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[博士论文] 褚欣奕
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:银屑病是一种在全球范围内发病率较高且难以治愈的慢性皮肤疾病。其发病机制十分复杂,涉及多个基因和调控通路间的相互作用,而目前还没有能够系统地整合这些因素的疾病模型。内源性网络理论(endogenous network theory)提出了一种从复杂疾病表型出发研究其内在机制的系统生物学框架。该理论认为控制生物表型的机制可以用一组关键调控者间通过相互作用构成的网络,以及该网络的稳定状态来进行描述。本研究借助内源性网络理论,尝试从系统的层面整合银屑病发病机制信息,阐释发病的调控机制,探索新的治疗方式。
  首先,本研究根据银屑病的主要症状以及发病机制中的关键因素,构建了银屑病内源性网络。该网络包含免疫调节、细胞周期控制和reactive oxygen species(ROS)平衡三个模块。网络的动力学模拟结果与银屑病的特征及患者的基因表达数据相吻合,表明该网络在一定程度上能够描述疾病背后的调控机制。之后,基于此网络的研究显示,现有的抗银屑病药物的作用机制多与网络的免疫调节以及细胞周期控制模块有关,而ROS平衡模块亦包含一些潜在的银屑病治疗靶标。这一结果不仅进一步证明了本研究中构建网络的准确性,同时也预示调节ROS是一种潜在的银屑病治疗方式。
  其次,本研究对ROS平衡的核心调控者Nrf2的激活剂进行了筛选,并进行了初步验证。基于connectivity map(cMap)数据的双聚类分析得到的候选化合物,本研究依据其分子结构和是否上市进行了二次筛选,共获得了22个非亲电子性药物。随后选取9个药物利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了其激活Nrf2靶基因表达的能力。结果显示其中6个药物能够显著上调Nrf2靶基因的表达。被测药物中阿司咪唑尤为突出,表现出了高于阳性对照-D,L-萝卜硫素的Nrf2激活能力。
  最后,本研究利用咪喹模特诱导的银屑病小鼠模型验证了阿司咪唑的抗银屑病活性。实验结果显示,腹腔注射阿司咪唑能够抑制模型小鼠中表皮过度增生相关的银屑病症状以及组织病理变化。另外,阿司咪唑与现有的抗银屑病药物甲氨蝶呤的组合显示出了较后者单药更强的抗银屑病效果。
  综上所述,本研究通过构建内源性网络对银屑病发病机制进行了系统地阐释,籍于此找到了潜在抗银屑病药物阿司咪唑,并利用实验手段初步验证了阿司咪唑的抗银屑病活性,为银屑病的治疗提供了有潜力的新药物。
[硕士论文] 魏翠云
生态学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全氟辛基磺酸盐(Perfluorooctane sulfonate,PFOS),作为一种典型的全氟类化合物,具有生殖毒性、发育毒性、神经毒性、基因毒性等多种生物毒性效应,但目前关于PFOS影响脂代谢和糖代谢的分子致毒机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,Celegans)作为一种模式生物,体内的多不饱和脂肪酸合成通路结合了植物和动物的过程,与高等动物相比,具有完整的从头合成多不饱和脂肪酸的能力。本文以C.elegans作为研究对象,用不同浓度梯度PFOS暴露C.elegans研究其对脂代谢与糖代谢的影响,主要研究结果有:
  1.建立了C.elegans脂肪酸甲酯化方法,并用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)定量检测了C.elegans体内9种典型脂肪酸含量,实验结果表明用0.5%甲酯化试剂(H2SO4/MeOH),甲酯化时间2h,甲酯化回收率较高,且GC-MS检出限都在ng/mL范围,远远低于C.elegans体内的μg/mL浓度范围,分析方法灵敏度高。
  2.不同浓度梯度(0,0.01,0.1,0.5,1.5μmol/L)PFOS暴露L1期C.elegans72h,GC-MS定量检测结果表明PFOS会导致C.elegans中脂肪酸含量降低,与饱和脂肪酸相比,不饱和脂肪酸降低相对显著;进一步发现脂肪酸合成关键基因,如乙酰辅酶A羧化酶的相关基因acc-4,△9去饱和酶的相关基因fat-7相对表达量随PFOS浓度的增加而显著下调(p<0.05),说明PFOS可能通过影响脂肪酸合成初期反应关键酶的表达,而导致C.elegans体内各脂肪酸含量下降。
  3.脂质代谢与糖代谢与氧化磷酸化水平密切相关,PFOS暴露72h后,C.elegans中葡萄糖含量也随PFOS浓度的升高而降低,1μmol/L PFOS暴露后C.elegans中的丙酮酸和ATP含量都显著降低于对照组(p<0.05);我们分别测定了C.elegans体内与葡萄糖代谢有关的糖异生、糖酵解和胰岛素通路中相关基因pck-1,pyk-1,pyk-2,pfk-1.1,gpd-2,ctl-1,daf-2,daf-16的相对表达量,结果表明PFOS暴露可能通过影响C.elegans体内与糖代谢相关基因的相对表达,从而导致C.elegans体内糖代谢紊乱;PFOS暴露会导致C.elegans中脂肪酸、葡萄糖含量的降低,而丙酮酸和ATP含量下降,提示三羧酸循环也发生紊乱,这可能是PFOS暴露造成C.elegans死亡的原因。
  总之,本文建立了灵敏可靠的C.elegans体内脂肪酸的GC-MS分析方法,定量测定了PFOS暴露对C.elegans体内脂肪酸代谢及相关基因表达的影响,并进一步分析了PFOS暴露对C.elegans体内糖代谢和三羧酸循环的影响,实验结果表明PFOS可以显著抑制C.elegans体内脂代谢、糖代谢和ATP的合成,具有明显的毒性效应。
[硕士论文] 赵晶
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究以4-壬基酚(4-Nonylphenol,NP)为受试物,以SD雄性大鼠和睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)为研究对象,应用生物光谱技术研究NP的雄性生殖毒性效应。
  方法:
  1、用对照组(玉米油)、系列浓度(25、50、100mg/kg)NP腹腔注射,每两天一次,连续20天染毒不同日龄(21、35、50日龄)SD雄性大鼠,构建动物模型;取睾丸组织、提取原代睾丸细胞后,分别用Raman光谱和ATR-FTIR光谱检测大鼠睾丸组织和细胞的生物化学改变;
  2、用对照组(DMSO)、系列浓度(2.5、5、10和20μM)NP对睾丸SCs进行染毒培养24h,细胞经消化、洗涤、固定后用ATR-FTIR检测;
  3、采用主成分分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的图谱进行多变量分析。
  结果:
  1、ATR-FTIR检测不同日龄大鼠的睾丸细胞,NP暴露组和对照组之间集群分离明显;且除了脂质区50日龄组中25mg/kgNP暴露组(P>0.05),其他暴露组与对照组的差异均具有统计学意义(P<0.001),并且显示出剂量-效应关系;聚类向量分析显示不同NP暴露下各组发生变化的生物标记物不同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率相比对照组均存在显著性差异(尸<0.001);
  2、ATR-FTIR分析不同浓度NP暴露下体外培养的睾丸SCs,NP暴露组和对照组集群图是分离开的,且在LD1平面NP暴露组和对照组效应差异显著(P<0.001);聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  3、Raman分析不同日龄大鼠的睾丸组织,观察到各组大鼠的睾丸间质组织远离对照组,且不同NP暴露组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异;在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、不饱和脂肪水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  结论:
  1、通过体内体外实验发现,不同浓度的NP对于睾丸组织和细胞产生的效应是不同的,而且伴有剂量效应关系;同时对不同的日龄大鼠所产生的的效应也各不相同;
  2、通过检测细胞的生物分子特征性变化,发现NP暴露可以干扰睾丸SCs和睾丸间质细胞脂代谢和糖代谢等细胞代谢过程,对睾丸细胞增殖活性有影响,也可以诱导蛋白质二级结构发生改变.
[硕士论文] 董伟
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.以新上市的抗肿瘤药物奥拉帕尼为先导化合物,设计、合成新的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,并评价其抑制PARP-1酶的活性及其对肿瘤细胞抗增殖能力的影响,以期获得的具有PARP-1抑制活性的新型靶向抗肿瘤化合物。鉴于PARP-1也可能是治疗AD的新型靶点,本研究同时也检测了目标化合物对AChE和BuChE的酶抑制活性,以评价其作为抗AD的多靶点配体的潜力。
  2.以Pubchem数据库中现有的PARP-1抑制剂为筛选对象,通过计算机辅助药物设计技术,筛选出具有AChE抑制活性的小分子化合物,并进行分子动态模拟,以期获得具有PARP-1和AChE双靶点抑制的抗AD化合物,为新型抗AD药物研究提供基础。
  方法:
  1.目标化合物的设计和合成:保留奥拉帕尼的主要药效团,对分子尾部的环丙基进行改造。选取分子长度适宜且尾部链自由度较小的共轭结构—取代芳香基丙烯酰基结构,对环丙基进行结构替换,设计和合成16个奥拉帕尼类似物。其合成方法为:以2-甲酰基苯甲酸为原料,经环合、氧化、还原等反应,合成重要中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸;以取代的芳香甲醛为原料,与丙二酸发生Knoevenagel反应,得到取代芳香基丙烯酸,与1-叔丁氧羰基哌嗪发生酰胺反应,脱去保护基团叔丁氧羰基后,与2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸发生酰胺化反应,得到目标产物。
  2.目标化合物生物活性评价:(1)采用HT同源PARP荧光法抑制试剂盒(Trevigen,Cat#4690-096-K)检测所合成的目标化合物对PARP-1酶的抑制活性,然后采用MTT法测定目标化合物对人结肠癌SW-620和人乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖能力的影响;(2)采用Ellman法评价目标化合物对AChE和BuChE的抑制能力。
  3.虚拟筛选:使用AutoDock Vina软件对具有PARP-1抑制活性的859个化合物进行虚拟筛选,寻找具有AChE抑制活性的潜力分子。使用GROMACS软件对目标分子进行动力学模拟,探究其分子识别机制和动态结合模式。
  结果:
  1.本研究设计、合成了16个(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,其结构通过1H-NMR、13C-NMR、IR和质谱进行了确证。
  2.(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物生物活性的评价:PARP-1酶活性的测试结果显示,化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性(IC50分别为41.50±2.65、37.90±1.89和16.10±1.25nM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.20±1.06nM);MTT测试结果显示,化合物44d、44e、44n对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞有较强的抑制增殖活性(IC50分别为10.25±2.20、13.95±1.28和11.62±2.15μM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.63±1.25μM),而对人结肠癌SW-620细胞无明显的抑制作用,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1可能有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究;采用Ellman法评价了目标化合物对AChE和BuChE的抑制作用。结果表明,化合物44d、44e、44n对AChE酶的IC50分别为27.44±0.46、12.24±0.49和24.55±1.10μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为0.04±0.01μM),对BuChE酶的IC50分别为13.17±0.23、5.93±0.19和9.16±0.91μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为12.01±4.05μM)。化合物44d、44e、44n对BuChE显示了较好抑制活性,而对AChE抑制作用稍弱。
  3.使用AutoDock Vina软件虚拟筛选出10个目标化合物,其中8个化合物都具有吡咯并咔唑母核结构,该结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有重要作用。CID71605390和CID57390505在与AChE的对接和分子动态模拟中显示出较高亲和力和稳定性。
  结论及创新点:
  1.本研究以奥拉帕尼为先导化合物,合成并确证了16个未见报道的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物。其中化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性,且对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞具有较强的抗增殖活性,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1具有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究。其中化合物44d、44e、44n还对BuChE显示了较好抑制活性。
  2.通过对Pubchem数据库中的PARP-1抑制剂进行虚拟筛选,初步筛选出具有较强AChE和PARP-1双靶点抑制作用的10个化合物,发现吡咯并咔唑母核结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有较重要作用,并对目标化合物进行进一步的分子对接和分子动态模拟,优选出化合物CID71605390和CID57390505,为寻找用于治疗阿尔茨海默病的新型AChE和PARP-1双靶点抑制剂提供了新的思路。
[硕士论文] 丁涛
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:糖尿病肾病是终末期肾脏病的主要病因之一,是心血管疾病的独立危险因素,目前缺少积极有效的治疗手段。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)作为重要的二氢黄酮类化合物,具有显著的抗氧化、抗炎和抗纤维化生物活性,其对糖尿病肾病的作用尚无研究。
  目的:
  本研究目的在于通过体内外实验探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏保护作用及机制。
  方法:
  利用高脂饮食/链脲佐菌素腹腔注射大鼠构建糖尿病肾病动物模型:采用ELISA法检测尿微量白蛋白和空腹血清胰岛素水平;运用生化试剂盒测定血清肌酐、血清葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平;肾脏组织切片进行苏木精-伊红和过碘酸希夫染色评价肾脏病理损害;利用免疫组化检测肾脏炎性因子IL-1β表达,从而探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。利用高浓度葡萄糖刺激大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1和人近端肾小管上皮细胞HK2构建糖尿病肾病细胞模型:采用MTT法测定细胞增殖;采用DCFH-DA法和激光共聚焦显微镜检测细胞内和线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成;利用免疫印迹法检测NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达,从而研究二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏细胞的作用及机制。
  结果:
  1.高脂饮食/链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠表现24h尿微量白蛋白水平、血清肌酐、空腹血清葡萄糖、空腹血清胰岛素水平、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显升高,胰岛素敏感性指数明显降低,肾组织病理学损害明显,肾小球系膜细胞增生和系膜基质增多,肾小球IL-1β表达水平增加。给予高剂量的二氢槲皮素(100mg/kg/day)治疗12周后,糖尿病肾病大鼠的24h尿微量白蛋白水平降低,血清肌酐、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显下降,肾组织病理学损害减轻,肾小球系膜细胞增生和系膜基质扩张减轻,肾小球IL-1β表达水平较前降低,而胰岛素水平及胰岛素敏感性指数无明显变化。
  2.HBZY-1和HK2细胞经高浓度葡萄糖刺激后,细胞增殖明显,细胞内和线粒体ROS生成增多,NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β和肾纤维化相关细胞外基质蛋白Fibronectin和CollagenⅣ过表达。给予二氢槲皮素处理后,细胞增殖显著被抑制,ROS生成减弱,NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达较前下调。
  结论:
  二氢槲皮素能够通过减轻尿微量白蛋白排泄、改善脂质代谢紊乱、减轻肾脏组织病理损害和肾脏炎性因子分泌等发挥肾脏保护作用,其可能的机制是抑制细胞增殖、降低ROS的生成、抑制NLRP3炎性小体的激活和抑制肾脏纤维化。
[硕士论文] 傅维佳
内科学(传染病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:随着HBsAg定量检测技术的发展,临床研究发现HBsAg定量水平在抗病毒治疗过程中有重要的意义。但是HBsAg不仅来源于Dane颗粒(含有完整病毒核酸的感染颗粒),还有更多来源于管状或球形颗粒(非感染性的病毒空壳),所以HBsAg水平与抗病毒治疗并不完全平行,且目前缺乏大样本的临床研究,尚未形成标准化的评价体系。本研究旨在通过回顾性研究,观察核苷(酸)类药物长期治疗的CHB患者其基线HBsAg、HBeAg及HBVDNA定量水平及治疗过程中的动态变化,分析这些指标在CHB患者治疗过程中的临床意义。
  方法:回顾分析从2012年1月至2016年12月期间在第二军医大学附属长海医院感染科就诊及随访的4000例初治慢性乙肝患者,收集相关的临床病例资料,分析指标包括HBsAg、HBeAg、HBVDNA、年龄、性别,共筛选出其中资料齐全的940例样本进行分析。
  结果:1.HBeAg阳性CHB患者(439例)年龄小于HBeAg阴性组(501例),基线HBsAg,HBVDNA定量水平大于HBeAg阴性组。2.HBeAg阳性组中,基线HBsAg与HBeAg,HBVDNA呈正相关,基线HBeAg与HBVDNA呈较弱的正相关。3.HBeAg阴性组中,基线HBsAg与年龄成显著的负相关,与HBVDNA不相关。4.HBeAg阳性组中,经过长期抗病毒治疗,HBsAg,HBeAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到SR。经过4年抗病毒治疗,达到SR者138例,其中ETV组35,LDT组75,LDT+ADV组11,ETV+ADV组9,LAM+ADV组8例。5.HBeAg阴性组中,经过4年抗病毒治疗,全部达到VR,HBsAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。没有发现对疗效有预测价值的因素。
  结论:HBeAg阳性CHB患者,抗病毒治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到血清学应答。HBeAg阴性组中,没有发现对应答有预测价值的因素。
[硕士论文] 周婷
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:骨质疏松是一种年龄退行性疾病,主要症状是骨量减少、骨微结构发生变化。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成骨细胞的祖细胞,具有多向分化功能,但是老化的BMSCs细胞的成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强,因此,老年人的骨质疏松治疗难度较大。抑制BMSCs老化,促进其成骨分化能力是提高老年人骨骼质量的一个突破途径。白藜芦醇具有抗氧化、抗炎等功能,那么白藜芦醇能否抑制BMSCs老化,促进其成骨分化,进而治疗老年入骨质疏松呢?本研究对来源不同月龄小鼠的BMSCs研究发现,随着月龄增加,老化的BMSCs占比增加,细胞增殖速率减慢。加入白藜芦醇后,BMSCs老化现象减少,且呈现浓度依赖性,同时,BMSCs的成骨分化能力显著增强。进一步研究发现,白藜芦醇逆转BMSCs老化的作用是通过激活AMPK信号通路,抑制细胞内活性氧的产生而实现的。这些结果的发现,揭示了白藜芦醇促进BMSCs成骨分化的机制,为老年人骨质疏松的治疗提供了新的方向。
[硕士论文] 苏东安
精神病与精神卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:抑郁症是一种常见的情感障碍,主要临床表现为情绪低落、兴趣减低,甚至可出现极端消极观念和自杀行为,致残及致死率非常高,预计到2020年,抑郁症将成为全球第二大常见疾病[1];先前研究发现抑郁症的发病机制可能与相应脑区神经营养因子水平下调及促炎性因子的异常激活有关[2-4]。大量研究指出氯胺酮作为一类临床常用的全身麻醉药,其可发挥快速起效的抗抑郁作用,且对伴有自杀倾向的难治性抑郁患者亦有改善作用[5,6],本研究旨在通过构建抑郁动物模型和临床实验进一步证实氯胺酮对抑郁症的治疗作用,并试图阐明氯胺酮抗抑郁机制,从而为临床治疗抑郁症提供理论基础。
  一、氯胺酮对抑郁大鼠白介素-1β和白介素-6表达的影响
  目的:观察氯胺酮对抑郁大鼠前额皮层及海马区组织内白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)表达的变化。
  方法:Wistar大鼠雄性20只,2月龄,体重180~220g。按随机方式分为2组(n=10),分别给予生理盐水(对照组,C组)、给予氯胺酮药物治疗组为K组。应用行强迫游泳实验15min的方法建立大鼠抑郁模型,建模后第2天腹腔注射氯胺酮10mg/kg或等体积生理盐水。注射30min后再次进行强迫游泳试验5min,记录大鼠不动时间。然后立即处死大鼠,剥前额皮层及海马组织测定IL-1β和IL-6的表达。
  结果:与对照组相比,氯胺酮干预后大鼠强迫游泳不动时间明显减少(p<0.01),大鼠前额皮层及海马区的IL-1β和IL-6表达均明显下调(p<0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与前额皮层及海马IL-1β和IL-6的表达下调有关。
  二、氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子及5-羟色胺水平的影响
  目的:探索单次小剂量静脉注射氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)及5-羟色胺(5-HT)水平的影响。
  方法:39名抑郁症患者随机分为两组:对照组(n=20),氯胺酮组(n=19)。氯胺酮组静脉持续推注0.5mg/kg盐酸氯胺酮溶液50ml,推注时间40min,对照组推注等容量生理盐水50ml。在治疗前及治疗后第1、3、7天完成汉密尔顿(HAMD)量表评分及测定外周静脉血BDNF及5-HT的含量。
  结果:与对照组相比,氯胺酮组患者在干预后第1、3、7天HAMD评分均明显降低(p<0.05),治疗后第1天BDNF水平明显上升(p<0.01),尽管第3天有所回落但仍显著高于对照组(p<0.05),第7天无明显差异(p>0.05),5-HT水平各时间节点与对照组无明显差异(p>0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与上调血清BDNF的表达有关,与5-HT的关系尚需进一步研究证实。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 余史丹
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:新型抗艾滋病复方药物(富马酸替诺福韦酯200mg+拉米夫定300mg+依非韦伦400mg,q.d.)是由加利福尼亚大学洛杉矶分校(UCLA)何志明院士课题组采用反馈系统控制(FSC)技术按照不同药物组合和剂量进行测试筛选优化得到的低毒高效的抗艾滋病复方药物。本课题建立高灵敏度、高特异性的LC-MS/MS方法对新型抗艾滋病复方药物进行了临床前药代动力学研究,了解其在动物体内吸收、分布、代谢及排泄等药动学及其相互作用过程,为新药的申报和进一步临床试验研究提供试验资料和参考依据。
  一、生物样品中替诺福韦、拉米夫定及依非韦伦定量分析方法的建立与确证
  本文建立了快速、灵敏、可靠的LC-MS/MS方法测定不同生物样品中替诺福韦(TEF)、拉米夫定(3TC)及依非韦伦(EFV)的浓度。选用阿昔洛韦(ACV)、双氢氯噻嗪(HCT)及恩曲他滨(FTC)作内标,样品采用蛋白沉淀法处理,色谱柱选用AgilentZORBAX SB-Aq(4.6×150mm,5μm)和Ultimate XB-C18(4.6×50mm,5μm);流动相为甲醇-水(25mM醋酸铵+0.1%甲酸)和乙腈-水(0.1%甲酸);梯度洗脱,流速为1mL/min,3∶7分流。采用ESI离子源,MRM检测模式,正离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z288.3→176.4(TEF)、m/z230.3→111.9(3TC)、m/z316.0→244.0(EFV)、m/z226.1→152.2(ACV,IS)、m/z247.8→129.9/101.1(FTC,IS);负离子扫描模式下,用于定量的离子通道分别为m/z314.0→243.9(EFV)、m/z296.0→204.8(HCT,IS);不同生物样品中TEF、3TC及EFV定量分析方法学验证结果均符合FDA、CFDA等颁布的生物样品定量分析相关指导原则且成功应用于新型抗艾滋复方药物的临床前药代动力学研究。
  二、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学相互作用研究
  采用自身对照、随机交叉试验方法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学相互作用进行评价。通过比较Beagle犬单剂量口服给药抗艾滋病单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现不同Beagle犬个体间差异较大,而TEF、3TC及EFV的主要药代动力学参数均不存在显著性差异(P>0.05),即不存在药物相互作用。提示TEF、3TC与EFV不存在相互作用,是否与Beagle犬个体差异大而掩盖了药物相互作用相关有待进一步的考察研究。
  三、新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在Beagle犬体内的药代动力学过程进行考察。对Beagle犬单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相对应的给药剂量进行线性回归,得TEF的相关系数为R2=0.4214(Cmax)和R2=0.6849(AUC0-τ),3TC的相关系数为R2=0.7889(Cmax)和R2=0.8286(AUC0-τ),提示TEF和3TC的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关,而EFV的相关系数仅为R2=0.2289(Cmax)和R2=0.3047(AUC0-τ)。Beagle犬多剂量给药复方药物第四天后,体内TEF、3TC及EFV的血药浓度基本上达到稳态。单剂量和多剂量口服给药抗艾滋病复方药物后TEF、3TC及EFV的平均药时曲线AUC累积比分别为1.89、0.95和1.17。以药物生物等效性的接受标准为参比(上限界定为1.25),提示连续给药7天后TEF在Beagle犬体内有蓄积,3TC及EFV无蓄积。
  四、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内药代动力学研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内的药代动力学及相互作用进行考察。对SD大鼠单剂量口服给药低、中、高三个剂量组抗艾滋病复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药动学参数Cmax、AUC0-τ与相应给药剂量进行线性回归,得TEF相关系数为R2=0.3035(Cmax)和R2=0.7803(AUC0-τ),3TC相关系数为R2=0.6134(Cmax)和R2=0.8646(AUC0-τ),EFV相关系数为R2=0.6886(Cmax)和R2=0.5314(AUC0-τ),提示TEF、3TC及EFV的药动学参数AUC0-τ与给药剂量基本呈正相关。比较SD大鼠单剂量口服给药抗艾滋病复方药物各单一组分和复方药物后体内TEF、3TC及EFV的药时曲线及相应药动学参数,发现TEF及3TC各参数无显著性差异(P>0.05);EFV的药动学参数Cmax、MRT存在显著性差异(P<0.05)。提示SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后对TEF、3TC体内药代动力学无显著影响,对EFV在体内的吸收、消除过程有一定的影响,即可能存在药物间相互作用。
  五、新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内组织分布及排泄研究
  采用LC-MS/MS法对新型抗艾滋病复方药物在SD大鼠体内主要脏器组织中的分布状况及其排泄特征进行研究。从抗艾滋病复方药物在各组织中的分布结果中发现,富马酸替诺福韦酯(TDF)经胃肠道吸收后迅速代谢成TEF,在肾脏中分布最快、浓度最高,肝脏次之。TEF不易通过血脑屏障进入脑组织,在脑组织中分布较少。给药2h后,3TC在肾组织中迅速达峰且分布浓度最高,24h仍维持较高浓度的分布。3TC在血流灌注丰富的组织(心、肝、脾、肺)中也有较为广泛的分布且达到较高浓度水平,在脑组织中分布较少。EFV在各组织中的浓度分布顺序为肝>心、脾、肾、脑>肺。药物EFV经胃肠道吸收,原型药物在肝脏中分布最快、浓度最高,其易于通过血脑屏障,因此在脑组织中浓度较高。
  从排泄实验结果中可以看出,SD大鼠口服给药抗艾滋病复方药物后,TDF主要以代谢物TEF形式从尿液、粪便及胆汁中排泄,平均累积排泄率分别为12.50%、28.84%和0.285%;3TC在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为21.37%、27.61%和1.293%,主要以原型形式排泄;EFV在SD大鼠体内存在广泛的代谢过程,以原型形式在尿液、粪便和胆汁中的平均累积排泄率分别为0.005%、5.86%和0.014%,总排泄率仅为5.879%,后期需进一步研究依非韦伦的体内代谢产物。
[硕士论文] 程丹
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脂肪酸类化合物在哺乳动物体内有较为完整的吸收代谢途径,研究发现脂肪酸能作为生物前体物质或能量被细胞摄取,因此广泛用于前药的设计之中。文献报道的脂肪酸修饰的抗肿瘤药物多以二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(α-LNA)、共轭亚油酸(LA)为代表的不饱和脂肪酸,但是关于长链饱和脂肪酸抗肿瘤前药的研究较少。本研究以临床较为常用的抗肿瘤药物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)为模型药物,选择两种长链饱和脂肪酸——棕榈酸(Palmitate acid,PA)和硬脂酸(Stearate acid,SA),以及两种不饱和脂肪酸——亚麻酸(Linolenate acid,LNA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)作为配体,合成了四种紫杉醇脂肪酸酯前药,将其制备成脂质体,并对其体内外性质进行研究,以期比较紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯前药在抗肿瘤效果方面的差异,并筛选出一种低毒高效的紫杉醇前药制剂。
  本研究首先通过酯化法合成了紫杉醇饱和与不饱和脂肪酸酯,即PTX-PA、PTX-SA、PTX-LNA和PTX-DHA,产物经ESI-MS与1H NMR确证为目标化合物。处方前研究表明,各种化合物的脂溶性均有不同程度增加。
  采用薄膜分散-探头超声法制备紫杉醇棕榈酸酯脂质体(PTX-PA-L)、紫杉醇硬脂酸酯脂质体(PTX-SA-L)、紫杉醇亚麻酸酯脂质体(PTX-LNA-L)和紫杉醇二十二碳六烯酸酯脂质体(PTX-DHA-L)。对其制备工艺和处方成分进行单因素考察优化后,最终确定处方工艺如下:磷脂与药物比例为25∶1,磷脂与胆固醇比例为25∶1,DSPE-PEG2000用量为0.4%,;制备过程中的薄膜制备时间和探头超声时间分别为45℃和90s。对最终处方进行验证后发现,与PTX-LNA和PTX-DHA相比,PTX-PA和PTX-SA制备出的脂质体粒径更小,过膜较顺畅,包封率较高,在制剂制备中更有优势。
  体外血浆转化研究表明,四种前药脂质体均能在大鼠血浆中缓慢释放出活性药物紫杉醇。PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L在血浆中孵育30h的转化率分别为3.49%、6.74%、8.55%和10.26%。体外细胞毒性研究结果表明,血浆中较稳定,转化较慢的PTX-PA-L和PTX-SA-L药物细胞毒性较低,而血浆中活性药物释放较快的PTX-LNA-L和PTX-DHA-L毒性相对较高。
  在体外研究的基础上,进行了体内药动学和组织分布实验。考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L、PTX-SA-L、PTX-LNA-L和PTX-DHA-L的体内药动学特征。实验结果发现血浆中累积释放速度较慢,血浆清除率低的PTX-PA和PTX-SA代谢出的活性母药PTX平均滞留时间长,代谢出的PTX的药时曲线下面积和半衰期分别为紫杉醇注射液的2倍和5倍。清除速率较快的PTX-LNA和PTX-DHA代谢出的PTX药时曲线下面积较小,半衰期短,与紫杉醇注射液相比并不具备优势。组织分布研究表明,肿瘤组织中,PTX-PA-L代谢出的PTX的AUCTumor(56.08μg/g*h)显著高于PTX-LNA-L(28.82μg/g*h)。证明PTX-PA-L在肿瘤组织可以更多的转化为PTX,增加药物在肿瘤部位的蓄积。
  最后,采用小鼠S180肉瘤细胞模型,考察了紫杉醇注射液、PTX-PA-L和PTX-LNA-L的体内抗肿瘤效果和骨髓抑制毒性。结果显示,等摩尔剂量下,虽然两种前药脂质体抗肿瘤效果均优于紫杉醇注射液,但PTX-PA-L(紫杉醇饱和脂肪酸酯脂质体)的抑瘤作用约为PTX-LNA-L(紫杉醇不饱和脂肪酸酯脂质体)的1.23倍,说明PTX-PA-L能够更为显著的提高药物的体内抗肿瘤活性,进一步说明血浆中释放较慢,血浆清除速率慢,肿瘤部位PTX浓度高的药物,药效更好。血常规检测结果发现,PTX-PA-L与其他两给药组相比,与骨髓抑制毒性有关的白细胞和血小板水平明显较高,说明体外细胞毒性较小的PTX-PA-L对荷瘤小鼠的骨髓抑制毒性同样较小。
[硕士论文] 杨启维
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。
  随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。
  目的:
  明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,迸一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。
  方法:
  1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。
  2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。
  3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。
  4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。
  结果:
  1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。
  2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。
  3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。
  4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。
  结论:
  我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。
[博士论文] 吴卉乔
外科学(骨外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Nampt参与介导椎间盘退变过程
  背景:
  腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。
  烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。
  目的:
  1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;
  2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。
  方法:
  1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级Ⅱ级和Ⅲ级为轻度退变组,退变等级Ⅳ级和Ⅴ级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。
  2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。
  3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  结果:
  1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。
  3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。
  4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用。
  5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。
  6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分解的作用。
  结论:
  1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。
  2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。
  第二部分 APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制
  背景:
  自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。
  Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。
  目的:
  1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用
  2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。
  方法:
  1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866 (10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  2、米用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(rNampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/mL)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。
  结果:
  1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。
  2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和rNampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。
  3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。
  结论:
  Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。
[硕士论文] 吕洪伟
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的致命性恶性肿瘤之一。肿瘤中被称为癌症干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs)的一小群细胞被认为是肿瘤发生、发展、转移和耐药的关键驱动力。维生素C(vitamin C,VC)(又称L-抗坏血酸或抗坏血酸盐)作为一种癌症疗法,有一段争议历史。20世纪70年代,著名诺贝尔化学奖、和平奖双料得主莱纳斯·鲍林(Linus Pauling)和外科医生伊万·卡梅伦(Ewan Cameron)报道称静脉滴注加口服大剂量维生素C(10g/d)能有效延长晚期肿瘤患者的生存期。随后,美国权威医疗机构梅奥诊所(Mayo Clinic)却通过临床试验证实口服大剂量维生素C并不能改善癌症生存率,因而否定了维生素C在癌症治疗中的作用。直到近些年,科学家才发现给予维生素C途径的差异是造成之前两次研究结果不同的主要原因。大剂量维生素C只有通过静脉注射而不是口服,才能在人体内达到药理学浓度,从而对多种肿瘤细胞产生杀伤效应。这些证据再次激发了全球科学界和医学界对维生素C治疗癌症的兴趣。然而,维生素C对肝癌干细胞的杀伤效果及机制尚未探明。
  研究方法与结果:钠依赖的维生素C转运体(sodium-dependent vitamin C transporter2,SVCT-2)在HCC中高表达;SVCT-2表达越高HCC患者生存期越短,肿瘤恶性程度越高。有趣的是,SVCT-2在肝癌干细胞中表达进一步升高,且与HCC临床样本中的干性相关基因表达呈正相关。另外,SVCT-2是肝癌干细胞干性维持所需,包括自我更新、耐药及成瘤能力。
  体内和体外实验表明高浓度维生素C可以杀死肝癌细胞;肝癌细胞对维生素C细胞毒性的敏感度由SVCT-2决定。更重要的是,与非干细胞相比,更高表达SVCT-2的肝癌干细胞对维生素C诱导的死亡更加敏感。与CSCs普遍耐受的传统化疗药顺铂相反,高浓度维生素C处理可以显著下调HCC细胞及肿瘤球中的干性相关基因表达,而且还能降低CD133阳性或EpCAM阳性CSCs的所占比例。另外,与OV6阴性的非干细胞相比,OV6阳性CSCs对高浓度维生素C的毒性更敏感,但对化疗药顺铂的毒性更耐受。此外,高浓度维生素C不仅抑制肝癌干细胞自我更新或体外成球能力,而且还以时间和剂量依赖的方式阻碍HCC细胞来源的肿瘤球的形成和生长。通过不同SVCT-2表达水平的人源性HCC组织异种移植模型(PDX模型),进一步证实大剂量维生素C抑制体内肿瘤生长,清除肝癌干细胞,且治疗效果与SVCT-2表达相关。机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞内,增加胞内ROS水平,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终通过引起细胞周期阻滞和caspase依赖的凋亡导致细胞死亡,而不是自噬或坏死性凋亡。因此,高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞。
  最后,通过对613例接受肝癌切除术作为首次治疗的HCC患者的回顾性队列研究发现术后静脉滴注维生素C治疗(2g/d)显著延长患者的无病生存期(DFS)(adjusted HR=0.622,95%CI0.487to0.795,p<0.001)。先前药代动力学研究证实静脉滴注2g维生素C在体内可达到的血浆浓度约1.5mM,而体外实验表明1.5mM的维生素C足以引起肝癌细胞和肝癌干细胞的死亡。因此,静脉滴注2g维生素C可能在体内杀伤术后残余肿瘤细胞,从而降低HCC复发风险。
  研究结论:1.SVCT-2在肝癌干细胞中高表达,且是肝癌干细胞干性维持所需;
  2.SVCT-2决定肝癌对维生素C诱导的细胞死亡的敏感度;
  3.高浓度维生素C优先杀死高表达SVCT-2的肝癌干细胞;
  4.机制上,维生素C通过SVCT-2进入细胞后生成ROS,进而诱导DNA损伤和ATP耗竭,最终导致细胞周期阻滞和凋亡;
  5.回顾性队列研究表明静脉滴注维生素C显著降低肝癌患者术后复发风险。
[硕士论文] 苏晓玲
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢癌是妇科致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿,缺少特异可靠的筛查诊断指标,发现时往往已是晚期。转移是卵巢癌患者死亡的主要原因。应激与肿瘤的关系的研究越来越受到关注。应激包括患者因患肿瘤引发的心理应激被认为能促进肿瘤的进展。糖皮质激素(GC)是重要的应激激素,具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并能在其受体(GR)的介导下调节细胞的新陈代谢、分化、增殖及存活。此外GC还是临床广泛使用的药物。除了治疗自身免疫性疾病和炎症外,还被作为实体肿瘤/癌症的化疗或放疗的辅助药物,用来减少放化疗的副反应,增加患者的耐受性。尽管GC与肿瘤的关系的研究一直受到关注,但结果一直不明确。研究证实GC可抑制一些实体肿瘤的增殖和进展,因此,有将GC单药或者联合细胞毒性药物(如5氟尿嘧啶)治疗乳腺癌和前列腺癌,并取得了一定的效果。反之近年来对多种肿瘤的研究表明,GC可以增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗,减少放化疗诱导的细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活,而这些作用加上GC的免疫抑制作用则有助于肿瘤的发生和发展。因此GC对肿瘤的作用还不清楚,其作用是否因肿瘤的不同类型而异需要进一步研究。
  缺氧是肿瘤常见微环境特征之一,低氧可诱导低氧诱导因子HIF-1的表达。HIF-1是重要的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚基为氧调节亚基。HIF-1α表达增加被认为与临床上肿瘤患者预后不良相关。研究表明卵巢痛组织中HIF-1α的表达明显高于正常卵巢组织;并且HIF-1α在卵巢癌组织中的表达水平高与卵巢癌患者的预后差呈正相关。近年来研究认为HIF-1α的高表达促进多种肿瘤细胞的迁移和侵袭,因此HIF1-α已经成为几种类型肿瘤进展的关键预测因子。而HIF-1α对卵巢癌细胞侵袭和迁移的研究较少,现有的研究亦认为缺氧下HIF-1α促进卵巢癌细胞的侵袭转移。
  MUC1是一种跨膜黏蛋白,常过表达于一些上皮肿瘤,能够与膜上的多种蛋白相互作用,激活细胞内的PI-3K/AKT通路、Wnt通路等多条信号转导通路,从而调节细胞的侵袭转移等。近年来,MUC1被当作一种新的低氧诱导因子受到人们的关注,有报道MUC1与HIF-1α之间存在相互作用,但确切作用机制还不清楚。小G蛋白Rho激活的蛋白激酶ROCK2作为一个下游信号通路分子可通过调节细胞骨架进而调节细胞运动,与肿瘤细胞的转移密切相关。有国外学者在其研究中发现,Rho/ROCK途径可以调节HIF-1α信号转导。
  我校病生教研室前期的研究发现GC在体内和体外可以明显促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,并且GC可以上调卵巢癌细胞中MUC1及ROCK2的表达。本课题在此基础上进一步探讨GC是否能影响卵巢癌细胞中HIF-1α信号通路进而促进卵巢癌细胞的迁移,并且探讨其可能的机制,主要观察了MUC1和ROCK2与GC增加HIF-1α蛋白进而促进卵巢癌细胞迁移中的作用的关系。
  研究方法:
  我们在细胞水平进行实验,以卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3为研究对象,实验过程中用含10%去激素血清的1640培养基培养细胞,去除血清中的激素对细胞的影响,用100nM DEX对细胞处理不同的时间。用Western Blot的方法检测HIF-1α蛋白的表达水平。siRNA干扰实验分别对HIF-1α、MUC1的表达进行干扰,继而使用Western Blot的方法验证MUC1、ROCK2及HIF-1α的表达。利用Transwell小室检测卵巢癌细胞的垂直迁移能力。
  研究结果:
  1.DEX可以明显上调卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,干扰HIF-1α的表达明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用。
  2.DEX能上调卵巢癌细胞中MUC1的表达,干扰MUC1的表达不仅可以明显阻断DEX促卵巢癌细胞迁移的作用,也能明显阻断DEX上调HIF-1α的作用;反之干扰HIF-1α却不影响DEX诱导MUC1表达的作用。
  3.干扰HIF-1α并不影响DEX上调ROCK2的表达。
  研究结论:
  DEX能明显增加卵巢癌细胞中HIF-1α蛋白的表达水平,该作用与Dex上调MUC1的表达密切相关。DEX上调MUC1进而增加HIF-1α在DEX促进卵巢癌细胞迁移中具有重要作用。
[硕士论文] 缪雄
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:利用骨形态发生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2,BMP-2)提高脊柱手术植骨融合率及对缺损骨组织进行修复是近年来骨科领域研究的重点和热点,但其应用后出现的一系列副作用也越来越被研究者们所关注。BMP-2临床使用过程中发生的骨溶解现象是目前学者们最为关注、最棘手的副作用之一,一直没有更好的解决办法。研究认为骨溶解的发生可能与BMP-2促进破骨细胞的活化有关,但具体的途径和机制尚未完全明确。
  方法:在本课题中,首先我们通过构建能过表达BMP-2的慢病毒,将其注射进入C57小鼠胫骨髓腔,使其在胫骨内表达BMP-2,使用mircoCT观察BMP-2对骨骼组织的影响。其次我们建立了BMP-2诱导异位成骨的模型,观察异位骨组织中的骨吸收情况。在体外实验中,从4-6周龄C57小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophages,BMMs)进行培养,用M-CSF使其增殖,用RANKL和M-CSF共同诱导其分化为成熟的破骨细胞,建立稳定的诱导破骨细胞分化的体系。在使用M-CSF和RANKL诱导BMMs分化为破骨细胞的同时,加入不同浓度的BMP-2(0ng/ml、30ng/ml、60ng/ml、90ng/ml),采用TRAP染色观察破骨细胞分化成熟情况;采用扫描电镜观察不同浓度的BMP-2刺激的破骨细胞在骨片表面的骨吸收功能;采用实时定量PCR检测与破骨细胞分化相关的标志基因表达,采用Western blot分析BMP/Smad1和NF-κB信号通路相关蛋白的翻译情况;最后采用BMP受体抑制剂、shRNA沉默基因和免疫共沉淀等方法探索BMP受体在BMP-2调节破骨细胞分化中的作用。
  结果:通过研究我们发现在体内BMP-2能诱导小鼠胫骨出现显著的骨吸收现象,使得骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度明显下降;BMP-2在诱导异位成骨的同时也激活了破骨细胞,导致骨吸收的发生。在体外,BMP-2能促进并加速RANKL诱导的破骨细胞分化,增强破骨细胞骨吸收功能。BMP-2通过激活Smad信号通路,使磷酸化Smad1增多,协同促进IκBα的降解,释放NF-κB,随后加速p65磷酸化并进入细胞核内,调节破骨细胞分化。同时BMP受体,特别是BMP2型受体在协同RANK进一步促进破骨细胞活化,增强骨吸收功能方面也起到非常重要的作用。
  结论:我们的研究结果初步明确了BMP-2导致骨溶解的分子生物学机制,为临床上合理使用BMP-2、减少骨溶解的发生并最终解决骨溶解问题提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 蔡文昌
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的和背景:随着肝脏外科手术技术的提高,器械设备和医用材料的发展,肝脏外科在各种肝脏良恶性疾病的治疗中发挥着越来越重要的作用。而且可进行手术范围更广、难度更大、危险度更高的肝脏外科手术。但是成功而又安全地完成这些手术后也需要更为理想的药物保证术后的顺利恢复。N-α-三甘氨酰-8-赖氨酸-加压素(Terlipressin,特利加压素,后简称为加压素)作为一种人工合成的血管加压素类似物,能选择性的收缩胃肠道的毛细血管床,从而显著的降低门静脉的压力,对肝硬化门静脉高压的一些常见并发症有良好的疗效。近期发现加压素能使肝大部切除术后肝功能得到明显改善,降低小肝综合征甚至肝功能衰竭的发生概率。更有研究证明加压素可以通过降低肝切除术后的高门静脉压力,从而促进残肝的再生。本研究旨在进一步探讨加压素对肝大部切除术后肝细胞再生的促进作用及其机制。
  研究方法:收集2016年11月至12月和2017年5月至12月在上海东方肝胆外科医院特需治疗一科/肝移植科行肝部分切除术的患者42例,其中术后静脉应用加压素21例,作为用药组;未应用加压素21例,为对照组,进行回顾性队列研究。监测其术后第一天和第三天的肝功能的结果进行对比。模拟人体肝大部切除建立小鼠肝大部切除模型,选取术后(24小时、48小时、72小时和96小时)4个时间点将应用加压素的实验组和安慰剂组的小鼠肝脏再生指标进行比较。然后对小鼠肝脏标本进行基因表达谱芯片的检测,探索加压素促进残肝细胞再生的可能机制。采用人正常肝细胞株(normal liver cells,HL7702)进行体外分组实验。以添加了加压素的培养基培养的细胞作为实验组细胞,普通培养基培养的细胞作为对照组细胞。利用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)对两组细胞的相对增殖活性进行比较。利用流式细胞仪(Flow cytometry instrument,FCM)进行两组细胞细胞周期的检测和比较。最后采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)对基因芯片筛选出的可能的机制进行验证。
  研究结果:临床结果显示肝大部切除术后第一天用药组和对照组丙氨酸氨基转移酶(Alamine aminotransferase,ALT)分别为:188.71±136.22和444.43±290.40U/L,(P=0.004);天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)分别为:377.76±147.56和648.67±421.07U/L,(P=0.009);凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)分别为:13.41±1.47和14.76±1.54S,(P=0.028);总胆红素(Total bilirubin,TB)分别为:22.79±11.44和37.35±19.14μmol/L,(P=0.008)。上述指标两组间均具有显著差异。术后第三天两组的ALT分别为:166.24±96.91和273.62±133.89U/L,(P=0.025);TB分别为:33.92±18.71和45.19±24.61μmol/L,(P=0.008);白蛋白(Albumin,ALB)分别为:40.10±3.40和37.12±2.55g/L,(P=0.002);前白蛋白(Prealbumin,PA)分别为:88.57±27.71和57.00±20.56mg/L,(P=0.000);PT分别为:13.67±0.98和15.35±1.87S,(P=0.003)。上述指标两组间均具有显著差异。小鼠肝大部切除模型显示:实验组小鼠肝体重比显著高于安慰剂组。其中术后24小时,实验组和安慰剂组分别为:0.02533±0.000577和0.01667±0.002082,(P=0.002);术后48小时两组分别为:0.02881±0.004116和0.02174±0.000659,(P=0.043)。实验组的残肝细胞核分裂像显著多于安慰剂组,分别为:31.33±2.082和20.67±1.528,(P=0.002)。术后24小时和48小时实验组残肝组织免疫组化Ki67染色阳性率也显著高于安慰剂组。术后24小时两组分别为:30.1%±0.42和8.57%±1.06,(P=0.001);术后48小时两组分别为:42.14%±4.92和9.42%±1.11,(P=0.012)。术后24小时和术后48小时实验组血清HGF显著高于安慰剂组,术后24小时两组分别为:3663.35±200.86和1936.77±394.22pg/ml(P=0.002);术后48小时两组分别为:532.80±65.38和274.68±19.46pg/ml(P=0.003)。残肝组织的基因表达谱芯片结果显示用药组相较于安慰剂组高表达的基因主要与细胞周期相关。细胞实验显示加压素处理的实验组第96小时的CCK8检测值显著高于对照组,两组的倍增数分别为:6.28±0.18和5.46±0.01,(P=0.009)。FCM细胞周期检测结果实验组处于S期的细胞比例明显高于对照组,分别为:25.19%和17.55%。RT-PCR结果也证实了加压素分别处理24小时和48小时后实验组细胞Cyclin B1基因和CDC20基因的表达明显高于对照组。术后24小时和48小时Cyclin B1基因两组表达结果分别为:2.82±0.08和1.00±0.04,(P=0.001),以及3.11±0.06和1.00±0.03,(P=0.000);术后24小时和48小时CDC20基因两组表达结果分别为:3.27±0.07和1.00±0.03,(P=0.001),以及3.89±0.03和1.00±0.05,(P=0.000)。
  研究结论:加压素可以加速患者肝大部切除术后残肝功能的恢复,可以促进肝大部切除术后小鼠残肝的再生,也可以促进HL7702细胞株细胞的增殖;其促进残肝再生和肝细胞增殖可能的作用机制是通过上调Cyclin B1基因和CDC20基因的表达实现的。
[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
[硕士论文] 林文婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是预后十分凶险的深部真菌感染,它好发于免疫缺陷人群,若不积极治疗,死亡率高。两性霉素B(简称AMB)是国内外治疗指南中治疗隐球菌性脑膜的首选用药,但因为其副作用多且严重,难以透过血脑屏障,使隐脑治疗效果下降。鞘内给药能提高脑脊液中AMB的浓度,但神经毒性较大,而且需要反复腰穿,难以达到理想的药代动力学水平,对疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一种可注射性智能型水凝胶,生物兼容性良好,在低于体温时是液态,能够包载药物,达到体温时变为凝胶状态,能够缓慢控制释放药物。本实验用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物来负载AMB,并进行鞘内注射,使AMB在脑脊液中得到缓慢释放,减少给药次数,减轻AMB的毒副作用,解决隐球菌脑膜炎目前的治疗困境。
  方法:
  第一部分,AMB凝胶的获取和相关性质检测。首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝胶渗透色谱仪确定该聚合物的分子结构和并对其性能进行表征。用生理盐水将聚合物溶解成不同浓度的聚合物水溶液,测定其凝胶化温度,根据结果选择合适的浓度的聚合物水溶液进行后续研究;用物理载药方法将聚合物AMB负载于聚合物水溶液中(简称AMB凝胶),并对载药前后的聚合物水溶液进行流体力学检测,以判断AMB对该水凝胶是否有影响。
  第二部分,AMB凝胶的体外实验。配制2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶,置于缓释液中,定时更换缓释液,测定AMB凝胶体外缓释度,绘制体外释放曲线,计算累计释放度,用药物缓释曲线中的一阶方程对缓释数据进行拟合。
  第三部分,AMB凝胶的体内实验。在毒理学研究方面,选取健康大鼠为实验对象,将AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶、生理盐水分别进行鞘内注射,每天观察每组大鼠给药后的情况,用Tavlor's评分评估四肢活动能力,记录大鼠死亡或存活情况,在给药后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色观察脊髓损伤程度,与以上三个指标比较各组药物对脊髓的神经毒性。在药效学研究方面,建立大鼠隐球菌脑膜炎模型,在建模后的第7天开始用AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶进行鞘内注射,在造模后的第14天和第21天取脑脊液做脑脊液培养计数和乳胶凝集试验,进行治疗效果的评价。
  结果:
  第一部分,通过对三嵌段聚合物的结构和性能表征,结果显示该聚合物分平均分子量为1790-1500-1790,聚合物的结构分布控制非常好,是理想的产物。其液体-凝胶转变相温度为34℃,25wt%聚合物水溶液课用于医用。载药前后聚合物水溶液的流体力学行为不发生变化,说明AMB对该聚合物水溶液没有影响。
  第二部分,体外缓释结果表明AMB凝胶可以缓慢释放AMB长达36天,2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶累积释放度分别为89.0%、77.1%、65.6%,AMB缓释数据符合药物缓释的一阶方程(R2>0.95)。
  第三部分,在毒理学实验中,AMB凝胶组大鼠四肢的Tavlor's评分高于普通AMB(P<0.05),AMB凝胶组大鼠的生存率明显高于普通AMB(P<0.05),HE染色结果显示AMB凝胶的脊髓损伤程度较普通AMB轻,以上结果表明AMB凝胶的神经毒性明显低于普通AMB。在药效学实验中,脑脊液培养结果显示AMB凝胶组大鼠脑脊液中菌体数量低于普通AMB组(P<0.05),乳胶凝集试验结果表明AMB凝胶组脑脊液隐球菌抗原滴度数低于普通AMB组(P<0.05),这都说明AMB凝胶的治疗效果优于普通AMB。
  结论:
  PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液负载AMB所得到的AMB凝胶较普通AMB有较多优势。它能缓慢释放AMB超过30天,体内的抗菌效果优于普通AMB制剂,此外它还能减轻鞘内注射AMB的神经毒性,减少鞘内给药次数,是比较理想的治疗隐球菌脑膜炎的药物,同时也是一种很好的鞘内缓控给药的手段。隐球菌性脑膜炎作为模式疾病,为其它疾病的鞘内缓控给药提供借鉴意义。
[博士论文] 王冬尧
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:尽管组合化学、超高通量筛选、后基因组计划、计算机技术的联合应用等多种技术快速发展,在药物研发的过程中仍然存在两个瓶颈,一是靶标生物大分子的确定和验证;二是具有生物活性小分子的设计和发现。本文主要关注第一方面,即其中的靶标分析方面。
  1.整合细胞膜色谱系统的构建及在VEGFR-2受体抑制剂靶标鉴定上的应用
  细胞膜色谱技术(cell membrane chromatography,CMC)是一种生物膜技术和色谱技术结合的分析方法,在一定程度上保留了细胞膜的生物学特征,可以模拟生理状态下生物活性小分子与其细胞膜上靶蛋白相互结合的过程。
  整合细胞膜色谱系统由多种细胞膜色谱模型、高效液相色谱、飞行时间质谱整合而成,其中,多种细胞膜色谱模型既相互补充,又相互验证,弥补了生物膜生命周期短、重现性差的内在缺点;高效液相色谱可以对复杂样品进行有效分离;飞行时间质谱可以准确鉴定其中每种组分,使得到的结论与常规的细胞膜色谱相比,更加真实、准确、可信。
  本部分应用SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC两种不同原发性肝癌的细胞膜色谱模型,构建了整合细胞膜色谱分析系统,并用于8个人工合成化合物的活性和靶点评价研究中,这8个喹唑啉类化合物是针对血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)进行设计合成的。在使用整合细胞膜色谱系统进行靶标验证的同时,也采用经典的激酶抑制方法测定了以上8个化合物对VEGFR-2的抑制率。结果表明,化合物在整合细胞膜色谱系统中的保留行为与激酶抑制率高低排序一致,即上述两种方法存在相关性。与分别测定每个待评价化合物样品的传统方法相比,整合细胞膜色谱系统可以直接分析含有多种样品的复杂体系,得到结论真实、可靠,同时,更加节约时间和成本,可成为药物研究中的一种实用分析方法。
  2.TCP-matrine探针的合成及在matrine靶标分析中的应用
  整合细胞膜色谱系统可以快速、有效地分析生物活性小分子与细胞膜蛋白质间是否存在相互作用,然而自然生物膜上含有成百上千种活性蛋白,小分子药物可能与多种受体存在协同结合,受到各种非特异结合因素的干扰,在没有其他关于可能结合靶标相关信息的线索下,很难鉴定、确证或排除某种膜蛋白作为潜在靶标的可能性,因此,将整合细胞膜色谱系统用于生物活性小分子结合靶标的准确鉴定和验证中,尚有困难,仍然需要其他更加深入、精细、直接的靶点鉴定技术的支持和配合,如基于亲和探针的靶点分析技术。
  三功能探针(tri-functional probe,TCP)是亲和探针的一种,是一种同时具有配体基团、光反应基团、标签基团三种功能基团的探针,是生物活性小分子靶标鉴定的有效手段。
  苦参碱(matrine)是一种天然生物碱,被发现具有抗肿瘤的活性,但其直接结合靶标和相关分子作用机制尚不明确,这也是阻碍将苦参碱进一步进行结构改造、活性增强、药物剂型改良等研究开发,最终成为临床一线治疗药物的众多障碍之一。因此,寻找并鉴定到苦参碱的直接作用靶标,意义重大。
  TC P-matrine探针是一个同时具有matrine、4-苯甲酸叠氮基、生物素的亲和探针,其中matrine作为配体基团,4-苯甲酸叠氮基作为光反应基团,生物素作为标签基团,与链霉亲和素构成生物放大系统,用于靶蛋白的纯化分析。本部分将TCP-matrine亲和探针用于matrine的靶点鉴定研究中,首次证明了膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是中药苦参中的活性成分苦参碱(同时也是一个有前景的抗癌药)的直接结合靶蛋白,通过抗体阻断实验和敲低表达实验进一步证实了ANXA2是苦参碱发挥抗迁移药效的关键分子,苦参碱可以有效抑制ANXA2介导的纤溶酶原(plasminogen,PLG)向纤溶酶(plasmin,PN)的生物转化,从而抑制肿瘤细胞的迁移。
  3.TCP-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  MLN8237是极光激酶A(Aurora Kinase A,AKA)的小分子选择性抑制剂,具有抑制细胞生长、发育,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移、侵袭等多种活性,Ⅰ期临床试验也表明MLN8237在恶性肿瘤方面具有较好的治疗作用,同时存在一定程度的不良反应,如恶心、呕吐、发热、贫血等,在理论上,MLN8237可能存在其他潜在靶蛋白。寻找并鉴定到小分子MLN8237的其他直接作用靶点,为阐明其作用机制,更全面地掌握该分子特性,最终实现其广泛的临床应用,具有重要的意义。
  在明确MLN8237构效关系的基础上,对其羧基部分进行结构修饰,首次合成了TCP-MLN8237探针,该探针含有MLN8237、4-苯甲酸叠氮基、生物素三种不同的功能基团,且探针与药物分子本身在促进细胞凋亡上没有明显差异。与对照探针(骨架相同但不含有配体基团MLN8237,只含有4-苯甲酸叠氮基、生物素基团的探针)处理组相比,经紫外光照射、磁珠纯化富集、凝胶电泳分离、银离子染色等操作后,只分离得到一个差异蛋白条带,经多级蛋白质谱技术分析鉴定,该蛋白为AKA,即目前公认的MLN8237的最强靶点,说明TCP-MLN8237探针是有效的,但由于探针为刚性结构,可能对配体基团与苴靶蛋白间相互结合过程有影响,仍然存在一些的局限,具有优化和改进的空间。
  4.DNA-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  在TCP亲和探针的基础上,将赖氨酸的刚性骨架更新为寡核苷酸链的柔性骨架,称为DNA亲和探针,由结合探针(binding probe,BP)与捕获探针(capture probe,CP)共同组成。
  本部分利用DNA亲和探针标记方法,合成了含有MLN8237的BP,含有4-苯甲酸叠氮基、荧光素的CP,经过BP(MLN8237)与靶蛋白结合、CP(4-苯甲酸叠氮基)与靶蛋白光交联、CP(荧光素)在聚丙烯酰胺电泳胶上成像的步骤,最终鉴定得到除AKA之外的7个潜在靶蛋白,在这些潜在靶蛋白分子中,对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase,p38)和层粘连蛋白受体(laminin receptor,LAMR)进行了生物学验证,其中,MLN8237与p38亲和力约为8μM,相关生物学功能效应(促进细胞凋亡)可能被AKA所掩盖;MLN8237与LAMR亲和力约为1.8μM,可以部分解释其抗肿瘤迁移和侵袭的生物学功能,为更深入地理解MLN8237的药效、毒性、副反应提供有效信息,为全面评价MLN8237作为潜在临床候选药物提供进一步证据。同时,也说明,利用DNA亲和探针寻找小分子的靶点,是一种十分有效的分析方法。
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