗传水平上的表达异常。在这些转录因子中,c-jun在肿瘤细胞生长和转移过程中发挥关键作用。通过生物信息学分析发现,在miR-497转录起始位点上游区域发现了c-jun的两个转录因子结合位点。ChIP-PCR和荧光素酶报告基因检测结果证实c-jun能够直接结合于miR-497启动子上并抑制其转录活性。实时荧光定量PCR检测结果显示c-jun能够负调控miR-497的表达。我们还证实了Wnt3a能够通过调节c-jun表达,从而控制miR-497的表达。我们的研究结果提示Wnt3a能够通过调控c-jun/miR-497轴促进胶质瘤细胞株的生长及侵袭转移。
  总之,我们的研究结果提示Wnt3a/c-jun/miR-497反馈环调控神经胶质瘤细胞的生长和侵袭。miR-497的下调与胶质瘤患者的预后不良密切相关,并且恢复miR-497的表达降低了胶质瘤细胞株的生长和侵袭转移,所以靶向miR-497可能是神经胶质瘤的潜在治疗手段之一。
[博士论文] 孙瑾
外科学(神外) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:脑胶质瘤发生、发展存在复杂调控机制,如何攻克胶质瘤始终是研究热点及难点。目前胶质母细胞瘤患者平均中位生存期只有12~18月,既往研究NF2基因与肿瘤发病过程关系密切,是一个重要肿瘤抑制因子,NF2基因表达产物merlin蛋白在肿瘤细胞调控过程作用关键。DNMT对NF2基因甲基化进行催化,异常DNMT表达与肿瘤发生紧密联系,而大量破坏DNA甲基化正是胶质瘤细胞迅速增殖的特性。已有大量研究发现不同miRNAs因子失调与肿瘤发病机制之间密切相关,但miRNAs和DNMT1之间调控机制及与胶质瘤凋亡、侵袭关系仍有待研究。
  目的和意义:
  本课题围绕miR-152-3p与DNMT1-NF2通路之间的调控机制,研究这条通路对胶质瘤发生、发展及凋亡等生物学行为的影响。通过检测miR-152-3p、DNMT1、NF2及其甲基化在胶质母细胞瘤组织和胶质瘤细胞表达,分析miR-152-3p、DNMT1、NF2三者与胶质瘤细胞凋亡、侵袭细胞学之间关系的实验,探讨miR-152-3p、DNMT1、NF2与胶质瘤发病机制之间关系,寻找调控胶质瘤细胞凋亡及侵袭新的环路。
  方法:
  本课题研究分两部分内容:第一章qRT-PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤组织和胶质瘤细胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表达;免疫组化检测正常人脑组织和胶质母细胞瘤组织中DNMT1、merlin蛋白表达;MSP和BSP检测胶质母细胞瘤组织和不同胶质瘤细胞系中NF2基因甲基化程度。第二章DNMT1基因siRNA重组质粒与NF2过表达载体构建;将敲减DNMT1基因表达质粒及NF2、miR-152-3p过表达载体转染体外培养U251胶质瘤细胞;qRT-PCR、Westrn blot、MSP和BSP检测转染后胶质瘤细胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表达;CCK方法检测质粒转染后U251胶质瘤细胞增殖情况;免疫荧光实验对CCK结果进行验证;流式细胞学方法、EDU方法检测质粒转染后U251胶质瘤细胞凋亡情况;评估transwell侵袭实验转染后U251胶质瘤细胞情况;双荧光素酶实验对miR-152-3p的靶点进行验证。
  结果:
  NF2甲基化引起DNMT1在胶质瘤母细胞瘤组织和U251、U87、T98-G、A172胶质瘤细胞系表达明显增加。敲低DNMT1mRNA表达引起NF2去甲基化,提高NF2转录及翻译水平表达。实验发现miR-152-3p在胶质母细胞瘤组织表达明显减少,miR-152-3p直接靶向调节DNMT1,两者潜在结合位点是DNMT13'-UTR的48~55位置。而且发现miR-152-3p、NF2过表达和敲低DNMT1显著诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭活力。MiR-152-3p通过减少DNMT1表达抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭活性。
  结论:
  1.胶质瘤发病过程DNMT1和miR-152-3p组成一个负反馈环,NF2和miR-152-3p形成一个正反馈环,miRNA在调控通路起肿瘤抑制因子作用。
  2.MiR-152-3p通过减少DNMT1表达抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭活性。
  3.MiR-152-3p作为一个新型提升胶质瘤细胞侵袭能力的调节因子和希望为胶质瘤治疗提供一个新的治疗途径。
[硕士论文] 赵秀雨
影像医学与核医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  应用多模态磁共振成像技术包括扩散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)、扩散峰值成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)和氢质子磁共振波谱(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)探定四脑室区脑肿瘤内部成分及细胞增殖状态,分析单参数及多参数在诊断与鉴别不同级别和类型肿瘤中的效能。同时,分析各成像参数与Ki-67的相关性,确定磁共振成像参数判定四脑室区脑肿瘤中细胞增殖状态的价值。
  方法:
  收集第四脑室区的43例脑肿瘤,所有患者检查前均知情同意。根据2016年WHO中枢系统肿瘤分类标准,病例包括8例WHOⅠ级(8例毛细胞型星形细胞瘤),12例WHOⅡ级(7例室管膜瘤、1例少突星形细胞瘤、3例弥漫性星形细胞瘤、1例毛细胞粘液样星形细胞瘤),8例WHOⅢ级(8例间变性室管膜瘤),15例WHOⅣ级(13例髓母细胞瘤、1例中枢神经系统胚胎性肿瘤NOS、1例胶质母细胞瘤)。男29例,女14例,平均年龄17.63±13.01岁。将WHOⅠ级和WHOⅡ级分组为低级别组肿瘤,共计20例;WHOⅢ级和WHOⅣ级分组为高级别组肿瘤,共计23例。43例病人均进行了常规T1WI、T2WI、DWI、DKI及1H-MRS检查。比较肿瘤实质区的表观扩散系数(ADC)值、平均扩散峰度(MK)值、径向峰度(Kr)值、轴向峰度(Ka)值、平均扩散系数(MD)值、各向异性系数(FA)值、胆碱/肌酸(Cho/Cr)比值。Spearson相关分析用于分析多模态成像参数(MK、MD、Kr、Ka、FA、ADC、Cho/Cr)和Ki-67阳性指数之间的相关性。以病理结果为金标准,选用independent sample T test(计量资料)或x2test(计数资料)分析高、低级别组以及不同类型肿瘤参数的差异;使用独立样本t检验和Logistic回归分析来生成ROC曲线,以评估单个和多个参数组合在肿瘤鉴别中的价值、敏感度和特异性,计算曲线下面积(AUC),P<0.05有统计学意义。
  结果:
  1、第四脑室区高级别和低级别脑肿瘤组、间变性室管膜瘤和髓母细胞瘤两种肿瘤患者年龄及性别的差异性进行统计学分析,结果显示:高级别肿瘤组患者平均年龄低于低级别组,差异有统计学意义(P=0.0028)。间变性室管膜瘤组平均年龄略低于髓母细胞瘤,但两组间差异无统计学意义(P=0.466)。各组患者性别差异统计学分析无统计学差异(P>0.05)。
  2、第四脑室区脑高级别组肿瘤组的MK、Ka、Kr和Cho/Cr值高于低级别肿瘤组,差异有统计学意义。高级别肿瘤组的ADC值和MD值均比低级别肿瘤组低,差异有统计学意义(P<0.05)。高级别组肿瘤的FA值高于低级别肿瘤组,差异有统计,学意义(P=0.039);MK、Kr、Ka、MD、FA、ADC及Cho/Cr值的曲线下面积分别0.937、0.889、0.925、0.810、0.742、0.800及0.760;多参数联合诊断的曲线下面积为0.980,敏感度为100%,特异度为85.7%。
  第四脑室区髓母细胞瘤与间变性室管膜瘤的比较,髓母细胞瘤的MK、Kr、Ka、Cho/Cr值均较间变性室管膜瘤的高(P<0.05);髓母细胞瘤的MD值低于间变性室管膜瘤,差异有统计学意义(P<0.05);髓母细胞瘤FA值和ADC值略低于间变性室管膜瘤,但差异无统计学意义(P>0.05)。MK、Kr、Ka、MD、FA、ADC及Cho/Cr值的曲线下面积分别为0.952、0.893、0.786、0.857、0.774、0.643及0.738;多参数联合诊断的AUC为0.964,敏感度为100%,特异度为85.7%。
  3、四脑室区脑高级别肿瘤组Ki-67较低级别肿瘤组高,髓母细胞瘤最高,其次是间变性室管膜瘤、室管膜瘤和星形细胞瘤。两组四脑室区脑肿瘤MK、Kr、Ka值随Ki-67的增高而升高,与Ki-67呈正相关(r值分别为0.884、0.777、0.850,P<0.01),MD和ADC值随Ki-67增加而降低,与Ki-67负相关,差异有统计学意义(r值分别为-0.881、-0.812,P<0.01),FA值则无统计学意义的差异(r=0.490,P>0.05)。Cho/Cr值随Ki-67增加而增加,并与Ki-67呈正相关,差异有统计学意义(r=0.879,P<0.01)。
  结论:
  DWI、DKI和1H-MRS技术在第四脑室区脑瘤分级中具有重要价值。单一模态参数鉴别高低级别肿瘤,DKI诊断准确率最高,其参数MK值的诊断效能最高;DKI结合DWI、1H-MRS的多模态磁共振成像对诊断四脑室区脑肿瘤的敏感性增加。磁共振参数MK值可作为评价第四脑室区肿瘤中恶性增殖水平的可靠指标,MK值是预测Ki-67增殖状态的最佳独立因素。
[硕士论文] 彭贵宝
神经外科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,发病率和复发率都很高、病人预后较差。目前,临床上主要治疗为手术切除病灶联合术后放化疗,但是,患者仍然难以达到长期存活。因此,为了研究胶质瘤的发生,发展的分子机制,寻找脑胶质瘤治疗的新靶点,已成为近年来胶质瘤诊治中的热点之一。
  人类PIM1基因编码一种丝/苏氨酸激酶(serine/threoninekinase):PIM1,它在人体的各种组织和细胞中广泛表达,并在肿瘤发展中起重要作用。PIM是编码丝状/苏氨酸激酶之一的原癌基因,由PIM1,PIM2和PIM3家族成员组成的PIM家族是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶家族,其在不同组织中表达不同:PIM1在造血细胞中高度表达;PIM1激酶的潜在致肿瘤性在血液和实体肿瘤中高度表达。靶向抑制蛋白激酶可显著提高胶质瘤患者的生存时间。研究表明,VEGF/AKT/eNOS信号通路参与神经胶质瘤细胞的生存、增殖、侵袭、凋亡及血管形成等进程中,迄今为止,PIM1激酶在神经胶质瘤及正常脑组织中的表达差异尚不清楚;PIM1激酶在神经胶质瘤细胞中的增殖、侵袭及血管形成过程中的作用及其分子机制尚不清楚;PIM1介导的胶质瘤细胞增殖、侵袭和血管形成及其与VEGF/AKT/eNOS信号传导通路激活是否相关联尚待研究。
  本研究我们首先检测正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中PIM1的表达水平;接下来,我们分别研究了基因敲除PIM1后胶质瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成能力的变化;最后,我们探讨了PIM1基因对恶性胶质瘤细胞系U87MG细胞VEGF/AKT/eNOS信号通路的影响。
  第一部分 PIM1在正常脑组织及胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况
  目的:探讨PIM1在正常脑组织及胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况。
  方法:收集武汉总医院神经外科28例手术切除的脑胶质瘤病理组织及15例外伤内减压取出的破损正常组织。用Western Blot和RT-qPCR检测组织样本中PIM1蛋白和mRNA的表达。统计分析用t检验,单因素方差分析和卡方检验进行,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:胶质瘤组织中PIM1的蛋白表达水平高于正常脑组织(P<0.05);胶质瘤组织中PIM1的mRNA表达水平高于正常脑组织(P=0.010),不同病理级别之间PIM1的mRNA表达水平无差异(P=0.734),表明PIM1mRNA表达与脑胶质瘤的病理级别无相关性。
  结论:PIM1的蛋白及mRNA表达水平在胶质瘤组织中较正常脑组织中增高,提示PIM1可能在胶质瘤发生发展中发挥重要作用。
  第二部分 PIM1影响恶性脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成过程
  目的:探讨敲除PIM1基因对U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成能力产生的影响。
  方法:先筛选人胶质瘤细胞系U87MG、U251MG、U373中蛋白高表达细胞株,选取人胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,分别采用短发夹RNA(shRNA)干扰敲除PIM1;利用Westem Blot检测U87MG恶性胶质瘤细胞中PIM1蛋白的表达情况;CCK8增殖实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的侵袭能力,血管形成实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的血管形成能力。采用t检验、单因素方差分析进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:PIM1蛋白在胶质瘤细胞系U87MG表达最高;shRNA干扰敲除PIM1后,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中PIM1蛋白的表达水平明显下降,提示转染成功,各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成能力下降(P<0.05)。
  结论:PIM1可对恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成能力产生影响,进一步确认PIM1在神经胶质母细胞瘤的发生和发展中具备重要作用,并且预期会成为抗胶质瘤治疗的潜在靶标。
  第三部分 PIM1对恶性胶质瘤细胞系U87MG细胞VEGF/AKT/eNOS信号通路影响的研究
  目的:探索PIM1基因对恶性胶质瘤细胞系U87MG细胞VEGF/AKT/eNOS信号通路的影响。
  方法:以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,shRNA干扰敲除PIM1。实验研究组别:经过shRNA干扰的基因敲除PIM1实验分成为3个组别:正常空白对照组、实施干扰对照组、shRNA干扰PIM1基因敲除组。利用Western Blot检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中PIM1、AKT、p-AKT、VEGFA、eNOS、p-eNOS、EGFR蛋白的表达情况。统计学分析运用t检验、单因素方差分析来统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:shRNA干扰技术敲除PIM1后,干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞PIM1蛋白的表达水平明显下降,提示转染成功,干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞中AKT、p-eNOS总蛋白水平无变化,VEGFA、p-AKT、eNOS蛋白水平下降(P<0.05)。
  结论:PIM1可能参与神经胶质瘤细胞中VEGF/AKT/eNOS信号传导通路的激活,本研究有望为恶性胶质瘤的治疗找寻到新的靶点及突破口。
[硕士论文] 高文静
影像医学与核医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:探讨氢质子磁共振波谱成像(1H-MRS)参数(Cho/Cr、Cho/NAA及NAA/Cr比值)与微小染色体维持蛋白2(MCM2)表达的关系,评估1H-MRS能否无创性预测脑胶质瘤细胞增殖活性以及高级别胶质瘤(HGGs)患者预后。
  研究方法:回顾性分析43例经病理证实的脑胶质瘤患者的1H-MRS数据,计算Cho/Cr、Cho/NAA及NAA/Cr比值,用免疫组织化学方法检测所有胶质瘤组织MCM2的表达。通过Pearson相关性分析评估MCM2标记指数(LI)与各代谢物比值之间的关系。以15个月总体生存期为分界点将高级别胶质瘤患者分为两组,通过ROC曲线判断各代谢物比值及MCM2LI区分两组患者的最佳截断值。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素生存分析采用COX比例风险回归模型方法。
  研究结果:Cho/Cr及Cho/NAA比值在低级别胶质瘤(LGGs)及HGGs患者中均存在显著性差异(P<0.01,P=0.023),NAA/Cr比值在LGGs及HGGs患者间的差异不具有统计学意义(P=0.372)。Cho/Cr比值和MCM2表达呈显著正相关(r=0.052,P<0.01),Cho/NAA及NAA/Cr比值与MCM2的表达无相关性(r=0.295,P=0.55;r=-0.042,P=0.788)。MCM2LI大于50%的HGGs患者中位生存期为13个月,小于50%的HGGs患者中位生存期为20个月。Cho/Cr比值大于2.68的HGGs患者中位生存期为13个月,Cho/Cr比值小于2.68的HGGs患者中位生存期为18个月。多因素生存分析显示Cho/Cr比值与MCM2均为HGGs患者的独立预后因素。
  研究结论:Cho/Cr比值能够预测MCM2的表达情况,并且可作为术前评估胶质瘤细胞增殖活性的指标。Cho/Cr比值越高,MCM2表达越多,则患者生存时间越短,Cho/Cr比值及MCM2可作为评估HGGs患者的临床预后指标。
[硕士论文] 王晓娅
生物医学工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,根据肿瘤良恶性程度,可以分为高级别脑胶质瘤和低级别脑胶质瘤。近年来,基因层面的研究已经被证实在脑胶质瘤预测和预后上具有很大的价值。但是仅仅基于分子层面对脑胶质瘤进行分级研究是不完整的。因此对脑胶质瘤在组织层面进行准确分级是进行分子诊断的基础,在脑胶质瘤患者临床诊断治疗上起着重要的作用。目前,临床上使用手术或活检的方法对肿瘤进行化验分级。但是这种方法由于手术侵入性和肿瘤的异质性使得它具有很大的局限性。
  作为一种无创性工具,磁共振成像(MR)在胶质瘤诊断中起着重要作用。大部分关于脑胶质瘤MR图像的研究都是针对单模态,或者是重点研究MR图像的一阶特征,如平均值和最大、小值等统计学特征,并不能完整的表示肿瘤的表型信息。基于这种现状,本文使用2015年BRATS提供的脑胶质瘤MR图像样本集,高通量的从多模态脑胶质瘤MR图像中提取影像组学特征,使用支持向量机-递归消除法对特征进行选择,获得能够表示脑胶质瘤表象特征的最优特征子集,然后使用XgBoost算法训练分类器,作为对比本文也使用ERT和SVM两种方法进行分类训练。
  本文从脑胶质瘤四个模态MR图像中,总共提取了420个影像组学特征。这些特征数据量庞大,具有很多无关特征和噪声,无法直接用于分类器训练研究。所以需要先进行特征选择,本文在特征选择环节使用的是支持向量机-递归消除法,整个过程中使用5-折交叉验证方法,对样本总集进行五次特征选择,获得五个最优特征子集,将这些特征子集中共同包含的特征作为特征选择的结果。可以发现多数的纹理特征和Tlc模态中的特征被选择出来,说明纹理特征和Tlc模态图像在高、低级别脑胶质瘤的分类中起到很重要的作用。这点研究发现和目前比较先进的国内外研究结论一致。
  本文最后使用XgBoost算法训练分类器,对样本集使用5-折交叉验证来评价分类器性能,同时使用ERT和SVM两种算法训练分类器作为对比,研究实验显示,XgBoost分类器的精度、查准率、查全率和F1分别为:91.25%、91.63%、91.25%和91.06%,均高于ERT和SVM两个分类器。这点也说明本文中采用XgBoost算法在本次良恶性肿瘤分级预测研究上具有很大的优越性。
  本文设计的分类训练器具有较高的精度,可以用于协助医生诊断脑胶质瘤的良恶性,是进一步分子诊断的基础。
[硕士论文] 吴建阳
外科学(神经外科) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究不同浓度的纳米银对C6胶质瘤细胞的作用,包括毒性、细胞形态、凋亡、细胞周期等相关实验检测,探讨纳米银对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。
  方法:
  1.利用CCK-8检测法评估纳米银对C6胶质瘤细胞的毒性作用:根据加入C6胶质瘤细胞培养板中的纳米银浓度不同分为空白对照组,0.1mg/ml组,0.2mg/ml组,0.3mg/ml组,0.4mg/ml组,0.5mg/ml组,0.6mg/ml组,分别培养24h和48h,加入CCK-8,使用酶联免疫检测光吸收值,确定C6胶质瘤细胞增殖率。
  2.光学镜下观察纳米银对C6胶质瘤细胞的形态作用:根据加入C6胶质瘤细胞培养板中的纳米银浓度不同分为空白对照组,0.2mg/ml组,0.4mg/ml组,0.6mg/ml组,0.8mg/ml组,1.0mg/ml组,培养24h后,在光学显微镜下观察C6胶质瘤细胞的生长形态和生长密度。
  3.通过Annexin V和碘化丙啶(PI)双染检测手段观测C6细胞的细胞膜受损情况:根据加入C6胶质瘤细胞培养板中的纳米银浓度不同分为:0.025mg/ml组,0.05mg/ml组,0.1mg/ml组,0.2mg/ml组,空白对照组。培养24h后,加入FITC Annexin V和Propidium Iodide。在1h内进行双变量流式细胞仪检测荧光表达强度和分析数据。
  4.利用流式细胞仪检测纳米银对细胞周期的影响:根据加入C6胶质瘤细胞培养板中的纳米银浓度不同分为:0.2mg/ml组,0.4mg/ml组,0.6mg/ml组,0.8mg/ml组,1.0mg/ml组,空白对照组。培养24h后,用流式细胞仪进行检测。
  结果:
  1.不同浓度的纳米银处理C6胶质瘤细胞24h和48h后,细胞增殖率明显下降,随着纳米银浓度的上升和作用时间增加,C6胶质瘤细胞的生存活力逐渐下降,说明了纳米银的毒性作用具有浓度和时间依赖性。
  2.经过纳米银的作用后,C6胶质瘤细胞间的融合联系稀疏,没有聚集生长,细胞密度明显下降,呈散在分布生长,同时随着纳米银浓度的增加其细胞密度不断下降;细胞形态由长梭形,皱缩成了小圆形,细胞形态不明显,细胞内可见黑色颗粒,同时较少能观察到增殖的分裂细胞;且C6胶质瘤细胞十分容易从培养板底层脱落,悬浮细胞数量增加,其贴壁生长能力明显下降。
  3.使用20nm的不同浓度纳米银检测培养24h的情况发现空白对照组的凋亡率是6.95%,0.025mg/ml组的是19.08%,0.05mg/ml组的是33%,0.1mg/ml组的是59.18%,0.2mg/ml组的是27.22%。不同浓度纳米银对细胞凋亡的影响存在浓度依赖性,浓度越高,诱导产生的凋亡率越高。
  4.利用流式细胞仪检测细胞纳米银对细胞周期的影响:实验结果显示,处于S期的细胞数目增加的同时,G0/G1期的细胞数目减少,但不管在什么浓度的实验情况下,G2/M期的细胞数量相比基本没有太大的变化,受损的细胞大量阻滞主要在S期。
  结论:
  本研究通过不同浓度纳米银作用于C6胶质瘤细胞的形态作用观察,可知纳米银对C6胶质瘤细胞有毒性作用,同时纳米银对C6胶质瘤细胞的毒性具有浓度依赖性;随着纳米银浓度的上升和作用时间增加,C6胶质瘤细胞的生存活力逐渐下降,纳米银对C6胶质瘤细胞的抑制作用呈现出浓度依赖性和时间依赖性;不同浓度纳米银对细胞凋亡的影响存在浓度依赖性,浓度越高,诱导产生的凋亡率越高,研究表明纳米银诱导C6细胞阻滞主要发生在S期。
[博士论文] 韩松
外科学(神外) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面展开论述:
  第一章 胶质母细胞瘤之病毒因素在其发生、发展的作用及预后分析
  目的:探讨HCMV在GBM微环境中的表达以及潜在作用机理。
  方法:应用免疫荧光技术检测GBM中HCMV gB、gH的表达;应用免疫组织化学方法检测IDH1R132H突变、PTEN缺失以及p-PDGFRα、PD-L1、CD8+T细胞的表达。多因素分析这些指标对预后的影响。
  结果:HCMV gB阳性的表达率为48.5%(33/68);gH阳性的表达率为42.6%(29/68),两者同时表达为30.9%(21/68),两者任一阳性表达的为60.3%(41/68)。
  结论:GBM微环境中可见HCMV gB、gH的表达,但无证据表明其参与GBM生物学行为的调控。
  第一部分 HCMVgB、gH在胶质母细胞瘤微环境中的表达及预后分析
  目的:HCMV gB、gH在GBM中表达及对预后的影响。
  方法:应用免疫荧光技术对68例GBM检测HCMV gB、gH,其中原发GBM64例,复发GBM4例。同时应用免疫组织化学检测方法检测IDH1R132H突变、PTEN缺失等,并对临床相关数据(年龄、性别、KPS评分、发病周期、肿瘤部位等)收集、整理。最后,应用统计学进行多因素分析及预后评价。
  结果:在68例GBM中,HCMV gB阳性表达为48.5%(33/68例);gH阳性表达为42.6%(29/68例);两者任一阳性表达为60.3%。IDH1R132H突变为20.6%(14/68例)。
  结论:HCMV gB及gH在GBM中存在表达,但与预后无关。
  第二部分 胶质母细胞瘤微环境中HCMV gB与PDGFRα表达的相关性研究
  目的:探索GBM中HCMV gB表达与血小板源性生长因子受体α(Platelet derived growth factorreceptorα,PDGFRα)表达的相关性,进而评价是否HCMV gB通过诱导PDGFRα磷酸化,促进肿瘤的增殖。
  方法:应用免疫荧光技术,检测84例GBM组织标本中HCMV gB表达情况,同时,应用免疫组织化学染色方法检测磷酸化PDGFRα的表达。应用统计学分析HCMV gB表达与PDGFRα表达两者之间的相关性并对预后进行评价。
  结果:84例GBM标本中,HCMV gB阳性表达为40/84(47.62%);磷酸化PDGFRα阳性表达为47/84(55.95%)。统计分析未显示HCMV gB与磷酸化PDGFRα之间存在相关性(P=0.694)。
  结论:虽然体外实验证明gB与PDGFRα结合,使其磷酸化,激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路,进而激活Akt,促进肿瘤增殖,抑制凋亡。但在组织标本中检测,未显示HCMV gB表达与PDGFRα磷酸化之间存在相关性。
  第三部分 HCMVgB在胶质母细胞瘤中的表达与PD-L1及CD8+T细胞的关系
  目的:探索GBM中gB的表达,与程序死亡配体-1(Programmed death-ligand1,PD-L1)及CD8+T细胞的关系。
  方法:应用免疫荧光技术对91例GBM检测HCMV gB,其中原发GBM73例,复发GBM18例。应用免疫组织化学检测方法同时对部分标本检测PD-L1的表达以及对微环境中CD8+T细胞进行检测,进一步评价HCMV感染是否通过PD-L1表达上调以及CD8+T细胞数量的下调参与GBM微环境中的免疫调控。
  结果:在91例GBM中,HCMV gB阳性表达率为47.25%(43/91例);PD-L1阳性表达率为20.99%(17/81例);CD8+T细胞高表达为51.95%(40/77例)。
  结论:GBM中虽有HCMV gB表达,但与部分免疫指标无相关性,HCMV感染在肿瘤微环境中参与免疫调节作用还有待于进一步研究。
  第二章 胶质母细胞瘤微环境之肿瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞的免疫调节作用及预后分析
  目的:探讨GBM微环境中肿瘤相关的巨噬细胞/小胶质细胞(Tumor-associated macrophages/microglia,TAMs)的表型极化及分布特征,并进一步研究TAMs M2型极化所参与的免疫调节作用以及对预后影响。
  方法:1.以iNOS、CD206、CD68为标记物,应用免疫组化检测人脑胶质母细胞瘤组织标本中TAMs的表型极化及分布特征。体外利用Transwell,胶质瘤细胞系U87、U251与THP-1共培养,模拟肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用,应用流式细胞仪、QPCR检测共培养后THP-1的极化状态。2.免疫组化检测GBM组织标本中CD206、PD-L1、PD-1、CD8+T淋巴细胞、TGF-β2、STAT3、p-STAT3的表达,统计分析CD206与上述免疫指标之间的相关性。体外共培养实验、CGGA转录组测序数据进行验证、分析。3.从组织标本、CGGA数据库双层面分析TAMs中M2型极化与预后的关系。
  结果:GBM微环境中TAMs以表达CD206标记的M2型为主。M2型TAMs多分布于血管及坏死区域周围。胶质瘤细胞系与THP-1共培养后,THP-1主要呈M2型极化,但与预后无关。CGGA转录组测序数据分析显示:编码CD206的基因与编码PD-L1、PD-1的基因相关(P=0.026;P=0.00)。体外实验与CGGA数据库结果相一致。
  结论:GBM微环境中,TAMs以M2型为主,同时并存M1型TAMs,参与免疫抑制、免疫应答双重作用。微环境中M2型TAMs可能通过STAT3信号通路及PD-L1/PD-1参与GBM免疫微环境的构成,因此,靶向M2型TAMs可能成为免疫治疗的新方向。
  第一部分 GBM中TAMs极化以及表达分布
  目的:评价GBM微环境中TAMs各种表型极化及分布特征。
  方法:以iNOS、CD206、CD68为标记物,应用免疫组化检测组织标本中TAMs的表型极化及分布特征。体外利用Transwell,胶质瘤细胞系U87、U251与THP-1共培养,模拟肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用,应用流式细胞仪、QPCR检测共培养后THP-1的极化状态。
  结果:组织标本检测GBM微环境中TAMs以表达CD206标记的M2型为主。M2型TAMs多分布于血管及坏死区域周围。胶质瘤细胞系U87、U251与人外周血单核细胞系THP-1共培养,THP-1主要呈M2型极化。
  结论:GBM微环境中,TAMs以M2型极化为主,同时并存M1型TAMs,参与免疫抑制、免疫应答双重作用。
  第二部分 TAMs对GBM免疫抑制微环境的作用及机制
  目的:通过检测GBM中TAMs的表达,并对免疫检查点、CD8+T淋巴细胞、免疫相关的信号通路、免疫抑制因子进行检测,评价GBM微环境中,TAMs所参与的免疫调节作用及机制。
  方法:应用免疫组化检测GBM组织标本中CD206、PD-L1、PD-1、CD8+T淋巴细胞、TGF-β2及信号转导和转录激活因子3(Signal transducerand activatorof transcription factor3,STAT3)的表达,统计分析CD206与上述免疫指标的相关性。体外共培养实验、CGGA转录组测序数据进行验证、分析。
  结果:GBM微环境中,CD206阳性表达率为100.00%(93/93例),计数平均值为:31.12±19.22(5.00-115.33)。PD-L1阳性表达率为20.48%(17/83例);PD-1阳性表达率0.00%(0/88)。CD8+T细胞阳性表达率为100.00%(83/83例),计数平均值为:18.59±16.34(1.00-79.67)。TGF-β2阳性表达率为56.76%(21/37例)。
  结论:M2型TAMs明显多于CD8+T淋巴细胞,进一步证明GBM微环境的免疫抑制状态。M2型TAMs可能通过STAT3信号通路及PD-L1/PD-1参与GBM免疫微环境的构成,靶向M2型TAMs可能成为免疫治疗的新方向。
  第三部分 GBM免疫抑制微环境中TAMs表达与预后的关系
  目的:M2型TAMs在GBM发展中发挥重要作用,调节肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、血管生成、影响抗血管药物疗效以及参与免疫逃逸机制。本研究的目的是检测M2型TAMs在GBM肿瘤组织中表达,并深入探讨其预后价值。
  方法:采用免疫组化技术检测84例GBM组织中CD206表达情况,采用K-M曲线来评估其对患者无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)的影响。
  结果:GBM微环境中,M2型TAMs的表达未与年龄、性别、KPS、Ki-67增值指数相关(P=1.000;P=0.389;P=0.810;P=0.654)。CD206的表达与GBM患者PFS(P=0.316)和OS(P=0.912)不相关。CGGA转录组测序数据分析MRC1基因(编码CD206)表达量与预后的关系,结果显示MRC1基因表达未与临床预后相关(P=0.134)。
  结论:本研究从组织标本、CGGA数据库双层面分析TAMs中M2型极化与预后的关系,结果未显示与预后相关,由此可见,虽然TAMs中M2型极化在GBM发展中起到至关重要的作用,但并不是影响预后的关键因素。
[硕士论文] 潘斌才
病理学与病理生理学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  定量分析正常脑组织和不同级别脑胶质瘤细胞核的图像分析参数及增殖指标Ki-67、CyclinD1的表达分数参数,揭示不同级别胶质瘤细胞形态及密度的差异,筛选对胶质瘤分级诊断有价值的参数。通过线性判别函数建立多个胶质瘤分级诊断模型并比较各诊断模型的回代判别准确率,探讨这些参数在脑胶质瘤分级诊断方面的意义,为胶质瘤组织学分级提供客观的方法。
  方法:
  1.实验材料和分组:收集2010年-2015年广东同江医院手术切除大脑胶质瘤存档病理标本共80例,所有病例均为初治患者,术前未行辅助放、化疗。根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类的组织学分级标准进行病理学诊断,按照病例的构成,将研究对象分为对照组及病变组,对照组为正常脑组织,收集因脑外伤等手术送检正常脑组织10例。病变组包括WHOⅠ-Ⅳ级胶质瘤组,其中Ⅰ级胶质瘤15例,Ⅱ级20例,Ⅲ级25例,Ⅳ级20例;
  2.实验方法
  (1)采用光学显微镜、显微摄像仪和图像分析软件进行数据采集和图像分析。首先使用物镜测微尺对测试软件进行标定,再将HE切片置于光学显微镜40倍物镜下随机捕获观察视野,每例取1-4个视野经显微摄像系统采集图像并输入计算机。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分别测试正常脑组织及不同级别胶质瘤细胞核的形态参数。包括:细胞核面积、细胞核长轴与短轴、细胞核周长。计数40倍物镜下细胞的数目及图像视野的面积,计算图片中细胞面数密度和细胞核面积密度。
  (2)采用免疫组织化学方法分别检测WHOⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤及正常脑组织中增殖指标Ki-67、CyclinD1的表达情况。所有标本经常规脱水、包埋、切片、脱腊后,采用免疫组化方法检测Ki-67、CyclinD1。以胶质瘤细胞胞核出现棕黄色颗粒为阳性,结果观察采用半定量12分法,测试并记录表达分数。所有标本免疫组化染色时均设立阳性对照和阴性对照。免疫组化染色结果由两位有经验的临床病理医师在未知诊断结果的情况下独立阅片判断。
  (3)采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,连续型变量的结果以均数((X))、标准差(SD)、最大值(Max)、最小值(Min),所有测试数值以均数±标准差((X)±SD)表示。对不同组间的测试结果进行多组独立样本的秩和检验;计数资料的比较采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义。对不同模型组别间进行逐步判别分析并分别建立Fisher线性判别函数,绘制判别函数分类图并计算各模型组的回代判别准确率。
  结果:
  1.不同级别胶质瘤细胞核形态参数的差异
  Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤细胞核的形态参数显示了核的面积、长轴、短轴和周长整体比较差异有统计学意义,Ⅳ级胶质瘤的上述形态参数平均值均为所有级别中最大,而其标准差为所有级别胶质瘤中最小;WHOⅠ级胶质瘤的上述形态参数(除长轴)平均值均为所有级别胶质瘤中最小,Ⅲ级胶质瘤的上述形态参数标准差为所有胶质瘤中最大。低级别胶质瘤(WHOⅠ-Ⅱ级)不论细胞核面积还是周长均明显低于高级别胶质瘤(WHOⅢ-Ⅳ级),除WHOⅠ级和Ⅱ级瘤细胞核长轴无统计学显著性差异外,其余各组两两比较均具有统计学意义(P值均小于0.05),提示低级别胶质瘤具有较小的细胞核,这是鉴别不同组织学级别的一个重要指标。另一特点是胶质瘤细胞核形态参数的变异程度有所不同,低级别胶质瘤核参数变异度(标准差)较小,高级别肿瘤,特别是WHOⅢ级肿瘤变异度较大,提示高级别肿瘤核的大小极不均一,这可能是瘤细胞多形性导致的因素。
  2.不同级别胶质瘤细胞密度参数的差异
  尽管不同级别胶质瘤的细胞面数密度存在总体显著性差异(P<0.001),但WHOⅡ级与Ⅲ级之间,以及高级别胶质瘤(Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤)之间却均无组间差异,提示WHOⅠ级胶质瘤的细胞面数密度最小,但Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤细胞密度并无明显变化。不同级别胶质瘤细胞的核面积密度也存在总体显著性差异P<0.001),且各级别之间也存在显著性差异,提示尽管细胞面数密度差别不大,但细胞核面积密度可作为鉴别不同组织级别的胶质瘤的重要图像分析参数。
  3.正常脑组织与胶质瘤细胞核形态参数及密度参数的差异
  正常脑组织与WHOⅠ级胶质瘤细胞核的参数比较中,除核的长轴有显著的差异(P<0.01),其余在核的面积、短轴及周长方面,无显著性的差异。而正常脑组织与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤在细胞核的面积、长轴、短轴及周长等参数的比较中,显示明显的统计学差异(P<0.01),提示Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤细胞核比正常脑组织细胞核显著增大;在细胞面数密度及核面积密度方面,正常脑组织与Ⅰ级胶质瘤比较无明显差异,而与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤存在显著的统计学差异。提示正常脑组织细胞核形态及单位面积中的细胞密度与Ⅰ级胶质瘤相近,而与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤差异性较大。
  4.Ki-67在正常脑组织及不同级别胶质瘤中的表达情况
  Ki-67在10例正常脑组织中均不表达;而Ki-67在80例胶质瘤的阳性率为67.50%(54/80),远高于正常脑组织的表达(P<0.01)。Ki-67在不同级别胶质瘤的表达情况不一致,Ki-67在Ⅳ级胶质瘤的表达分数最高,在Ⅰ级胶质瘤的表达分数最低;Ki-67的表达分数与Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的Spearman等级相关系数为0.703(P<0.001),显示随着Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤级别的升高,Ki-67表达的指数分数也逐渐升高。在分组的两两比较中,低级别胶质瘤(Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤)与高级别胶质瘤(Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤)中Ki-67的表达差异有显著的统计学意义(P<0.01);Ki-67在Ⅰ级与Ⅱ级胶质瘤中的表达有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),与在Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤中的表达类似。在临床病理参数中,Ki-67在不同年龄的表达差异有统计学意义(P<0.05),在不同性别、肿瘤大小及部位中表达差异无统计学意义(P>0.05);
  5.CyclinD1在正常脑组织及不同级别胶质瘤中的表达情况
  CyclinD1在正常脑组织及不同级别的胶质瘤中的表达不一致,CyclinD1在正常脑组织中仅有1例表达阳性(1/10),而在胶质瘤中的表达阳性率高达83.75%(67/80),具有显著统计学差异。CyclinD1在Ⅰ级胶质瘤的表达分数最低,在Ⅳ级胶质瘤的表达分数最高;CyclinD1的表达分数与Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的Spearman等级相关系数为0.616(P<0.001),显示随着胶质瘤级别的升高,CyclinD1的表达率逐渐升高,染色的强度逐渐增强,而且在表达率的分组两两比较中,Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的差异均有统计学意义(P<0.05)。CyclinD1的表达在不同性别、年龄、肿瘤大小及部位中差异无统计学意义(P>0.05)。
  6.胶质瘤中Ki-67、CyclinD1表达的相关性分析
  Pearson相关检验显示Ki-67、CyclinD1两种蛋白在胶质瘤中的表达存在显著相关,提示两者之间呈显著正相关关系(R=0.816,x2=19.218,P<0.01)。
  7.基于图像分析参数及增殖指标表达分数参数的多种胶质瘤分级诊断模型
  (1)以正常脑组织、不同级别胶质瘤的形态参数及密度参数为基础参数,加入Ki-67及CyclinD1的表达分数进行Fisher线性判别分析,通过建立线性判别函数获得正常脑组织与四级胶质瘤分类中四级胶质瘤图像分析诊断模型、四级胶质瘤图像分析+Ki-67诊断模型、四级胶质瘤图像分析+CyclinD1诊断模型及四级胶质瘤图像分析+Ki-67、CyclinD1诊断模型四个模型,计算回代判别准确率分别为76.7%、75.6%、78.9%及78.9%。将各诊断模型回代判别总准确率进行分组两两比较,结果显示均无统计学差异(P值均大于0.05)。
  (2)整合低级别胶质瘤(Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤)及高级别胶质瘤(Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤)的图像分析参数(形态参数及密度参数),加上正常脑组织的图像分析参数(形态参数及密度参数)进行Fisher线性判别分析,通过建立线性判别函数获得高低级别胶质瘤图像分析诊断模型,计算回代判别准确率为88.9%。
  结论:
  1.胶质瘤细胞核的图像分析中的面积、长轴、短轴及周长等形态参数和单位面积中的细胞数量及核面积密度可作为胶质瘤组织学定量分级诊断的重要指标参数,对脑胶质瘤诊断分级具有重要意义。
  2.增殖指标Ki-67及CyclinD1表达分数随着胶质瘤级别的增高而增高,两者联合应用在胶质瘤的病理分级诊断及预后分析具有较强的客观性及实用价值。
  3.基于图像分析中的核面积、核长轴、核短轴和单位面积中的细胞数量及细胞核面积、Ki-67及CyclinD1表达分数建立胶质瘤分级诊断模型,回代判别准确率相近(两两比较无统计学差异),可达78.9%。
  4.基于胶质瘤细胞的核面积、核长轴、核短轴及核周长和单位面积的细胞数量及核面积密度,建立高低级别胶质瘤分级诊断模型,准确率可达88.9%。
[硕士论文] 李超
外科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨Ki-67、EMA、Vimentin和S-100在脑膜瘤中的表达和脑膜瘤复发的相关因素。
  方法:收集2007年1月-2017年12月本院神经外科手术切除,经病理确诊的脑膜瘤84例。采用免疫组化方法检测84例脑膜瘤中Ki-67、EMA、Vimentin以及S-100表达,分析各项免疫组化指标与临床病理学特征之间的相关性以及复发性脑膜瘤的相关因素。
  结果:1.Ki-67、EMA、Vimentin和S-100在84例脑膜瘤中均有表达,Ki-67-LI<10%表达率为59%、10%≤Ki-67LI<20%为31%、Ki-67LI≥20%为10%; EMA、Vimentin和S-100阳性率分别为62%、79%、12%。
  2.Ki-67LI在脑膜瘤的大小、形状、瘤周水肿、钙化和WHO分级中,差异具有统计学意义(P<0.05),在肿瘤较大(≥4.5cm),形状呈分叶、蕈伞状,存在水肿,无钙化及WHO分级高者,其Ki-67LI高(P<0.05)。
  3.EMA阳性率在脑膜瘤WHO分级和不同形状中差异具有统计学意义(P<0.05);脑膜瘤的WHO分级越低(I、II>III)其阳性率越高,形状呈圆形其阳性率高于蕈伞、分叶状(P<O.05)。
  4.Vimentin阳性率在脑膜瘤WHO分级和不同形状中差异具有统计学意义(P<0.05);WHO分级越高(III、II>I)和呈现分叶、蕈伞状其阳性率高(P<0.05)。
  5.S-100的阳性率与脑膜瘤的临床病理学特征之间无统计学差异,仅作为鉴别诊断指标。
  6.Ki-67LI≥10%与Vimentin之间存在正相关性(r=0.353,P<0.05);EMA与Vimentin表达间呈正相关性(r=0.427,P<0.05);Ki-67LI≥10%与EMA之间存在负相关性(r=-0.397,P<0.05)。
  7.在脑膜瘤的临床病理特征中,MRI形态、大小、Simpson分级、年龄及WHO分级与其复发存在相关性,差异具有统计学意义(P<0.05)。脑膜瘤表现为直径较大(≥4.5cm),形态呈蕈伞、分叶状,WHO分级越高(Ⅲ、Ⅱ>Ⅰ),患者年龄≥60岁及Simpson分级高(Ⅲ、Ⅳ>0、Ⅰ、Ⅱ)其复发率较高(P<0.05)。
  8.Ki-67LI≥10%在复发性脑膜瘤中差异具有统计学意义(P<0.05),Ki-67LI≥10%的患者其术后复发率高(P<0.05)。
  结论:1.Ki-67、EMA和Vimentin的表达与脑膜瘤病理分级密切相关并协同参与脑膜瘤的发展过程,是预测脑膜瘤恶性生物学行为的重要参考指标,可指导脑膜瘤基因、免疫治疗及判断预后。
  2.在脑膜瘤的临床病理特征中年龄≥60岁,肿瘤直径≥4.5cm,呈分叶及蕈伞状,WHO分级,Simpson分级和Ki-67LI≥10%可作为评估脑膜瘤复发的重要参考因素,存在以上因素的患者可配合放疗并缩短复查周期。
[硕士论文] 曲玥
神经病学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:神经胶质瘤是最常见的神经外胚层来源的颅内恶性肿瘤。目前尽管采用手术、放疗和化疗在内的综合治疗,胶质瘤患者仍面临着低生存率和高复发率。因此,迫切需要找到一种新的有效安全的治疗手段。多篇文献报道,Robo1蛋白在胶质瘤中呈过表达,其表达水平较正常脑组织中明显上调,这使其适合作为胶质瘤的特异性靶点。近年来,CD19-CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤患者方面取得了巨大的进步,为肿瘤患者带来了希望,但在治疗实体瘤方面因效果差、副作用多仍不乐观。NK细胞是固有免疫系统的效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥其强大的抗肿瘤作用,并且不受MHC限制性。然而,许多肿瘤细胞常常通过高表达MHCI类分子、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力。所以,需要引入CAR修饰NK细胞并引导NK细胞对肿瘤细胞的靶向性以达到靶向抗肿瘤的目的。据此,本试验构建了Robo1-CAR-NK-92细胞并比较其与NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果。为了进一步优化Robo1-CAR-NK-92细胞的培养条件,本试验测试了用不同组合的IL-15,IL-21和地塞米松分别处理NK-92细胞及Robo1-CAR-NK-92细胞3天对二者的增殖,活性及杀伤能力的影响。
  目的:
  研究Robo1-CAR-NK-92细胞与NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果,并测试在培养基中添加IL-15,IL-21和地塞米松对NK-92细胞及Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖,活性及杀伤的影响以进一步优化其培养条件。
  方法:
  1.用慢病毒转染的方法构建Robo1-CAR-NK-92细胞后分选扩增,并用RT-PCR及流式细胞术检测Robo1-CAR-NK-92细胞的转染效果。
  2.用流式细胞术检测Robo1在AsPC-1,U-87 MG和U251细胞上的表达。
  3.用体外杀伤试验和活细胞成像的方法检测在不同的效靶比下Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞对AsPC-1,U-87 MG及U251细胞的体外杀伤效果。
  4.用流式多重微珠阵列法检测Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时杀伤U-87 MG细胞过程中分泌的细胞因子含量。
  5.用台盼蓝染色和活细胞自动计数仪经25ng/mL的IL-15,25ng/mL的IL-21,25ng/mL的IL-15+25ng/mL的IL-21,25ng/mL的IL-15+50nM的地塞米松,25ng/mL的IL-21+50nM的地塞米松,25ng/mL的IL-15+25ng/mL的IL-21+50nM的地塞米松分别处理3天的Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞的计数、活性率。
  6.用测定体外杀伤率和活细胞成像的方法检测经上述处理3天的Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时对U-87 MG细胞的体外杀伤效果。
  结果:
  1.构建Robo1-CAR-NK-92细胞并经分选扩增后RT-PCR检测可见其阳性表达,流式细胞术检测其阳性率为98.89%。
  2.流式细胞术检测结果显示Robo1在AsPC-1,U-87 MG及U251细胞上表达的阳性率分别为1.89%,88.14%,98.75%。
  3.在不同的效靶比下,Robo1-CAR-NK-92细胞对AsPC-1细胞的杀伤率与NK-92细胞相比未见显著差别(P>0.5)。在不同的效靶比下,Robo1-CAR-NK-92细胞对U-87 MG,U251细胞的杀伤率明显高于NK-92细胞(P<0.5)。
  4.Robo1-CAR-NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时杀伤U-87 MG细胞过程中分泌的IL-6,IL-10,TNF-α和IFN-γ均较NK-92细胞明显增高(P<0.5)。
  5.与对照的NK-92及Robo1-CAR-NK-92细胞相比,白介素对NK-92细胞的增殖和杀伤无明显影响(P>0.5)。IL-15增强Robo1-CAR-NK-92的增殖和活性(P<0.5)而IL-21则起相反作用(P<0.5),二者联用对Robo1-CAR-NK-92细胞能抑制Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖(P<0.5),但对其活性无明显影响(P>0.5)。IL-21和IL15联合IL-21增强NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力(P<0.5),而IL-15的处理对二者的杀伤能力无明显影响(P>0.5)。
  6.与仅用白介素处理的NK-92及Robo1-CAR-NK-92细胞相比,地塞米松联合白介素增强NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖和活性(P<0.5),但抑制NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力(P<0.5),除IL-15和地塞米松不影响Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力外(P>0.5)。
  结论:
  1.Robo1-CAR-NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞具有强大的靶向杀伤能力。
  2.IL-15联用地塞米松处理Robo1-CAR-NK-92细胞3天是在本次实验条件下体外增殖Robo1-CAR-NK-92细胞的最适的培养方案。
[硕士论文] 林佳君
影像医学与核医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  根据最新版的WHO中枢神经系统肿瘤分类,间变性黄色星形细胞瘤(anaplastic pleomorphic xanthoastrocytoma,APXA)作为一种独立的星形细胞瘤亚型,其诊断标准定义为每10个高倍镜视野下出现大于等于5个核分裂像.与经典多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma,PXA)相比,APXA具有侵袭性和相对较差的预后.本研究旨在分析PXA和APXA的多模态MR影像特征,评估多模态MR检查在鉴别PXA和APXA中的临床应用价值.
  方法:
  回顾性分析2007年12月至2017年12月期间在本院经手术病理证实的11例PXA患者和10例APXA患者的影像资料.所有患者术前均行常规磁共振平扫和增强检查,其中10例PXA和9例APXA行弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查,4例PXA和5例APXA行动态磁敏感对比增强灌注加权成像(dynamic susceptibility contrast-perfusion weighted imaging,DSC-PWI)检查.分析和评估PXA组与APXA组的常规MR影像学特征(包括肿瘤位置、瘤体大小、是否囊变、强化类型、瘤周水肿程度等).对行DWI和DSC-PWI的肿瘤,分别对肿瘤实性强化区域及对侧正常丘脑区域进行测量,得到相对最小ADC值(relative minimum apparent diffusion coefficients,rADCmin)比值和相对最大CBV值(relative cerebral blood volume,rCBVmax)比值.两组患者间瘤体直径、瘤周水肿、rADCmin和rCBVmax比值采用Mann-Whitney U检验进行比较,两组间年龄、性别、肿瘤位置、瘤内是否囊变和实性成分强化特征采用卡方检验进行比较,以P<0.05认为差异具有统计学意义.以组织病理结果为金标准,应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)计算rADCmin和rCBVmax比值鉴别诊断PXA与APXA的诊断效能,联合约登指数得出鉴别诊断PXA与APXA的最佳诊断阈值及相应的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值.
  结果:
  (1)APXA组肿瘤最大径为4.68±0.53cm,明显大于PXA组(3.15±1.05cm),差异有统计学意义(P=0.002).9例(9/10,90%)APXA呈不均匀强化,而仅3例PXA(3/11,27.2%)呈不均匀强化,强化方式在组间差异有统计学意义(P=0.004).APXA组的瘤周水肿最大径为2.34±0.90cm,明显大于PXA组(1.00±0.96cm),差异有统计学意义(P=0.007).两组间的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤囊变差异无统计学意义(P>0.05).(2)APXA组的rADCmin比值(0.98±0.16)明显低于PXA组(1.46±0.44),而APXA组的rCBVmax比值(2.64±0.78)明显高于PXA组(1.69±0.35),差异均具有统计学意义(P<0.05).(3)应用ROC统计分析,rADCmin和rCBVmax比值的曲线下面积分别为0.944和0.950,选择最大的约登指数作为鉴别诊断PXA与APXA的最佳诊断临界点时,rADCmin比值最佳阈值为1.02,其诊断APXA的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值各为77.78%、90%、84.21%、87.50%、81.82%;rCBVmax比值最佳阈值为2.20,其诊断APXA的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值各为80%、100%、88.89%、100%、80%.
  结论:
  与PXA相比,APXA多表现为瘤体更大、不均匀性强化、明显瘤周水肿、肿瘤实性部分弥散受限(低rADCmin比值)、实性部分灌注增高(高rCBVmax比值)的影像学特征.常规MR、DWI和DSC-PWI成像技术有助于描述PXA和APXA的影像特征及术前准确鉴别两者.
[博士论文] 尹腾昆
外科学(神经外科) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探索应用三维影像融合技术重建颅内静脉系统的方法及其在脑膜瘤切除术中的应用价值。并应用此方法结合MRV资料分析上矢状窦旁脑膜瘤(parasagittal meningioma,PSM)患者中,瘤周皮质静脉和大脑镰内及镰旁静脉侧支循环建立的方式及临床意义,以及不同类型的瘤周水肿与颅内静脉循环代偿状态及神经功能预后之间的关系。
  方法:选取2015年9月至2017年12月我院神经外科收治的PSM患者。所有患者术前均接受常规MRI和CE-MRV检查,并应用神经导航仪中的手术计划系统重建3D静脉-肿瘤融合模型,依此对颅内静脉循环做围术期评估。皮质静脉分为3种类型:(a)单向吻合型;(b)瘤-端吻合型;(c)端-端吻合型。大脑镰旁静脉侧支循环建立方式分为4种类型:(a)大脑内侧皮质静脉移位或增生;(b)侧支静脉连接SSS闭塞段的前后两端;(c)侧支静脉连接SSS和大脑深静脉系统;(d)镰状窦再通或继发性镰状窦形成。分别对皮质静脉和大脑镰旁侧支静脉的类型与肿瘤大小、位置及SSS闭塞程度间的关系进行分析。瘤周水肿分为2种类型:(a)与脑-肿瘤界面弱相关型水肿(PIRE);(b)与脑-肿瘤界面强相关型水肿(SIRE)。根据SSS的闭塞程度、皮质静脉的受累数量、以及静脉侧支循环建立程度对颅内静脉系统的代偿状态进行评估。分析瘤周水肿和静脉代偿状态的关系,并评价其对患者术后短期(术后7天内)和远期(术后3-6个月)神经功能预后的影响。
  结果:应用神经导航仪建立的3D静脉融合模型显示效果良好,手术中所见肿瘤与周围静脉窦、静脉血管的关系与术前评估完全吻合。瘤周皮质静脉损伤后,术后并发症的发生率由高到低依次是60%(a型)、16.7%(c型)、0%(b型)。23.8%的患者术后存在静脉相关性肿瘤残留(相当于SimpsonⅢ级切除)。b和c型皮质静脉的数量和肿瘤体积呈正相关关系。大脑镰旁静脉代偿通路的发生率分别为35.6%(a型)、4.4%(b型)、11.1%(c型)、15.6%(d型)。b、c和d型镰旁静脉通路只见于SSS重度闭塞的患者,c和d型静脉通路只存在于SSS中部和后部重度闭塞的患者。PIRE组患者中出现静脉失代偿状态的比例为75%,高于SIRE组的38.5%和无水肿组的22.2%。多因素Logistic回归分析表明静脉循环失代偿状态与PIRE的发生之间的关系有明确的统计学意义(P=0.029)。PIRE组术后短期神经功能预后评分最低,而SIRE组患者术后远期评估中,完全独立生存状态的改善率最高(23%)。
  结论:应用多模态三维影像融合技术建立的3D静脉融合模型,能准确评估颅内静脉与肿瘤的相对关系,使术者对肿瘤及周围静脉的影像资料从三维角度有更深入的了解。手术前静脉循环评估的重点是分析静脉窦的通畅程度、瘤周皮质静脉和镰旁静脉通路的类型和分布,其中要特别注意端-端吻合型静脉和继发性镰状窦的评估。在争取肿瘤完全切除的同时,应针对性地处理瘤周皮质静脉,尽量避免重要静脉的医源性损伤,减少术后静脉源性并发症。PIRE的形成和静脉循环失代偿状态存在伴随关系,并预示着术后短期神经功能预后较差。术前常规应用MRV和3D静脉模型对PSM患者瘤周皮质静脉和大脑镰内及镰旁静脉通路的准确评估对制订合适的手术策略有重要指导作用。
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