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[硕士论文] 夏阳
模式识别与智能系统 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:针对基于生物电阻抗对人体腹部内脏(腹内)脂肪面积(VFA)的预测,本文采用基于半监督学习的ABC-SVR预测模型对人体腹内脂肪面积进行预测,以克服训练样本有限与标准值相关性不够高的问题。通过测试样本集进行标准差和相关性计算仿真实验,结果表明,该模型具有较强的非线性函数逼近,能有效对人体腹内脂肪面积的预测。
  论文的主要研究内容如下:
  1、构造了预测人体腹内脂肪面积的特征属性。通过将人体腹部等效为椭圆柱导体模型,给出了一种人体腹部生物电阻抗的测量方法,并定义了与人群类型有相关的特征属性,构成了以腹部总阻抗Zt、腹部皮下阻抗Zs、腰围值w、腹部宽度a、腹部厚度b,体质指数B、体脂肪率T、腰臀比Y八种特征的人体腹内脂肪面积预测模型的输入量特征。
  2、构建了一种人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。通过改进的人工蜂群算法对人体腹内脂肪面积特征属性进行全局寻优训练,找出最优特征向量的解。对最优特征向量进行支持向量回归机拟合,获得人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。
  3、给出了一种人体腹内脂肪面积预测模型的半监督学习算法。通过对新采集的未标记样本进行优化标记,通过半监督学习算法对添加的新标记样本与原有的标记样本对ABC-SVR预测模型进行重复训练,并通过与已建立的预测模型进行赤池信息量准则性能比较,获取新的最优预测模型,解决训练样本可不断增加和模型可重复训练的问题。
  4、选用经典的最小二乘回归模型和ABC-SVR模型作为本文的半监督学习ABC-SVR模型的对比模型,并通过测试样本集的预测与比较分析,本文方法是可行与有效性的。
  本文运用Matlab对基于半监督学习的人体腹内脂肪面积预测模型以及测试样本进行仿真实验,通过相关性和标准差的分析结果表明,本方法的改进效果明显。
[硕士论文] 黄祎
食品科学与工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:卵磷脂是一种存在于动物和植物体内非常重要的含磷物质,具有许多优良的生理功能,如具有抗氧化活性、提高大脑活性、降低血脂等功能;在食品、化妆品以及医药等领域有广泛的应用。大豆和蛋黄是卵磷脂的主要来源,其中,研究较多的为大豆卵磷脂,但是蛋黄中的卵磷脂含量较高,性能优于大豆卵磷脂。因此,对于蛋黄卵磷脂的提取和性能研究和开发是十分重要的。为此,本文通过响应面法优化超声辅助提取蛋黄卵磷脂工艺,并对提取得到卵磷脂进行性质分析,利用卵磷脂制备纳米乳,为蛋黄卵磷脂的提取和利用提供一定的参考价值。主要成果如下:
  超声辅助提蛋黄卵磷脂的最佳提取工艺条件料液比15ml/g,乙醇浓度92%,提取时间22min,实际测得的卵磷脂含量为375.69mg/g,相对误差为0.73%。其中,乙醇浓度对于卵磷脂的提取影响因素最大,其次是提取时间,影响因素最小的是料液比。
  分别采用薄层色谱和红外光谱对提取的卵磷脂进行了定性分析,验证了提取物质为卵磷脂;采用GC-MS检测了卵磷脂脂肪酸组成,主要为油酸、亚油酸、硬脂酸和软脂酸;光照和温度对卵磷脂的稳定性有一定的影响,蛋黄卵磷脂的稳定性和抗氧化活性高于大豆卵磷脂。
  采用卵磷脂制备纳米乳,得到最佳的卵磷脂和壳聚糖浓度分别为:25mg/ml和0.1mg/ml,纳米乳的粒径为146.7nm,多分散指数为0.264,zeta电势为50mV,表明纳米乳是比较理想的纳米载体。通过FT-IR说明了卵磷脂和壳聚糖之间发生了离子化反应,利用TEM观察纳米乳的形态为球形。并且以虾青素为例证明了纳米乳可以成功包载脂溶性活性成分或药物。
[硕士论文] 王昕
化学工程与技术 上海交通大学 2016(学位年度)
摘要:糖脂是由糖和脂两部分通过共价结合组成的一种复合糖类的总称。糖脂在食品、医药、化妆品等领域具有很大的研究和开发价值。微藻中糖脂丰富,生长简单,不同环境条件下其生长及生化组分容易受到影响。本课题研究了不同的硝酸盐和磷酸氢盐条件下,蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和聚球藻(Synechococcus sp.)糖脂累积的情况。当硝酸盐浓度为0gL-1时,蛋白核小球藻和聚球藻的糖脂含量达到最高,分别为24.61%和15.37%(占细胞干重百分比);蛋白核小球藻在磷酸氢盐浓度为0.01 g L-1、而聚球藻在0 g L-1时的糖脂含量也较高,分别可达到17.19%和10.99%。环境胁迫条件下糖脂含量的变化可能是由三种主要糖脂(MGDG、DGDG和SQDG)含量变化而引起的。在硝酸盐缺乏时,两种藻的三种糖脂含量均至少提高了8.5%;在磷酸氢盐缺乏时,蛋白核小球藻和聚球藻三种糖脂中的DGDG和SQDG含量分别提高了21.2%和48.4%以上,而MGDG含量则降低了至少22.2%。利用中心复合试验来优化微藻糖脂累积的最佳条件,发现在硝酸盐浓度为0-0.6 g L-1,磷酸氢盐浓度为0-0.021 g L-1时,蛋白核小球藻糖脂累积可达到25%以上;当硝酸盐浓度为0-0.15 g L-1,磷酸氢盐浓度为0.025-0.04 g L-1时,或者硝酸盐浓度为1.21-1.5 g L-1,磷酸氢盐浓度为0-0.007 g L-1时,聚球藻糖脂累积可达到21%以上。这些结果说明氮磷限制可能是提高微藻糖脂累积的一个有效途径。
[硕士论文] 刘泽群
化学工程与技术 北京化工大学 2016(学位年度)
摘要:测定生物体内脂肪酸含量一直是临床研究以及脂质组学研究的重点。脂肪酸在人体内存在游离态与非游离态两种形式,而且碳链长度由八个碳到二十六个碳,这其中又存在大量的顺反异构体,这都给全面检测脂肪酸含量增加了难度。血清中脂肪酸含量被认为可以反映短期内脂肪酸代谢状况,而研究者也报道了红细胞膜上的脂肪酸含量更能反映人体内长期脂肪酸代谢状况。但白细胞膜上的脂肪酸与血小板膜上的脂肪酸含量以及代谢状况分析却未见报道。本论文从血细胞分离出发,建立了一整套检测细胞膜脂肪酸含量的方法,并对44位健康志愿者的血样进行了血细胞膜脂肪酸含量分析。具体结论如下:
  1、在Ficoll梯度密度离心分离法的基础上,建立了血细胞分离方法。血细胞分离效果好,通过加入羟乙基淀粉,HEPES等试剂,优化了分离步骤,解决了分离出的白细胞与血小板中红细胞污染的问题。
  2、比较了TG-WAX色谱柱与SP-2560色谱柱两种极性色谱柱对复杂脂肪酸甲酯组分分离能力,结果显示,利用TG-WAX色谱柱分离脂肪酸甲酯时,几种顺反异构体不能有效分离。但TG-WAX色谱柱的柱长短,当分析组分不复杂时,利用其进行检测工作可以缩短分析时间。SP-2560色谱柱对复杂脂肪酸甲酯组分的分离效果较好,满足本论文分离要求。本论文应用SP-2560色谱柱进行了一系列检测方法学验证工作,保证检测方法的准确性。同时对衍生方法也进行了准确性,温度性考察。
  3、对来自北京,长沙两地的健康志愿者进行脂肪酸检测分析,总结了健康27种人红细胞膜,白细胞膜,血小板膜脂肪酸含量范围。并且对比了两地健康志愿者脂肪酸含量差异,结果显示,两地志愿者的脂肪酸含量存在明显差异,说明不同地域的人在生活以及饮食习惯上存在的差异会对细胞膜脂肪酸含量带来影响。
[博士论文] 张东辉
微生物学 中国农业科学院 2016(学位年度)
摘要:长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs)对人体有良好生理功能,除了鱼油这种传统来源外,在油料作物中重构LC-PUFAs的合成途径是一种非常有前景的替代来源。在以表达脂连接型去饱和酶为策略的LC-PUFAs代谢工程研究中,去饱和酶中间代谢产物需要在PC库和CoA库之间进行多次转换,导致LC-PUFAs合成的终产物含量较低。
  LPCAT(属于溶血磷脂酰基转移酶)被推测是在转换过程中起重要作用的酰基转移酶。然而,植物来源的LPCAT报道较少,而且LPCAT对LC-PUFAs合成的影响以及参与PC和CoA库之间脂肪酰基转运的机制尚不清楚。
  本研究从烟草Nicotiana benthamiana和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中克隆LPCAT基因,并在酵母中进行功能验证和底物特异性研究。通过将LPCAT与不同类型脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达,分析其脂肪酸,CoA及脂质组变化,试图阐明LPCAT对LC-PUFAs合成的中间代谢产物转运及终产物积累的影响机制。主要结果如下:
  (1)从烟草中克隆到两个溶血磷脂酰基转移酶基因NbLPCAT1和NbLCPAT2,其编码产物均属于MBOAT蛋白家族。LysoPAF敏感实验表明NbLPCAT1和NbLCPAT2都有LPCAT酰基转移酶活性。酵母磷脂分析实验表明:表达NbLPCAT1和NbLPCAT2的重组酵母优先利用16:0-LPC,16:1-LPC和18:1-LPC作为酰基受体;18:2-CoA,18:3-CoA为酰基供体。
  利用重组酵母微粒体为LPCAT酶源的体外酶活实验表明:NbLPCAT1对LPC及不饱和的C18-CoAs表现出偏好性。NbLPCAT2对LPA表现出的活性比LPC要高,且对18:3-CoA有较好的偏好性。采用RT-PCR方法检测烟草LPCAT基因的表达模式,结果表明:NbLPCAT1和NbLPCAT2在花中的表达水平最高,在其它组织器官中均有不同程度的表达。
  (2)从富含EPA的三角褐指藻中克隆到一个PtLPCAT基因并验证功能。将NbLPCAT1,NbLPCAT2及PtLPCAT与不同来源的脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达,这些脂肪酸去饱和酶和延长酶包括:来源于三角褐指藻的脂连接型去饱和酶PtD6,PtD5;来源于小立碗藓的脂肪酸延长酶PSE;来源于青绿藻的CoA型去饱和酶OtD6和细小微胞藻中的CoA型去饱和酶MsD5。
  构建三种不同类型重组酵母并进行功能验证,三种类型的重组酵母中分别共表达:(a)CoA型去饱和酶和延长酶;(b)脂连接型去饱和酶和延长酶;(c)脂连接型去饱和酶、延长酶和LPCAT。结果表明:(a)类型重组酵母中LC-PUFAs终产物的含量最高,(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比,△6去饱和酶中间代谢产物在CoA库中的含量较高,终产物LC-PUFAs的积累量较高,表明LPCAT的表达促进了代谢中间产物的脂肪酰基在PC和CoA之间的转移,在一定程度上解除脂连接型去饱和酶应用于转基因合成LC-PUFAs过程中的代谢瓶颈,提高LC-PUFAs的积累量。
  (3)不同类型重组酵母脂质组分析表明:(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比,表达NbLPCAT1的重组酵母菌株中PCsn-1、sn-2位置上18:2和18:3脂酰基的含量明显上调,表达NbLPCAT2的重组酵母菌株中PCsn-1位置18:2脂酰基含量上调。
  表明LPCAT的表达能够明显提高△6去饱和酶反应的底物和产物的量;同时进一步证实了NbLPCAT1和NbLPCAT2的底物偏好性,也表明了NbLPCAT1对LPC酰基化的位置没有明显的偏好性。
[硕士论文] 胡逸灵
微生物学 安徽大学 2016(学位年度)
摘要:萜类是天然产物中重要类群,在生物体内发挥着重要生理功能或生物活性,如抗疟疾的青蒿素,抗乳腺癌的紫杉醇,抗氧化的番茄红素,天然名贵香料檀香油等。这些高价值的萜类化合物很多来自植物,但是从植物组织细胞中直接提取则费时耗力,化学直接合成则成本高昂。随着这些天然产物合成途径的解析,当前基于微生物的代谢工程手段给予了生产这些活性萜类天然产物的新策略,通过选用安全可靠的宿主微生物,导入目标化合物合成的特异性基因,甚至重新引入或改造整条代谢通路,优化特殊酶的表达系统并结合多种代谢工程手段,在诸如酿酒酵母体内合成目标天然产物,这种利用微生物来合成天然产物的手段比直接提取要高效节能。本研究选择高价值的抗氧化剂和着色剂番茄红素与名贵香料檀香油主成分前体物α-檀香烯作为目标化合物做高产研究。本研究分为两个部分:
  第一部分:基于链霉菌底盘的番茄红素高产研究。⑴宿主底盘Streptomyces avermitilis的选择。番茄红素高产研究多基于大肠杆菌和酵母底盘,但目前研究者在经过大量操作后,产量的提升空间已经十分有限,本研究首次选用次级代谢产物丰富多样的链霉菌作为底盘,挑选拥有大量萜类次级代谢产物基因簇的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis作为宿主。⑵番茄红素合成基因簇的选择。通过S.avermitilis的基因组分析,发现其编码的萜类基因簇中蕴含有一个沉默的番茄红素合成的基因簇。本研究选取这个沉默的番茄红素基因簇,作为表达番茄红素的合成基因,通过过表达这一基因簇,成功实现这一基因簇的激活,得到番茄红素。⑶启动子元件选择。基因的表达与启动子关系密切,在链霉菌系统中,本实验室前期通过建立基于流式细胞仪的荧光定量技术表征了系列的表达元件,研究中从启动子元件库中选择了系列启动子,通过Gibson assembly和Golden Gate技术构建7种不同启动子元件驱动的番茄红素基因表达单元,利用整合型质粒将表达单元整合到宿主基因组中,通过优化发酵条件,发酵检测。结果显示,随着启动子强度的逐渐增强,番茄红素的产量呈现先高后低的产量变化,此时番茄红素的产量在SP23启动子驱动下5天达到13.88 mg/gDCW水平。⑷绝缘子元件的引入。随着启动子强度的逐渐增强,番茄红素产量呈现先高后低的变化,这一现象可能是由于表达元件之间相互干扰所致,前人的研究中得知一类绝缘子元件可以有效的减弱表达元件之间的干扰,研究中在系列启动子和crtE基因RBS之间引入绝缘子元件RiboJ,有效的消除了表达元件之间的干扰,随着启动子的强度增强,菌株的番茄红素的产量也逐步增加,番茄红素在SP44启动子的表达下获得了82.02±8.69 mg/g DCW的产量,其菌株单产优于大肠杆菌的现有水平。
  第二部分:基于酿酒酵母底盘的a-santalene高产研究。⑴Saccharomyces cerevisiae底盘的选择。由于α-santalol的合成途径中涉及植物来源的真核系统依赖的CYP450依赖的单加氧酶和还原伴侣蛋白,研究选择真核模式生物酵母菌为出发菌株,初步选择烯烃代谢优势酵母Yarrowia lipolytica,和改造实例丰富的S.cerevisiae。在对比菌株初始产量、产物比例和遗传操作工具的前提下,选择S.cerevisiae作为宿主菌株。⑵过表达tHMG1和ERG20。为了验证MVA途径操作对增产的作用,研究中先采用GAL1-10p诱导型启动子体系(后期可以通过敲除GAL80,实现自诱导。)过表达MVA途径的最重要的限速靶点截断型HMG-CoA还原酶基因HMG1和FPP合酶基因ERG20,并导入檀香烯合酶基因SaSSy,检测到α-santalene的产量提升约7倍。⑶底盘细胞代谢工程改造。上述操作有效后,采用MVA途径全途径过表达,其中tHMG1做三重过表达,对FPP的代谢点做限流优化:首先,使用MET3p替换利用FPP合成甾醇的ERG9基因自身启动子,MET3p在外源添加甲硫氨酸时受到抑制;其次,敲除DPP1和LPP1这两个利用FPP转化为FOH的酶,实现对FPP代谢支路的抑制,在研究初期,使用GAL1-10p的半乳糖诱导体系,为增强诱导效果,敲除半乳糖代谢基因GAL1,GAL10和GAL7。外源基因的表达前期使用低拷贝的游离型质粒,后期采用高拷贝游离型质粒。通过上述操作,α-santalene的产量再度提升约15倍,通过最终定量,α-santalene的产量在摇瓶水平,利用合成培养基,3天的产量达到182 mg/L。在使用经密码子优化后的SanSyn基因替换SaSSy后,工程菌株BY4742-MVA-426-SanSyn的α-santalene产量为404.74±12 mg/L,为后续的α-santalol的生产提供了坚实基础。
[硕士论文] 吴正国
食品科学与工程 福建农林大学 2016(学位年度)
摘要:是一种化学结构稳定,无腐蚀性,气味温和的淡黄色澄清液体,具有良好的渗透、乳化、增溶等性能,被广泛应用于食品、化工、医药等行业,也可作为一种绿色替代性的生物质燃油。脂肪酸甲酯可采用植物油脂、动物油脂、餐饮废油等为原料,与低级醇发生酯化或酯交换反应制备而得。但是,传统制备法通常以无机酸碱作为催化剂,不符合绿色食品加工和绿色化工过程的要求,因此开发脂肪酸甲酯的绿色制备工艺具有一定研究意义。
  本文以油脂的水解产物油酸或油脂本身为原料,以合成的离子液体替代硫酸为催化剂,并引入超声波-微波联合辅助技术,研发脂肪酸甲酯绿色、高效的酯化或酯交换法制备工艺过程。主要研究内容与结果如下:
  1、以浓硫酸为催化剂,油酸与甲醇酯化反应制备脂肪酸甲酯。考察反应温度、反应时间、醇油摩尔比、催化剂用量对油酸转化率的影响,并通过响应面分析法优化制备工艺。结果表明:反应温度、反应时间、醇油摩尔比间的相互作用对油酸转化率影响较大,最佳工艺条件为:反应时间3.5h、反应温度65℃、催化剂4%、醇油摩尔比9:1,此时油酸转化率97.5%。
  2、以1-磺酸丙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐离子液体为催化剂,油酸与甲醇经酯化反应制备油酸甲酯。考察了反应时间、反应温度、醇油摩尔比、催化剂用量对油酸转化率的影响,并对制备工艺进行了响应面优化。结果表明:各因素对转化率的影响与硫酸为催化剂的制备工艺基本一致;该离子液体绿色环保,且催化活性优越,基本与硫酸的催化活性接近,且重复使用4次后,转化率仍达90%以上;优化工艺条件为反应时间3.5 h、反应温度60℃、醇油摩尔比9:1、催化剂用量10%,此时油酸转化率为98.3%。
  3、合成1-磺酸丙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1--磺酸丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-甲基咪唑硫酸氢盐、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐四种离子液体,作为甲酯化反应的催化剂,在超声波-微波辅助下油酸与甲醇制备脂肪酸甲酯。考察了离子液体在超声波-微波联合辅助下的催化性能,并在单因素实验基础上,优化了制备工艺。结果表明:1--磺酸丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐催化性能优越;超声波-微波的引入,显著缩短了反应时间,降低了成本,提高了效益;优化工艺条件为微波反应功率118 W,反应时间17 min,醇油摩尔比22:1,催化剂用量11%,此条件下油酸转化率为97.32%。
  4、合成[ BsIm(CH2CH2O)nCH3][HSO4]等三种不同分子量的单甲醚类温控离子液体,采用FT-IR、NMR、TG-DTA等表征手段对合成的离子液体进行了表征。探索了离子液体的温控特性及甲酯化催化性能。结果表明:合成的离子液体能与甲苯—环己烷形成温控体系;在温控体系中,离子液体催化活性较好,与硫酸接近。
[硕士论文] 胡英
营养与食品卫生学 扬州大学 2015(学位年度)
摘要:多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是许多细胞及生理活动中非常重要的成分,机体多不饱和脂肪酸的平衡影响着生物体正常的生理功能。哺乳动物体内合成多不饱和脂肪酸实际上是一个耗氧的过程,饱和脂肪酸在一系列酶诸如细胞色素b5、黄素蛋白-NADH-依赖型细胞色素b5还原酶(Ncb5or)和脂肪酸去饱和酶等蛋白的共同作用下形成多不饱和脂肪酸。已有研究表明在小鼠、利什曼原虫和拟南芥中,特定的脂肪酸合成缺陷与细胞色素b5还原酶或者与细胞色素b5相关,但对NADH-细胞色素b5还原酶、细胞色素b5、硬脂酰辅酶A去饱和酶以及其他的去饱和酶之间的相互关系还未曾报道。在秀丽线虫多不饱和脂肪酸合成过程中NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5是以哪种形式的存在并发挥着作用还不清楚,也不知道秀丽线虫中从FAT-1~FAT-7的脂肪酸去饱和酶在去饱和作用过程中是否需要NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5的共同参与来激活并发挥功能?
  本研究以秀丽线虫作为模式生物,通过分子生物学和遗传学方法探索属于P450酶系超家族基因的NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5影响多不饱和脂肪酸合成的具体机制。运用RNA干扰抑制基因表达的方法来抑制NADH-细胞色素b5还原酶和细胞色素b5的基因,并将提取的脂肪酸采用气相色谱来检测脂肪酸成分的变化。利用薄层色谱-气相色谱连用的方法检测秀丽线虫脂肪含量的变化。本研究还运用荧光实时定量PCR检测秀丽线虫相关脂肪酸合成与分解关键基因的表达量及用基因过表达绿色荧光蛋白的荧光强度检测蛋白表达水平。并利用外源添加所缺脂肪酸的方法来缓解其缺陷的表型。
  在本研究中,寻找到NADH-依赖型细胞色素b5还原酶和细胞色素b5,以及他们在秀丽线虫不同的去饱和酶活性功能发挥过程中所起的作用。本研究发现线虫中NADH-细胞色素b5还原酶的同源基因为T05H4.4、hpo-19;细胞色素b5的同源基因为cytb-5.1。三个基因功能缺失后,线虫脂肪酸成分发生显著的变化。hpo-19和cytb-5.1干扰株脂滴变小、产卵减少、多不饱和脂肪酸含量和脂肪储存量减少。另外,抑制hpo-19导致生长发育变缓,抑制cytb-5.1导致寿命缩短等多种表型。在脂肪酸去饱和酶基因表达的研究过程中,hpo-19和cytb-5.1明显使fat-2、fat-6和fat-7上调。外源补充所缺脂肪酸缓解其缺陷发现当hpo-19添加C18∶3n3、C18∶3n6和C20∶4n6时,其下游产物都可以部分恢复,但添加C20∶3n6时,其下游产物C20∶4n6没有任何恢复。而cytb-5.1外源加入C18∶1n9、C18∶2n6、C18∶3n3、C18∶3n6、C20∶3n6和C20∶4n6等六种脂肪酸时,都能将其下游产物的脂肪酸和生长表型等恢复。细胞色素b5(CYTB5.1)主要与硬脂酰辅酶A去饱和酶(FAT-6、FAT-7)共同作用调控脂肪酸合成,而细胞色素b5还原酶(HPO-19)与FAT-1、FAT-2、FAT-3和FAT-4共同作用,主要与FAT-2和FAT-4共同作用调节秀丽线虫多不饱和脂肪酸的合成。
[硕士论文] 郝昭程
生物工程 齐鲁工业大学 2015(学位年度)
摘要:10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是一种不饱和中链脂肪酸,是蜂王浆的主要活性成分,目前自然界中主要在蜂王浆中发现,因此又称王浆酸。10-HDA不仅是蜂王浆的主要质量指标,而且研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗肿瘤等多种重要的生理功能,因此,10-HDA具有重要的医药和保健价值,应用前景广泛。对10-HDA的生物合成途径的探索对于了解其生物合成的本质和对其实现工业化生产有着重要的意义。
  本研究通过克隆10-HDA生物合成相关基因蜜蜂电子转移黄素蛋白β基因和3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因,构建真核表达载体,整合到毕赤酵母基因组进行表达,为进一步探索10-HDA生物合成途径奠定基础。硫酯酶在生物体内能催化水解脂酰酰基载体蛋白和饱和脂肪脂酰链,对中链脂肪酸(Medium chain fatty acids,MCFAs)的积累起着关键作用。我们通过克隆拟南芥ACP硫酯酶基因,构建真核表达载体,分析外源基因的插入对毕赤酵母代谢产脂肪酸的影响,探索构建微生物工程菌代谢产10-HDA的可行性。以拟南芥cDNA为模板,PCR扩增得到其脂酰-ACP硫酯酶基因AtFatA,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的质粒中,获得重组质粒pPICZαA-AtFatA。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵诱导,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析获得明显目的蛋白条带,成功构建AtFatA的真核表达系统。气质联用法检测发酵产物胞外游离脂肪酸,发现毕赤酵母AtFatA重组菌株比起始GS115菌株胞外游离MCFAs(写全称),辛酸产量增加51%,MCFAs产量占胞外总脂肪酸产量的28.7%,而野生菌中仅有18.1%,这为日后生产安全无毒害的MCFAs探索了一条新的途径。
[硕士论文] 张柳
临床检验诊断学 温州医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  研究内源性神经酰胺对于THP-1细胞各种炎症因子基因表达的影响,尤其是对白细胞介素(IL)-6的影响及其相关机制;研究内源性神经酰胺对于仓鼠肝脏组织炎症影响,及其与脂代谢和相关microRNA的相关机制。进一步明确神经酰胺与炎症、脂代谢的关系,及其意义。
  方法:
  1、THP-1细胞的体外培养,分为对照组、Myriocin抑制神经酰胺合成组、Palmitate促进神经酰胺合成组、PA+M组。Myriocin终浓度为50μmol/L,Palmitate终浓度为500μmol/L。Myriocin干预2h,再加入Palmitate培养16h。利用LC-MS法检测各组不同类型的神经酰胺的含量。
  2、利用Real-time PCR法检测各组细胞及两组仓鼠的IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA的表达水平,及两组仓鼠的miR-486的表达水平
  3、用ELISA法检测各组THP-1细胞上清中IL-6的释放量。
  4、利用Westernblot法检测各组细胞质IκBα与细胞核NF-κBP65蛋白的表达水平。
  5、利用流式细胞仪检测各组细胞ROS的水平。
  6、利用海马生物能量代谢测定仪XF96检测各组细胞的基础代谢率、ATP产量、最大呼吸能力、储备呼吸能力。
  7、各组细胞DNA的IL-6甲基化的检测。
  8、利用高果糖饮食制造仓鼠模型,LC-MS法检测两组组不同类型的神经酰胺的含量。
  9、用ELISA法检测两组仓鼠血清中VLDL、HDL、LDL的含量。
  结果:
  1、PA组各种类型的神经酰胺均有所升高,PA+M组又较PA组有所下降。
  2、内源性神经酰胺促进THP-1细胞合成释放IL-6,但却没有促进TNF-α、IL-1β、IL-18的表达。
  3、内源性神经酰胺增加IκBα的降解及核内NF-κBP65水平。
  4、神经酰胺能降低细胞的ATP产生、最大呼吸能力、储备呼吸能力。
  5、四组细胞IL-6基因甲基化情况没有差异。
  6、HFD组仓鼠较对照组仓鼠各种类型的神经酰胺均有所升高。
  7、HFD组仓鼠较对照组仓鼠miR-486表达量下降。
  8、HFD组仓鼠较对照组仓鼠IL-6 mRNA的表达量升高。
  9、HFD组仓鼠较对照组仓鼠血清中VLDL、HDL、LDL含量升高。
  结论:
  本实验证明内源性神经酰胺可以特异性促进THP-1细胞IL-6的基因表达,这种作用可能与其能够刺激NF-κB活化有关。同时,内源性神经酰胺对线粒体功能有所影响。成功通过高果糖饮食建造神经酰胺升高模型,仓鼠实验证实神经酰胺与miR-486的表达、VLDL、HDL、LDL的含量、有相关性。同时,仓鼠肝脏神经酰胺还可促进肝脏IL-6的mRNA的表达。
[硕士论文] 赵倩
微生物学 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:L-丝氨酸在医药和食品等领域都有广泛应用。生物酶转化法因其反应条件温和、产物单一等优点,是目前生产L-丝氨酸的主要途径。但是该法所需的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)耐热性较差,限制其工业应用水平。蛋白质改造提高SHMT耐热性能是目前的研究热点之一。大肠杆菌的SHMT具有较好研究基础,可作为其他同源蛋白研究的模式酶。进一步利用分子动力学模拟辅助对SHMT进行改造,有望获得耐热性好的SHMT。本文以大肠杆菌SRZ018为对象,克隆表达SHMT编码基因glyA,分离纯化该纯蛋白并研究其理化性质。在此基础上,对SHMT进行分子动力学模拟,以期为定点突变提高SHMT耐热性能提供科学依据。取得主要研究结果如下:
  (1)建立了SHMT的原核表达体系,通过表达SHMT编码基因glyA并分离纯化获得了该蛋白。从大肠杆菌SRZ018中成功扩增SHMT编码基因glyA,并构建原核表达载体pET-28a-glyA,以E.coli BL21为宿主实现大量表达目标蛋白,并用Ni-NTA树脂纯化SHMT,确定了洗脱液中咪唑最适浓度为150 mmol/L,获得的酶蛋白溶液浓度为1.0 mg/mL,满足后续实验要求。
  (2)建立了SHMT体外反应体系。对影响体外反应的CTAB、PLP和DL-β-苯基丝氨酸进行了优化,发现反应体系中含有0.03 g/L的CTAB、50μmol/L的PLP和200 mmol/L的DL-β-苯基丝氨酸时的反应效果最佳。
  (3)研究了SHMT的pH稳定性和热稳定性。发现SHMT最适pH为7.5,且在pH6.5-8.0下处理1 h仍能保持85%以上的相对酶活,表明pH稳定性良好;最适温度为40℃,且在35-70℃下处理10 min,剩余酶活均低于80%,酶活下降明显,表明温度稳定性较差。
  (4)采用分子动力学模拟确定了提高SHM T耐热性的突变位点。使用分子动力学模拟软件Gromacs对SHMT进行模拟,通过分析RMSF值,确定了SHMT的G151柔性较大。进一步将151位的甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)后进行再次模拟,结果显示,G151A突变将会提高蛋白质热稳定性。
[硕士论文] 刘四磊
食品科学 中国农业科学院 2015(学位年度)
摘要:食用油是人体最为重要的脂肪酸来源,在人体三大能量营养素中占有重要的地位,甘油三酯(Triacylglycerols,TAGs)是由一个甘油分子与三个脂肪酸分子缩合而成的,占食用油成分的95%以上。研究证实,TAGs的营养学及物理化学性质不仅与其所含的脂肪酸的组成、碳链长短及不饱和度等有关,而且脂肪酸在甘油骨架上的酰化位置分布对脂肪酸的生物利用率有着重要影响,即使食用油中所含的脂肪酸组成相似,但由于它们在TAGs中甘油骨架上的酰化位置分布有所差异,会使得不同的油脂物理性状有很大的不同,进而造成了脂质在人体内的吸收代谢等情况有很大的差异,并决定了油脂的营养及应用价值。
  TAGs的这种“脂肪酸酰化位置效应”对于指导功能油脂产品的研发有着非常重要的研究意义。结构脂质(Structured lipids,SLs)通过化学法或生物酶法对脂肪酸在甘油骨架上的组成及酰化位置分布进行修饰,将具有特殊营养价值或生理功能的脂肪酸结合到甘油骨架上的特定位置,从而最大限度的发挥脂肪酸所具有的营养价值和生理功能。作为一类新型的功能脂质,SLs的研究在油脂深加工领域得到了广泛关注。与化学催化剂相比,脂肪酶具有许多优点,如催化活性高、催化反应更具有专一性、反应的副产物少、反应条件温和、环境友好,且能得到化学合成法不能得到的产品等优点。然而,脂肪酶所具有的专一性是在适宜的条件下才能实现的,不同的反应条件、酰基供体、反应介质及不同的物理辅助处理等条件对脂肪酶的位置专一性有着明显的影响。因此,研究酶促酯交换反应中的脂肪酸酰基转移位置专一性和选择性是脂质化学中值得关注的基础性研究工作,相关内容能为功能脂质改性的研究提供理论支持。因此,本论文主要研究结果如下:
  1.结合固相萃取和气相色谱联用技术,建立了SLs中α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析方法,实现了在一根固相萃取小柱上依次分离TAG、DAG、MAG及FFA,该方法能够成功应用于实际样品的分析中;
  2.研究了酶法合成OPO型SLs,在有机溶剂反应体系中,采用物理辅助杆式超声预处理方法能够显著提高产物中OPO的含量。最终确定,超声功率:50%;超声预处理时间:6 min;振幅模式:3 s/9s;底物摩尔比(PPP/OA):1∶8;脂肪酶添加量:12%;应温度50℃为最优条件。Lipozyme RM IM重复使用十次以后其活性并未发生严重损坏。超声预处理条件下反应动力学表观速率常数是常规磁力搅拌方法的2.52倍;
  3.建立了尿素包埋法富集纯化乙酯形态LC-PUFAs的方法;利用纯化得到的乙酯形态的LC-PUFAs为原料,通过单因素实验及四因素、三水平Box-Behken响应面分析实验优化酶法合成APA型SLs的工艺。对反应产物中sn-2位发生的酰基转移反应进行了研究。本实验所合成的APA型SLs既能保证sn-2位含有较高的棕榈酸,又能确保ARA在sn-1,3位具有较高的插入率,所合成的这种SLs在食品及营养食品中有潜在应用价值。
[硕士论文] 汪吴林
生物化工 浙江工业大学 2014(学位年度)
摘要:甜菊糖苷来源广泛,价格低廉,是一种理想的甜味剂,低热、安全低毒,经酸水解得到异斯特维醇。异斯特维醇及其衍生物具有很好的降血糖、抗高血压、保护心肌、抑菌、抗肿瘤等生物活性,一直受到研究者的重视,但其作为催化剂用于不对称反应的研究报道则很少。异斯特维醇骨架具有一定的刚性,有多个稳定的手性中心,能够形成一定的空间位阻和提供手性环境,A环的19-羧基和D环的16-酮基为两个化学活性部位,易衍生得到具有贝叶烷结构的衍生物。以异斯特维醇为基本骨架,引入Lewis酸(杯芳烃)和Lewis碱(叔膦)基团,拟设计合成具有贝叶烷二萜结构双官能团手性催化剂Cat1-5。通过1H-NMR、13C-NMR、MS对合成得到的化合物Cat1-3和化合物11、12进行了结构表征。
  本论文分为两章,第一章主要综述了2000年以来氨基酸、金鸡纳碱、糖、肽、萜六类常见天然产物衍生的手性催化剂的研究进展以及选题依据;第二章详细介绍了Cat1-3、化合物11、12的合成以及条件筛选,考察了温度、溶剂、碱种类等对反应的影响,试验结果表明温度对Cat3和化合物12的合成影响很大,溶剂和碱对化合物11的合成影响较大,只有碱用NaH才能取得中等收率,其中,Cat1的总收率较高,其他化合物总收率均较低。最后,初步考察了 Cat1-3的稳定性,发现在室温下Cat1-3稳定性均较好。
[硕士论文] 张智超
病理学与病理生理学 南华大学 2014(学位年度)
摘要:背景与目的:1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)作为一种信号鞘磷脂,绝大多数与高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)结合,并介导HDL诸多生物功能如抗动脉粥样硬化、抗血栓和保护血管内皮等。S1P通过其5个受体(S1PR1~S1PR5)激活细胞内复杂的信号转导通路实现生物功能多样化。其中S1PR1/3在细胞增殖、血管发生和重建、神经形成、免疫细胞迁移、炎症反应、内皮细胞屏障功能等方面发挥重要作用,但有关S1PR1/3对巨噬细胞内胆固醇代谢的影响未见报道。因此,本论文主要探讨S1P通过S1PR1/3对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用及其信号机制,为全面了解S1P的抗动脉粥样硬化机制提供新的理论基础。方法:1.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)诱导THP-1单核细胞24 h后,选择不同时间和浓度的S1P进行处理,人胆固醇 Elisa试剂盒检测细胞培养液中胆固醇含量。2.分别用VPC23019(S1PR1/3抑制剂,10μM)和JTE-013(S1PR2抑制剂,10μM)孵育THP-1源性巨噬细胞12 h,然后加BODIPY-Cholesterol孵育过夜,激光共聚焦显微镜下观察胆固醇分布、定位和含量变化,同时用油红O染色显示细胞内脂质蓄积情况。3. VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞4 h后,Western Blot检测PI3K-Akt信号通路及NF-κB(P65)的蛋白活性,VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞24 h后,Western Blot检测LXR及其下游基因ABCA1和ABCG1蛋白表达水平。4.分别以LY-294002和MK2206阻断P13K-Akt信号通路后,采用Western Blot检测ABCA1的蛋白表达水平,RT-PCR检测ABCA1和ABCG1的mRNA表达水平,BODIPY-Cholesterol荧光探针结合荧光显微镜,观察THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量,荧光分光光度计检测培养液中胆固醇浓度和胆固醇外流情况。
  结果:1.1μM S1P处理THP-1源性巨噬细胞24 h,培养液中胆固醇含量达到最高。2. THP-1源性巨噬细胞胆固醇大部分选择性定位于细胞胞膜上,S1P可降低THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量。3.与对照组相比,S1PR1/3抑制剂VPC23019下调THP-1源性巨噬细胞PI3K-Akt信号通路活性,并增加NF-κB(P65)蛋白活性,降低LXR、ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平。4.分别用S1PR1/3抑制剂、PI3K抑制剂和Akt抑制剂阻断S1PR1/3-PI3K-Akt信号通路后,ABCA1和ABCG1的蛋白及mRNA表达水平下降,THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量增加,胆固醇外流减少。
  结论:
  1.S1P促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出。
  2.S1PR1/3-PI3K-Akt信号转导通路参与S1P对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用。
[硕士论文] 马彦庆
生物化工 大连理工大学 2014(学位年度)
摘要:磷脂(PL)是生物膜的重要组成部分,对细胞各种活性起着重要作用,它是一种常用乳化剂和抗氧化剂,在食品、化妆品及医药行业有广泛应用。二十二碳六烯酸(DHA)作为一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸,在身体的多项机能中发挥重要作用。DHA型磷脂在拥有磷脂和DHA各自功能特性的基础上还具有多种其它他生物学活性,因此人们开始重视DHA与磷脂的双重作用。目前食用级DHA型磷脂绝大多数提取于海洋生物,但这种DHA型磷脂的来源却有多方面局限性。而工业化脂肪酶产品的出现,为DHA型磷脂酶法制备及生产提供了广阔的基础和与条件。
  本论文首先以DHA在反应产物中的含量为指标,利用单因素法优化了固定化磷脂酶A1(PLA1)催化富含磷脂酰胆碱(PC)磷脂与DHA酸解的反应条件。详细研究了底物摩尔比(DHA/PC)、反应温度、加酶量等对反应的影响,发现在40℃、底物比为4∶1、加酶量为底物总质量20%、溶剂用量为4mL、反应时间2h条件下DHA在产物中含量较高,随后进一步利用响应面法继续优化反应条件,最终得到的最优条件为:底物比4.4∶1、反应温度40℃、加酶量21%、溶剂用量4mL、反应时间2.4h,DHA含量达到17.5mg/g。
  然后又以DHA在反应产物中的含量为指标,利用单因素法优化了固定化PLA1催化粉末磷脂与DHA酸解的反应条件。详细研究了底物比、反应温度、加酶量等对反应的影响,发现在45℃、底物摩尔比(DHA/PL)为10∶1、加酶量为底物总质量25%、溶剂用量为5mL、反应时间3h条件下DHA在产物中含量较高,随后进一步利用响应面方法继续优化反应条件,最终得到的最优条件为:底物比11∶1、反应温度45℃、加酶量25%、溶剂用量5mL、反应时间3h,DHA含量达到70.1mg/g。
  最后根据实验数据简单讨论了PLA1催化磷脂与DHA酸解的反应机制。
[硕士论文] 徐俊科
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2014(学位年度)
摘要:乳糜微粒作为富含甘油三酯的脂蛋白颗粒,其组装和分泌只发生于肠上皮细胞内,是膳食中的脂质吸收进入淋巴循环进而进入血液循环的唯一方式。高甘油三脂血症会引发各种健康疾病,同时,它也是引发代谢综合征的一个潜在因素。值得注意的是,长链脂肪酸(Long-chainfattyacid,LCFA)是磷脂、甘油三脂和胆固醇的基本成分。本试验通过研究长链饱和脂肪酸棕榈酸(Palmitinicacid,PLA)、以及长链n-3多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA)对肠道上皮细胞乳糜微粒的分泌、甘油三酯的重新合成和分泌、以及脂肪酸转运相关基因的影响,旨在探讨不同长链脂肪酸在肠道上皮细胞中的转运机制。
  1、不同长链脂肪酸对肠道上皮细胞乳糜微粒分泌的影响。Caco-2细胞培养21d后,分别用100μM、200μM和400μM的长链脂肪酸[1-14C]PLA、[1-14C]EPA和[1-14C]DHA处理24h。24h后收集细胞培养液,采用超速离心法测定细胞培养液中乳糜微粒(Chylomicron,CM)含量。结果表明,与对照组相比,各处理组随着脂肪酸浓度升高,肠道上皮细胞乳糜微粒分泌量极显著增加(P<0.01);分别在100μM、200μM和400μM,PLA处理组乳糜微粒分泌量均显著高于EPA组和DHA组(P<0.01);在100μM时,EPA处理组和DHA处理组CM分泌量无显著差异(P>0.05),在200μM和400μM时,DHA处理组CM分泌量显著低于EPA处理组(P<0.01)。这些结果表明,与饱和脂肪酸PLA相比,长链n-3多不饱和脂肪酸EPA和DHA能有效降低肠道上皮细胞乳糜微粒的分泌;200μM和400μM浓度下,更长链的DHA的抑制作用比EPA更强。
  2、不同长链脂肪酸对肠道上皮细胞甘油三脂重新合成和分泌的影响。Caco-2细胞培养21d后,分别用100μM、200μM和400μM的长链脂肪酸PLA、EPA和DHA处理24h。24h后收集细胞和培养液,收集前4h,向培养液中加入139μL[1,2,3-3H]glycerol([1,2,3-3H]甘油),检测细胞内甘油三脂(Triglyceride,TG)重新成量和培养液中的分泌量。结果显示,与对照组相比,各处理组随着脂肪酸浓度升高(100μM、200μM和400μM),肠道上皮细胞甘油三脂重新合成和分泌量极显著升高(P<0.01);分别在100μM、200μM和400μM,PLA处理组甘油三脂重新合成和分泌的量均显著高于EPA组和DHA组(P<0.01);在100μM时,EPA处理组和DHA处理组甘油三脂重新合成和分泌的量无显著差异(P>0.05),在200μM和400μM时,DHA处理组甘油三脂重新合成和分泌的量显著低于EPA处理组(P<0.01)。这些结果表明,与饱和脂肪酸PLA相比,长链n-3多不饱和脂肪酸EPA和DHA能有效降低肠道上皮细胞甘油三脂重新合成和分泌量;200μM和400μM浓度下,更长链的DHA的抑制甘油三脂重新合成和分泌的量作用比EPA更强。
  3、不同长链脂肪酸对肠道上皮细胞脂肪酸转运相关基因的影响。细胞培养21d后,分别用100μM、200μM和400μM的长链脂肪酸PLA、EPA和DHA处理Caco-2细胞24h。24h后收集细胞,采用定量PCR方法测定细胞内脂肪酸转运相关基因(PPARα、CD36、L-FABP、DGAT1、和MTP)mRNA的表达量。结果表明,随着脂肪酸浓度升高,PLA、EPA和DHA均显著上调了PPARα、L-FABP、DGAT1和MTPmRNA表达量(P<0.01);在200μM时和400μM时,EPA和DHA处理组PPARα、L-FABP、DGAT1mRNA表达量显著高于PLA处理组(P<0.05);在100μM和400μM脂肪酸处理时,EPA和DHA处理组MTPmRNA表达量显著高于PLA处理组(P<0.05)。这些结果表明,随脂肪酸浓度增加,基因表达量以剂量依赖效应增加;值得注意的是,EPA和DHA对PPARα、L-FABP、DGAT1和MTP基因的调控作用强于PLA。
  本研究通过以上试验可以得出结论:随脂肪酸浓度增加,肠道上皮细胞脂肪酸转运相关基因表达量上调,甘油三酯重新合成和分泌量提高,乳糜微粒分泌量增加;与饱和脂肪酸棕榈酸相比,EPA和DHA能有效抑制甘油三酯重新合成和分泌,降低细胞乳糜微粒的分泌;在200~400μM时,DHA对脂肪转运的抑制作用强于EPA。
[硕士论文] 江伟
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2014(学位年度)
摘要:L-丝氨酸因其具有重要的生理功能及其生化作用而在化工、制药、食品以及化妆品生产等多个行业中有着十分广泛的应用。以甘氨酸和甲醇作为底物,借助于甲基营养型细菌体内的丝氨酸循环途径生产丝氨酸的方法已经有很多报道,但目前研究报道的细菌都来自于陆地环境。当前酶促转化法是L-丝氨酸的主要生产方法,丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT;E.C.2.1.2.1)是酶促转化过程中的关键酶,所以,发现和分离一些高产丝氨酸活性的水生细菌显得非常重要。
  本研究中,具有高活性SHMT的细菌Shewanella algae(S.algae)和Arthrobacter nicotianae (A.nicotianae),分别来自于海洋淤泥和南湖淡水环境中筛选出来。与L-丝氨酸合成相关的酶为SHMT,由glyA基因编码,通过TAIL-PCR的方法克隆获得SaglyA基因的全长序列,该基因编码417个氨基酸残基;通过简并引物克隆得到AnglyA基因全长序列,该基因编码440个氨基酸残基,与大肠杆菌SHMT有54.3%的相似性。重组的glyA基因在Escherichia coli (E.coli) BL21(DE3)中进行表达。酶学性质研究表明SaSHMT酶最佳pH值为7.0,最佳温度为50℃C,活性是同等条件下E.coli中SHMT的0.87倍。此外,通过分析AnSHMT酶催化机理、催化活性位点以及进行三维结构建模,在249位对该酶进行了定点突变。结果表明基于序列比对和生物信息学预测的249位的定点诱变(亮氨酸替换异亮氨酸)后突变子I249L的催化效率是野生型的2.78倍。
  本研究中通过两种方法对L-丝氨酸生产进行了研究,第一种方法是静息细胞系统(Resting cell system)法,利用完整的出发菌株转化L-丝氨酸,该方法主要用于高产丝氨酸菌株的筛选;第二种方法是酶促反应系统(Enzymatic reaction system)法,构建pET-15b-SaglyA工程菌并在反应体系中添加外源的辅酶。以10g/L的甘氨酸和26.6mmol/L的甲醛(流加)作为底物,该SaSHMT可以通过酶促转化生产L-丝氨酸77.76mM,催化甘氨酸到L-丝氨酸的分子转化率是相同条件下大肠杆菌的1.41倍。综上所述,本研究中基于理性设计对AnSHMT进行的定点突变为进一步的研究奠定了基础;SaSHMT酶促转化的研究为工业化生产L-丝氨酸提供了一条有利的途径,此外由于其具备碱性环境的耐受性和相对高的酶促转化率,从而在研究和工业应用上具有较大的潜在价值。
[硕士论文] 孙妍
生物学 哈尔滨工业大学 2014(学位年度)
摘要:本课题以人神经母细胞瘤系SH-SY5Y为模型,研究n-3多不饱和脂肪酸对过氧化氢诱导的氧化应激及其毒性的调控机制。
  实验采用细胞计数法和Hoechst染色观察和研究n-3多不饱和脂肪酸对过氧化氢诱导下SH-SY5Y细胞生存活性和细胞凋亡的影响;采用ATP含量测试试剂盒检测细胞内ATP的水平;采用相关氧化应激指标的测试试剂盒检测细胞内GSH含量、SOD酶活;采用RT-PCR技术,研究与细胞凋亡密切相关的Bcl-2、Bax的基因表达以及氧化应激相关蛋白UCP2、UCP4的基因表达。
  研究发现,当SH-SY5Y细胞用500μM H2O2处理后,细胞内发生明显的凋亡现象,细胞生存率明显下降,细胞内ATP含量下降,抗凋亡蛋白Bcl-2基因表达下降,促凋亡蛋白Bax基因表达增加,这说明细胞产生了较高的氧化应激,细胞通过线粒体凋亡途径引发的凋亡现象十分明显。此外,GSH含量也显著下降。当SH-SY5Y细胞用EPA、DHA预处理24 h后,细胞生存活性升高,凋亡减弱,细胞内单位蛋白 ATP含量也得到恢复,同时发现Bcl-2表达增加,Bax表达下降。此外,细胞内GSH含量、SOD酶活都发生了不同程度的升高,在60μM时作用最显著。RT-PCR结果显示,n-3 PUFA对UCP2、UCP4的mRNA表达水平无显著性作用。
  因此,n-3 PUFA可以抑制过氧化氢诱导的细胞活性下降及细胞凋亡现象,而且可以通过作用于Bcl-2家族基因及ATP含量调控线粒体凋亡途。此外,n-3 PUFA可以提高GSH含量、SOD酶活提高细胞的抗氧化能力,调节氧化应激,抑制氧化应激诱导的细胞凋亡从而保护细胞。
[硕士论文] 邹晓华
生物化学与分子生物学 三峡大学 2014(学位年度)
摘要:目的:随着生活习惯及饮食结构的变化,近年来脂肪性肝病的发病率越来越高,成为危害公共卫生的重要因素。而饱和游离脂肪酸可以诱导肝细胞脂肪变性,通过“两次打击”导致脂肪性肝病的发生发展。有研究发现细胞内非编码微小RNA miR-34a在脂肪性肝病中高表达,因此,本实验拟应用饱和游离脂肪酸及参与脂肪性肝病调控的miR-34a建立肝细胞损伤模型,研究它们对肝细胞生物学活性的影响,为进一步探索脂肪性肝病的发病机制,以及寻找有效防治脂肪性肝病措施提供前期基础。
  方法:(1)瞬时转染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a质粒到HepG2细胞中,24h后在荧光显微镜下观察GFP绿色荧光的表达;36h后收细胞通过RT-PCR检测miR-34a的表达。(2)不同浓度的棕榈酸处理正常、瞬时转染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a质粒的HepG2细胞,MTT法检测棕榈酸和miR-34a对HepG2细胞增殖的影响。(3)实验分为空白对照、棕榈酸处理、miR-34a转染、miR-34a转染+棕榈酸处理四个组,用DAPI分别给四个组的细胞染色,显微镜下观察细胞核的形态学变化;并用细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况。(4)收集四个处理组的细胞,用RT-PCR检测细胞衰老相关基因P21,P53,细胞周期相关基因CDK6,CyclinE2,E2F1以及细胞炎性因子TNF-α,MCP的表达。(5) western blot检测四个处理组细胞周期蛋白CDK6和细胞衰老相关蛋白Sirt1的表达。
  结果:(1)由于载体pEGFP-C1带有GFP基因,因此表达质粒在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光。瞬时转染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a质粒到HepG2细胞中,24h后在荧光显微镜下观察到了绿色荧光的表达;RT-PCR结果显示,36h后miR-34a在其转染的HepG2细胞中高表达,而在空载组中表达为阴性。(2)不同浓度的棕榈酸处理HepG2细胞,MTT法检测棕榈酸可抑制HepG2细胞增殖,并且呈剂量依赖关系;而棕榈酸和miR-34a联合处理细胞可明显抑制HepG2细胞增殖。(3)研究表明,衰老细胞的细胞核体积增大,细胞内β-半乳糖苷酶在酸性条件下被催化生成深蓝色的沉积产物。本实验结果显示棕榈酸和miR-34a联合处理细胞DAPI染色发现细胞核体积增大,应用试剂盒检测也发现,实验组细胞特异性β-半乳糖苷酶呈深蓝色。(4) RT-PCR结果显示,与对照细胞相比较,miR-34a和棕榈酸联合作用于HepG2细胞,使与细胞衰老相关的基因p21,p16,p53,以及炎性细胞因子MCP,TNF-α的表达明显升高,细胞周期相关基因CDK6为低表达。(5) Western blot发现棕榈酸和miR-34a联合作用使CDK6和Sirt1的表达受到抑制。
  结论:研究结果表明miR-34a和棕榈酸联合作用于HepG2细胞,可以诱导细胞内β-半乳糖苷酶,阻滞细胞周期,促进HepG2细胞的衰老,提示高脂及miR-34a在肝细胞衰老中的重要作用及药物干预的潜在靶点。
[硕士论文] 郭晓锋
应用化学 哈尔滨理工大学 2014(学位年度)
摘要:熊去氧胆酸是当前世界上惟一能治疗原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的药品。获取该化合物的传统方法是从熊胆中提取,来源有限,且有违动物保护,因而熊去氧胆酸的人工合成成为研究的热点。
  通过分析大量的文献,本课题组提出从廉价易得的甾醇出发合成熊去氧胆酸的方法。其中3位羟基的构型反转和双键的立体选择性还原是合成熊去氧胆酸的关键步骤。文中分别以3α-胆甾醇和四种3,5位异构的二氢甾醇的合成来呈现上述两个反应,这5个甾体化合物同时也是其它甾体药物合成中的重要中间体。
  本文在总结3α-胆甾醇现有合成工艺的基础上,设计并尝试了三种3α-胆甾醇的合成路线。最终确定了以3β-胆甾醇为原料,经甲磺酰化、SN2乙酰化、水解三步反应合成3α-胆甾醇的方法。文中首次对乙酰化反应进行了系统的研究,分别考察了乙酰化试剂、相转移催化剂、反应溶剂等对反应的影响。其中乙酰化试剂分别尝试了碱金属、碱土金属、过渡金属的乙酸盐以及HOAc-R3N体系。
  四种二氢甾醇的合成:两种5位氢为α型的二氢甾醇5α-胆甾-3β-醇(4)和5α-胆甾-3α-醇(5)分别由3β-胆甾醇和3α-胆甾醇在Pd/C催化加氢下还原生成,产物经1HNMR进行了结构确认。两种5位氢为β型的二氢甾醇5β-胆甾-3β-醇(8)和5β-胆甾-3α-醇(9)通过还原5β-胆甾-3-酮得到,最终获得二者的混合物,1HNMR分析结果表明n(8)∶n(9)=1∶3。
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