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[博士论文] 田甜
结构生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:在有丝分裂的过程中,偶联的姐妹染色单体准确平均分配到两个子细胞中,完成遗传物质的传递,对于维持遗传稳定性和物种连续性至关重要。姐妹染色单体的平均分离主要依赖于动粒在着丝粒区的组装。着丝粒是染色质上一段结构和功能都高度特化的区域,在该区域H3被其变体CENP-A所替代。动粒是在着丝粒区组装的一个大的蛋白复合体,负责为姐妹染色单体与纺锤体微管的连接建立承载区。动粒主要包括:内层CCAN蛋白质网络和外层KMN蛋白质网络。CCAN蛋白网络又可划分成五组亚复合物:CENP-C、CENP-LN、CENP-HIKM、CENP-TWSX和CENP-OPQUR。其中,CENP-N能够特异性识别CENP-A核小体,招募CENP-L,完成CENP-A所携带遗传信息的解码和起始动粒蛋白的招募。
  在本文第一篇中,我们解析了CENP-LN/CENP-A-NCP复合物的冷冻电镜结构,整体分辨率为5.8(A)。CENP-N通过其C端约100个氨基酸与CENP-L相互作用,形成一个异二聚体,与溶液中聚集状态相吻合;通过其N端约200个氨基酸与CENP-A核小体直接相互作用,其中,CENP-A L1 loop上的R80、G81和D83对CENP-N特异性识别CENP-A核小体具有重要作用,另外,CENP-N氨基端的碱性氨基酸还可以与核小体DNA上的四个位点的磷酸骨架直接相互作用,进一步稳定两者的结合。DNA上的这四个位点分别为:第+37/+36位核苷酸、第-32/-31位核苷酸、第+26/+25位核苷酸和第-22/-21位核苷酸。我们通过体外结合实验验证了CENP-N上与DNA结合的关键氨基酸残基有K10A、R11A、R44A和H77A。在体内,与DNA相互作用的关键氨基酸位点的突变,显著减弱了CENP-N自身及CENP-L等动粒蛋白的定位,说明CENP-N与核小体DNA的结合,对CENP-N在动粒上的定位和其他动粒蛋白的招募至关重要。而且,在不同物种中,为了维持这种“解码”机制的保守性,CENP-N可与CENP-A共同进化。
  糖酵解过程是所有生物体进行葡萄糖代谢产生ATP供能的必经阶段。在糖酵解过程中,己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶被认为是关键酶,有它们催化的反应是不可逆的。其中,磷酸果糖激酶的催化效率较低,是最为重要的调控关键酶,功能单位为四聚体,以ATP为磷酸供体,催化F6P转变为FBP,并产生一分子ADP。它是一种经典的别构酶,通过R-state和T-state的构象转变来调节自身的催化活性。
  在本文的第二篇中,我们利用E.coli表达了金黄色葡萄球菌的Pfk,它在溶液中存在二聚体和四聚体两种状态,且蛋白浓度越高四聚体越多,而且这种四聚体状态可以被低pH,或ADP,或ATP,或AMP-PNP诱导解离为二聚体形式,但是也可以被其底物F6P所稳定。我们通过解析Pfk及其与不同配体复合物的结构发现:Sa_ Pfk、Sa_Pfk/ADP、Sa_Pfk/ATP和Sa_Pfk/AMP-PNP的结构为二聚体,Sa_Pfk/F6P和Sa_Pfk/F6P/AMP-PNP的结构为四聚体。通过结构分析,我们认为Sa_Pfk所特有的G150-L151 motif的柔性赋予了α7-helix“开关”的功能,在F6P的协同作用下,调节自身二聚体-四聚体间的转换,从而调控酶的催化活性。
[硕士论文] 赵雅君
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:2006年日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)首次利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入体细胞中,成功建立小鼠诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)。实验证明iPSCs已经可以分化为心肌细胞、视网膜细胞以及造血细胞等,对临床研究具有极大意义。本研究室以自主开发的新型干细胞诱导技术为基础[1],将小鼠iPSCs放入添加四种生物活性因子ABCL(Activin A,BMP4,CHIR99021和mLif)的基础培养液中,使其诱导为一种更具多能性的新型干细胞(iPSC-advanced pluripotent stem cells,iPSC-ASCs)。
  实验结果如下:
  1、通过脂质体将六种转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Rarg及Lrh1的组合转入小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),使其成功转化为iPSCs。两种不同iPSCs系在ABCL中培养,诱导出iPSC-ASCs,其AP染色均为阳性,与iPSCs无显著差异。
  2、免疫荧光染色检测了胚层分化基因Cdx1、Sox17、以及细胞周期调控因子c-Myc在蛋白水平的表达。结果显示所用的两种iPSC-ASCs细胞系的Cdx1和c-Myc蛋白表达均比对照组iPSCs高。
  3、RT-qPCR结果显示,iPSCs和iPSC-ASCs的多能性基因Oct4,Sox2,Nanog表达与MEF相比均显著提高。而且在形态扁状的Flat-iPSCs(F-iPSCs)诱导出的F-iPSC-ASCs中,发现Oct4,Sox2,c-Myc,T,K18,Gata4基因与iPSCs相比表达均上升,而在形态圆状的Round-iPSCs(R-iPSC)及R-iPSC-ASCs中未得到同样的结果。
  4、通过嵌合体制备检测iPSC-ASCs的发育潜能。实验结果显示iPSC-ASCs细胞系可贡献到10.5天的胎儿和卵黄囊,又可贡献到胎盘,而且iPSC-ASCs细胞系可进入13.5天胚胎的生殖嵴。
  5、把iPSC-ASCs和iPSCs直接培养在基础培养基N2B27中,观察其分化状态。在培养到第六天,iPSC-ASCs和iPSCs基本全部分化,相对于iPSCs,iPSC-ASCs更容易向中胚层分化。
  综上所述,本实验利用化学成分明确的培养条件建立了的iPSC-ASCs与iPSCs相比,在基因表达水平和发育潜能等方面,iPSC-ASCs更具有多能性,是一种新型诱导多能性干细胞系。
[硕士论文] 孔祥菲
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:减数分裂是真核生物有性生殖的必经过程。通过一轮的DNA复制和两轮的染色体分离,形成染色体数目减半的配子。双方的配子结合形成合子,使子代的染色体数目最终与亲本相同,维持物种的遗传稳定。同时由于减数分裂过程中非姊妹染色单体的自由组合和同源重组,产生的子代具有不同于亲本的新性状,是物种适应环境变化、不断进化的重要机制。人类减数分裂缺陷会造成包括唐氏综合征在内的多种疾病,甚至严重影响人类生命。深入研究减数分裂的分子机制,对于临床研究治疗和促进人类健康具有重要意义。
  减数分裂第一次分裂(MI)前期分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期五个时期,其中同源重组修复起始于细线期的双链断裂,之后经过链入侵、Double Holiday Junction等过程,最终产生CO。CO是减数分裂染色体正确分离的重要保证,研究减数分裂前期的关键事件是研究整个减数分裂进程的重要切入点。
  R-loop是一种三链核酸结构,包括RNA和它的模板DNA缠绕形成的杂合双链和一条非模板DNA单链,主要产生于转录过程。研究表明,R-loop的非模板单链裸露在外、易受破坏,进而造成基因组的不稳定性。细胞体内的R-loop结构在DNA复制、基因转录、基因表达调控等多种生物过程中具有重要作用。细胞中R-loop受多种途径的精密调控。其中最重要的是核糖核酸酶RNH1和RNH2对R-loop的降解作用。RNH1和RNH2具有功能冗余,两者都能够特异性的识别R-loop中的RNA链并对其进行切割从而去除R-loop。细胞中的THO复合物能够及时运输新转录出的RNA至细胞质中,从而降低R-loop形成的几率;SEN1解旋酶可以特异性的打开DNA∶RNA双链。多种途径协调作用将细胞体内的R-loop控制在合理的范围内。
  本文采用的实验材料为真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,该生物具有生长快、遗传操作简单、单倍体和二倍体细胞稳定并且四分体孢子易分离等特点,被广泛应用于诱变、重组、染色体分离、表达调控等遗传学研究的各个领域。我们构建了R-loop相关的rnh1Δ、rnh2Δ、hpr1Δ等突变体,发现单突变体减数分裂R-loop含量与野生型相比无明显变化,从DNA复制、减数分裂过程及最终的孢子存活率来看,均未对减数分裂造成明显影响。而在双突变菌株中,R-loop含量明显上升,孢子存活率显著降低。多突变菌株减数分裂前DNA复制时间增加。由此可知,R-loop含量的变化对减数分裂有重要影响。该发现对我们进一步研究R-loop对减数分裂的调控以及有丝分裂和减数分裂过程中R-loop的功能差异提供了重要借鉴。
[硕士论文] 郭蒙蒙
生物学;微生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是从早期囊胚中的内细胞团(Inner cell mass,ICM)细胞分离而得到的。在适宜的体外培养个条件下,能够无限制的进行自我复制式的增值即自我更新,通过合适的诱导条件还能够分化成来源于内、中、外三个胚层的各种类型细胞的能力,即多项分化的潜能[1-3]。由于小鼠胚胎干细胞具有的这些特性,使其成为研究发育生物学的理想原材料和疾病模型构建的重要材料。因此,具有重大的经济和社会价值。早期分离得到的小鼠胚胎干细胞需要培养在灭活的饲养层细胞(Mouse embryonicfibroblasts,MEFs)上,并添加含胎牛血清的培养基[1]。对于胚胎干细胞的研究,其中一个重要的内容就是在体外培养的条件下如何去维持其处在多能性的状态。经过大量研究人员的不断探索目前已经建立起了LIF/血清(FBS)培养体系,无血清的N2B27培养体系以及2i[3]培养体系等适合不同胚胎干细胞的体外培养体系。研究胚胎干细胞在体外培养的条件下如何能够维持在自我更新的状态而不分化,就要对其维持自我更新的分子机制进行研究。经过研究人员的不懈努力,已经筛选和鉴定出了一些维持小鼠胚胎干细胞自我更新的关键调节基因[4]如:Tfcp2l1,Nanog, Esrrb,Sox2等,信号通路如:LIF/STAT3,WNT/β-catenin等。虽然这些信号通路和基因已经筛选出来,但是胚胎干细胞的调节是各种基因和信号通路相互作用的复杂过程。目前对于胚胎干细胞如何维持自我更新而不出现分化的分子机制仍然不清楚。因此,需要将细胞学和生物化学以及分子生物学相结合,进一步对胚胎干细胞进行研究,探究其自我更新和分化的调节机制[5]。
  前期已经有文献报道,Id基因家族的成员在无血清的N2B27培养条件下是BMP4/SMAD信号通路的下游基因,过表达后可以部分的代替BMP4的作用来维持小鼠胚胎干细胞的干性[6]。但是,Id基因家族维持mESCs自我更新的机制仍然不清楚。先前有文献报道Id1基因在含血清的培养基中能够部分的代替LIF的作用,通过上调Nanog基因的表达来维持mESCs的自我更新,同时对于中胚层的标志基因T的表达也具有一定的抑制作用[7]。但是,对于Id基因家族的另外两个成员Id2,Id3在mESCs中所发挥的作用并没有报道。因此,本课题主要研究Id2和Id3在mESCs的作用。Id家族表达的蛋白具有螺旋-环,螺旋(helix-loop-helix,HLH)结构域,对于细胞的迁移与周期发生具有促进的作用,同时又能够抑制多种前体的分化,延缓细胞的衰老[8]。因此,其对于胚胎干细胞干性的维持可能具有一定的作用。
  为了研究Id2和Id3这两个基因在mESCs中的作用,我们首先过表达这两个基因,利用相关的生物学软件设计引物并大量扩增所需要的基因片段。验证结果正确后,借助脂质体的特性将重组质粒转染到mESCs中。经过筛选与验证,确定正确的能够稳定遗传的过表达细胞系。我们将建立的过表达细胞系培养在不含有LIF的血清培养体系中进行培养。一段时间后发现过表达的细胞株仍然具有胚胎干细胞的形态,而对照组细胞出现死亡或者已经分化。接着我们对胚胎干细胞的标志性基因(如:Nanog、Oct4、Esrrb、Tfcp2l1等)进行验证。结果显示:过表达Id2或者Id3的细胞系Nanog和Oct4的免疫荧光呈阳性,且多能性的标志碱性磷酸酶染色(AP)也成阳性,而对照组均为阴性。通过对检测结果的分析,过表达后的细胞仍然维持在多能性的状态,而且Id2过表达的细胞与Id3过表达的细胞相比,产生更多的AP阳性克隆,说明其促进自我更新的作用优于Id3。因此,我们后续主要对Id2基因进行研究。接着我们通过shRNA的方法下调Id2基因的表达。结果显示:下调后的细胞出现了分化,不能维持胚胎干细胞的形态,说明Id2对mESCs干性的维持是非常重要的。随后,我们使用转录组测序技术筛选Id2调控的下游靶基因。测序结果显示:实验组和对照组进行比较,有许多基因的表达量发生了变化。通过进一步的筛选,我们发现与胚胎干细胞多能性维持具有相关作用的c-Myc和n-Myc这两个转录因子的表达上调。接着我们通过在转录水平和翻译水平对测序结果进行验证,结果与测序一致。最后,我们对经过分析后所选择的靶基因进行功能性验证。在过表达Id2的细胞系中,下调c-Myc和n-Myc的表达,结果显示:下调后胚胎干细胞出现了分化。在下调Id2表达的细胞系中,分别过表达c-Myc和n-Myc,结果显示:过表达c-Myc和n-Myc后能够对下调Id2后导致的细胞分化具有一定的削弱作用。
  综上所述,我们的研究结果表明,过表达Id2和Id3后的mESCs在不含LIF的血清培养条件下均能够维持在胚胎干细胞的状态。且Id2的作用强于Id3,Id2通过调节c-Myc和n-Myc的表达发挥促进mESCs自我更新的作用。本研究结果进一步揭示了维持胚胎干细胞干性的调控网络和分子机制,有利于以后对干细胞的基础研究和应用。
[硕士论文] 王曼曼
细胞生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是分离自着床前囊胚期内细胞团的细胞(Inner cell mass,ICM),在体外培养具有无限自我复制式增殖的能力,简称自我更新(Self-renewal),以及多向分化的潜能,简称多能性(Pluripotency)。小鼠的ESCs注射到囊胚中具有形成嵌合体动物的能力,这种发育状态称为Na(i)ve或者Ground多能性状态。而小鼠的上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)与人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)在注射到囊胚后不能形成完整的嵌合胚胎。hESCs和mEpiSCs的这种相似的发育状态称为Primed多能性状态。小鼠和人的ESCs需要不同的培养条件来维持其多能性状态。通过在培养体系中加入相应地小因子、生长因子或细胞因子来激活或抑制细胞内的信号通路,从而能够维持ESC的自我更新和多能性。
  无饲养层培养体系中加入血清(serum)和细胞因子LIF(Leukemia Inhibitory Factor)可以在体外长期维持mESCs的自我更新和多能性。LIF作为胞外信号,主要通过激活细胞内的JAK(Janus kinase)/STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3)信号通路,从而激活下游相关转录因子表达来维持mESCs的Naive多能性状态。一些LIF/STAT3信号通路的下游靶基因己被筛选并鉴定出来,例如Gbx2,Klf4,Sps和5和Tfcp2l1等。然而,这些基因在促进mESC自我更新方面的机制仍不清楚。
  转录因子Gbx2(Gastrulation brain homeobox2),即原肠胚形成和脑特异性同源蛋白框2,被证明是LIF/STAT3信号通路的直接下游靶基因。过表达Gbx2的小鼠胚胎干细胞能够在无LIF的血清培养基质中长期维持自我更新和多能性;并且过表达Gbx2还能够促进mEpiSCs重编程为类似于小鼠胚胎干细胞(mESCS-like)的Na(i)fve多能性状态。但是,关于过表达的Gbx2如何替代LIF维持胚胎干细胞自我更新和多能性的分子机制,目前在国内外并未有相关报道。也就是说,LIF/STAT3信号通路中,Gbx2激活哪些关键的下游基因来发挥作用呢?为探究该问题,本课题首先进行了Gbx2靶基因的筛选和鉴定。利用PiggyBac(PB)载体系统转染的方法,在46C小鼠胚胎干细胞中过表达Gbx2(PB-Gbx2),对照组转染PB空载体,然后通过RNA-Seq结合生物信息学分析的方法对Gbx2候选靶基因进行初步筛选,包括显著性基因表达聚类分析、GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析干细胞多能性信号通路相关的基因。qRT-PCR初步验证结果显示,相比于对照组PB mESCs,PB-Gbx2mESCs中Klf4,Nanog的mRNA表达水平增加了约2.0fold以上。为了进一步探宄Gbx2对Nanog和Klf4表达的调控作用,我们从以下三个方面入手。首先,正常LIF/serum培养PB和PB-Gbx2mESCs,撤掉LIF1h到24h,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示:过表达的Gbx2能够抑制LIF的撤除所导致的Klf4下调,却不能抑制Nanog下调。其次,加入4-OHT(4-hydroxytamoxifen)诱导Gbx2-ERT2mESCs中Gbx2的激活,qRT-PCR结果显示:随着4-OHT加入时间的增加(0-120minutes),Klf4的表达也明显上调,而Nanog的表达无明显趋势。最后,在mESCs中下调Gbx2的表达,qRT-PCR结果显示只有Klf4的表达显著降低。以上结果表明,Klf4是Gbx2调控的下游基因。为了进一步证明Klf4是否为Gbx2直接调控的靶基因,本课题从JASPAR核心数据库(the JASPAR CORE database)在线分析和预测Gbx2在Klf4启动予(Promoter)上的结合位点(binding motifs)。之后通过对PB-Gbx246C mESCs进行染色质免疫共沉淀(ChIP)并检测Klf4启动子序列所控制且由Gbx2所激活的荧光素酶的活性,数据证明了Klf4是Gbx2的直接靶基因。
  以上结果验证了Klf4是Gbx2的直接靶基因,那么Gbx2在功能上是否依赖靶基因Klf4的表达呢?因此,本课题后期主要针对靶基因Klf4对Gbx2促进自我更新和重编程功能两方面的影响进行探究。该部分研究结果如下:1.碱性磷酸酶染色及多能性标志基因NANOG蛋白的免疫荧光染色等数据显示,在过表达Gbx2的小鼠46C胚胎干细胞中将Klf4的表达敲低,Gbx2的过表达维持mESC自我更新和多能性的功能显著降低,即:靶基因Klf4介导了Gbx2的促自我更新效应。2.在CD1mEpiSCs中过表达Gbx2,并knockdown靶基因Klf4的表达,与对照组相比,该细胞克隆出现明显的死亡或分化。因此,Klf4的下调消除了Gbx2促进mEpiScs重编程的效应。由此我们得出结论:对于Gbx2促进mEpiSCs重编程为Na(i)ve多能性状态效率的能力,靶基因Klf4也是至关重要的。
  综上所述,本课题揭示了LIF/STAT3信号通路中转录因子Gbx2维持和诱导小鼠胚胎干细胞Na(i)ve多能性状态的分子机制:Gbx2直接调控靶基因Klf4的转录表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新以及促进小鼠上胚层干细胞重编程到类似小鼠胚胎干细胞的状态。这一发现不仅扩大了我们对多能性调控网络的认识和理解,也为进一步探究和优化小鼠甚至人胚胎干细胞的体外培养和分化条件提供了线索。
[硕士论文] 汪凤宇
材料物理与化学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:膜融合是所有活细胞生命过程中的重要进程。包膜病毒通过与细胞膜的融合完成入侵宿主细胞的第一步,受精作用首先需要精子和卵子的膜融合,还有细胞内部的膜融合如胞吐、蛋白质转运和线粒体重塑等。因而,膜融合的研究尤其是其分子机理的研究是许多学科关注的重要课题。
  为了实现膜融合,要先拉近原本独立的两个膜,然后在膜上产生局部的扰动和变形,最后融合成单个膜,整个过程需要克服巨大的能量势垒。在生物系统里,膜融合蛋白负责克服这些能量势垒。许多对膜融合蛋白的研究发现,膜融合时膜蛋白会发生构型转变,伴随着融合蛋白的重排会暴露出一段融合多肽,融合多肽会靠近靶向的磷脂双分子层引发融合反应。融合多肽是一个短的,相对疏水的多肽,它可以实现和融合蛋白一样的膜融合功能。
  毋庸置疑,膜融合对细胞生命体有着至关重要的影响。但是目前人们对于膜融合在分子层面上的机理知之甚少。由于活细胞的复杂性,对于观察到的情况难以进行详尽的解释。因此,为了深入了解融合过程,需要开发组分简单的人工膜融合体系。在这种情况下,简单的融合多肽相比于复杂的融合蛋白显然是一个更好的选择。在这之中,有许多工作是借助源自天然融合蛋白的融合多肽来研究膜融合,如流感病毒的融合多肽。也有人工开发的合成融合多肽,如被广泛研究的GALA是由谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸的重复单元组成的结构。
  但是,相比于膜融合蛋白,大部分融合多肽都有一个缺点,即它们在诱导囊泡融合时,都会伴随着囊泡内物质的外泄。尤其是,目前膜融合体系在药物输送和基因转染等方面的应用发展也受到很多关注,pH敏感的GALA多肽诱导的泄漏融合可以帮助破坏细胞膜,甚至杀死细胞,但是并非所有的治疗都需要破坏细胞膜,比如基因运输。众所周知,破坏细胞膜的完整性会导致细胞坏死,释放出细胞内物质从而引起炎症。所以不管是为了探究融合蛋白的融合机制,还是寻找药物输送需要的非泄漏融合多肽,都迫切需要开发非泄漏的融合多肽。
  在本课题的研究工作中,介绍了两种融合多肽ORB-KK和ORB-KKopen,目前尚未见文献报道。它们源自臭蛙皮肤分泌的一种抗菌肽ORB的衍生多肽。其中ORB-KK是一种发卡状多肽,通过一个分子内二硫键固定,序列为LKGCWTKSIPPKPCFK。ORB-KKopen是基于ORB-KK的开环形式。它们可以在不同pH下诱导大的单层脂质体囊泡发生pH选择性的不泄露的完全膜融合。
[硕士论文] 刘奎升
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:哺乳动物的发育起始于精子(sperm)与卵子(oocyte)的结合,两者形成受精卵(zygote)后启动发育程序,此后受精卵会经历一系列的卵裂(cleavage),细胞数量不断增多,细胞功能形态差异化。1981年由Evans和Kaufman从小鼠着床前囊胚内细胞团中成功分离了小鼠的胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs),由此建立了最早的胚胎干细胞系。之后人们又陆续分离了人、大鼠等的胚胎干细胞。由于胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的生物学特性,所以无论是在生物发育研究方面还是临床医学应用方面都具有非常重要的研究价值。经过前人的大量工作,现在人们已经找到能够在体外长期维持部分胚胎干细胞自我更新状态的方法。但是由于胚胎干细胞维持自我更新是一个极其复杂的生物学过程,因此全面深入的研究胚胎干细胞维持自我更新及分化的调控机制,有利于其广泛而安全的应用。
  目前体外培养胚胎干细胞的培养基主要有两种:一种是LIF/serum培养基;一种是无血清的2i/N2B27培养基:在N2B27中添加CHIR和PD03两种小分子抑制剂(2i)。这两种培养基通过不同的信号通路维持胚胎干细胞的自我更新,LIF/serum主要是通过LIF/STAT3信号通路。本课题组成员之前的研究发现:在众多的LIF/STAT3信号通路的靶基因中,Tfcp2l1是唯一下调之后导致LIF/serum培养条件下的小鼠胚胎干细胞出现分化的基因。这说明了在LIF/STAT3信号通路促进mESCs自我更新的过程中Tfcp2l1占有极其重要的位置。并且人们后来又发现同时过表达Tfcp2l1和klf2可以替代2i维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,所以Tfcp2l1作为多条通路的共同靶基因扮演了十分特殊的角色,但是Tfcp2l1作用的具体机制还不是很清楚。
  为了探究Tfcp2l1在mESCs中调控自我更新的具体机制,我们首先在细胞中下调Tfcp2l1的表达量,检测各个胚层的基因表达,查看其影响了向哪些胚层的分化。结果发现内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)和滋养层(trophectoderm)的基因发生了明显的上调。为了反向验证这个结果,我们使用可经DOX诱导过表达Tfcp2l1的细胞株i-Tfcp2l1进行了拟胚体(EB)分化,结果显示:在EB形成过程中,诱导Tfcp2l1的表达可以抑制mESCs向内胚层、中胚层和滋养层方向分化。这些研究结果表明Tfcp2l1抑制mESCs向中内胚层以及滋养层细胞方向分化。
  TFCP2L1蛋白结构是其发挥作用的基础,于是我们通过实验分析了TFCP2L1蛋白不同结构域在维持mESCs自我更新方面的作用。首先我们在前人研究的基础上把TFCP2L1蛋白划分成了四个结构域:N-terminus(aa1-20)、CP2-like domain(aa21-242)、SAM domain(aa310-376)和C-terminus(aa377-480)。我们把这些片段一一缺失,构建了四个过表达缺失突变蛋白的mESCs细胞株(△NT、△CP2、△SAM、△CT)进行分化实验。结果显示△NT和△CP2细胞株不能在无LIF条件下维持自我更新。紧接着我们也进行了mEpiSCs(mouse epiblast stem cells,mEpiSCs)重编程回到na(i)ve多能性状态的实验。发现△NT和△CP2突变体不能或极少的使mEpiSCs重编程回na(i)ve状态。以上实验结果说明了N-terminus和CP2-like domain对于Tfcp2l1维持mESCs的na(i)ve多能性非常重要。
  我们在培养缺失突变细胞株的过程中发现△NT和△CP2细胞株在正常LIF/serum培养条件下出现了微分化,进一步的qRT-PCR检测发现△CP2细胞株存在比较高的内胚层基因(Gata4和Gata6)的表达;△NT细胞株则表达了较高的中胚层(T和Mixl)和滋养层的基因(Cdx2和Gata3)。于是我们便寻找导致细胞分化的原因,借以探究Tfcp2l1抑制mESCs向中胚层和滋养层分化的机制。经过一系列的实验我们证明了△NT细胞株向中胚层和滋养层方向分化是由Lef1上调表达引起的,即Tfcp2l1通过抑制Lef1的表达来抑制中胚层和滋养层基因的出现。
  那么Tfcp2l1对于内胚层基因的调节又是通过怎样的途径呢,我们查找资料后发现,MTA家族基因或许起着非常重要的作用。我们通过实验发现MTA家族基因中只有Mta1的下调可以导致过表达Tfcp2l1的mESCs分化,并且是向内胚层方向分化。反之,过表达Mta1能够延缓mESCs分化。免疫共沉淀进一步证明两者蛋白之间存在相互作用。由此我们得到初步的结论,即TFCP2L1通过与MTA1蛋白之间的相互作用调节mESCs内胚层基因的表达。
[博士论文] 周永刚
细胞生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从探究生长促进因子在NK细胞组织特异性功能和促进NK细胞发育和成熟过程中的作用机制和转录调控机制方面展开研究,获得如下结果:
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育
  本研究通过高通量基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞,筛选鉴定子宫trNK细胞组织特异性功能分子。通过荧光定量PCR、免疫荧光和流式内标技术检测分析子宫trNK细胞产生生长促进因子(Growth-promoting factors,GPFs)的能力,包括多效生长因子(Pleiotrophin,PTN)、骨生成诱导因子(Osteoglycin,OGN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)。通过绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系研究子宫trNK细胞产生GPFs的调控机制。最后通过检测临床反复流产病人的子宫trNK细胞分泌GPFs能力确定其与胚胎早期发育相关性,进一步通过Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠确认子宫trNK细胞分泌生长促进因子促进胚胎早期发育的重要生理意义。通过上述研究方案取得了如下结果:
  1.基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞
  差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞的基因芯片数据,结果显示子宫trNK细胞与外周血NK细胞功能分子存在显著差异,子宫trNK细胞特异性高表达PTN、OGN和OPN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。
  2.子宫trNK细胞分泌生长促进因子PTN,OGN和OPN
  定量PCR、免疫荧光、流式内标检测结果均验证基因芯片结果,子宫trNK细胞相较于外周血NK细胞特异性产生生长促进因子PTN、OGN和OPN。
  3.HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子
  建立绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系模拟体内子宫trNK细胞微环境,结果显示绒毛外滋养层细胞可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。细胞干扰和抗体阻断实验及721.221-HLA-G细胞系共培养实验结果均提示,绒毛外滋养层细胞过表达的HLA-G分子可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。
  4.反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显著降低
  分析反复流产病人子宫trNK细胞,结果显示病人该细胞数量以及产生生长促进因子能力相较正常人均显著减少。该结果提示,子宫trNK细胞产生生长促进因子能力与正产妊娠密切相关。进一步研究发现发育异常的胚胎相较于正常发育胚胎的HLA-G分子表达显著降低。
  5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
  分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育情况,结果显示生长促进因子联合缺陷小鼠子宫trNK细胞产生生长促进因子能力缺陷后,孕鼠胚胎发育受限,体重、体长值均显著降低。该结果提示子宫trNK细胞可以产生PTN、OGN等生长促进因子促进胚胎早期发育。
  综上所述,该研究通过人转录组基因芯片,比较了子宫NK细胞和外周血NK细胞的功能基因差异,发现早期妊娠中CD11b-CD27-子宫NK细胞高表达PTN、OGN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。胚胎来源的绒毛外滋养层细胞表达的HLA-G与子宫trNK细胞相互作用,诱导NK细胞大量表达生长促进因子,促进胚胎发育。反复流产病人中子宫trNK细胞表达生长促进因子的能力显著下降,不能支持胚胎早期的正常发育。该研究不仅丰富了NK细胞的功能,而且为临床治疗胚胎生长受限和反复流产等相关疾病提供新的思路。
  第二部分 PBX1通过调控生长促进因子转录促进NK细胞在骨髓发育成熟
  本研究从NK细胞进化中关键分子保守性的角度筛选鉴定调控NK细胞发育和成熟的关键转录因子PBX1,并且通过定量PCR,Western blotting,流式内标技术方法检测分析人NK细胞体外分化扩增体系不同时间点的细胞和骨髓NK细胞的关键转录因子PBX1和其潜在靶基因生长促进因子PTN和OGN的表达情况。为了研究关键转录因子PBX1的调控机制,通过电核转技术构建NK细胞基因干扰体系,以及通过慢病毒感染构建NK细胞体外分化扩增过程中基因过表达体系,验证PBX1与生长促进因子的潜在调控相关性。为了进一步研究PBX1调控PTN和OGN的作用机制,利用NK细胞CHIP-Seq技术,荧光素酶报告体系和DNA-pulldown体系确认PBX1转录调控PTN和OGN的机制。接下来为了鉴定PBX1对NK细胞发育和成熟的调控作用,通过构建小鼠骨髓嵌合体模型及条件型Pbx1敲除小鼠模型检测分析NK细胞的发育和成熟情况。最后构建Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型验证PBX1-PTN/OGN轴对NK细胞发育和成熟的关键作用机制。
  本研究通过上述研究方案取得了如下结果:
  1.PBX1是NK细胞高度保守的转录因子
  分析NK细胞关键分子基因在不同物种中的保守性,发现PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。多种实验技术检测结果显示,人骨髓NK细胞相对T细胞特异性高表达PBX1,而且PBX1在NK细胞发育早期和成熟期均有较高表达。
  2.PBX1调控NK细胞表达PTN和OGN
  生物信息学预测分析结果显示,PTN和OGN基因启动子区富含多个转录因子PBX1结合位点。NK细胞干扰和过表达PBX1基因后,流式内标检测生长促进因子PTN和OGN结果显示,在NK细胞中PBX1上调生长促进因子PTN和OGN的表达。为了进一步研究PBX1调控机制,在NK细胞中用抗PBX1抗体富集DNA序列的CHIP-Seq分析结果显示在PTN和OGN基因启动子区中分别存在转录因子PBX1的特异性结合峰。PTN和OGN基因启动子区的荧光素酶报告实验结果和特异性序列的DNA-pulldown实验结果均验证PBX1可以识别特异性序列,并直接结合PTN和OGN基因启动子区。
  3.Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少
  对比分析小鼠骨髓嵌合体模型中Pbx1基因被干扰的骨髓细胞和未被干扰的骨髓细胞中NK细胞的比例和数量,结果显示干扰Pbx1基因表达显著降低骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量。分析Pbx1条件型缺陷小鼠,Vav1-Cre小鼠介导的造血前体期Pbx1条件型缺陷严重影响NK细胞的发育,导致小鼠骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量显著下降,与骨髓嵌合体小鼠模型结果一致。Ncr1-Cre小鼠介导的NK细胞成熟期Pbx1条件型缺陷同样显著减少成熟NK细胞在骨髓和外周的比例和数量。该结果提示,PBX1不仅可以调控NK细胞的早期发育而且对于NK细胞的成熟具有关键调控作用。
  4.PBX1促进骨髓NK细胞末端成熟
  进一步分析发现Vav1-Cre小鼠和Ncr1-Cre小鼠介导的Pbx1条件型缺陷均可以导致小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量显著减少,从而导致外周CD11b+单阳性NK细胞同样比例和数量显著减少。重组表达的生长促进因子PTN和OGN体内和体外恢复实验结果显示,补充的PTN和OGN可以恢复条件型Pbx1缺陷小鼠CD11b+NK细胞的比例和数量。该结果提示,PBX1通过上调PTN和OGN促进NK细胞自身的末端成熟。
  5.PBX1-PTN/OGN轴参与NK细胞库的维持
  分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量,发现与Pbx1条件型缺陷小鼠结果一致,细胞的比例和数量均显著减少。分析小鼠骨髓NK细胞生长促进因子受体的表达,结果显示小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞高表达PTN受体RPTP-β。野生小鼠骨髓细胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓细胞混合转输实验结果显示,少量的野生型小鼠骨髓细胞即可恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周中成熟NK细胞的比例和数量。重组表达的PTN和OGN体内恢复实验结果也显示,补充PTN和OGN可以恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK细胞的比例和数量。该结果提示PBX1通过促进PTN/OGN自分泌支持NK细胞在骨髓的发育和成熟,即PBX1-PTN/OGN轴参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。
  6.PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达
  分析Pbx1条件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞增殖和存活以及迁出骨髓的能力,结果显示PBX1-PTN/OGN轴可以促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓的能力,但不影响NK细胞存活。T-bet作为控制NK细胞末端成熟和迁出骨髓能力的重要检查点转录因子,T-bet表达检测结果显示在条件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞中T-bet表达显著降低,重组表达的PTN和OGN可以显著恢复缺陷小鼠骨髓NK细胞T-bet的表达。该结果提示,PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞在骨髓的成熟。
  综上所述,本研究鉴定PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。在NK细胞中PBX1可以直接分别结合生长促进因子PTN和OGN启动子区调控其转录。PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达促进骨髓NK细胞终末成熟,参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。该研究不仅对于深入理解NK细胞的发育和成熟具有重要意义,而且对于进一步完善基于NK细胞过继转输的免疫治疗方案也有深远影响。
[硕士论文] 韦杰
航天工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,有关细胞内主动机械力在细胞生理过程中扮演重要角色的报道不断增加。研究细胞内主动机械力的产生,不仅是生物力学的根本问题,对生理学和生物医学也具有重大意义。
  细胞内主动机械力的产生涉及到许多蛋白质种类和多种潜在机制,本文关注主要成分为肌动蛋白和肌球蛋白的两种亚细胞结构:肌节和应力纤维。结合有限元方法与蒙特卡罗方法,本文建立了亚细胞结构的机械一化学耦合模型,用数值模拟方法探索细胞内主动力的产生机制。主要研究内容有:
  (1)通过模拟不同ATP浓度下肌节的收缩,研究ATP浓度对肌节收缩的影响。模拟所获得的ATP浓度与肌节收缩速度的关系,同实验结果高度一致。分析不同状态分子马达的受力,发现处于僵直状态分子马达会产生阻碍收缩的阻力。在过高的阻力下,与细肌丝结合的分子马达数目不能随着肌节载荷线性变化,分子马达的受力调控不再有效。较高的ATP浓度可以降低阻力,从而提高肌节收缩速度,并使得分子马达受力得到比较精确的调控。模拟结果还表明肌节的正常收缩需要细肌丝的抗拉刚度高于一定数值。
  (2)通过模拟交联分子与反平行纤维对之间的相互作用,研究各种物理化学参数对纤维力加载过程的影响。模拟结果表明,交联分子依靠结合或解离过程中的极性,可以产生与分子马达可比的机械力,是一种不同于分子马达的主动机械力产生机制。模拟结果还显示,这种机制的力加载过程中力的数值可能会发生剧烈波动,这种不稳定性可能有助于细胞快速响应外部环境变化。
[博士论文] 周兴东
兽医学;预防兽医学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:自噬是真核生物中一种保守的对细胞内物质周转的通路,靶向结构被自噬小体包裹隔离并递送到溶酶体中进行降解,降解后的物质重新被细胞生物合成所利用。自噬参与许多疾病的病理生理学机制,其调节功能已被证明对于许多特定疾病的攻克有着积极作用。自从20世纪50年代Chirstian de Duve在电子显微镜(Electron Microscopy,EM)下首次发现自噬小体后,在电镜下对自噬小体等自噬相关结构的观察以及量化分析成为自噬鉴定方法的金标准。溶酶体抑制剂,如巴弗洛霉素A1(Bafilomycin,BafA1)和氯喹(Chloroquine,CQ),被认为具有阻断溶酶体降解的能力,经常在抑制自噬的体外实验中使用并可以互相替换。CQ是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物,因此是最具有广阔临床应用前景的自噬抑制剂。然而,CQ阻止自噬的确切机制仍然未被可靠地证明。化学药物对细胞自噬有影响的同时,很多研究证明病毒感染也能够诱导或抑制自噬,从而利用其相关反应协助病毒复制,或降低被细胞自身代谢更新所降解的可能。猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是属于alpha-冠状病毒(alpha-Coronavirus,alpha-CoV)亚属的冠状病毒(Coronavirus,CoV),在感染的哺乳期仔猪中造成很高死亡率,并且全球分布广泛,对农业生产特别是生猪产业造成了巨大的经济损失。尽管PEDV在兽医是很重要的一种家畜传染病病原,但关于其与自噬关系的研究很少,在很大程度上仍然是未知的,仅有的少量研究结果阐述了PEDV与自噬的关系,但这些研究并没有肯定彼此的结果,因此对于PEDV是否诱导自噬尚存争议。同时PEDV在宿主细胞中诱导的细胞内膜结构重塑的研究更基本为空白,乃至整个alpha-CoV仍然没有对其在宿主细胞中诱导的所有形态学改变的时间和全面描述的研究。
  本研究从使用电镜观察细胞的超微结构变化入手,分析这两种外来物对细胞内结构的影响。首先使用Western blot、长寿蛋白降解等多种自噬研究方法对药物处理和病毒感染后的细胞进行分析。然后使用常规电镜的手段对其进行超微结构变化定性和定量的全面分析,随后使用高通量免疫荧光显微镜、免疫电子显微镜(Immuno-EM,IEM)以及自噬功能的多项测定方法分析各超微结构的功能。为了深入全面的探索了其在整个感染生活史中细胞内超微结构变化及膜结构的重组,本研究还选择了时间进程(time course)的方法,结合病毒RNA合成、后代病毒释放、病毒复制等参数来确定不同膜结构出现在病毒生命周期的哪个阶段。
  本研究观察到两种自噬工具药虽然同为溶酶体抑制剂,但对细胞的超微结构影响有着很大的差别,尤其是CQ,不仅能够诱导与其他溶酶体抑制剂相似的降解小体结构,还有不同的体积较大的液泡产生,同时证明了这种液泡可能具有降解功能。本研究还发现,CQ通过减少自噬小体和溶酶体融合来抑制自噬潮,而BafA1是通过抑制溶酶体降解功能。此外,CQ引起高尔基体和内溶酶体系统的严重混乱,这可能是融合障碍的原因之一。
  虽然Western blot对微管相关蛋白轻链3(Light Chain3,LC3)的检测显示PEDV加强了LC3的脂质化进程,但仅仅能够非常低频地观察到自噬小体,但是由于其数量过少、频率过低而不能够进行量化分析。本研究结果发现,PEDV感染能够在形成双层膜囊泡(Double Membrane Vesicle,DMV)、卷曲膜(Convoluted Membrane,CM)和LVCV之前,诱导内质网和高尔基体发生显著重组。这些结果与已发表的内容一致,此外,还发现,内质网和高尔基体经历了其他CoV未观察到的变化,如内质网增生和高尔基液泡化导致形成称为不规则囊泡簇(Irregular Vesicle Cluster,IVC)的结构。还发现,PEDV与HCoV-NL63和TGEV相似,内质网与高尔基是PEDV病毒粒子装配的主要平台。
  总之,首先本研究通过使用电镜对细胞内部超微结构的观察以及荧光水平标签蛋白的追踪等方法,在与BafA1比较研究中发现了很多差异,认为CQ作为自噬工具药并不能理想替代BafA1,从而填补了相关方面的空白。其次,本研究结果显示PEDV对自噬有一定的诱导作用,这有助于了解PEDV感染的发病机制,并为有效的治疗策略的发展提供新的见解。最后,细胞内膜结构系统的支持是细胞行使功能的关键因素。因此推测,PEDV感染诱导的细胞膜结构重排可能是导致猪小肠功能障碍以及腹泻的重要原因。本研究使用电镜以及荧光水平等相关方法,解读调节PEDV诱导膜结构重排生物合成的分子机制可能有助于更精准地开发抑制病毒复制的新型疗法和药物,并且开辟了在体内使用这些疗法和药物作为有效的预防和预防治疗的可能性。
[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 任婧
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:绵羊是非常重要的经济型家畜,为人们提供肉、奶、皮毛等产品。运用卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer, ET)技术对优质家畜进行良种扩繁,能有效提高家畜生产力。卵母细胞的发育与成熟是这些技术的基础,因此,卵母细胞成熟的品质好坏直接影响子代能否成活及存活后代的健康状况。从卵母细胞成熟到早期胚胎发育的过程中,除内源性基因的表达调控作用之外,培养环境中的信号分子作用也影响其能否正常发育。通过旁分泌因子发挥调控作用是这种调控最常见、最直接的方式之一。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、基质细胞衍生因子-1(Stromalcell-derived factor-1,SDF-1)、神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是卵巢旁分泌因子。研究发现CTGF能促进小鼠、大鼠卵泡发育,SDF-1能增加颗粒细胞存活和提高胚胎质量,NGF能以剂量依赖的方式增强山羊初级卵泡的体外生长,HGF能诱导牛的颗粒细胞增殖。但这四种旁分泌因子是否能够作用于绵羊卵母细胞,并提高卵母细胞体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率,尚未做过充分研究。因此,我们利用绵羊卵母细胞作为实验材料,研究CTGF、SDF-1、NGF和HGF单独添加和组合添加对绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育的作用。
  本研究主要内容包括:⑴在绵羊卵母细胞成熟液中分别单独添加不同浓度梯度的CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子,统计绵羊卵母细胞成熟率,找到单独添加CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子的最佳浓度。接着将这四种因子组合添加到绵羊卵母细胞成熟液和早期胚胎发育液中,统计绵羊卵母细胞成熟率、卵子激活率和早期胚胎发育率。以卵丘扩散指数(cumulus expansion index,CEI)、细胞膜表面早期细胞凋亡信号和胚胎的囊胚细胞数作为评价卵母细胞成熟和早期胚胎发育潜能的指标,并且检测了凋亡基因Bax、Bcl-2、P53和PTGS2的基因表达量。⑵在四种旁分泌因子单独使用的实验中,添加30.0 ng/mLCTGF因子,10.0 ng/mL SDF-1因子,3.0 ng/mL NGF因子,100.0 ng/mL HGF因子能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育;在四种旁分泌因子组合使用的实验中,添加30.0 ng/mL CTGF+10.0ng/mL SDF-1+3.0 ng/mL NGF+100.0 ng/mL HGF时,卵母细胞成熟率、激活率以及早期胚胎各个时期的发育率都优于单独添加单一因子组和不添加因子组;组合因子对CEI、抑制卵子凋亡率和提高囊胚细胞数有显著作用;组合因子的使用能降低卵丘细胞、卵母细胞和囊胚细胞中凋亡基因的表达量。⑶旁分泌因子CTGF、SDF-1、NGF和HGF能促进卵母细胞成熟;四种因子组合使用能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎的发育。
[硕士论文] 金连丰
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。
  研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。
  本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用qPCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。
  研究结果如下:
  (1) RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:
  RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organdle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;
  (2) miR-139-5p靶基因的验证
  选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。
[硕士论文] 张晓枫
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:毛囊的生长发育过程受到一系列生长因子和信号通路的调控,成纤维细胞生长因子家族和骨形成蛋白家族就是其中两种参与调控的生长因子。FGF5在影响被毛长度方面的作用现已被广泛证实,Noggin主要通过抑制BMPs功能的发挥进而参与毛囊生长发育的调控。CRISPR/Cas系统作为一种新兴的第三代基因编辑技术,有简便易行、省时高效的优势,其应用对于畜牧育种而言可以大大提高育种的效率,缩短育种时间,减少育种成本,也可以实现许多之前难以完成的工作。本研究的出发点是希望利用CRISPR/Cas系统和原核显微注射技术构建FGF5、Noggin双基因编辑小鼠模型,通过研究这两个基因对毛囊发育的影响,为加快优良产绒性状绒山羊新品种培育工作提供参考。本实验通过脱毛实验观察小鼠的毛发生长速度;通过石蜡切片H&E染色的方法检测小鼠皮肤毛发的再生情况及毛囊分布和毛干数目的变化;通过实时定量PCR检测阳性小鼠皮肤组织中与毛囊发育相关基因的表达情况。
  本研究主要内容包括:⑴通过原核显微注射法将基于CRISPR/Cas9系统作用机理构建的FGF5-gRNA、pKI-Noggin载体以及Cas9质粒注入小鼠受精卵原核中,最终移植268枚注射后胚胎,获得36只新生小鼠,经鉴定,共获得6只不同类型阳性小鼠,分别是3只FGF5基因敲除小鼠、2只Noggin基因过表达小鼠和一只FGF5基因敲除且Noggin基因过表达的小鼠,总阳性率为16.7%。⑵通过脱毛实验、石蜡切片、实时定量PCR技术检测阳性小鼠和野生型小鼠。结果表明,与野生型小鼠相比,FGF5基因敲除小鼠毛发生长速度相对较慢,毛囊独立生长,但分布较为杂乱,毛囊直径基本不变,毛囊数量增多;Noggin基因过表达小鼠毛发生长速度次之,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少;FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达的小鼠毛发生长速度最慢,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少。实时定量PCR检测结果显示,92号、601号Noggin基因过表达小鼠,633号FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达小鼠皮肤组织中Noggin基因的mRNA水平的相对表达量分别是野生型小鼠的2.67、8.36、35.35倍,三只阳性小鼠在mRNA水平都表达了Noggin基因。另外,三种不同类型小鼠的β-catenin、VEGF、Tβ4三个基因的mRNA的相对表达量较野生型小鼠也有不同程度的上调。
[硕士论文] 丁颖
生物化学与分子生物学 安徽师范大学 2017(学位年度)
摘要:树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是感知外来刺激启动适应性免疫应答的重要免疫细胞。DCs是一种异质性的细胞群体,根据其呈现的表型和功能的不同,可分为许多亚群。例如,最近的一项体内研究显示,在生理状态下淋巴器官常驻型的传统DC(conventional DCs, cDCs),即稳态DC,具有极强刺激CD4+T细胞增殖的能力;而在炎症条件下由单核细胞衍生的DC(monocyte-derived DCs,moDCs),即炎性DC,则具有促进Th1/Th17的极化作用。然而,体内DC数量极少难以转化应用于临床治疗。我们之前的研究已经证实体外GM-CSF诱导的骨髓DC(GMDC)相当于体内的炎性DC,Flt-3L诱导的骨髓DC(FLDC)相当于体内的稳态DC。但体外的FLDC和GMDC在促进T细胞增殖与分化方面的功能性质是否也与体内DC相同目前还不清楚。据此,本硕士课题以体外骨髓培养的DC为材料,深入探讨稳态及炎性两种不同DC的功能特性及其分子机制,为临床应用打下基础。我们发现,在T细胞活化增殖方面,稳态FLDC和炎性GMDC都有较强诱导CD4+T细胞活化和增生能力,但GMDC对细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激反应不敏感。在T细胞分化方面,GMDC能促进Th2和Th17的分化,而FLDC则偏向推动T细胞朝Th1方向转化。进一步深入研究发现,LPS刺激后GMDC不能进一步提高CD4+T细胞增殖的部分机制是由于NO的产生,而两种DC不同T细胞分化能力的原因则来自于它们各自分泌的T细胞极化因子不同。我们据此认为体外培养的FLDC和GMDC可模拟体内稳态和炎性DC,在免疫应答过程中分工协作,各司其职。合理恰当地运用它们既能正调又能负调的双重免疫作用,如在感染和癌症治疗中提高免疫反应,或在自身免疫疾病和器官移植中降低免疫应答,可为相关免疫疾病的治疗提供有效的防控策略。
[硕士论文] 吴雪臣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。
  本研究选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-1-Methylxanthine(IBMX)和cAMP激活剂Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0μM、30.0μM、450.0μM和150.0μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0μM Forskolin+0.3μM Mil,50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX,50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil,50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body, PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μMdbcAMP+10.0μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μMIBMX或50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0.μM IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX组与对照组没有显著差异。研究表明:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
[硕士论文] 贺妍
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  作为着丝粒重要组件,Zwint-1参与招募动力蛋白激酶和动力蛋白,促进染色体运动或调控纺锤体检查点,在着丝粒组装和有丝分裂中期适当沉默 SAC起到关键作用,以此确保染色体正确分离。通过进一步实验,来考察Cdc20与 Zwint-1之间的关系,以及 D-box序列在这其中发挥的作用,为进一步理解控制染色体分离的分子机制打下基础。
  方法:
  经PCR、双酶切鉴定等一系列实验技术来构建重组质粒pCMV-myc-Cdc20、pcDNA3-flag-Zwint-1、pcDNA3-flag-Zwint-1ΔD-box、pEGFP-Zwint-1和 pEGFP-Zwint-1ΔD-box;采用胸腺嘧啶双阻断法将HEK293T细胞同步化在 G1/S期,用流式细胞术通过碘化丙啶染色来确定细胞时相,用Western blot检测Zwint-1蛋白在细胞周期的表达水平;使用放线菌酮和MG132处理细胞,经Western blot检测来观察Zwint-1蛋白在体内的降解情况;对HEK293T细胞转染了质粒 pCMV-myc-Cdc20,即过表达 hCdc20,做了Cdc20与 Zwint-1之间的免疫沉淀实验;过表达 hCdc20和 RNA干扰 Cdc20,用Western blot来检测内源性Zwint-1蛋白质水平;将分别编码Zwint-1-flag、 Cdc20-myc和 Ub-HA的质粒共转染 HEK293T细胞,做了体内泛素化分析;删除了 Zwint-1的两个D-box基序(128 RTQL131和203 RDKL206),将突变序列亚克隆进pcDNA3-flag,与质粒pCMV-myc-Cdc20共转染,用Western blot来检测D-box缺失的Zwint-1蛋白质水平。
  结果:
  Zwint-1蛋白水平随细胞周期时相变化而变化;Zwint-1蛋白水平在用放线菌酮孵育8 h和16 h后显著降低,在用MG132孵育6 h和12 h后蛋白水平迅速增加;免疫沉淀结果为阴性;过表达 hCdc20使 Zwint-1蛋白质含量显著减少;RNA干扰抑制Cdc20活性时Zwint-1蛋白和cyclin B显著积累;当过表达Cdc20-myc时,Zwint-1蛋白多泛素化水平显著上升;缺乏D-box基序的Zwint-1不能被Cdc20识别降解。
  结论:
  Zwint-1的蛋白水平随细胞周期出现周期性变化;Zwint-1通过 APC/C-Cdc20途径泛素化降解;其机制是Cdc20识别Zwint-1的D-box基序。
[硕士论文] 卢晓
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:ATM(mutated in Ataxia-Telangiectasia)是一个重要的表达丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶的基因,在DNA损伤与修复中发挥重要作用。DNA双链断裂会引起ATM的激活,从而引发下游一系列损伤修复反应。此外,染色体的高度动态变化也会激活ATM,iPS细胞诱导过程中染色体会发生巨大变化和高度修饰,但很少有研究报道ATM基因在重编程过程中的作用。
  本研究利用基因敲减技术分析了一些参与细胞代谢与生命活动的蛋白酶与蛋白激酶对于体细胞重编程的影响。结果显示,除chuk基因外,敲减其他磷酸化相关基因后iPS细胞的诱导效率均有所提高。其中,敲减ATM不但提高iPS诱导效率,同时获得的iPS克隆折光性很好,边界清楚,且形成的转分化细胞很少,iPS克隆非常均一。进一步分析显示,随着敲减ATM比例的增高,重编程的效率降低,且生成的克隆内源性Oct4未被激活,不能继续培养传代,而低敲减ATM的克隆经检测重编程完整,多能性基因表达正常。此外,敲减ATM后,抑制P53和H2AX的磷酸化,同时发现敲减ATM后,细胞自噬相关蛋白LC3被激活,自噬在重编程过程中也发挥着重要作用。最终我们得出结论,适当敲减ATM会通过降低P53-pi和γH2AX的水平而提高重编程的效率。
[硕士论文] 翁雷
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:X染色体失活是雌性哺乳动物早期胚胎发育的重要事件,而非编码基因Xist是X染色体失活的关键调控因子。Xist RNA通过包被即将失活的X染色体并使其发生沉默。而在分化细胞的重编程过程中,失活的X染色体伴随着Xist的下调而发生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)结合到Xist基因的第一内含子区,以稳定ESC的多能性状态。但有研究报道,Xist的表达不会因为敲除第一内含子而受到影响,也不能提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制备效率。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-likeeffectors based designer Transcription Factors, Tale-dTFs)Repressor6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制备了R6-MEF细胞系,并通过细胞生长曲线制备、免疫荧光染色、实时定量PCR及流式细胞仪筛选分析等技术手段,证明了该R6-MEF细胞系具有不同于野生型MEF细胞系的特点。
  本研究主要内容包括:⑴利用脂质体转染法制备的R6-MEF细胞形态类似于低代次的野生型MEF细胞系,呈短梭状,而生长速率明显高于野生型MEF细胞系;R6-MEF细胞系可传至50代以上,且未见明显异常。⑵实时定量PCR结果显示,R6-MEF中的多能性基因Nanog、Sox2、Oct4及生殖相关基因Prdm14均有不同程度的上调;但R6-MEF中NANOG的免疫荧光染色结果呈阴性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫荧光染色结果显示,R6在一定程度上降低了该表观遗传修饰的印迹水平。⑶流式细胞分选结果显示,野生型MEF细胞系中的GOF-GFP呈阴性,而R6-MEF细胞系中的GOF-GFP呈弱阳性。⑷核型分析结果显示,R6-MEF细胞与野生型小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的染色体均为40条,未见明显异常。
[硕士论文] 代洋
生物学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究KLF15对VEGF的调控作用和对血管生成的影响,揭示KLF15调控VEGF所介导的的血管生成新功能机制。
  方法:提取糖尿病患者基因组DNA,构建DNA池,测序获知VEGF启动子的突变位点并分析不同单倍型和发病相关性;之后分别构建带有不同VEGF启动子区的pGL3-Basic质粒,利用双荧光素酶报告系统检测VEGF不同单倍型对启动子活性的影响;再利用MatInspector软件,对不同启动子序列进行生物信息学分析;通过ELISA和Western Blot技术检测过表达或干扰KLF15后VEGF的蛋白表达;最后利用增殖和迁移实验阐明KLF15对VEGF介导的血管生成产生的影响。
  结果:通过DNA池测序检测,在VEGF基因启动子区-460位和-634位分别检测到T>C和C>G的单碱基突变,且关联分析发现这两个位点的突变均能显著影响微量白蛋白尿水平。双荧光酶系统检测启动子活性实验显示不同单倍型对启动子活性有明显影响。依靠生物软件分析发现-460位突变能够改变转录因子KLF15的结合情况。ELISA及Western Blot结果证明KLF15可影响VEGF的表达,最后实验表明KLF15能影响HUVEC细胞增殖和迁移,进而影响血管生成过程。
  结论:KLF15能抑制VEGF介导的血管生成过程。
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