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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[博士论文] 秦文昊
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  胆固醇对于维持细胞正常的生理功能有着重要的意义。随着人类生活方式及饮食结构的改变,高胆固醇血症患者急剧增多。大量研究表明,高胆固醇血症是许多严重疾病的危险因素,包括动脉粥样硬化,冠心病及脑卒中等。但是,胆固醇与恶性肿瘤之间的关系一直备受争议。在一些流行病学研究中,血液总胆固醇水平与肝癌、食管癌、肺癌、胃癌等的发病呈明显的负相关,而与膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌等的发病呈正相关,而且相关关系会受性别和人种等差异的影响。这些结果表明胆固醇在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,且在不同类型的肿瘤中具有不同的作用模式,但其分子机制一直未被阐述清楚。因此,深入研究高胆固醇血症对肿瘤的影响并明确相关分子机制,对于肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。
  方法及步骤:
  1.利用循证医学方法研究血胆固醇水平与多种肿瘤发生风险的关系
  检索收集已发表文献,提取数据进行循证医学统计和分析,明确胆固醇代谢异常对总肿瘤、肝癌、肺癌发病率的影响,为本项目的研究题目提供可靠的现实依据。
  2.构建饮食诱导及基因型诱导小鼠高胆固醇血症模型
  高胆固醇饮食诱导:给予6-8周龄野生型C57小鼠高胆固醇饮食4周,诱导小鼠产生高胆固醇血症。
  ApoE基因缺失小鼠:C57遗传背景下的ApoE-/-小鼠会自发产生高胆固醇血症。被广泛用于动脉粥样硬化相关研究,本研究采用6-8周龄ApoE-/-小鼠进行后续实验。
  3.在高胆固醇血症小鼠模型基础上,构建小鼠荷瘤、诱癌以及肿瘤转移模型
  荷瘤模型:采用皮下荷瘤的方法,观察黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌细胞在高胆固醇血症小鼠模型中的生长情况。
  诱癌模型:通过给予出生15天小鼠腹腔DEN注射(25mg/kg)诱发肝癌形成,观察高胆固醇血症小鼠的肝癌发生发展情况。通过支气管灌注Cre病毒的方法,诱发KrasG12D小鼠肺部特异性的Kras突变激活,诱发小鼠肺癌,观察小鼠高胆固醇血症对肺癌发生发展的影响。
  黑色素瘤肺转移模型:经小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤肺转移模型,观察小鼠高胆固醇血症对黑色素瘤肺转移的影响。
  4.通过转录组测序等方法探寻高胆固醇影响肿瘤发生发展的途径
  收集对照组及高胆固醇组的小鼠荷瘤组织,进行转录组测序分析,并对差异基因进行KEGG及GSEA分析,探索相关的基因及信号通路改变。
  5.检测高胆固醇对免疫细胞的影响,明确发挥作用的关键免疫细胞亚群
  利用PCR及流式检测方法检测荷瘤组织中免疫细胞的相对比例,观察自然杀伤细胞(NK)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞及DC细胞的相对比例和绝对数变化。
  利用相应清除性抗体清除各类免疫细胞,观察对照小鼠及高胆固醇小鼠的肿瘤生长差异,明确发挥作用的免疫细胞亚群。
  6.检测高胆固醇对于关键免疫细胞功能以及杀伤能力的影响
  利用PCR及流式检测方法,分析高胆固醇组免疫细胞的活性,并通过细胞毒性实验、脱颗粒实验及细胞过继实验,证明高胆固醇组来源的免疫细胞在体内外,均具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力。
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞胆固醇含量的变化,并通过体外人为调节免疫细胞胆固醇水平,调节其杀伤肿瘤细胞的能力。
  7.探索高胆固醇影响关键免疫细胞功能的分子机制
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞中免疫受体数量、定位的变化,相关通路的活化情况,明确高胆固醇调控免疫细胞功能的关键通路与分子事件。
  8.探索通过调节胆固醇代谢改善免疫细胞抗肿瘤活性的方式方法
  利用慢病毒过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)或PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,检测这些方法对免疫细胞内胆固醇含量及其肿瘤杀伤能力的影响。
  结果:
  首先,我们通过荟萃分析(Meta),发现人群恶性肿瘤总体发病率,以及肝癌、肺癌的发生率与血总胆固醇水平呈明显的负相关。在高胆固醇组小鼠体内,多种肿瘤的发生、生长及转移受到抑制。转录组测序分析证明,对照组与高胆固醇组的差异基因在免疫系统及免疫细胞活化相关通路有着明显富集。同时,高胆固醇血症对肿瘤的抑制现象在NSG小鼠中不复存在,这表明此抑制作用可能和免疫系统密切相关。随后,我们发现在高胆固醇小鼠的肿瘤组织中NK细胞比例明显上调,而其他免疫细胞的比例则没有显著变化。NK细胞清除性抗体或清除剂可以消除高胆固醇对肿瘤生长的抑制作用,这表明高胆固醇主要通过NK细胞发挥抗肿瘤作用。
  随后,我们检测发现高胆固醇组小鼠体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强,细胞内总胆固醇含量及膜胆固醇含量明显上升。在体外,以胆固醇处理正常NK细胞可增强其细胞毒性,而用环糊精降低细胞胆固醇含量可下调高胆固醇组NK细胞肿瘤杀伤能力。在机制方面,我们发现细胞内胆固醇蓄积会增加细胞表面的脂筏数量,使NK细胞的激活性受体NCR1及NKG2D在脂筏定位增多,下游的信号通路激活,从而上调了NK细胞的活化能力。
  最后,我们证实过表达LDLR,或通过PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,均可以增加NK细胞的胆固醇含量,进而增强其抗肿瘤活性。
  结论:
  血液中的胆固醇水平对免疫细胞的抗肿瘤作用具有重大影响。NK细胞内胆固醇蓄积可增加细胞膜表面的脂筏数量,促进激活性受体向脂筏的移位,进而激活下游信号通路,增强其肿瘤杀伤能力。目前,肿瘤的免疫治疗正在快速发展。我们的研究表明升高免疫细胞内胆固醇水平,可增强其杀伤功能,改善其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路与新策略。
[硕士论文] 罗旭
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝炎-肝硬化-肝癌被认为是肝癌发生过程中“三部曲”。临床大量资料显示,大多数肝癌患者有肝纤维化或肝硬化背景,且伴肝硬化背景的肝癌患者中位生存期下降,肝窦内压力增加及肝硬化促进肝癌进展。研究发现肝脏硬度可作为肝癌发生的独立危险因素,患者肝纤维化程度越重,肝癌肝内转移率也越高,说明肝纤维化与肝癌细胞增殖及侵袭转移间也存在非常重要的关系。门脉高压时,肝窦内压力大幅增加,肝窦显著扩张,肝细胞受到了肝窦压力和肝窦扩张后的张应变力等生物力学因素直接或间接的作用。但是,肝纤维化所致张应变力的变化对肝癌细胞的影响及其相关机制,如牵涉到的MicroRNAs(miRNAs)等未见报道。众所周知,miRNA是一种长21~23核苷酸的非编码RNA分子,在调控细胞增殖、分化和凋亡中起着重要的作用。一些研究发现miRNAs同时与张应变力和肝癌均有关系。所以本研究运用流式细胞术及cck-8,Brdu等方法测定张应变力对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响。使用Agilent单色标记芯片实验筛选差异表达MicroRNAs,再使用RT-PCR证实。并运用GO和Pathway分析基因。为肝癌力学微环境是如何影响肝癌细胞的行为提供有用的信息。
  方法:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  周期性张应变加载细胞主要有三个参数:张应变幅度、张应变频率和张应变时间。通过固定其中两个参数,变化另一个参数以观察此参数下的张应变对肝癌HepG2细胞的影响(除此三个参数外其余实验条件均相同)。
  (一)细胞牵拉力加载方法
  采用Flexcell FX4000T张应变力加载装置进行张应变力加载。方法是将体外培养的人肝癌细胞系HepG2细胞用不含PBS的DMEM培养基同步化24h后接种在鼠尾胶原包被后的Flexcell六孔板上,细胞贴壁后把六孔板置于培养箱内的BioFlex Culture Plate底座上,首先开启真空泵和桥接器,然后在相连电脑上启动Flexercell Strain中央控制器,根据需要设定张应变力参数进行张应变力加载。
  (二)最适张应变力加载条件的确定
  把实验分为三组:1.张应变时间组:固定频率1Hz、张应变幅度15%,设立张应变时间分别为2h、6h、12h、24h、48h共5个实验组,另设不加载张应变组为对照组。2张应变频率组:固定张应变幅度15%、时间24h,设立张应变频率分别为0.5Hz、1Hz共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。3.张应变幅度组:固定张应变时间24h、张应变频率1Hz,设立张应变幅度分别为5%、15%共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。张应变力加载结束后,以标准程序用流式细胞仪检测,评价不同张应变力加载条件对细胞增殖的影响,确定最适张应变条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  将同步化24h的HepG2细胞同样在Flexcell FX4000T张应变力装置进行张应变力加载,另设无张应变力加载组为对照组。使用BrdU法和CCK-8法验证上步确定的肝癌细胞最适张应变力加载条件对HepG2细胞增殖能力的影响。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  采用上海欧易生物医学科技有限公司的Agilent Human miRNA芯片。样品总RNA使用Trizol法提取后,参照其公司芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。采用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理。利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<=0.05。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  采用Trizol法提取实验各组HepG2细胞的总RNA,紫外检测仪分别在260nm和280nm波长下检测RNA的浓度及纯度。用逆转录试剂盒(Thermo Fisher)合成cDNA,以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。实验同步以U6作为内参照。mRNA表达量的分析采用比较Ct数据法(2-△△Ct)进行。验证筛选出的差异miRNAs是否准确。
  四、张应变力调节肝癌细胞增殖功能的生物信息学分析
  利用3个数据库(Targetscan,microRNAorg,PITA)共同对差异miRNA进行靶基因预测,接着对预测出的靶基因进行GO分析和KEGG富集分析,以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路。最后,对差异miRNA进行非监督层次聚类,利用热图的形式展示差异miRNA在不同样本间的表达模式。探索其影响肝癌细胞功能的可能生物学过程。
  结果:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  摸索出使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板使HepG2细胞稳定贴壁生长的方法,选定张应变幅度15%、频率1Hz、时间24h为后续实验条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  BrdU法与CCK-8法结果均显示与control组相比,张应变幅度15%、频率1Hz、24h的张应变力加载促进了细胞增殖和代谢活力,结果具有统计学意义(P<0.0001)。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  使用张应变力加载条件:幅度15%,频率1Hz加载HepG2细胞24h后,使用miRNA芯片实验筛选差异表达miRNAs,共检出2557个miRNA,其中7个差异较大(表达差异>2倍,且P<0.05)miRNA,分别是hsa-miR-296-5p、hsa-miR-6752-5p、hsa-miR-6794-5p、hsa-miR-6889-5p、hsa-miR-7845-5p(上调),hsa-miR-4428、hsa-miR-503-5p(下调)。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  使用RT-PCR实验验证筛选出的7个差异表达miRNA,结果显示qRT-PCR检测到的7种miRNAs变化趋势与miRNA芯片结果一致。
  四、张应变力调节肝癌细胞功能的生物信息学分析
  利用生物信息学对7种差异miRNAs的潜在靶基因进行了搜索,数据库miRNAorg、PITA和TargetScan分别预测了2306、1277和16205个靶基因,取3个数据库的交集,共224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得关注。为了解这些目标基因的生物学特性,GO分析结果显示目标基因的生物学功能集中在:细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物,微管细胞骨架,蛋白激酶,RNA聚合酶Ⅱ活性,DNA模板转录的正调控,骨骼肌组织发展的正调控,血管形成等一系列生物学功能上。KEGG Pathway分析发现52个显著的通路,包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、内分泌抵抗等疾病相关通路和TGF-β,MAPK,PI3K-Akt,FoxO,Ras等信号通路。
  结论:
  一、使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板可以使HepG2细胞稳定贴壁生长,张应变力加载能促进人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖,特别是在牵拉幅度为15%,牵拉频率为1Hz,牵拉时间为24小时的牵拉条件下促进效果最显著。
  二、使用最适条件加载后的HepG2细胞miRNAs表达产生明显变化,筛选出7个差异较大的miRNA和224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得后续进行探索相关功能和机制。
  三、GO和KEGG分析显示目标基因的生物学功能集中在与多种癌症相关的功能上,也包括TGF-β、MAPK、PI3K-Akt等与各种癌症关系密切的信号通路上。待验证的可能机制为张应变力相应的hsa-miR-503-5p调节SMAD7基因与TGF-β信号通路。
[硕士论文] 沈皓
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:中国HCC的发病例数和死亡例数占全球的50%以上,但各个地区的HCC发病率差异明显。本研究旨在比较中国大陆肝癌高发地区(High HCC prevalence regions)和肝癌低发地区(Low HCC prevalence regions)的肝癌病人在肝切术后的远期预后情况,找出不同地区之间影响预后的危险因素的差异。
  研究方法:回顾性分析了1996-2010年间在东方肝胆外科医院进行肝癌切除术并获得组织病理学证实的肝癌病人临床病例资料。参照《2012年中国癌症登记年报》,将病人按照出生地分为高发地区组和低发地区组。计量资料的比较采用Mann-Whitney非参数U-检验,计数资料的比较采用卡方检验,生存资料的分析采用Kaplan-Meier法、对数秩检验和Cox风险回归分析。使用R3.4.1和SPSS18.0统计软件对统计结果进行分析。
  研究结果:本研究随访日期截止至2013年6月30日,中位随访时间为24.1个月。研究共纳入4919例病人,其中3370例来自肝癌高发地区,1549例来自肝癌低发地区。在全部病人中,高发地区组的5年肿瘤复发率明显高于低发地区组(82.9%比69.2%;p<0.001),而其5年生存率则低于低发地区组(48.8%比53.7%;p<0.001)。多因素分析发现,来自高发地区在肿瘤复发和总体生存中都是独立危险因素(TTR[HR]:1.18;OS[HR]:1.24)。
  按地区不同对病人进行亚组分析后发现,来自高发地区的病人HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性率更高并且HBV-DNA>2000IU/mL,AFP>20ng/ml,微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)阳性及肿瘤低分化(Edmondson-Steiner分级:Ⅲ-Ⅳ级)的比例也更高。两地区病人共同的预后独立危险因素为AFP水平>20ng/mL,肿瘤直径>5cm以及MVI阳性。低发地区组的预后独立危险因素是年龄≤50岁,男性和输血,而高发地区组的独立危险因素为HBeAg阳性,HBV-DNA>2000IU/mL,TBIL>17.1umol/L,非解剖性肝切除以及肿瘤低分化。
  全部病人中,符合米兰标准的病人共2497例(高发地区组1739例,低发地区组758例);符合BCLC0期标准的病人共370例(高发地区组264例,低发地区组106例)。多因素分析发现,来自高发地区在以上两个分期中依旧是肿瘤复发和总体生存的独立危险因素(米兰标准:TTR:1.27;OS:1.37;BCLC0期:TTR:1.94;OS:2.50)。
  对全部病人、符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中HBeAg阳性病人分别进行亚组分析后发现,高发地区组的1、3、5年复发率均高于低发地区组(全部病人:p=0.030;米兰标准:p=0.004;BCLC0期:p=0.048),符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中高发地区组的1、3、5年生存率低于低发地区组(米兰标准:p=0.043;BCLC0期:p=0.046)。但在全部病人中,两者的1、3、5年生存率并没有明显差异(p=0.182)。
  研究结论:本研究首次发现了中国大陆肝癌高发地区和肝癌低发地区病人术后远期预后存在明显差异,来自高发地区的病人预后更差。来自高发地区在多个肿瘤分期中都是预后的独立危险因素。高发地区的病人HBV感染率更高且环境毒素暴露机会更多可能是导致这种现象的原因。
[博士论文] 杨琦
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA的表达谱
  目的:(1)通过高通量转录组测序的方法获取前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA(circRNAs)的表达谱。(2)筛选出前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达的circRNAs。(3)对差异表达的circRNAs进行功能预测及分析。
  方法:选择3种前列腺癌相关细胞系(正常前列腺上皮细胞系RWPE-1、前列腺癌原发灶细胞系22RV1、前列腺癌骨转移细胞系PC-3)及65对前列腺癌与癌旁组织,进行高通量转录组测序,并结合生物信息学方法综合分析。
  结果:(1)3种前列腺癌相关细胞系中共识别出9,545个circRNAs,其中845个circRNAs在3种细胞系中均有表达,同时还发现了大量差异表达的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示这些差异表达circRNAs的宿主基因具有重要的生物学功能并在许多重要的分子信号通路中发挥关键作用。(2)采用DCC、find circ和circRNA_finder这三种算法在65对前列腺癌与癌旁组织中共识别出277,122个circRNAs,其中三种算法共同识别出的circRNAs有82,797个。非监督聚类和PCA分析提示前列腺癌与癌旁组织中circRNAs的表达谱存在明显差异,其中有9个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著上调,86个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著下调。对这95个差异表达的circRNAs进行功能预测提示其与相应的miRNAs具有多个结合位点。
  结论:(1)circRNAs在前列腺癌相关细胞系及组织中均广泛存在,而且不同细胞系及组织之间具有显著表达差异;(2)生物信息学分析显示,前列腺癌中差异表达的circRNAs可能通过竞争性吸附miRNAs发挥相应生物学功能,或与其宿主基因一起参与前列腺癌的疾病进展,并可能具有潜在的诊断应用价值。
  第二部分 前列腺癌中差异表达环状RNA的验证及作用研究
  目的:(1)对前列腺癌相关细胞系及组织中circRNAs的测序结果进行验证。(2)结合细胞系测序及验证结果分析环状RNA-circFUT8在前列腺癌相关细胞系中的表达差异及意义;(3)结合组织测序及验证结果探讨环状RNA-circAMACR在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  方法:(1)选择测序结果中部分差异表达的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分别在正常前列腺上皮细胞系与前列腺癌细胞系、前列腺癌与癌旁组织中对其进行表达量验证。(2)结合细胞系测序结果选择circFUT8(在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中低丰度表达,在前列腺癌原发灶细胞系22RV1和前列腺癌骨转移细胞系PC-3中表达逐渐升高)为研究对象,对其在前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并结合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化过程中的作用及意义。(3)结合组织测序结果选择circAMACR(在前列腺癌组织中表达上调最为显著,fold change=6.19,P=1×10-13)为研究对象,对其在前列腺癌组织与癌旁组织、前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并通过siRNA干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨其在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  结果:(1)前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达circRNAs的qRT-PCR验证结果与测序结果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌细胞系中的表达显著高于正常前列腺上皮细胞系,在前列腺癌转移细胞系(PC-3、DU145)中的表达显著高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1),在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中的表达也显著高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,在前列腺癌细胞系中的表达也显著高于正常前列腺上皮细胞系。circAMACR主要表达于细胞质中,干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达后,细胞的增殖和迁移能力减弱。
  结论:(1)通过高通量转录组测序获取的前列腺癌相关细胞系及组织中的circRNAs表达谱是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相关细胞系中具有独特的差异表达模式,可能参与了前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化的生物学过程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有肿瘤特异性并且在其进展过程中具有一定的肿瘤生物学作用。
  第三部分 环状RNA应用于前列腺癌血浆检测的初步研究
  目的:(1)提高前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的稳定性;(2)筛选前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目及最适内参基因组合。(3)初步探讨circRNAs应用于前列腺癌血浆检测的临床意义。
  方法:(1)改进血浆样本总RNA提取方法,优化前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的qRT-PCR反应条件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血浆样本,对β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8个候选内参基因进行qRT-PCR检测,并使用NormFinder和geNorm软件分析实验数据。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血浆样本,对组织测序结果中差异表达显著的29个circRNAs(表达上调9个,表达下调20个)进行qRT-PCR检测,并结合组织测序及验证结果进行分析。
  结果:(1)本研究实验体系下前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目为2个,最适内参基因组合为GAPDH和PPIA。(2)血浆qRT-PCR检测时,有9个circRNAs无扩增曲线,14个circRNAs的扩增产物电泳时无目的条带,3个circRNAs的扩增产物电泳时杂带明显,只有3个circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中稳定表达。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中的总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中的总体表达水平无显著差异。
  结论:(1)在前列腺癌患者血浆中进行circRNAs检测是可行的,但应根据具体实验体系做出适当优化。(2)GAPDH和PPIA的内参基因组合可作为均一化标准用于前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆样本的qRT-PCR检测。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中稳定存在,且总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,提示其对于前列腺癌具有一定的诊断应用价值。
[硕士论文] 伍睿
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  胆囊癌(Gallbladder Carcinoma,GBC)和胆管癌(Cholangiocarcinoma)同属胆道系统恶性肿瘤,其中胆管癌根据原发肿瘤起源于胆管树上皮位置的不同,分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma,EHC),肝外胆管癌又可再细分为肝门部胆管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HCCA)和远端胆管癌(Distal Cholangiocarcinoma,DCCA)。胆道肿瘤恶性程度高,转移侵袭性强,易复发,预后差。迄今为止,手术根治切除仍然是获得较好预后的唯一方法。通常术前依靠肿瘤标志物结合影像学检查结果对手术可行性进行评估并制定手术方案,但由于胆道肿瘤位置特殊周围结构复杂、易于侵犯周围肝脏和大血管,局部扩散和淋巴结转移等情况在术前评估中往往不易被发现,最终影响手术过程和效果。
  循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从肿瘤原发灶脱落至外周血中的肿瘤细胞,因为在肿瘤转移过程中发挥重要作用,近年来在越来越多的肿瘤相关领域被广泛研究。现已逐步证实循环肿瘤细胞与肿瘤的临床分期和预后状况紧密相关。循环肿瘤微癌栓(Circulating Tumor Microemboli,CTM)是指外周血中发现的由2个或更多循环肿瘤细胞聚集在一起组成的细胞团。其相比与单个循环肿瘤细胞,具有更强的侵袭和转移潜力。目前对于不同类型的肿瘤,循环肿瘤细胞及循环肿瘤微癌栓相关研究已逐步展开,但在胆道肿瘤研究中,其在临床应用中的价值尚不明确
  本研究旨在通过检测胆囊癌及胆管癌患者术前循环肿瘤细胞计数水平及循环肿瘤微癌栓阳性率,结合各肿瘤术后临床病理分期情况,评估其作为诊断指标的诊断效能,并探索其与传统肿瘤标志物在疾病诊断评估方面的优势。
  研究方法:
  1、根据预先设计的纳入标准,选取拟行手术治疗的胆囊癌、胆管癌患者共105例,于术前1日采集静脉血通过使用带孔滤膜法系统鉴定循环肿瘤细胞和循环肿瘤微癌栓,根据排除标准,最终76例行手术治疗患者被纳入研究;
  2、术后采集研究患者的临床基本信息、CEA、CA19-9水平及病理相关资料,并根据最新美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版胆道肿瘤分期标准对每个患者进行TNM分期;
  3、进行统计分析,评价CTCs计数水平、CEA水平、CA19-9水平在不同胆道肿瘤中对不同TNM分期的诊断效能,并分析CTM发现阳性率在不同胆道肿瘤的不同TNM分期中的差异性。
  研究结果:
  1、在胆囊癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分胆囊癌和良性病的诊断敏感性为95.45%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.964(P=0.0001)。当截断值选择>5个/5ml时,CTCs计数显示可以区分肿瘤T分期T1+2和T3+4的诊断敏感性为66.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001)。当截断值选择>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为85%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9(P=0.0001);
  2、在肝内胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝内胆管癌和良性病的诊断敏感性为76.47%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.916(P=0.001)。当截断值>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期T1和T2+3+4期的诊断敏感性为78.57%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.905(P=0.0001)。当截断值>5个/5ml时,CTCs计数显示区分肿瘤M0和M1期的诊断敏感性为100%,特异性为71.43%,ROC曲线下面积为0.893(P=0.0024);当截断值>5个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为58.33%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.808(P=0.0045);
  3、在肝门部胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝门部胆管癌和良性病的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.896(P=0.001)。但CTCs计数对肝门部胆管癌TNM各分期之间诊断效能较差(P>0.05);
  4、远端胆管癌组,选取CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分远端胆管癌和良性病的诊断敏感性为91.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9333(P=0.0001)。当截断值>4个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期中T2和T3期的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001);
  5、CTM在胆囊癌、肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌各组的阳性率分别为0%、16%、12%、16%。各组内CTM阳性率在T分期、N分期、M分期及TNM分期中未见明显差异(P>0.05)。
  研究结论:
  1、术前CTCs计数作为诊断指标在区分胆道肿瘤良恶性疾病时,普遍具有较好的诊断价值,可作为传统肿瘤标志物的辅助参考依据;
  2、术前CTM在胆道肿瘤中阳性率普遍很低,且与TNM分期间无明显相关性。
[博士论文] 塔娜
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤,其五年生存率不足5%,中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC),约占所有胰腺癌病例的85%-90%。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物,大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移,从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差,极易复发转移。近年来,随着医学的发展,人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加,但胰腺癌患者的生存期并无明显改善,因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示,胰腺上皮内瘤变(PanIN),尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3),是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6%提高到Ⅰ期的50%左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查,胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外,胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变,探索胰腺癌的发病机制,将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。
  MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子,长度为19-24个核苷酸,主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合,导致mRNA的降解或翻译的抑制,在转录后水平调节30%的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点,同时,多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关,例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明,miR-21,miR-155,miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差,应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此,本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制,为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。
  目的:
  筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs,并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证,研究其对胰腺癌生物学特性的影响,并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性,再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因,进一步探寻其作用机制。
  方法:
  1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。
  2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术,在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况,获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs,并分析其诊断效能。
  3.结合胰腺癌患者临床病理资料,分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。
  4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。
  5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。
  6.利用生物信息学(MiRDB,Targetscan,MiRanda)分析技术,预测miR-1290可能的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系,并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。
  7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术,分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况,探讨其临床意义。
  结果:
  1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比,PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调(超过5倍)的miRNAs有30余种,结合文献,筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p,miR-29a-5p,miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p,miR-29a-3p,miR-34a-3p,miR-155;下调的主要有miR-105-3p,miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
  2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准,筛选出高表达的miRNAs共计6条,包括miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p以及miR-155。
  3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中,miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高,差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能,miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能,AUC分别为0.848和0.829。
  4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达,癌旁正常组织低表达,与外周血浆结果相一致,提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子,具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。
  5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量,发现其在AsPC-1中表达最低,在PANC-1中表达最高,选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中,miR-1290被成功过表达,转染miR-1290Antagomir的细胞系中,miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示,过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p<0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示,miR-1290过表达,细胞增殖速度加快,24小时活细胞数量明显高于对照组(p<0.05);miR-1290抑制后,细胞增殖速度减慢,24小时活细胞数量明显少于对照组(p<0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示,过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p<0.05);抑制miR-1290,细胞迁移和侵袭能力显著下降(p<0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示,过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。
  6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积更大(p<0.05);抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积减小(p<0.05)。
  7.生物信息学结果显示,IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。
  9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达,可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα,可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量,NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。
  结论:
  1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查,6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。
  2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性,提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。
  3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高,且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关,提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。
  4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力,参与胰腺癌生物学行为的调控,其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。
  5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一,其可直接被miR-1290抑制(结合位点为3'端843-849处),促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。
  6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展,可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。
[硕士论文] 吴震中
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 超声引导下微波热消融治疗cN0期甲状腺乳头状癌的临床随访评估
  目的:探讨超声引导下cN0期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效。
  方法:收集2011年10月至2017年5月于上海长征医院超声科和上海国际医学中心接受微波消融治疗的cN0期甲状腺乳头状癌患者222例并对其随访,统计分析其结节吸收情况、并发症发生率以及复发率。
  结果:原消融灶均呈不同程度缩小,平均缩小率约87.34%,共56例消融灶完全吸收。除2例单侧腺体消融损毁后出现亚临床甲减,其余患者消融术后甲状腺功能指标正常。术后无严重并发症出现,随访共发现1例出现淋巴结转移灶,1例出现腺体内其他部位新生癌灶,予以了二次消融,后续随访未再出现复发。
  结论:微波热消融治疗cN0期甲状腺乳头状癌临床效果较好,可能是未来治疗甲状腺乳头状癌的重要手段。
  第二部分 cN1期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效及其复发危险因素的研究
  目的:探讨cN1期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效及其复发危险因素。
  方法:回顾性分析2013年7月至2017年4月于上海长征医院超声科和上海国际医学中心接受微波消融治疗的cN1期甲状腺乳头状癌患者共50例,其中临床淋巴结转移cN1a期32例、cN1b期18例。探讨cN1期甲状腺乳头状癌微波消融术后的临床疗效以及性别、年龄、原发肿瘤大小、肿瘤病灶数等与复发的关系。影响复发的单因素差异性比较采用log rank检验,并运用COX回归模型进行多因素分析。
  结果:随访过程中共发现9例出现淋巴结转移灶,3例出现腺体内其他部位新生癌灶,未见有远处转移的病例,总体复发率为24%。单因素分析显示了性别、肿瘤病灶数、淋巴结转移分期是甲状腺乳头状癌微波消融术后复发的危险因素。多因素分析显示肿瘤病灶数和淋巴结分期是甲状腺乳头状癌消融术后复发的危险因素。
  结论:微波热消融治疗cN1期甲状腺乳头状癌具有一定的临床效果,具有可重复性好的优点,但仅行一次消融复发率较高,重复消融并不增加并发症的发生率。
[硕士论文] 涂文婷
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 传统CT形态学特征对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  探讨传统CT形态学特征预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR基因突变状态的诊断价值,并联合临床特征构建EGFR基因突变预测模型。
  方法:
  回顾性分析病理证实为NSCLC并行EGFR基因检测的243例患者的影像学资料,其中突变型有112例,突变率为46.1%,野生型有131例。比较分析两组患者的5个临床特征(性别、年龄、临床分期、CEA水平及吸烟情况)和17个传统CT形态学特征(最大直径、密度、形状、分叶、胸膜凹陷征等)。将EGFR基因突变状态作为因变量、有差异的特征作为自变量进行多因素Logistic回归分析,并对回归预测概率和各单独特征进行ROC曲线分析。
  结果:
  单因素分析显示,性别、临床分期、最大直径、密度、纵隔或肺门淋巴结肿大、位置、空泡征及CT支气管征在两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,性别、密度和病灶位置是EGFR突变型的独立预测因素,对回归预测概率进行ROC曲线分析后,AUC为0.693(P<0.05)。对各单独特征进行ROC曲线分析后,性别、密度和病灶位置的AUC分别为0.608、0.631和0.579。
  结论:
  在NSCLC患者中,性别、病灶密度和病灶位置与EGFR基因突变密切相关,女性患者、亚实性密度以及周围型肺癌可提示EGFR基因突变阳性。
  第二部分 放射组学标签对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  建立并验证基于放射组学标签的EGFR基因突变预测模型,并与形态学联合预测模型进行对比。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年2月的243例非小细胞肺癌(NSCLC)作为训练集,另外收集2015年5月至2016年10月的161例NSCLC作为独立验证集。采用组内相关系数(ICC)检验放射组学特征的一致性,采用无监督一致性聚类分析在训练集中进行放射组学标签的建立。使用Mann-Whitney U检验、卡方检验对所有特征及放射组学标签进行单因素分析,多因素Logistic回归分析用于构建EGFR基因突变预测模型。ROC曲线分析用于评价单个特征及模型的预测效能,并采用Delong检验比较两个模型之间的效能差异是否有统计学意义。
  结果:
  在485个放射组学特征中,筛选出可重复性高的313个放射组学特征,聚类分析构建了5个放射组学标签。放射组学联合预测模型由最大直径、RS1和RS2组成,在训练集和验证集中,该模型的预测效能(AUC=0.789、0.797)均高于形态学联合预测模型(AUC=0.693、0.616),Delong检验表明这两者的AUC具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  Ⅰ型RS1、Ⅰ型RS2及较小的最大直径可提示EGFR基因突变阳性,放射组学联合预测模型具有较高的预测效能,可辅助临床靶向治疗。
  第三部分 放射组学标签预测Ⅰ期NSCLC患者远处转移情况的初步研究
  目的:
  探索影响Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的术后远处转移情况的相关因素,评估放射组学标签用于预测Ⅰ期NSCLC患者预后的可行性。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年10月的404例NSCLC患者,其中243例作为训练集用于构建放射组学标签,其余161例作为验证集用于检验放射组学标签的可靠性。根据纳入标准和排除标准筛选出194例Ⅰ期NSCLC患者,并对其远处转移情况进行随访。计算7个临床特征、16个传统CT形态学特征及5个放射组学标签的风险比(HR)。采用log-rank检验进行单因素生存分析,在此基础上进行COX模型多因素分析,筛选独立预后因素。
  结果:
  随访时间为3~63个月(中位数为21个月),25例(12.9%)患者发生远处转移,其无转移生存期(DMFS)为3~54个月(中位数为15个月)。单因素分析显示,除年龄、吸烟情况、形状、分叶征、尖角征、空泡征、胸膜增厚及RS4之外,其余20个特征均与Ⅰ期NSCLC患者的远处转移相关(P<0.05)。多因素分析显示组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  在Ⅰ期NSCLC患者中,组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1是影响其远处转移情况的独立预后因素,表现为非腺癌、Ⅱ型RS1及伴有胸膜凹陷征的患者趋向于发生术后远处转移。
[博士论文] 徐庆国
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乙型肝炎病毒感染(HBV)是全球范围内的主要公共健康问题之一,尤其是包括中国在内的发展中国家。虽然目前针对HBV的抗病毒治疗可以抑制HBV的复制,但仍不能彻底清除HBV。部分慢性乙型肝炎(CHB)患者发展成为进行性肝纤维化,并逐步导致了肝硬化,甚至是原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生。在中国,由于HBV感染的广泛性和抗病毒治疗的不规范性使得肝硬化和肝癌的发生比例较高。慢性HBV感染所导致的肝硬化和肝癌严重威胁着中国人民的生命健康,是中国十三五规划中需要着重解决的重大课题。
  HBVX基因(HBx)作为HBV四个开放阅读框之一,可以编码出分子量为17KD的HBx蛋白。大量的研究证实HBx蛋白在肝硬化和肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用,是尤为重要的病毒蛋白。由于HBV复制过程中不准确的逆转录和缺乏校对能力,HBx DNA存在多种变异。在前期研究中,通过测序技术在大队列的肝癌癌组织和癌旁组织中对HBx的基因型进行了调查,发现了一型携带多个位点共同变异的基因型,即HBx-EHBH2(HBx-E2)。预后分析表明携带HBx-E2的患者预后较好。此外,还初步研究了HBx-E2在肝癌细胞中的生物学功能。
  然而,HBx-E2在判断肝癌患者预后中的作用和在临床转化中的意义还需多中心的队列进行验证,而且HBx-E2在肝癌发生和发展中所发挥的功能,以及具体的分子机制仍需进一步探索。同时,HBx-E2与临床病理指标的相关性分析表明HBx-E2与肝硬化的缺失相关。所以,HBx-E2在肝硬化进程中是否也发挥了与其他基因型不同的作用,也需进一步研究。针对上述的科学问题,开展了本研究。
  第一部分HBx基因EHBH2基因型影响肝癌进程的分子机制
  研究目的:明确HBx-E2基因型在术前预测肝癌患者预后中的作用。确定HBx-E2在肝癌发生发展中的生物学功能及相关分子机制。
  研究方法:在不同地区的肝癌患者队列中检测HBx基因型,并对HBx-E2进行预后分析和临床病理指标相关性分析。构建多株表达多个HBx基因型的肝癌细胞系和肝细胞系,通过细胞计数试剂盒8(CCK8)、克隆形成、流式细胞术等实验明确HBx-E2对细胞增殖的影响。利用体外合成重组HBx蛋白和蛋白芯片筛选HBx-E2与野生型HBx蛋白结合蛋白的差异,并通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术探索分子机制。
  研究结果:在不同地区的肝癌患者组织队列(n=171)的癌和癌旁中以及在血清队列(n=168)中,HBx-E2均与患者较好的预后相关。临床病理指标相关性分析表明HBx-E2与肝硬化缺失、肿瘤直径较小相关。按照HBx基因型分类和巴塞罗那肝癌临床(BCLC)分期在组织队列和血清队列分层进行预后分析,结果表明HBx-E2可以作为术前预测BCLC B期患者预后的分子标记物。体内外实验证明相对于其他基因型,HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力。蛋白芯片和免疫共沉淀等实验发现HBx-E2失去与JAK1结合的能力,而且不能激活STAT3和STAT5。JAK1的抑制剂Upadacitinib可以抑制除HBx-E2外其他基因型的增殖能力。
  研究结论:HBx-E2可以作为分子标记物术前预测BCLC B期患者预后。HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力,不能激活JAK1/STATs通路。JAK1是HBV相关肝癌中某些HBx基因型患者的潜在治疗靶点。
[硕士论文] 王宇璐
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨在中国汉族人群中,GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性的关系。并根据年龄、性别、吸烟情况、肿瘤家族史和病理类型进行分层分析,观察在各亚层中GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性之间的关联。
  研究方法:
  采用病例对照研究方法,选取上海及江苏泰州地区汉族人群中经病理诊断为肺癌患者974例和健康体检者1005例入组本研究。采集研究对象的外周静脉血标本,然后采用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA,采用SNPscanTM方法对GSTP1基因rs1695位点进行基因分型。基因分型质量控制按照质量控制(QC)流程进行,包括大于95%的成功检出率、重复检出基因型、内部阳性对照样本检测以及Hardy—Weinberg遗传平衡检验。
  采用Student t检验及x2检验比较病例组与对照组在年龄、性别、吸烟状态、肿瘤家族史方面的差异,以及两组GSTP1基因rs1695位点A、G等位基因频率及AA、GA、GG基因型频率分布差异。用非条件logistic回归分析等位基因模型、基因型模型、显性基因模型和隐性基因模型与肺癌风险的关联,并对研究对象的年龄、性别、吸烟状况和肿瘤家族史进行校正,结果以比值比(odds ratios,ORs)及其95%的置信区间(confidence intervals,CIs)表示。采用SPSS19.0统计学软件进行所有统计分析,所有的p值都是双侧检验,p<0.05为具有统计学意义。
  研究结果:
  1.本研究包括974例肺癌患者及1005例健康体检者,两组性别、年龄比较差异无统计学意义(p=0.101,p=0.944)。肺癌组中吸烟者及有肿瘤家族史者均多于对照组,差异均有统计学意义(p<0.001)。
  2.本研究中基因分型检出率为99.9%。GSTP1基因rs1695A/G位点基因型频率符合Hardy—Weinberg遗传平衡(p>0.05)。
  3.肺癌组与对照组中A、G等位基因频率差异无统计学意义(x2=3.785,p=0.053),G等位基因携带者罹患肺癌的风险降低(OR=0.811,95%CI0.684-0.961,p=0.016)。两组间各基因型的分布频率差异无统计学意义(x2=4.072,p=0.131)。GG基因型使肺癌风险降低(OR=0.591,95%CI0.347-0.988,p=0.048),GA基因型与肺癌风险无明显关联(OR=0.838,95%CI0.683-1.028,p=0.091)。
  4.分层分析显示,G等位基因携带者罹患肺癌的风险在男性(OR=0.784,95%CI0.639-0.962,p=0.020)、有吸烟史的人群(OR=0.732,95%CI0.591-0.906,p=0.004)、无肿瘤家族史的人群(OR=0.782,95%CI0.643-0.950,p=0.014)以及肺腺癌患者(OR=0.798,95%CI0.641-0.990,p=0.042)中有所下降。在女性、无吸烟史的人群、有肿瘤家族史的人群以及肺鳞癌患者和小细胞肺癌患者中,是否携带G等位基因与肺癌发生风险之间无明显关联(p>0.05)。
  研究结论:
  GSTP基因rs1695位点多态性与肺癌发病风险相关联,有望成为肺癌风险预测的靶点。
[硕士论文] 彭立嗣
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)不仅有细胞保护作用,而且参与抗癌药物耐药性的产生。但是,GST同工酶在胰腺癌化疗耐药中的作用仍不清楚。本研究将检测GSTM2基因在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达。并通过siRNA及shRNA沉默GSTM2基因,分别转染胰腺癌细胞及注入裸鼠胰腺构建原位移植瘤模型后用吉西他滨处理,从体外、体内实验两个层面观察在胰腺癌中沉默GSTM2对吉西他滨敏感性的影响。最后分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  结果表明吉西他滨处理可以增加胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中GSTM2的表达。沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞的凋亡增加、活力降低,体内实验进一步表明在裸鼠胰腺原位移植瘤模型中利用shRNA诱导GSTM2沉默,能增强吉西他滨化疗的药物敏感性。研究还发现,GSTM2在胰腺癌组织中的表达低于正常胰腺组织,而GSTM2的高表达则与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  综上所述,GSTM2能使接受吉西他滨处理的胰腺癌细胞产生耐药性并存活,故吉西他滨也能增加胰腺癌细胞株中GSTM2的表达,GSTM2在胰腺癌中的沉默有益于增强吉西他滨的化疗效果,胰腺癌患者中GSTM2的高表达与总体生存期显著相关。因此,GSTM2有潜力成为优化胰腺癌化疗方案选择和预测胰腺癌预后的生物标志物。
  一、GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达
  目的:分析吉西他滨处理胰腺癌细胞及癌组织对GSTM2表达的影响。
  材料和方法:利用qRT-PCR和western blot检测吉西他滨处理前后GSTM2在胰腺癌细胞株中的表达情况。收集接受吉西他滨新辅助化疗后手术和仅接受外科手术的胰腺癌患者的癌组织标本,进行免疫组化染色,比较两组中GSTM2表达水平的差异。
  结果:GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株中的表达水平明显高于未经吉西他滨处理的对照组;在接受吉西他滨化疗的胰腺癌患者组织中的表达水平明显高于仅接受外科手术的患者。
  结论:吉西他滨能使胰腺癌细胞和胰腺癌组织中的GSTM2表达水平上升,初步证实GSTM2参与胰腺癌吉西他滨化疗耐药性产生。
  二、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体外实验研究
  目的:检测siGSTM2对吉西他滨处理胰腺癌细胞株的化疗敏感性的影响。
  材料和方法:运用siRNA技术沉默BXPC-3、Panc-1、L3.6pl和MPanc96四种胰腺癌细胞株中的GSTM2基因,利用qRT-PCR和western blot检测沉默效果。再用吉西他滨处理上述细胞株,通过流式细胞仪检测癌细胞的凋亡水平,应用MTT分析法检测细胞活力。
  结果:qRT-PCR和western blot检测结果示siRNA转染4种胰腺癌细胞株成功,沉默GSTM2效率高,均在60%以上。经吉西他滨处理后,siGSTM2组与siControl组相比癌细胞凋亡率明显更高、活力显著降低。
  结论:siGSTM2能在胰腺癌细胞株中高效沉默GSTM2基因。沉默GSTM2能增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。
  三、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体内实验研究
  目的:检测shGSTM2对裸鼠胰腺原位移植瘤行吉西他滨化疗敏感性的影响。
  材料和方法:用shGSTM2对胰腺癌细胞株Mpanc96进行转染,行qRT-PCR和western blot检测评估沉默效果。将证实已被shRNA成功转染的Mpanc96细胞株原位注入裸鼠胰腺,构建裸鼠胰腺原位转移瘤模型。用IVIS成像系统予以生物荧光成像明确成瘤效果。用吉西他滨处理胰腺癌原位瘤后,用Living Image软件程序进行定量分析瘤体体积变化。
  结果:shRNA转染Mpanc96成功且沉默GSTM2效果佳。生物荧光成像可见裸鼠胰腺位置有荧光信号,移植瘤成瘤,建模成功。shGSTM2+吉西他滨组裸鼠瘤体体积最小。
  结论:沉默GSTM2能在体内增强胰腺癌吉西他滨化疗的敏感性。
  四、GSTM2在胰腺癌患者中的表达与临床预后相关性的研究
  目的:分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  材料和方法:收集于我院确诊胰腺癌的50例手术患者的癌组织标本,以癌旁组织及正常人的胰腺组织样本作为对照,检测GSTM2的mRNA表达水平的差异。根据GSTM2的平均蛋白表达量将胰腺癌样本分为GSTM2低表达组和GSTM2高表达组,分析两组生存期的差异。
  结果:GSTM2在胰腺癌患者胰腺组织样本中的表达显著低于癌旁组织及正常人的胰腺组织样本。GSTM2低表达组的胰腺癌患者较高表达组患者的总体生存率低,预后差。
  结论:GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  总结上述研究,可得出结论如下:
  1、吉西他滨可以增加胰腺癌中GSTM2的表达。
  2、沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞凋亡增加、活力降低。
  3、沉默GSTM2能使接受吉西他滨化疗的裸鼠胰腺原位移植瘤体积缩小,在体内增强吉西他滨化疗的敏感性。
  4、GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  5、GSTM2有潜力作为生物标志物筛选对吉西他滨高敏感的胰腺癌患病人群行精准治疗,同时预测胰腺癌的预后。
[硕士论文] 唐渊
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胃癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤,中国新发生的胃癌,其中90%以上患者是进展期胃癌。目前胃癌主要治疗方式是手术加上化疗,部分进展期的胃癌通常不能直接进行手术,需要进行术前的新辅助化疗。目前临床胃癌新辅助化疗,存在化疗耐药问题。课题组前期研究发现,胃癌新辅助化疗能够诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞会分泌大量的炎性因子,趋化因子,蛋白酶体等,这种表型是细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),能够通过多种方式,导致化疗耐药。进一步研究发现胃癌新辅助化疗标本耐药的患者存在SASP相关因子升高。课题组前期对胃癌新辅助化疗组织标本进行回顾性研究发现:胃癌新辅助化疗的效果与tristetraprolin(TTP)的表达有着密切相关,TTP高表达的患者胃癌新辅助化疗敏感性好,TTP低表达的患者新辅助化疗敏感性差。TTP作为一个RNA结合蛋白,能够与大量细胞因子mRNA的3'UTR区的AU富集区(AU-rich element,ARE)结合,进而降解目标因子的mRNA,也是一个重要的抑炎和抑癌蛋白。TTP调控的靶因子的mRNA与SASP相关分泌因子的mRNA有大量重叠。由此推测:TTP可能通过调控胃癌新辅助化疗引起的SASP,进而增加胃癌新辅助化疗敏感性。TTP其有可能成为候选的胃癌新辅助化疗敏感性的生物标志物。本研究拟在此研究基础上,通过在体外胃癌细胞衰老模型下,研究TTP通过调控SASP相关因子表达,提高新辅助化疗敏感性具体作用及其分子调控机制。为进一步探讨如何通过TTP改善胃癌新辅助化疗敏感性,以及胃癌患者治疗个体化治疗方案,也为TTP作为胃癌新辅助化疗有效的生物标志物提供基础理论支持,具有重要的临床意义。
  方法:第一部分:根据课题前期相关实验结果,选取胃癌BGC-823细胞系。分别在0、25nM、35nM、45nM浓度下紫杉醇诱导处理BGC-823细胞24h、48h、72h。衰老相关的β-gal半乳糖苷酶染色,分析构建稳定体外的胃癌细胞衰老模型。
  第二部分:基于胃癌BGC-823细胞系构建TTP过表达和TTP干扰细胞株,嘌呤霉素筛选稳定表达和稳定干扰的细胞株。实验分为三组:TTP过表达组,TTP干扰组,空白对照组。在紫杉醇35nM浓度下,诱导胃癌BGC-823细胞72h,分别通过qPCR和ELISA检测SASP部分相关因子的mRNA水平和蛋白分泌水平。
  第三部分,在体外紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞衰老模型上,通过Western blot方法检测p65在TTP过表达,TTP干扰的细胞核内外表达水平变化。进一步通过细胞免疫荧光,确定核内外p65表达水平,使用Image pro plus软件进行核内外p65荧光强度半定量分析。
  结果:第一部分:成功构建胃癌BGC-823细胞衰老模型构建:在35nM浓度下,紫杉醇诱导BGC-823细胞72h,β-gal染色,染色阳性,说明成功构建体外的胃癌细胞BGC-823衰老模型,其中胃癌BGC-823细胞衰老染色在紫杉醇诱导72h细胞衰老的比例达到60%以上
  第二部分:构建胃癌BGC-823细胞的TTP过表达和TTP干扰的细胞株,通过RT-qPCR验证TTP过表达和TTP干扰细胞株构建成功。通过嘌呤霉素在2μg/ml浓度作用下,筛选得到TTP稳定过表达和TTP稳定干扰的胃癌BGC-823细胞株。在35nM浓度紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞72h,通过qPCR和ELISA分别检测SASP部分相关因子的mRNA和蛋白变化。结果显示:TTP过表达时,能够下调SASP部分相关因子的表达,TTP干扰时,上调SASP部分相关因子表达,相比空白对照组差异具有统计学意义。
  第三部分:为了进一步研究TTP对SASP调控分子机制,在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型上,Western blot结果显示p65核内外的表达,TTP过表达组相比空白对照组显著减少,TTP干扰组核内p65相比空白对照也是显著增多。为了进一步验证TTP过表达和TTP干扰是否对p65入核影响,细胞免疫荧光,TTP过表达,TTP干扰组,空白对照组在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞72h条件下,细胞免疫荧光分析结果显示:在TTP过表达,核内的p65的荧光相比空白对照组和TTP干扰组有差异具有统计学意义。
  结论:成功构建紫杉醇体外诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型,在胃癌细胞衰老模型上,发现TTP能够调控胃癌BGC-823细胞的衰老相关分泌表型。TTP通过ARE结合途径直接降解SASP相关因子表达,还可以通过减少p65入核,抑制NF-κB信号通路激活,进而调控胃癌细胞衰老相关分泌表型。这也揭示:TTP可能通过调控SASP相关因子的表达,增加胃癌新辅助化疗敏感性。
[博士论文] 乔苏迟
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨骼系统最常见的的原发恶性肿瘤,年发病率约(1-3)/1000,000,可于任何年龄发病,但高级别骨肉瘤(High-grade osteosarcoma,HGOS)主要发生于10-20岁的青少年和儿童。OS多累及长骨末端,尤其是生长快速的骨骼,如股骨远端、胫骨近端、肱骨近端等。
  得益于新辅助化疗的发展、假体以及材料学技术的进步,目前OS的保肢率和生存率都得到了较大的提升。但复发及远处转移的患者预后仍然较差,新型药物的研发也迟滞不前,OS的治疗已经进入到瓶颈。阐明OS发生发展的分子机制,研发新型药物是目前迫切需要解决的问题。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)的是一类重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。已有大量研究报道,LncRNA出现异常表达或是突变,与恶性肿瘤增殖、侵袭、转移、耐药等机制密切相关。而在OS中,LncRNA的相关研究尚处于起步阶段,是否可以利用下调或上调异常表达的LncRNA方式治疗OS,或是逆转OS耐药,有待深入探索。此外,LncRNA能否作为OS患者临床诊断的重要参考,以及判断化疗敏感性和预后的分子标志物,有待临床实践检验。
  LINC00511是一个较为全新的LncRNA,在非小细胞肺癌、舌鳞癌以及胰腺导管腺癌中,已证实LINC00511呈现高表达,并在其中作为癌基因发挥作用,促进相应恶性肿瘤增殖、迁移,与患者预后不良密切相关。
  通过芯片筛选等前期预实验,发现,相对于癌旁正常组织,LINC00511在OS组织中呈现低表达。本研究旨在进一步探索LINC00511在OS中的表达情况,并分析其表达与患者临床特征及预后的相关性,此外,分别从体外和体内层面对LINC00511的功能展开研究并初步揭示LINC00511在OS中的调控机制。
  第一部分:LINC00511在骨肉瘤组织、细胞株中的表达及其意义
  第一部分研究中,通过定量PCR检测LINC00511在OS组织标本和癌旁正常组织标本的表达情况,并结合临床资料分析LINC00511的表达水平与OS患者年龄、性别、肿瘤分期、化疗敏感性、预后等临床特征之间的相关性。此外,同时采用定量PCR检测LINC00511在不同OS细胞株及正常成骨细胞细胞株中的表达水平差异。结果显示,LINC00511在OS组织及细胞株中呈现低表达;LINC00511的表达与患者肿瘤坏死率显著相关,高表达患者呈现出更好的化疗敏感性;LINC00511的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、肿瘤体积变化、手术方式等无关;LINC00511表达水平与骨肉瘤患者预后明显相关,高表达患者三年生存率更高,预后更好。上述结果提示,LINC00511可能是骨肉瘤疾病发生发展中的重要抑癌基因,其表达升高预示更好的化疗敏感性及预后,有望成为骨肉瘤诊断以及预后判断中的重要分子标志物。
  第二部分:LINC00511对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用
  第二部分研究中,构建了OS细胞株MG-63及Saos-2的LINC00511的过表达稳定株,并检测比较肿瘤生物学行为的变化。在体外细胞层面上,LINC00511表达上调后,进行CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞划痕实验、细胞transwell实验等观察LINC00511对OS细胞增殖、凋亡以及迁移的影响。在体内层面上,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证LINC00511对OS发生发展的作用。结果显示,MG-63及Saos-2中过表达LINC00511能够显著抑制OS细胞增殖、迁移,但不影响细胞凋亡;裸鼠成瘤实验中LINC00511过表达的裸鼠肿瘤生长更慢,相同时间内肿瘤体积更小,肿瘤质量更轻。上述结果提示,LINC00511在OS中能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移,是其发病机制中重要的抑癌基因。
  第三部分:LINC00511对骨肉瘤疾病进展的调控机制的初步研究
  第三部分研究中,对LINC00511调控OS的分子机制进行初步的研究。从OS上皮间质转化及PI3K/Akt信号通路的调控两方面进行观察。在Saos-2各组细胞中,利用Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimemin和α-SMA的表达,以及PI3K/Akt信号通路中PI3K和p-Akt的蛋白表达量,初步探讨LINC00511抑制OS增殖、迁移的分子调控机制。结果显示,Saos-2中过表达LINC00511后OS中的E-cadherin蛋白表达显著升高,而Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,OS的EMT受到显著抑制。此外,PI3K和p-Akt(308)蛋白表达显著降低,而p-Akt(473)蛋白表达并无明显变化,PI3K/Akt信号通路受到明显抑制。上述结果提示,LINC00511可能通过抑制OS的EMT以及PI3K/Akt信号通路,对OS细胞增殖、迁移产生调控作用,其中,PI3K/Akt信号通路产生作用的Akt的磷酸化位点是苏氨酸308(Thr308)。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
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