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[博士论文] 王小滔
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:染色质三维结构在基因表达调控、细胞发育以及疾病发生过程中起着重要作用。在过去,人们主要依赖显微技术来研究染色质的空间组织模式。近年来,染色质构象捕获技术,特别是能够在全基因组范围捕获染色质交互的Hi-C技术,极大地提高了研究染色质结构的精度和通量,推动了人们对染色质层次化结构的认识。染色质拓扑相关结构域(topologically associating domains,简称TADs)是染色质高阶结构中重要的结构单元,它广泛存在于各个物种中,其位置在细胞发育甚至进化中都是非常保守的。在功能上,TADs限定了增强子与启动子的空间交互范围,是基因表达、DNA重组、基因组复制调控的基本单元。传统上,人们对TADs内部结构认识较少,本文深入研究了TADs内部染色质交互的分布特征,分别提出了TADs总体结构度量指标和层次化结构域识别算法,用于研究TADs内部结构特征和功能。
  首先,本文分析了TADs内部显著性交互的聚集模式,定义了一种能够衡量TADs内部总体结构特征的量化指标—聚集偏好指数(aggregation preference,简称AP)。接着,本文使用AP指数对TADs进行结构注释,将TADs内部结构与功能相关联。具体地讲,我们分析了来自人类和小鼠9个细胞系的11组传统Hi-C和原位Hi-C数据,发现AP值较为均匀地分布在0-1之间,说明TADs具有较强的结构异质性。通过整合DNA序列特征、表观修饰以及基因表达数据,我们发现AP值与染色质活跃状态呈现出显著的正相关关系。最后,细胞系间的比较结果表明,不同细胞系中TADs内部结构的重排与基因表达调控的改变密切相关。
  其次,TADs并不是单一层次的结构,它们常常是以一种层次化的形式组织起来的,因此开发层次化结构域的识别算法对分析不同层次结构域在染色质结构组织和功能上的差异具有重要意义。针对这个问题,本文综合利用染色质局部和远程交互,在传统定义的基础上进一步将TADs精细定义为“在指定目标函数下能够最佳分割染色质内交互的结构域集”,并递归地将其内层结构域定义为“在指定目标函数下最佳分割上一层次结构域内染色质交互的结构域集”。通过新的TADs定义,我们开发了HiTAD算法来识别层次化结构域,并使用来自人类和小鼠7个细胞系的传统Hi-C和原位Hi-C数据从多个角度对其进行了交叉验证。计算结果表明,HiTAD在敏感性、可重复性以及细胞系间的保守性方面均优于现有软件Arrowhead和TADtree;HiTAD识别的不同层次结构域均表现出与传统单一层次TADs类似的属性,如“边界绝缘性”、“边界信号富集”以及“转录因子CTCF结合DNA序列的方向性”等。为方便不同结构域集合之间的比较,我们开发了层次化结构域比对算法,并利用此算法定义了多种结构域边界以及结构域变化模式。以边界为基础,我们研究了不同层次结构域在关联染色质区室(compartments)和基因组复制上的差异,发现TADs而非Sub-TADs是染色质区室和基因组复制调控的基本单元;以结构域为基础,我们发现TADs和Sub-TADs在基因调控中亦扮演着截然不同的角色。
  综上所述,本文提出了能够反映TADs内染色质交互聚集程度的AP指数和识别TADs内部层次化结构域的HiTAD算法,进而从不同角度研究了TADs内部结构和生物功能之间的联系。
[硕士论文] 李雅梅
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:三羧酸循环(TCA cycle)是发生在线粒体中的重要代谢途径。它是糖类,脂类和氨基酸的共同代谢途径,也是糖类,脂类和氨基酸代谢的联系枢纽。三羧酸循环是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统。在这一过程中乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成一分子的柠檬酸,然后柠檬酸经过四次脱氢,两次脱羧重新生成草酰乙酸。三羧酸循环中产生的NADH和FADH2会进入电子传递链产生大量的ATP。目前越来越多的研究也表明三羧酸循环与代谢性疾病以及癌症的发生发展息息相关。
  线粒体非折叠蛋白反应(UPRmt)是线粒体自我保护的一种防御手段。当线粒体中错误折叠蛋白异常累积的时候,线粒体就会启动UPRmt将那些错误折叠的蛋白降解,通过将信号传递给细胞核内调控线粒体热休克蛋白,蛋白酶等保护基因的转录水平从而维持线粒体蛋白的平衡。UPRmt作为新发现的细胞内应激机制,与衰老、先天性免疫、神经退行性疾病、二型糖尿病、癌症等疾病的发生发展密切相关。
  秀丽线虫作为模式生物具有生长周期短、遗传背景清楚、操作简单方便等优点。线粒体非折叠蛋白反应的信号通路虽然首次发现是在哺乳动物细胞中发现的,但是其分子机制的研究却是在秀丽线虫中展开的,因此我们用秀丽线虫作为实验对象进行研究。
  线粒体是细胞的能量工厂,它与脂肪酸的合成与β氧化都密切相关。在本研究中,我们首先通过RNAi的方法筛选出三羧酸循环中aco-2或者idha-1被干扰后,能够专一性的在线虫的生殖腺中产生UPRmt,而且通过尼罗红染色结果证明当aco-2或者idha-1被干扰后会导致线虫中脂肪的积累。在秀丽线虫中aco-2编码的是顺乌头酸酶,在三羧酸循环中催化柠檬酸到异柠檬酸这一过程。idha-1编码的是异柠檬酸脱氢酶的α亚基,在三羧酸循环中催化异柠檬酸到α-酮戊二酸这一步。同时我们也观察到当这两个基因被干扰后其后代数目显著减少,我们猜测aco-2或者idha-1被干扰后导致的脂肪积累可能与生殖腺信号通路有关,因此将生殖腺信号通路中有关基因的突变体养存aco-2或者idha-1干扰菌上,尼罗红固定染色结果表明pha-4(zu225)能够恢复aco-2或者idha-1被干扰后的脂肪积累表型。因为aco-2和idha-1是三羧酸循环中的重要基因,我们猜测当这两个基因被干扰后柠檬酸的含量会升高。HPLC结果证明当aco-2或者idha-1被干扰后秀丽线虫体中柠檬酸含量会升高,而且外源补充柠檬酸也会引起脂肪的积累以及产生UPRmt。而柠檬酸通过柠檬酸裂解酶产生乙酰CoA参与到脂肪酸的合成。ATFS-1,DVE-1和UBL-5作为UPRmt中重要的转录因子,我们发现这三个基因的突变体atfs-1(tm4525),dve-1(tm4803)以及ubl-5(ok3389)也能够抑制aco-2或者idha-1被干扰后引起的脂肪积累。
  本文主要是想探究三羧酸循环如何影响脂肪代谢以及线粒体非折叠蛋白反应,并且试图解答线粒体非折叠蛋白反应与脂肪储存之间的关系。
[硕士论文] 陈欣欣
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:由于抗生素的滥用,病原菌的耐药性已经变得越来越强。因此,迫切地需要发展一个更加有效且合理的方式来解决细菌强耐药性的问题。在寻找更加有效的治疗方式时,许多精力都放在了细胞壁裂解酶的研究中。细胞壁裂解酶能够破坏细菌的细胞结构,进而杀死被侵染的细菌,得益于该酶对耐药菌株具有高效能活性,而且导致新型耐药表型细菌出现的概率较低,因此细胞壁裂解酶成为抗菌药物研究的合适候选者。
  面对海量的蛋白数据,提供一个计算方式来准确且有效地预测细胞壁裂解酶是很有必要的。本工作致力于开发一个预测器来识别细胞壁裂解酶。为了这个目的,在本工作中,首先通过搜寻 UniProt数据库收集了一系列客观且严格的蛋白序列。最终,68条细胞壁裂解酶蛋白和307条非裂解酶蛋白序列被选中并构成基准数据集。随后,我们使用改进的伪氨基酸组分来表征蛋白样本序列,不仅包括序列的 g-间隔二肽组分,还包括两个残基之间理化性质的相关性。一种基于方差分析的特征筛选技术被用来获取含有63个特征的最优特征子集,最终支持向量机算法被用来执行预测。Jackknife交叉验证获得了84.82%的最优的平均精度,且此时全局精度为90.13%、auROC为0.926。为了便利其他研究者,我们开发了一个免费的预测器 Lypred,其网址为 http://lin.uestc.edu.cn/server/Lypred。我们确信 Lypred将成为裂解酶研究和抗菌药物研发的有力工具。
  根据物种来源的不同,细胞壁裂解酶又可分为内溶素和自溶素两种。我们将Lypred中的68条细胞壁裂解酶作为数据集构建模型来进一步辨识它们,其中的27条内溶素蛋白作为正样本,余下的41条自溶素蛋白序列组成为负样本集。我们用三肽特征来提取蛋白序列的信息,为了剔除冗余的、嘈杂的特征,使用二项分布来进行特征筛选。最终通过使用对分类最有贡献力的44个特征,支持向量机被用来训练了预测模型。所构建模型的全局精度高达94.12%,auROC也达到了0.986,这证明了所构建模型的强健。
[博士论文] 江莹
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癌症独特的能量代谢方式是其恶性表型的标志性特征之一,发展针对癌症能量代谢的治疗手段将是实现癌症有效治疗的新方向。有多篇报道指出细胞小窝结构的成分蛋白:小窝蛋白1(caveolin-1, Cav-1)与细胞能量代谢密切相关,同时小窝结构也是细胞与外界环境进行信息交换的桥梁,其运动性是其功能发挥的基础。本文通过研究Cav-1/小窝结构内吞及运动性信号途径,以及Cav-1和线粒体之间的相互作用,揭示Cav-1在细胞能量代谢中所扮演的角色,以及Cav-1运动性的关键作用,取得的主要研究成果如下:
  1. RalA调节Cav-1/小窝依赖的内吞过程:(a)通过考察牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)诱导的内吞过程中RalA活化状态的变化,证明内吞过程可触发RalA活化。(b)通过检测RalA持续活化突变体和显性负突变体对内吞以及RalA,Cav-1结合水平的影响,说明内吞过程的实现以及RalA与Cav-1的结合都需要RalA活化。(c)利用siRNA的方法抑制RalA的表达,同时转染质粒恢复其表达,对比抑制前后以及恢复表达后内吞水平的变化,证明RalA是Cav-1/小窝内吞的重要调节分子。
  2. RalA通过活化下游效应分子PLD(Phospholipase D)调节Cav-1/小窝依赖的内吞:(a)通过研究PLD非特异性抑制剂对内吞的影响,证实PLD活化对内吞的促进作用。(b)采用PLD1和PLD2特异性抑制剂确定只有PLD2是内吞的调节分子。(c)PLD2抑制剂和突变体对Cav-1-RFP运动性的抑制再次证实PLD2在此过程中的重要作用。(d)通过PA感应器GFP-PASS(phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity)观察内吞过程中PLD2下游产物PA(phosphatidic acid)在小窝生成并由此促进Cav-1/小窝依赖的内吞。
  3. Cav-1抑制引起线粒体形态学的改变:(a)采用siRNA的手段抑制Cav-1的表达,同时观察线粒体形态,发现线粒体呈现片段化和增长的双重改变。(b)利用PA-GFP(photoactive-GFP)在线粒体的扩散程度量化线粒体的基质融合程度,此结果亦可代表线粒体的动态水平。对比Cav-1抑制前后,发现抑制后细胞的线粒体有更高的动态水平。(c)通过FRAP(fluorescence recovery after photobleaching)方法测试基质蛋白的运动速率,进一步强化Cav-1抑制提升线粒体动态水平的结论。
  4. Cav-1通过抑制Mfn2和Drp1的线粒体定位改变线粒体动态:(a)线粒体组分分离发现抑制Cav-1,Mfn2和Drp1在线粒体的表达量增加。(b)通过免疫共沉淀和FRET(fluorescence resonance energy transfer)的方法证实Cav-1分别与Mfn2和Drp1二者结合。(c)免疫荧光染色同样检测到抑制Cav-1时Drp1在线粒体的定位增加。(d)引入ER和线粒体的人工链接分子OMM-ER-mRFP加强ER和线粒体交互,发现Mfn2在Cav-1抑制的情况下发生ER回流,说明Cav-1可能通过调节ER和线粒体交互来调整Mfn2在二者的表达水平。
  5. Cav-1的抑制是线粒体自噬的诱因:(a)对比Cav-1抑制前后线粒体比量的变化发现Cav-1抑制导致线粒体比量减少。(b)通过对比细胞自噬标志分子表达量,发现Cav-1抑制细胞的自噬水平升高。(c)引入mt-Keima检测线粒体自噬,证实Cav-1的低表达可诱导线粒体自噬的发生。
  6. RalA通过Cav-1影响线粒体功能和细胞能量代谢:(a)采用siRNA的手段实现RalA和Cav-1的单独和共同抑制。(b)检测MMP,ATP,H2O2和糖酵解产物L-lactate的生成,发现RalA和Cav-1抑制的细胞中出现MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加,并且RalA和Cav-1共同抑制时与单独抑制Cav-1结果无异,证明RalA的作用是借Cav-1发挥的。
  总之,本论文通过对Cav-1/小窝内吞途径的分析确立了RalA在此过程中的重要调节作用,并证实该作用是通过其下游效应分子PLD催化PA在小窝生成而实现的。通过研究Cav-1与线粒体的关系,发现Cav-1抑制Mfn2和Drp1的线粒体表达进而调节线粒体动态水平和线粒体自噬。最后将RalA和Cav-1联系起来,说明Cav-1的表达水平和运动性均能对线粒体功能和细胞能量代谢带来重大影响。
[硕士论文] 梁敏
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:轴周蛋白(Periaxin)是成髓鞘的施万细胞和晶状体纤维细胞中特异且大量表达的一种细胞骨架相关蛋白。Periaxin参与髓鞘中PDG复合物的形成,是Cajal条带存在的分子基础,一旦L-periaxin突变或缺失会引起过度髓鞘化或脱髓鞘现象。Periaxin的定位在髓鞘的形成过程中是不断变化的,从最初的细胞核到最后的远离轴突的质膜处。Periaxin可以编码含有PDZ结构域的两种蛋白亚型,分别为L-periaxin和S-periaxin。PDZ结构域在Periaxin定位和PDG复合物形成中具有重要作用,但与其结合的配体却未见报道。EphrinB2是受体酪氨酸激酶家族的一个成员。EphrinB2配体可以和其对应的受体EphB2之间形成双向信号,这种信号可以直接指导轴突的生长、细胞的聚集和迁移、髓鞘的形成。EphrinB2配体包括胞外区,跨膜区和胞内区,在C端包含有PDZ结合基序。通过结合PDZ协调组织细胞膜上的蛋白复合物。
  本文对L-periaxin与EphrinB2间的相互作用进行了分析。首先,免疫荧光共定位实验结果表明了L-periaxin与EphrinB2在细胞质和细胞膜上有共定位现象。之后对L-periaxin与EphrinB2之间的相互作用进一步验证,结果显示L-periaxin与EphrinB2之间存在相互作用。为了确定EphrinB2与L-periaxin的互作的具体区域,对L-periaxin的四个不同的结构域分别利用双分子荧光互补实验、海肾荧光素酶互补实验及免疫共沉淀实验去分析与EphrinB2间的相互作用,结果表明L-periaxin的 PDZ结构域与 EphrinB2之间存在着相互作用。将EphrinB2的PDZ结合基序去掉之后,这种相互作用消失。S-periaxin与L-periaxin有着同样的PDZ结构域,通过双分子荧光互补实验(BiFC)、海肾荧光素酶互补实验、免疫共沉淀实验、GST Pull-down实验的检测,也证实S-periaxin的PDZ结构域与EphrinB2的相互作用。
  实验室前期研究揭示L-periaxin可以通过其分子内NLS2,3结构域与酸性结构域的相互作用形成首尾自环结构,而DRP2与L-periaxin的NLS2,3的结合会减弱L-periaxin的分子内的首尾相互作用。本文通过DRP2的干扰实验,体外NLS3多肽孵育施万细胞,结合双分子荧光互补实验,揭示DRP2及NLS3合成多肽片段可以竞争性结合L-periaxin的NLS结构域,从而破坏L-periaxin之间的分子内的相互作用,免疫荧光定位揭示L-periaxin的分子由闭环到开环的状态改变,引起L-periaxin细胞膜定位数量的增加。
  最后,为了检测L-periaxin是否影响RSC96细胞的增殖,利用MTT法及流式细胞术对敲除L-periaxin及过表达L-periaxin后对RSC96细胞的增殖的影响进行了研究。结果显示敲除了L-periaxin基因的细胞增殖速度减慢,G1期细胞的比例比正常细胞增加了18.16%, S期减少了20.62%。说明了L-periaxin会促进RSC96细胞的增殖。
[硕士论文] 王文贺
轻工技术与工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:叶绿体起源于蓝藻细胞内共生,至今仍像一个独立个体一样进行分裂。叶绿体通过二分法进行分裂,位于叶绿体基质侧内包膜(IEM)上的FtsZ环与位于叶绿体细胞溶质侧外包膜(OEM)上的ARC5环同时收缩挤压最终共同完成这一分裂过程。而位于IEM上的ARC6蛋白与位于OEM上的PDV2蛋白在内外包膜间隙(IMS)间的相互作用实现了FtsZ环与ARC5环之间的连接与协作。遗憾的是,ARC6与PDV2之间协同作用的机理至目前为止研究的还不够清晰。
  在这篇论文里,我们将ARC6与PDV2两个蛋白通过一段灵活的肽链相融合,并对融合蛋白进行了表达、纯化、晶体筛选以及后期获得晶体后的晶体优化,通过这一系列工作最终获得了高质量的复合物晶体结构,成功解析IMS区域内ARC6-PDV2复合物的晶体结构。从结构上我们发现,PDV2的C末端巧妙地嵌入了ARC6所形成的口袋型区域,这种结合方式就像一把钥匙插入到锁里一样,与此同时,我们进一步发现PDV2的结合诱导ARC6二聚体的形成。pdv2突变体植株削弱了PDV2诱导ARC6形成二聚体而导致植物细胞内ARC6环出现形态学异常,并进一步给叶绿体分裂带来负面影响。
  综合前述,本论文的研究揭示了PDV2引起的ARC6二聚在叶绿体分裂过程中有着至关重要的作用,同时提出了一种内外协同作用下的质体分裂机制。
[硕士论文] 张峰
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物染色质在核内具有高级结构,除了将基因组DNA装配并压缩,染色质结构具有调节基因表达的功能,且呈动态变化,随细胞状态、类型不同而不同。Hi-C技术能够在全基因组范围捕获染色质相互作用信息。本论文重点关注:1,分析染色质多重相互作用特征及在分化中的变化,即分析染色质多个部分(n≥3)相互作用(靠近)的特征及其在不同类型细胞中的变化。2,染色质相互作用可视化,即基于Hi-C信息,通过一定算法,直观地展示染色质在核内的分布和相互作用情形。3,理解染色质多重相互作用及染色质结构动态的生物学意义。
  利用人类胚胎干细胞及四种分化细胞的Hi-C数据,通过Hi-C Reads的位置信息,识别出染色质多重相互作用位点,并通过深度优先遍历算法构建染色质相互作用网络。发现:染色质多重相互作用位点约占所有相互作用位点数目的30%,存在局部富集效应,干细胞具有更多的多重相互作用位点,分化中多重作用数量变少;染色质相互作用网络呈现大量星型结构,在不同细胞系间局部集中程度存在差异,但整体集中程度相近;染色质相互作用关联的基因,在干细胞与分化细胞间有70%~80%相同,这些共同的基因表达活跃。总之,在细胞分化过程中,染色质多重相互作用局部变化较多,整体框架稳定。
  基于干细胞及分化细胞的Hi-C数据,利用多维标度分析(Multi-dimensional Scaling,MDS)算法,构建了染色质三维结构模型及染色质空间结构可视化方法,并结合基因表达信息与表观遗传信息对结构特征进行了分析。结果表明:论文的模型可以基于H1-C信息,直观地展示染色质的空间相互作用情况。在不同类型细胞间,染色质相邻位点间平均距离变化剧烈,而方向角变化稍小,说明染色质动态更多涉及平动,而非旋转和扭曲。干细胞与分化细胞有50%以上的染色质结构保守(r>0.8),保守区域线性位置相对固定。表观遗传修饰偏向于分布在结构上不保守且紧密靠近的染色质区域。以上表明,分化有关的染色质变化主要以距离的平移为主,且涉及表观遗传修饰。
  论文通过分析染色质多重相互作用,构建染色质作用可视化模型,建立了基于Hi-C的染色质动态分析方法,研究了分化中的染色质结构特征,结果暗示:染色质多重作用比例多,分化中减少;染色质动态以平动为主,主要发生在紧密作用区域,与表遗传修饰关联。论文的方法和结果为理解染色质结构及其变化提供了线索。
[硕士论文] 何超
遗传学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:对于真核生物,染色质是最大的单一生物大分子,是基因组的存在形式,是遗传和表观遗传的共同载体,而细胞核是染色质的储存空间。在有丝分裂间期,不同的染色质在细胞核内分别占据一个相对独立但又相对固定的空间位置即染色体领域CT(Chromatin Territory),每条染色质进一步分层级折叠成复杂而有序的三维高级结构,这些稳定的高级结构及其核内空间定位与 DNA重组与复制、基因的转录甚至翻译等密切相关。大量研究发现,很多调控因子都是依赖着染色质三维空间结构来发挥功能。
  染色体构象捕获技术3C(Chromosome Conformation Capture)是2002年出现的研究染色质折叠的核心生化技术,近年来随着3C的衍生技术如4C、5C、Hi-C、Capture-C以及考察特定蛋白介导染色质互作的 ChIA-PET等分子图谱(Mapping)以及DNA-FISH等不同类型的成像(Imaging)技术的迅速发展,人们对染色质折叠的认识不断加深。目前普遍认为:有丝分裂间期染色质的折叠包含染色质领域(chromosome territory)、拓扑结构域(TAD)、染色质环(chromatin loop)等从大到小不同层级的结构单元,作为基因组序列及其DNA和组蛋白修饰、染色质调控蛋白的结合等的最终载体和响应器(carrier&responser)或“集大成者”(moderator),基因组的复杂三维高级结构与组蛋白修饰、DNA甲基化、DNase敏感性等基因组其它组学特征以及基因的复制、转录等基因组功能特征密切相关。
  顺式调控元件 CREs(cis-regulatory elements)往往指的是与结构基因串联的特定非编码DNA序列,它们通过与转录因子等的结合而调控基因转录的精确起始和转录效率,从而参与基因表达的调控。根据序列组成等特性,可以将其分为常见的启动子、终止子、增强子、绝缘子、边界元件、基因组座位调控元件以及重复元件、核基质附着区等不同类型。其中重复元件(repeat elements)在基因组中多次重复出现,包含了大量的有着不同的结构和来源的DNA元件,在真核生物基因组中的比例可达到一半以上。根据片段长度及生物学特性,重复元件可进一步分成串联重复序列及转座元件等。由于受到测序读长、比对等技术手段的限制,人们对于重复元件在基因组中发挥的功能和机制目前还知之甚少,需要进一步发掘。核基质附着区(MARs)是一类在不同物种与组织细胞的基因组中广泛存在的、富含 AT序列且与核基质紧密结合的 DNA元件。目前认为MARs元件一方面可能作为染色质三维折叠的结构单元,对于建立和维持染色质领域发挥着作用;另一方面可能作为基因表达调控的功能性单元,通过与核基质等结合,调节基因表达。
  本研究以染色质三维结构实验数据为基础,通过多组学数据整合分析,从基因组序列特征出发,考察了多种不同顺式调控元件在染色质三维折叠中的可能作用,以及染色质三维结构对这些元件演化等潜在影响,为进一步深入了解不同元件在染色质三维高阶结构的建立、维持以及传递等过程中可能的作用奠定了基础。
  本论文的主要研究内容如下:
  开发了Hi-C数据处理的一站式软件HBP。建立了针对特殊顺式调控元件的研究方法,开发了能够系统考察特殊顺式调控元件参与的染色质相互作用的处理软件HBP(Hi-C BED file analysis Pipeline),通过简单的操作即可实现针对不同元件的处理和分析。HBP作为一款开源、灵活、高度优化的一站式处理平台,能够有效地分析全基因组三维高级结构特点及特殊序列元件参与的染色质相互作用,大大方便了针对特定相关区域染色质折叠的系统研究。作为一个简便、高效、可靠的工具,HBP能够通过整合组蛋白修饰一级 ChIP-seq、RNA-seq等其它组学数据,针对特定区域的染色质相互作用进行大规模系统挖掘与分析,对潜在分子机制以及生物学意义等进行多方面的研究。
  基于染色质三维结构对部分重复元件进行了研究。重复元件在各类物种基因组中广泛分布且种类繁多,不同种类之间序列功能各异。本研究探索了与染色质三维结构高度相关的一些重复元件子类,发现了包括Alu等在内的重复元件广泛地参与了染色质的三维折叠。首次从染色质三维结构的空间距离层面,系统考察了相邻重复元件子类间的演化过程,发现在一维序列演化关系上相对靠近的子类,在三维空间结构上的相互作用强度相对较高,提示重复元件的进化历程可能与基因组三维高级结构的形成密切相关。
  基于染色质三维结构对核基质附着区进行了研究。核基质附着区 MARs(Matrix Associated Regions)在不同的物种间广泛存在,虽然存在AT序列相对富集等共同序列特征,却没有发现显著保守性等其它结构特征,此外其在细胞核内的功能和机制也尚无定论。本研究针对MARs元件,从相互作用频率分布、网络拓扑结构及潜在生物学功能等三方面进行了探索。发现 MARs元件与染色质三维结构高度相关,且在高强度相互作用中占据着较大的比例,提示MARs元件对染色质折叠具有重要影响。同时,拓扑结构聚类分析证实MARs元件可以分为不同类型,包括了维持染色质领域及高级空间构象等方面的结构单元部分以及调控基因表达等方面的功能单元部分,提示不同类型 MARs元件在基因组细胞核高级结构及功能上可能发挥不同的作用。
  综上所述,本课题以染色质三维结构为基础,以研究不同顺式调控元件在染色质三维结构中发挥的作用为目的,开发了特定的Hi-C数据分析处理软件HBP,建立了多组学数据的整合分析方法,并且对部分重复元件及核基质附着区与基因组三维高级结构的关系等进行了分析,发现了一些与染色质三维结构高度相关的现象,为进一步的染色质高阶构象及构成元件结构与功能等方面的研究奠定了基础。
[硕士论文] 陈晓洁
物理学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:细胞膜是细胞表面主要由膜脂和膜蛋白组成的双分子层。细胞膜使细胞内部组织与外界环境分隔开,同时也在细胞内外能量和物质交换过程中扮演着重要的角色。细胞膜的侧向组织(lateral organization)和膜内分子的动力学行为在很多细胞的生命活动过程中起着非常重要的作用,因此弄清楚细胞膜的微观结构和动力学性质对于理解细胞膜的生物功能以及相关的生物过程或疾病的微观机制具有非常重要的意义。已有研究表明,脂分子在细胞膜中的侧向分布是不均匀的,在一定条件下会发生相分离形成微观畴结构(domain)。然而,由于细胞膜系统结构和动力学性质的复杂性,无法从实验上直接观察和研究真实细胞膜中纳米尺寸的微观畴结构,人们对于细胞膜内脂分子(尤其是带电脂分子)侧向相分离和侧向动力学行为的微观机制知之甚少。
  本文主要采用基于粗粒化MARTINI力场的分子动力学方法,详细研究了脂分子的带电性质以及不饱和度对细胞膜微观结构和动力学性质的影响。我们主要模拟了由带电或不带电的饱和脂分子、不饱和脂分子和胆固醇组成的三组分细胞膜模型脂质双分子层。通过改变脂分子的带电性质和不饱和度,分析脂分子的面积、扩散系数和有序度等,从分子层次上系统地揭示了脂分子的带电性与不饱和度是如何共同影响细胞膜的微观结构和动力学性质的。我们的研究结果主要包括以下几部分:
  (1)当不饱和脂分子的不饱和度较低时,系统中带电脂分子之间的静电相互作用会抑制脂双层发生相分离行为,特别是当脂双层中的饱和脂分子带电,不饱和脂分子不带电时,脂分子在脂双层中的分布近似均匀。这种情况下,脂质双层膜的微观结构受到带电脂分子之间的静电相互作用的影响很大。
  (2)当不饱和脂分子的不饱和度较高时,不管是电中性的膜还是带电的膜,都发生强相分离,分成流体有序畴和流体无序畴。显然,在这种情况下,脂双层膜的微观结构主要由脂分子的不饱和度控制,脂分子的带电性对脂双层的相分离行为几乎没有影响。
  (3)通过比较各个脂双层膜内脂分子的侧向扩散系数,我们发现,带电脂分子之间的静电排斥相互作用能够增加脂分子在膜平面内的扩散速度。尤其是在含有低不饱和度脂分子的系统里,静电排斥相互作用对脂分子侧向扩散的影响非常显著。在含有高不饱和度脂分子的系统里,由于系统发生强相分离,静电排斥相互作用对脂分子侧向扩散的影响不太明显,但是跟电中性系统里脂分子的侧向扩散比较还是有些增强。
  我们的这项研究工作为理解细胞膜中微观畴结构和脂分子的侧向扩散的微观机制提供了一些理论参考。
[硕士论文] 熊海波
生物化学与分子生物学 上海师范大学 2017(学位年度)
摘要:质体编码的聚合酶(PEP)是叶绿体中主要的聚合酶,负责绝大部分叶绿体基因的转录。PEP是由叶绿体编码的核心亚基以及细胞核编码的外周蛋白组成。pTAC15/mTERF8是PEP复合物(也称TAC复合物)成员之一。本文研究了pTAC15在质体基因表达过程中的作用。pTAC15含有8个保守的线粒体转录终止因子(mTERF)结构域,属于线粒体转录终止因子(mTERF)家族的成员。烟草体内瞬时表达结果表明,pTAC15∶GFP融合蛋白定位于叶绿体中。进一步利用pTAC15∶MYC转基因植株进行免疫实验分析表明,pTAC15是一个类囊体定位的叶绿体蛋白。结合BN-PAGE,2-D电泳和免疫杂交的实验,pTAC15∶MYC出现在660kD的超分子复合物中,同PEP复合物核心亚基rpoB共迁移。酵母双杂交实验表明,pTAC15在PEP复合物中与另一个成员pTAC10相互作用。为了分析pTAC15在叶绿体基因表达过程中的作用,分离鉴定到ptac15的突变体。qRT-PCR分析表明,突变体中绝大部分叶绿体基因的表达水平与野生型相比没有明显差异,只有psbJ的转录水平上出现了上调。环式PCR的实验结果表明,野生型中叶绿体psbJ的转录终止位于终止密码子后第94和95的核苷酸位置,而ptac15突变体中psbJ的转录终止除了位于终止密码子后第94和95的核苷酸位置外,还出现了其他异常的转录终止位点。这些结果表明,pTAC15的缺失干扰了叶绿体基因组中psbJ的转录终止。凝胶阻滞(EMSA)实验以及体内的免疫共沉淀产物qPCR分析表明,pTAC15能够特异性结合质体基因psbJ的3'端序列。进一步的体外生化实验结果表明,pTAC15蛋白具有转录终止的作用。这些研究结果表明,拟南芥叶绿体蛋白pTAC15作为PEP复合物中的一员,能够特异性结合叶绿体基因psbJ的3'末端,参与该基因转录终止的作用。
[博士论文] 黄得来
动物遗传育种与繁殖 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:核仁不仅是核糖体合成与加工的场所,也与细胞周期调控、DNA损伤修复、压力信号应答等生化过程有关。核仁作为细胞核内致密的非膜细胞器,富集了超过4,500种不同蛋白质。然而,人们对于这些蛋白质在核仁中的功能以及这些蛋白在核仁中是如何被调控的所知甚少。本实验室之前的研究发现核仁蛋白Def(Digestive-organ expansion factor)能够介导半胱氨酸蛋白酶CAPN3(Calpain3)降解p53。但是并不清楚Def如何帮助CAPN3降解p53,也不知Def-CAPN3在核仁内是否还存在其他靶蛋白。
  本研究首先发现人CAPN3能够降解p53A138V、p53M2371、p53R248W和p53R273P,而不能降解p53R175H。p53R175H作为癌症样品中出现频率最高的p53点突变,提示了CAPN3在肿瘤形成中的意义。通过免疫共沉淀实验,证明Def与人CAPN3能够直接互作,并在核仁内形成蛋白复合体。发现这种互作在斑马鱼上也具有保守性,斑马鱼Def能够与Capn3b(人CAPN3在斑马鱼上的同源蛋白)在核仁内形成蛋白复合体。进一步的研究发现,Def能够通过磷酸化修饰调控其与CAPN3的结合能力,招募CAPN3进入核仁降解p53。此外,Def-CAPN3对细胞周期及斑马鱼器官发育的调控也是部分通过p53实现的。
  在两个不同的capn3b基因敲除品系斑马鱼的肝脏细胞中,p53都大量积累于核仁。虽然该斑马鱼纯合突变体可正常繁育,但是成年鱼表现出体长变短、躯体易侧弯的症状,与capn3基因突变引起的先天性肢带型肌肉营养不良(LGMD2A)症状类似。
  为了寻找Def-CAPN3在核仁内的其他靶蛋白,通过蛋白质组学技术分析了capn3b基因敲除斑马鱼与野生型斑马鱼肝脏细胞核仁中差异表达的蛋白,发现了119个在capn3b突变鱼中上调(超过1.45倍)的核蛋白,其中核仁蛋白33个。对其中8个候选蛋白进行体内、体外的验证实验,证明其中7个(LmnA、Nkap、Ddx18、Cdk9、Hmgb1、Tra2a、Bbof1)蛋白能够被CAPN3降解,而且能够被Def诱导降解。此外,通过对蛋白质组学数据的深入分析,发现Capn3b还参与了免疫系统的调节,这解释了为何部分LGMD2A患者在发病早期出现炎症反应。
  综上所述,研究首次阐明了Def-CAPN3降解途径能够在核仁内通过对靶蛋白的降解,调控细胞周期进程及器官发育。作为首个斑马鱼核仁蛋白质组学研究,我们的工作不仅为斑马鱼核仁蛋白功能的研究提供了帮助,也通过这种方法鉴定出了7个Def-CAPN3的新底物,为Def-CAPN3的功能研究提供了新的基础。此外,所构建的capn3基因敲除斑马鱼能够作为LGMD2A疾病研究模型,将来可用于药物筛选。
[博士论文] 陈笑风
固体力学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:大量实验表明胞外基质的力学性质,比如刚度、拓扑结构、变形等,可以调控细胞的形态、迁移、基因表达等。细胞的这种能感知周围环境的力学信号并产生响应能力称为细胞的力敏感性。细胞与基体相互作用是细胞力敏感行为的重要组成部分。本文从分子尺度、亚细胞尺度、细胞尺度三个尺度分别研究了细胞与基体相互作用,从力学角度为更深入地理解细胞与基体相互作用提供了新的思路和方法。
  本研究主要内容包括:⑴经典的滑移键强度理论认为,当加载速率低于某个临界值时,经典键合强度会变为零。这个预测与一些实验观察相悖。本文基于键合在低加载速率下可再结合的假设,提出了平均键合强度的理论。分析表明平均键合强度在低加载速率下逐渐饱和,饱和值随着系统刚度的增大而增大。本文认为平均键合强度可作为一种衡量滑移键强度的新物理量在动力学力谱实验中进行测量。⑵基于不同形式的双态模型,本文构建了两种类型的逆锁键,研究了两类逆锁键在不同变载荷作用下的动力学特性。当逆锁键受到先加载后固定的载荷时,两类逆锁键具有相似的寿命与载荷关系。在受到其它形式的变载荷时,两类逆锁键的记忆性却表现出显著的不同。⑶在生理条件下,分子键团簇受到振动载荷的作用,其稳定性受到单分子键的解离和结合动力学特性的调控。通过求解受体与振动配体结合的扩散反应方程,本文发现在大部分生理条件下受体与振动配体结合可以简化为与扩散无关的过程。分析结果表明,键合的平均结合时间在高频时趋于饱和,且存在一个最佳键合刚度使得平均结合时间最小。⑷研究了分子键团簇在循环载荷作用下的稳定性。模拟结果表明滑移键团簇有两种失效模式:寿命较长的滑移失效模式和寿命较短的快速失效模式。滑移键团簇的寿命随着循环载荷幅度和频率的增大而减小,但高频时趋于饱和。本文还发现了滑移键团簇反常的稳定性增强现象:当循环载荷的振幅较高而频率较低时,滑移键团簇的寿命会显著增加。参数研究表明,单分子键的随机动力学特性和循环载荷的形式都对该现象有显著影响。⑸模拟了键合均为第一类逆锁键或第二类逆锁键的两种逆锁键团簇在循环载荷作用下的稳定性。模拟结果表明循环载荷倾向于降低两类滑移键团簇的稳定性。两类逆锁键团簇的寿命都随着振幅增加而降低,且都随着频率增加而降低并逐渐饱和。⑹从弹性肌节粘附模型出发,同时考虑了黏着斑中的拉力和剪切力的作用,研究了细胞的最终取向和拉伸应变比的关系,以及不同初始角度、不同拉伸应变比的细胞旋转动力学过程。本文提出的理论成功解释了双轴循环拉伸下的细胞旋转实验结果。
[硕士论文] 于新磊
生物医学工程 大连理工大学 2016(学位年度)
摘要:目的:血流剪切应力对肿瘤细胞的定向作用可能是引起肿瘤细胞转移的重要原因之一。剪切应力作用于细胞膜上表面,首先引起细胞膜表面张力的改变,这种物理改变可能是肿瘤细胞定向迁移的基础,但目前尚未有针对剪切应力作用下肿瘤细胞膜表面张力的分布模式的研究。本文将采用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer,FRET)技术对剪切应力引起的细胞膜表面张力变化模式及其相关机制进行探究。
  方法:本文首先采用常规亚克隆技术,利用具备分子弹簧功能的蜘蛛丝蛋白序列(GPGGA)8及一对可以发生FRET的荧光蛋白ECFP/YPet设计制备可以可视化检测细胞膜表面张力变化的FRET探针,并通过人为改变细胞膜表面张力对该探针进行了验证。其次采用平行平板流动腔对HeLa细胞施加不同大小的定常层流剪切应力,并且利用多种试剂作用于细胞膜和细胞骨架,在FRET荧光显微镜下动态记录单个细胞的表面荧光FRET变化。然后通过MetaFluor软件处理荧光照片,得到细胞FRET ratio图像的整体趋势,而后采用MATLAB软件编程,把细胞图像沿着力的方向分成50等份,得到细胞膜上表面张力的局部变化数据,并采用Hill方程拟合沿流体方向的FRET数据,探究剪切应力作用下细胞膜表面张力的局部分布变化规律。
  结果:探针的FRET ratio变化可以反映细胞膜表面张力的动态变化;在层流剪切应力的作用下,细胞膜表面张力沿流体方向呈现中游高、上下游低的分布模式,细胞膜表面张力整体水平增高,其幅度与剪切应力大小呈现正相关,且最高点所在位置随力的增大向细胞上游偏移,上游增高幅度大于下游;加载剪切应力之前人为改变细胞膜流动性,苯甲醇处理会使得细胞膜表面张力升高更显著,而胆固醇作用后细胞膜表面张力整体下降明显,但仍然呈现与对照组类似的上下游非均匀性分布变化。采用Nocodazole、Cytochalasin-D及ML7分别破坏细胞骨架微管、微丝或抑制微丝收缩,细胞膜表面张力在剪切应力作用下仍呈现中间高而上下游偏低的模式;破坏微管使剪切应力作用下细胞膜表面张力的整体增高受到明显抑制,并且局部分布发生了明显变化,最高值幅度有所下降而且向上游侧偏移,而且上下游的变化幅度趋于一致;微丝解聚后对整体表面张力的增高没有显著影响,但却导致上下游表面张力增高幅度的反转;而抑制微丝收缩也在一定程度上抑制了剪切应力作用下细胞膜表面张力的增高,而且对上下游非均匀性分布变化也有显著影响。
  结论:本文成功构建了可用于可视化检测细胞膜表面张力变化的FRET生物探针,为细胞膜生物物理相关研究提供了一种有力的工具。剪切应力作用下,肿瘤HeLa细胞膜表面张力变化出现了上下游非均匀的分布,可能是流体作用下肿瘤细胞定向迁移的基础。细胞膜流动性的改变对细胞膜表面张力大小存在显著影响,但并不能显著改变剪切应力作用下细胞膜表面张力非均匀分布的规律。细胞骨架的完整性对剪切应力作用下细胞膜表面张力的非均匀分布起着决定性作用,其中微管系统起着主导作用,而微丝系统相对影响较弱。
[硕士论文] 林浩鹏
发育生物学 汕头大学 2016(学位年度)
摘要:建立高效传递生物大分子和细胞器的方法,对于治疗多种疾病,例如苯丙酮尿症和线粒体疾病,具有重要意义。但是,目前传递生物大分子和细胞器的系统存在效率低、费时费力和生物安全性等问题。为克服上述缺点,本研究建立了一种不但能有效传递蛋白质,而且能高效转移线粒体的递送系统。首先,通过瞬时转染方法,获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的Ad293细胞,然后利用机械挤压法,使表达VSV-G的细胞穿过孔径约为3μm的聚碳酸酯膜,并获得促融质膜颗粒,不表达VSV-G的Ad293细胞制备的质膜颗粒用作对照。共聚焦显微镜结果显示,胞质定位和线粒体定位的绿色荧光蛋白(EGFP、Mito-EGFP)均存在于质膜颗粒,但是核定位的绿色荧光蛋白(H2B-EGFP)在质膜颗粒中观察不到。相应地,qRT-PCR结果表明,质膜颗粒中的mRNA,microRNA和线粒体DNA只有微弱的减少,而核DNA几乎检测不到;而且,Western blot结果显示,与对照组相比,胞质蛋白和膜蛋白也只有微弱的减少,但核蛋白未检测到;线粒体DNA编码的蛋白表达水平检测结果显示,与正常细胞相比,质膜颗粒中蛋白表达量只有微微降低。另外,将携带红色荧光蛋白(DsRed)的促融质膜颗粒和靶细胞孵育,结果表明胞质蛋白DsRed被成功传递到40%的靶细胞中;利用可诱导CreER/loxP系统,将携带CreER的促融质膜颗粒与携带Cre报告质粒(CMV-DsRed-loxP2-EGFP)的靶细胞孵育,结果表明CreER蛋白质能够成功传递到靶细胞,介导loxP间的DNA重组,导致靶细胞由DsRed+变成EGFP+,证实胞质蛋白确实可以通过促融质膜颗粒进行递送。
  另外,和促融质膜颗粒孵育5h后,20%的靶细胞检测到供体来源的线粒体。为了进一步检验供体线粒体的功能,以线粒体缺陷型HeLa细胞(Rho0)作为靶细胞,结果表明,与对照组相比,促融质膜颗粒添加组的HeLa细胞数量增加了一倍;与此相反,用R6G处理使线粒体功能缺失后,促融质膜颗粒未能促进Rho0细胞的生长,表明供体线粒体而不是质膜颗粒中的生物大分子对恢复Rho0细胞的线粒体活性是必须的。最后,MitoTracker染色和JC-1染色结果显示,Rho0细胞的线粒体形状和膜电位恢复到正常水平。这些实验结果表明,本研究成功建立了一种方便、高效传递蛋白质和线粒体的投递系统,VSV-G介导的促融质膜颗粒可能为线粒体相关疾病的治疗提供一条有效的途径。
[硕士论文] 赵智权
动物学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:Parkinson’s Disease(PD)是一种多系统功能障碍为主要表现的神经系统变性疾病,病理学特征是黑质多巴胺能神经元损失和路易体(Lewy body)形成。氧化应激、蛋白质误折叠和聚集的增多都涉及在PD的病理学变化中,而多巴胺能神经元退化的精确描述仍存在空缺。越来越多的遗传和生化研究揭示自噬溶酶体途径的功能障碍在帕金森病(PD)发病机制中有重要作用。目前,大多数研究集中在突触核蛋白次级聚集引起的神经毒性累积。在依赖于年龄的PD病人中,出现了溶酶体功能的损伤。这表明自噬溶酶体系统的缺陷似乎也可通过多种机制引起自噬神经毒性。ATP13A2在哺乳动物中脑有很高的表达量,其突变可导致被称作Kufor–Rakeb syndrome(KRS)的神经退行性疾病。ATP13A2部分定位于溶酶体膜,推测其功能为阳离子转运体。ATP13A2突变后对自噬溶酶体途径是否有影响,突变的ATP13A2是否参与突触核蛋白病理学,促进神经元的退化还尚未可知。
  为了探究这些问题,构建了ATP13A2野生及突变的稳转B103神经母细胞瘤细胞株,研究ATP13A2突变基因对神经元的损伤作用,以及对自噬溶酶体途径的影响。同时在β-syn稳转B103细胞株中,过表达ATP13A2野生及突变质粒,研究在ATP13A2作用下,突触核蛋白病理学的变化。
  通过免疫荧光及免疫印迹技术,在ATP13A2稳转B103细胞株中发现:野生型ATP13A2呈聚集状态并主要定位于溶酶体,过表达ATP13A2野生型蛋白后,轻微的降低溶酶体的活性。而突变型ATP13A2蛋白在B103细胞中出现部分弥散的现象,在溶酶体的定位程度增高,显著降低了溶酶体活力。突变ATP13A2蛋白在内质网积留,引起内质网应激,并引起线粒体连续性降低,减弱了线粒体融合能力。ATP13A2突变蛋白引起自噬,主要通过自噬溶酶体系统降解。在β-syn稳转B103细胞株中,过表达突变型ATP13A2蛋白后,抑制了突触核蛋白降解,促进突触核蛋白聚集。LDH和WST-1显示,ATP13A2突变蛋白有明显的神经毒性作用。
  总的来说,ATP13A2在维持细胞内溶酶体活性方面有着重要作用,突变型ATP13A2引起内质网应激,线粒体连续性降低,增加了神经毒性。同时突变ATP13A2降低突触核蛋白降解,促进突触核蛋白聚集形成包涵体,加剧了突触核蛋白引起的神经退化。
[硕士论文] 李姗姗
生物化学与分子生物学 山西大学 2016(学位年度)
摘要:线粒体是高度动态变化的细胞器,其在细胞内通过不断的融合与分裂以保持一定的形态。线粒体的分裂与融合程度失衡,会引起线粒体功能障碍,如线粒体膜去极化及ATP合成受抑制等,机体主要通过线粒体自噬来消除这些发生功能障碍的线粒体。线粒体自噬是自噬机制对线粒体的一种选择性的清除,即损伤的线粒体被包裹在自噬体中,进而与溶酶体融合而被降解,以此来保证细胞的稳态。线粒体自噬的异常与多种疾病包括神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等都密切相关。
  先前的研究发现,重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI(recombination buckwheat trypsin inhibitor)主要通过诱导肿瘤细胞自噬来抑制细胞增殖的,但是rBTI诱导肿瘤细胞发生自噬的机制还不清楚。近期研究显示,rBTI作用于肝癌细胞Hep G2后,线粒体数量明显减少,且伴随有大量自噬泡的产生,由此推测rBTI诱导Hep G2细胞发生的自噬可能为线粒体自噬。
  为了进一步研究rBTI诱导Hep G2细胞发生自噬的机制,本实验采用透射电子显微镜、MDC染色、Western Blot、质粒pEGFP-LC3转染细胞及激光共聚焦显微镜等方法分析rBTI对Hep G2细胞自噬水平的影响;质粒pDsRed2-mito转染细胞、激光共聚焦显微镜等技术分析rBTI对线粒体形态的影响;Western Blot及qRT-PCR技术分析 rBTI对线粒体融合与分裂的影响;质粒 pEGFP-LC3与 pDsRed2-mito共转染Hep G2细胞来分析自噬标志蛋白LC3与线粒体的共定位;流式细胞术、酶标仪、Western Blot等技术分析rBTI对Hep G2细胞线粒体膜电位、ROS及抗氧化系统的影响;流式细胞术、pEGFP-LC3转染细胞及Western Blot分析ROS和rBTI诱导的自噬的关系。
  结果显示,rBTI作用于Hep G2细胞后,包裹有线粒体的自噬体结构明显增多;细胞的自噬水平升高;点状分布的GFP-LC3增多;细胞自噬相关分子(LC3, beclin1, ATG5)表达量升高,自噬底物P62表达降低,表明rBTI诱导Hep G2细胞发生自噬。同时发现,线粒体标志分子Tom20和Cox IV表达水平降低,线粒体发生片段化,线粒体分裂蛋白Fis1表达水平升高,而线粒体融蛋白Mfn1表达水平降低,表明rBTI促进线粒体发生分裂,引起线粒体数量减少。因此推测rBTI促进自噬机制对线粒体的清除。而且发现,自噬标志蛋白LC3与线粒体的共定位现象增强,进一步说明rBTI 诱导Hep G2细胞发生的自噬属于线粒体自噬。同时检测到,rBTI引起线粒体膜电位降低,诱导活性氧(ROS)短暂升高,ATP水平降低,表明rBTI引起Hep G2细胞线粒体发生功能障碍,这可能是rBTI引起Hep G2细胞发生线粒体自噬的直接原因。而超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性,还原型谷胱甘肽(GSH)的含量及还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例均有升高的趋势,表明rBTI增强了细胞的抗氧化能力,这可能是细胞对ROS短暂升高的应激反应。同时发现,ROS又可以作为一种信号分子参与 rBTI诱导的线粒体自噬。这些结果为深入研究 rBTI诱导肿瘤细胞线粒体自噬的机制提供了重要的基础和实验依据。
[硕士论文] 刘凌洁
生物医学工程 东南大学 2016(学位年度)
摘要:核小体定位是指DNA双螺旋相对于组蛋白八聚体的位置。核小体定位通过暴露和遮蔽蛋白结合位点参与基因的表达调控。核小体定位在不同环境下呈现动态变化。目前已经有方法可以实现两样本的核小体动态定位识别,但尚未有针对多样本(n≥3)的动态定位分析方法。可是,在发育、分化等诸多生物学研究中,必然会遇到多种细胞系或者多种细胞状态(n≥3)下核小体动态定位分析的情形,识别这种动态变化对于解析细胞表观调节机制具有重要意义。
  本文针对多样本核小体高通量测序数据,提出了一种基于统计模型的核小体动态定位识别技术,以实现在多样本(n≥3)情形下,在单碱基分辨率下,准确识别核小体动态定位的基因组区域。
  该技术(Dimnp)主要包含两个模块:核小体定位信号提取和多样本动态定位区间识别。在核小体定位信号提取模块,通过对原始的测序数据进行位移、调整片段长度、去冗余、平滑和归一化处理,最终得到适用于多样本比较的核小体信号;在多样本动态定位识别模块,以卡方检验作为统计模型,在单分辨率基础上计算差异显著性,然后对P值进行阈值过滤识别出动态定位区间。在此基础上开发了两款离线工具包,分别适用于Linux和Windows系统。
  通过绘制ROC曲线、与DANPOS算法对比分析来评估Dimnp技术的可靠性和有效性。结果表明:Dimnp能够较准确的识别多个样本(n≥3)的核小体动态定位区域,其结果与DANPOS算法结果保持了较好的一致性(与DANPOS两两比较的结果合并对比)。但相比于DANPOS算法,Dimnp可以一次性分析多个核小体样本,从而更全面的识别出不同环境下核小体动态变化区域,同时Dimnp一次识别DANPOS多次两两比较的结果,大大提高了分析的效率。
  应用Dimnp技术对酵母基因组核小体动态变化情形进行了分析。选取四组不同组蛋白突变的多样本酵母核小体数据,识别出每组的动态定位区域。对识别结果的进一步分析表明,动态变化区域显著集中在启动子区,且在端粒区的动态变化更明显,与动态变化区域相关的基因与特定的生物学功能相关。
  综上所述,论文开发了识别多样本核小体动态位置的方法,建立了计算工具,系统评价表明方法可行且具有较好的准确性。论文为研究核小体在细胞生长、分化、环境特异响应、癌变等过程中的动态改变提供了方法和工具。
[硕士论文] 唐其省
生物化学与分子生物学 南昌大学 2016(学位年度)
摘要:细胞表面微囊泡是贴壁细胞铺展后存在于细胞表面的与细胞质膜绑定的半球状突起,直径约为1um。目前,仅依据尺寸的相似性,有少量报道把这种细胞表面微囊泡当作释放型细胞外微颗粒的前体来看待,既缺乏直接的证据表明两者的相关性,也因缺乏有效的分离纯化方法无法对细胞表面微囊泡的结构和功能进行深入研究。因此,非常有必要提供直接证据鉴定细胞表面微囊泡是属于细胞外微颗粒的前体还是一种具有独立结构和生理功能的新型微囊泡;也非常有必要建立一种分离、纯化细胞表面微囊泡的有效方法,为后续的结构和功能研究打下坚实基础。
  本课题以脐静脉内皮细胞系HUVEC和人肝癌细胞系HepG-2两种贴壁细胞为细胞模型来研究细胞表面微囊泡。通过共聚焦显微镜和扫描电镜观察首先确定了这种微囊泡是存在于细胞表面,通过特异标志物的免疫荧光染色也排除了这种微囊泡是细胞质中线粒体和多泡小体等细胞器顶起所致的可能性;随后,通过已被广泛认可的特异性标志物(CD31、CD146、CD63和PS等)的免疫荧光染色,证明这种微囊泡不属于细胞外微颗粒、外泌小泡和凋亡小体;实验还发现,这种微囊泡能够被70%以上浓度的乙醇和氯仿甲醇溶解,但能被脂质固定试剂锇酸所保护,说明这种微囊泡是具有脂质成分的结构;免疫荧光实验还发现,这种微囊泡表面可能含有FAK、GM1、GM3或小窝蛋白-1等分子,但不是其所特有;进一步强烈证据表面,细胞表面微囊泡对Triton X-100、SDS和saponin等去垢剂具有极强的抗性,是这种微囊泡具有的独特物化性质之一;最后,通过大量的探索研究,利用其独特的物化性质本课题实现了细胞表面微囊泡的有效分离,为该膜结构的分子特性研究和组分分析提供了可能。
  本课题提供了坚实、可靠的证据,证明细胞表面微囊泡既不是细胞内细胞器(如线粒体和多泡小体等)顶起所致、也不是细胞外囊泡(如细胞外微颗粒、外泌小泡和凋亡小体等)的前体,而是一种位于细胞表面、具有脂质成分和独特物化性质的新型微囊泡;更为重要的是,本课题首次建立了一种分离细胞表面微囊泡的简单、有效的分离方法,为其组分、结构和功能的后续研究提供了可能性。这种新型微囊泡的确定将在细胞生物学上开创一个全新的研究领域,而新型微囊泡有效分离方法的建立将推动这个领域的快速发展,因而,本课题研究的意义极其重大。
[硕士论文] 张清珍
生物学;微生物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:线粒体是真核生物进行氧化代谢,糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所,为细胞的生命活动提供能量,是细胞氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞“动力工厂”之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系,但基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的表达障碍直接导致各种各样的疾病,如何治疗线粒体疾病成为目前的研究重点。许多研究表明,线粒体功能异常与帕金森氏症、阿尔兹海默病、糖尿病、肿瘤的发生发展过程密切相关,既是疾病病因之一,又是疾病发病的早期征兆。因此研究线粒体基因表达机制,可以为治疗线粒体基础疾病提供帮助。Mpa1是我们实验室通过串联亲和纯化(Tandem affinity purification)、免疫共沉淀和质谱(mass spectrometry)鉴定技术,发现的与Ppr10有体内相互作用的蛋白。mpa1是未被研究过的一个新颖的基因,因而本研究选择mpa1基因作为研究对象。
  本研究借助在线工具MitoProtⅡ(https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析结果得知,Ppr10含有线粒体的定位信号肽,但是无法预测到Mpa1的线粒体定位信号肽。由于Mpa1与Ppr10蛋白存在体内相互作用,猜测Mpa1与Ppr10共定位。为了进一步明确Mpa1的定位,对Mpa1做了亚细胞定位,最终确定Mpa1定位于线粒体基质。为了研究Mpa1的相关功能,首先以单倍体酵母菌株yHL6381为出发菌株构建了mpa1基因缺失突变株。接下来,针对突变株进行了一系列的表型研究:包括生长曲线测定,细胞形态观察,不同生长阶段的存活能力、在基础培养基和非发酵性培养基上的生长状况及对线粒体呼吸链抑制剂抗霉素A的敏感性研究。表型研究结果表明,mpa1基因缺失突变株在与呼吸功能相关的培养基上呈现出生长缺陷,并且在生长阶段后期生存能力严重受损。总的来说△mpa1是线粒体呼吸缺陷菌株。同时,Western Blot技术进一步分析得出,mpa1的缺失导致线粒体相关蛋白的合成量降低。本实验成功构建了△mpa1/pJK148-1500-mpa1-3HA菌株,且可以正常表达Mpa1蛋白。点圈实验证明菌株可以弥补mpa1基因缺失突变株在非发酵培养基上的生长缺陷,同时Western Blot证明回补菌株可以恢复线粒体蛋白的合成。由此可知,mpa1的自身调控序列在5'-UTR上游1500 bp范围内,并验证了mpa1是非必需基因。在此基础上,对缺失特定区域的Mpa1结构的研究。无论缺失哪部分区域,都可以正常表达Mpa1,但都不能弥补可以弥补mpa1基因缺失突变株在非发酵培养基上的生长缺陷,推测Mpa1在结构完整的情况下才能发挥功能。
[硕士论文] 杨艳梅
生物学;生物技术 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:线粒体是真核生物细胞中一种重要的细胞器。最近的研究表明,线粒体的功能失调与多种疾病相关,如艾滋病、神经退行性疾病和癌症。粟酒裂殖酵母是一种优秀的研究线粒体遗传学和分子生物学的模式生物,并为研究各种细胞器和核-线粒体的相互作用提供了一个良好的载体。
  本研究利用改进的蔗糖梯度离心方法纯化了粟酒裂殖酵母线粒体,采取不去除小片段的方法提取了包括tRNA和小RNA在内的所有线粒体RNA,并且通过透射电镜和定量PCR验证了线粒体RNA的质量和纯度。结合高通量测序和传统的生物学实验方法,我们对粟酒裂殖酵母的线粒体转录组进行了全面分析。线粒体转录组测序结果显示的RNAs的切割位点和基因的表达量差异表明转录后调控机制的存在。我们确定了rnl、atp6和tRNAAsn的切割位点,并通过CR-RT-PCR验证了测序数据的可信度。trz2与人的tRNase ZL(ELAC2)高度同源,而ELAC2基因与前列腺癌及艾滋病相关。Trz2定位在线粒体,具有tRNA3味端加工酶活性。全面分析了Trz2失活对线粒体RNA加工和表达的影响,结果表明Trz2对于线粒体tRNAs的3'端的加工是必不可少的,并且Trz2的功能缺失也影响了线粒体mRNAs和rRNAs5'端成熟体的加工。线粒体是调控细胞凋亡的核心细胞器。我们发现高表达Trz2导致酵母细胞出现凋亡现象:DAPI染色发现高表达Trz2导致粟酒裂殖酵母出现细胞核破碎和染色质凝聚;Annexin-Ⅴ标记表明高表达Trz2引起细胞膜磷酯酰丝氨酸外翻,并且定量PCR发现线粒体凋亡激活因子aif1表达上调;线粒体荧光染料MitoTracker染色发现OETrz2菌株的线粒体发生断裂,并且通过罗丹明123染色发现细胞内累积了大量的活性氧。高表达Trz2引起的细胞凋亡依赖其线粒体定位。在国内外的研究中尚未有Trz2调控细胞凋亡的相关报道。粟酒裂殖酵母是一种优秀的模式生物,许多重要生物过程与人接近。因此,本文章希望通过利用裂殖酵母为模型研究Trz2调控的线粒体介导的凋亡,本研究为了解tRNase ZL及凋亡相关疾病的发生机制和寻找新的疾病预防及治疗的策略提供新思路。
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