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[硕士论文] 郭岩乳
药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:药物引起的Ⅰ型超敏反应是药物刺激机体产生的特异性IgE介导的过度免疫应答,其主要的临床表现有皮炎、荨麻疹、哮喘、血管神经性水肿、胃肠变态反应、过敏性休克等症状,严重时可导致迅速死亡,又称为速发型超敏反应(Immediate hypersensitivity reactions,IHRs)。新药的研发必须经过临床前安全性的评价,而药物诱导IHRs的潜能(药物过敏性预测)是新药临床前安全性评估的必需环节。由于缺乏理想的临床前实验模型,目前尚不能有效的准确预测药物的致敏性,特别是预测小分子药物(Low molecule weight compounds,LMWC)的致敏性更是一个世界性难题,迫切需要建立一个更加有效的LMWC致敏性评价模型。
  正常外周血中含量最少的白细胞通常是嗜碱性粒细胞,但却是除肥大细胞IHRs最重要的效应细胞。目前临床上,自体外嗜碱性粒细胞激活试验(Basophil activation test,BAT)被开发及研究以来,其已广泛应用于研究和确诊过敏疾病(包括食物、毒液、花粉和药物等引起的过敏)。它的基本原理是在体外模拟IHRs活化嗜碱性粒细胞后,利用流式细胞术检测细胞表面活化标记物的变化,进而诊断和研究过敏疾病。与其它诊断方法比较,BAT仅需要少量外周血样品,且系体外与致敏原孵育激发,具有安全性高、耗时短、特异灵敏、技术成熟、操作简单等优点。但BAT在动物身上研究较少,所以其在药物非临床评价中的研究和应用任有待开发研究。借鉴临床上BAT的方法,探讨建立致敏动物外周血BAT模型,有望形成一种能和临床前长期毒性试验相结合的药物致敏性评价新技术,改善我国预测LMWC致敏性评价的水平。
  BALB/c小鼠高表达IgE,已被广泛用于各种药物过敏反应的动物模型构建,是研究TH2型免疫反应的主要小鼠品系。同时考虑到,大鼠是药物临床前安全性评价中长期毒性试验研究最常用的动物,而BN大鼠同样也是免疫球蛋白(尤其是IgE)高应答品系,可作为研究IHRs的主要模型动物。本课题拟首先建立BALB/c小鼠和BN大鼠BAT模型,然后选择临床上常发生IHRs的青霉素G(Penicillin G,PG)为工具药,模拟LMWC体内致敏和激发形成IHRs的半抗原假说机制。把半抗原PG和大分子蛋白质载体体外藕联形成全抗原。然后以PG和BSA的藕联物(Penicillin G conjugated BSA,PG/BSA)致敏BALB/c小鼠和BN大鼠。取致敏动物外周血,体外与PG和OVA的藕联物(Penicillin G conjugated Ovalbumin,PG/OVA)共孵育,流式细胞术观察嗜碱性粒细胞活化标记物CD63分子的表达情况,以期验证BAT模型预测LMWC致敏性的有效性。
  实验第一部分:首先建立基于流式细胞术(CD45APClow/IgE FITChigh)鉴定BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的方法。同时,利用传统瑞氏-姬姆萨染色法染色小鼠血涂片,显微镜下观察小鼠嗜碱性粒细胞的形态,并计数其相对数量。比较对照组和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的形态及数量变化。比较流式细胞术与传统血涂片计数二者之间的差异和计算二者的相关性。选择以CD45APClow/IgE FITChigh作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的流式方案,研究anti-IgE(阳性对照)体外与小鼠嗜碱性粒细胞孵育后CD63的表达情况,确定小鼠嗜碱性粒细胞活化标记物,并优化体外孵育时间。OVA致敏BALB/c小鼠外周血,体外以OVA激发致敏的小鼠嗜碱性粒细胞后,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞CD63表达情况,以建立小鼠BAT模型。同时,以传统的被动皮肤致敏试验(Passive cutaneous anaphylaxis,PCA)证实小鼠处于致敏状态。为了验证小鼠BAT预测LMWC致敏的准确性,选择临床上可导致IHRs的典型药物PG为工具药,首先以PG/BSA致敏BALB/c小鼠,然后取致敏小鼠外周血,体外与PG/OVA共孵育,以激发小鼠嗜碱性粒细胞,观察CD63分子的表达情况,验证小鼠BAT模型检测LMWC的有效性。结果显示:(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组小鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.59±0.14%和0.54±.018%,但二者未见明显差异(P>0.05)。小鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组嗜碱性粒细胞形态未见明显改变;嗜碱性粒细胞数量分别为0.60±0.42%和0.70±0.27%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.51,说明以CD45APClow/IgE FITChigh可以作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的标记物。(2)Anti-IgE体外可刺激小鼠嗜碱性粒细胞表面CD63的表达,体外最佳孵育时间为15min,提示CD63可作为建立小鼠BAT模型的激活标记物。(3)OVA致敏小鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为59.70±37.93%,显著高于PBS体外刺激(2.15±1.13%P<0.05)。(4)PG/BSA致敏小鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为62.74±41.05%显著高于PBS对照组(2.73±1.40%P<0.05)。表明成功建立了小鼠BAT并且此可以用于检测LMWC的致敏性。
  第二部分:首先建立流式细胞术(CD45APClow/IgE FITChigh)鉴定BN大鼠嗜碱性粒细胞数量的方法,确定大鼠外周血中嗜碱性粒细胞群。同时利用瑞氏-姬姆萨法染色血涂片,显微镜下观察大鼠嗜碱性细胞的形态,并计数嗜碱性粒细胞的相对数量。比较对照组和OVA致敏的BN大鼠的嗜碱性粒细胞形态及数量变化。比较两种计数方法的相关性。由于大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性和在过敏性休克的大鼠模型中嗜碱性粒细胞表面CD63表达上升,所以建立BN大鼠BAT的体外孵育时间参考小鼠为15min来检测CD63的表达情况。取肝素完全抗凝OVA致敏大鼠外周血,与OVA在37℃孵育15min,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞表面分子CD63的表达情况,PCA验证BAT中的大鼠是致敏状态。为了检测BAT预测LMWC药物致敏的准确性,以PG/BSA致敏大鼠PG/OVA体外激发,观察CD63分子的表达情况。(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组大鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.25±0.07%和0.24±0.10%,二者未见明显差异(P>0.05)。大鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组比较未见明显形态改变;对照组与致敏组嗜碱性粒细胞数量分别为0.3±0.24%和0.4±0.37%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.61,说明CD45APClow/IgE FITChigh可以作为鉴定大鼠嗜碱性粒细胞的流式方案。(2)OVA致敏大鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为35.00±23.90%,显著高于PBS体外刺激(1.78±1.08%P<0.05)。(3)PG/BSA致敏大鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为31.10±20.04%显著高于PBS对照组(2.74±2.10%P<0.05)。BN大鼠建立的BAT可以用于检测LMWC的致敏性。
  综上所述:经致敏后的小鼠和大鼠嗜碱性粒细胞,当体外再次接触相同抗原时,流式细胞术可明显检测到嗜碱性粒细胞表面激活标记物CD63表达,表明小鼠和大鼠BAT模型构建成功。利用该模型可有效检测PG的致敏潜能,提示该模型可用于评价LMWC的致敏性。
[硕士论文] 邱李斌
流行病与卫生统计学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:个体内变异系数是表示变异程度的重要指标之一,用途甚广,如测量工具的信度评价,高变异药物的生物等效性评价等。个体内变异系数的区间估计目前主要有正态近似法和方差稳定性转化法,它们在非正态分布和小样本量(如样本量小于25)情形下统计性能不佳。为此,本研究旨在建立一种新的个体内变异系数的置信区间估计方法,以改善现有方法的不足。
  目的:①借鉴Shoukri等人提出的个体内变异系数的最大似然估计法和方差重估计法(MOVER)的杂交思想,构建单组设计的MOVER法置信区间;②借鉴MOVER思想和Wald检验法,构建配对设计差值MOVER法的置信区间。
  方法:①先分别计算个体内变异系数WSCV=σe/μ的σe和μ的置信区间上下限,利用MOVER杂交思想中θ1/θ2方法,构建单组设计MOVER法置信区间。②基于单组个体内变异系数MOVER法,先分别求得对应个体内变异系数置信区间,然后杂交MOVER(θ1-θ2)方法计算两组相关个体内变异系数差值的MOVER置信区间。③模拟比较的评价指标采用置信区间覆盖率、平均/中位置信区间宽度以及尾侧不覆盖率比值指标。
  结果:模拟研究得出:①基于单组个体内变异系数的置信区间估计,个体内变异系数MOVER法覆盖率及尾侧不覆盖率指标各参数设置下均有较好的表现,相比于方差稳定转化法,本研究提出的个体内变异系数MOVER法的计算更为简单。②基于两相关样本个体内变异系数差值置信区间估计,MOVER法的整体表现良好,置信区间覆盖率与已有的差值正态近似法相近,尾侧不覆盖率较已有的差值正态近似法好。
  结论:本研究建立的单组个体内变异系数的MOVER置信区间估计方法,以及两相关样本个体内变异系数差值的MOVER置信区间估计方法,较正态近似法和方差稳定转化法具有较好的统计性能,且计算更为简便。
[硕士论文] 陈蓓
药学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:研究新型左旋泮托拉唑钠水合物晶型——左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型的结构和稳定性;左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型原料药的质量标准建立验证及稳定性考察。
  采用X-射线单晶衍射(SXRD)、X-射线粉末衍射(PXRD)、热重分析(TG)、红外光谱(IR)等多种分析方法,对左旋泮托拉唑钠水合物(二点五水合物与三水合物对比研究)晶型进行结构表征;并通过热处理实验、影响因素试验及加速试验对左旋泮托拉唑钠水合物(二点五水合物与三水合物对比研究)的稳定性进行研究。确定左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型作为原料药晶型后,主要采用高效液相色谱(HPLC)法、对左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型原料药的有关物质、光学异构体、含量测定等进行考察,并进一步系统的考察其稳定性情况。
  结果表明,在高湿条件下,左旋泮托拉唑钠二点五水合物极易吸水,转变成左旋泮托拉唑钠三水合物;左旋泮托拉唑钠三水合物在45℃热处理条件下极易转变成左旋泮托拉唑钠二点五水合物,但晶型的空间结构不发生改变,即左旋泮托拉唑钠二点五水合物和三水合物具有相同的晶体结构,只是其中结晶水含量有差别;二点五水合物的40℃高温及光照(4500±500lx)条件下稳定性优于三水合物;加速试验条件下两者变化趋势基本一致。针对左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型原料药所建立的质量控制方法具有良好的专属性、回收率和精密度,能够较好的控制产品质量。左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型原料药加速6月及长期24月质量稳定。
  因此,左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型与左旋泮托拉唑钠三水合物晶型虽然具有相同的晶体结构,但二点五水合物的综合稳定性优于三水合物,故选择左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型作为原料药晶型进行开发。左旋泮托拉唑钠二点五水合物晶型原料药加速及长期稳定性良好。
[硕士论文] 陈晓蕾
药学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:手性药物对映体由于空间结构不同,与生物分子的结合形式多种多样,因此它们在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄存在显著差异,导致它们可以产生不同甚至完全相反的药理和毒理作用。故而手性药物的分离和测定对于研究药物的安全性、有效性和质量可控性具有重要的意义。但手性药物对映体之间理化性质几乎相同,其分离和检测一直是药物分析的研究热点和难点。
  目前,用于手性药物对映体分离及检测的方法主要为色谱法,但是或多或少都有一些局限性。因此开发一种新的更快速简便的手性药物对映体分离方法非常有必要。质谱是一种快速、灵敏的检测手段,已经成功地应用在生命科学等领域,常与色谱法联用对手性药物进行区分,但是过去质谱通常被认为只能提供分子量信息,而手性药物对映体因为具有相同的分子量,因此无法单独通过质谱区分。然而,随着离子源技术的进步和对手性区分机理的深入研究和理解,近年来,单独的质谱法也开始在手性区分领域崭露头角。但是质谱用于对映体区分依旧是一个难点,特别是含有多个手性中心的药物目前鲜有文献报道。本文建立了以金属离子和β-环糊精(β-CD)为配体的立体异构体碰撞诱导解离质谱法,并采用计算机模拟方法对其区分机理进行了研究。以Cu2+和β-环糊精为配体区分依折麦布对映体及其机理研究
  以Cu2+和β-CD作为配体,建立SRS、RSR-依折麦布对映体区分和分析的质谱法方法,并结合DFT、PM6等计算机模拟方法对其机理进行研究。实验中将12.5μg/ml Cu2+、25μg/mlβ-CD及依折麦布溶液混合,形成三元配合物[Cu(Ezetimibe)2(β-CD)-H]2+,再分别在离子阱和Q-TOF质谱仪上采用三元配合物碰撞诱导解离法,在二级质谱中寻找到丰度具有差异性的[Ezetimibe-H2O+H]+碎片离子(m/z=392.15)来区分SRS、RSR-依折麦布。此外,计算机模拟所得结果清晰地展示了在质谱气相真空环境中,三元配合物可能的结合方式,揭示了SRS、RSR-依折麦布对映体与配体结合的能量差异,为之后质谱分离对映体的方法研究提供了新的思路。
  以不同金属离子和β-环糊精为配体分离依折麦布对映体及其机理研究
  为了探究不同金属离子和β-CD作为配体对于区分SRS、RSR-依折麦布效果的影响,我们结合计算机模拟方法对质谱实验结果进行验证。我们选取了常见的2价金属离子Mg2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+、Co2+为研究对象,采用同样的质谱实验方法,对SRS、RSR-依折麦布进行区分。结果发现不同的金属离子形成的三元配合物,在二级质谱中产生差异的碎片离子是不同的、并且区分效果也有差异;此外,计算机模拟方法被用于研究各金属离子与β-CD和药物之间的结合方式。通过计算出各种金属离子结合的能量差异,并结合金属离子本身的特性,我们发现金属的失电子能力以及金属半径的大小是影响金属离子作为配体的区分效果的重要原因。
  以金属离子和β-环糊精为配体分离其他手性药物对映体及其机理研究
  在上述工作的基础上,更换不同的手性药物进行研究,以深入了解药物在三元配合物中的作用以及分析方法的适用范围。卡托普利和布洛芬是临床常用药物,分子结构中都含有羟基以及环状结构,因此我们选用其作为研究对象,以Cu2+和β-CD作为配体,进行质谱区分实验。结果发现卡托普利并不能形成稳定的三元配合物体系,因为它的巯基在金属离子的存在下,极易发生氧化反应;而布洛芬对映体在Cu2+和β-CD作为配体的体系中也不能够进行区分,但是可以在金属离子与D-葡萄糖的体系中进行区分。因此,以金属离子及β-CD为配体进行手性异构体区分有其局限性。
[硕士论文] 陈丹阳
药学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:抗生素作为兽药和饲料添加剂已在畜牧业中广泛使用,然而过度或滥用抗生素会导致抗生素残留及耐药菌产生,这既严重威胁人类健康,也会破坏生态平衡。因此,发展快速灵敏检测抗生素的方法具有重要意义。电化学传感器因具有设备简单、操作方便、分析快速等优点,已成为医疗检测领域的研究热点。鉴于此,本论文利用制备的类石墨烯功能纳米复合材料,构筑了抗生素电化学传感平台,建立了新型抗生素检测的电化学传感分析方法,主要研究内容如下:
  1、利用一步水热法制备了三维氮杂石墨烯水凝胶/二硫化钼纳米复合材料(3D NGH/MoS2),该材料具有比表面大、导电性良好、电子转移效率高等优异的性能,且可负载更多的生物识别分子。利用氯霉素(CAP)适配体与3D NGH/MoS2之间的π-π吸附作用,构筑了识别CAP的光电化学(PEC)传感界面。适配体吸附在3D NGH/MoS2表面,阻碍了物质传递,导致光电流强度显著降低,当其与CAP特异性结合形成复合物后,脱离3D NGH/MoS2表面,进而光电流强度得到恢复。基于这一原理,研制了一种CAP的PEC适配体传感器。在优化条件下,所恢复的光电流强度与CAP浓度在0.1~300 nmol L?1(R2=0.998)范围内呈良好的线性关系,其检出限为0.03 nmol L?1,且所研制的传感器具有良好的选择性和重现性,可用于CAP的快速检测。
  2、采用一步水热法合成了石墨相氮化碳/石墨烯水凝胶纳米复合材料(g-C3N4/GH)。对比研究发现,g-C3N4/GH可与共反应剂K2S2O8产生更强的电化学发光(ECL)信号(约为g-C3N4的4.2倍),表明GH的引入可有效增强K2S2O8体系的ECL信号。以所制备的g-C3N4/GH为载体,利用其与四环素(TET)适配体间的π-π吸附作用,构筑了识别TET的传感界面。适配体的吸附阻碍了物质传递,导致ECL信号显著降低,当其与TET结合形成后,脱离材料表面,ECL信号得到恢复。基于此原理,研制了一种TET的ECL适配体传感器。在最优条件下,所构建传感器的工作范围为0.5 nmol L?1~1μmol L?1,检出限为0.17 nmol L?1,且具有良好的选择性及重现性,为抗生素的检测提供了新思路。
  3、通过煅烧法合成超薄石墨相氮化碳/氧化钨(utg-C3N4/WO3)纳米复合材料。对比实验发现,utg-C3N4的引入提升了WO3导电性及电荷转移的效率,延长了光生载流子的寿命,并有效抑制了光生电子-空穴的分离。基于葡萄糖可被空穴氧化,进而增强光电流的原理,构建了一种灵敏的葡萄糖PEC传感器。在优化条件下,所构建的PEC传感器具有线性范围宽(10~7120μmol L?1)、检出限低(3.33μmol L?1)、选择性高及稳定性好等优点,为构建葡萄糖灵敏测定平台提供了新方法。
[硕士论文] 梁红丽
药学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  制备均一性、分散性良好的金纳米颗粒(AuNPs),考察物理化学性质不同的金纳米棒(AuNRs)与金纳米颗粒(AuNPs)对牛血清白蛋白(BSA)与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)淀粉样纤维化的影响。
  方法:
  采用经典Frens法制备AuNPs,通过紫外-可见吸收光谱法、动态光散射及Zeta电位分析、透射电子显微镜、电感耦合等离子体质谱法对AuNRs与AuNPs的理化性质进行表征,评价其均一性与分散性。
  以BSA和HEWL作为蛋白质淀粉样纤维化研究对象。采用ThT荧光法、同步辐射圆二色谱法(SRCD)、原子力显微镜(AFM)、SDS-PAGE凝胶电泳法对形成的淀粉样纤维进行表征,考察AuNRs与AuNPs对淀粉样纤维的动力学生长曲线、二级结构、形态学及分子量的影响。
  结果:
  TEM结果显示,AuNPs的平均尺寸为18.48±0.56 nm,Zeta电位为-36.80±0.44,浓度为155.82μg·mL-1,具有良好的均一性和分散性;AuNRs尺寸分别为20×40 nm、20×60 nm、20×80 nm,Zeta电位分别为43.13±1.16、39.83±0.76、20.40±1.11 mV。AuNRs-2、AuNRs-3、AuNRs-4与AuNPs在水溶液中的平均粒径分别为(1.63±0.04)×(51.36±0.75)、(5.06±0.06)×(82.73±0.78)、(5.47±0.20)×(104.61±6.5)、34.29±0.19。
  BSA纤维化动力学曲线遵循指数型增长规律。相同浓度的AuNRs对BSA纤维化的抑制作用明显大于AuNPs。纤维化过程中,BSA二级结构中的α-螺旋结构含量逐渐降低,β-折叠结构含量逐渐升高,AuNRs与AuNPs的加入对上述过程均具有抑制作用。BSA成熟纤维形态相互缠结,呈网状结构,高浓度AuNRs组纤维较短且分散,AuNPs组纤维多数团聚,形成大的无定型团聚体。SDS-PAGE结果表明,高浓度AuNRs与AuNPs组BSA形成的大分子量纤维均明显减少。
  HEWL纤维化动力学曲线遵循“S”型增长规律,纤维化过程中α-螺旋结构特征峰峰位置发生蓝移,AuNRs与AuNPs加入后其蓝移程度增大。HEWL成熟纤维形态呈较长的丝状纤维结构,AuNRs组 HEWL形成蛋白质的无定型聚集体,AuNPs组HEWL形成较短的丝状纤维。
  结论:
  BSA与HEWL纤维化能够形成形态良好的淀粉样纤维,其具有蛋白质淀粉样纤维的典型属性,AuNRs与AuNPs均可抑制两者的纤维化,且具有浓度依赖性。相同浓度下,AuNRs的抑制作用大于AuNPs。
  本课题为国家自然科学基金“核分析技术指导下的生物稳定和安全性量子点生物荧光探针的设计和合成”(编号:11375211)。
[硕士论文] 贺小琴
药物分析学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:寡核苷酸适配体(简称适配体,aptamer),系指经指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列(ssDNA或RNA)。适配体通过折叠成一定的三维结构,经空间构型互补与靶分子形成高亲和力,高特异性结合,故又称为“化学抗体”。其与靶分子之间的分子识别作用与抗体极为相似,但特异性和亲和力甚至更高。与抗体相比,适配体稳定性好、能够进行大量的化学合成、并且无免疫原性、无毒性。另外,适配体具有核酸自身变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记、及作为优良的纳米器件等诸多特点,是一类重要的“明星分子”。
  随着新型SELEX筛选技术、高通量测序、生物芯片等序列活性评价技术的快速应用,所筛选出来的适配体分子种类逐年增多,作用的靶分子范围从离子、小分子、转录因子、蛋白(酶),到细胞、组织、细菌、病毒等等,也更加广泛。适配体在分析传感、临床诊断和治疗方面存在巨大潜力。然而,到目前为止,仅有少量适配体进入到临床试验研究阶段,仅有一种适配体药物经FDA批准上市,即治疗老年相关性黄斑病变的哌加他尼。做为商业化临床诊断元件的适配体亦寥寥无几,此点与蓬勃发展的适配体研究趋势并不匹配。其主要技术瓶颈应在于其自身二三级结构不清、与药靶的相互作用机制不明、体内生物利用度尚待提高等方面。
  从分子相互作用基础层面而言,大多数适配体存在结构上的易变性、多样性,在与靶分子发生特异性的亲和识别时,多以“自适应”形成优势构型,但大多数适配体—靶分子的精确结构模型尚未得到,多数识别模式的判别具有片面性、经验性。另外,经SELEX技术筛选得到的适配体全长序列中,仅有部分序列存在亲和活性,亟需发展有效的技术方法指导结构剪裁及修饰,从中寻找亲和性更高、特异性更强、序列更短的适配体,除去冗余序列,提高适配体识别研究的容错度、通用性和稳定性。这就使得SELEX后优化(Post-SELEX)成为研究“热点”。Post-SELEX中多采用试错法,依据核酸二级结构及自由能(ΔG)的经验性判断,对适配体序列进行较为随机的剪裁或定点突变。其主要缺点在于随机方法效率较低、难度较大,尚无系统的理论指导和较好的解决方案。
  本学位论文的主要内容则针对上述post-SELEX中的基础科学问题进行了深入研究,共分为五章。
  第一章为前言(文献综述)部分,概述了适配体的特点、应用前景以及适配体研究存在的主要问题;对适配体后筛选优化途径、以及相应的相互作用评价优化方法进行了总结和评述;以及对适配体结构表征方法、适配体做为分析传感元件的应用现状进行了综述。最后提出本论文的立题依据及主要的研究内容。
  第二章为一种步进型组合文库的构建及基于SPR的亲和评价优化方法研究。在本章中,我们基于组合化学思想,以重组人促红细胞生成素α(EPO-α)的适配体807-39nt为模式分子,发明设计了四组步进型序列,构成新型的多方向、步进型适配体小型组合文库。该文库包含向左收缩、向右收缩、两端收缩和两端扩展等四组分子群,共35条序列。并开发了免标记SPR方法,对上述适配体序列进行快速、高效的筛选评价。最终得到了最短适配体—In27,仅保留了初始适配体39nt二级结构中的环部部分,但亲和活性与之相当。从而证实了该小型步进型组合文库构建的合理性和高效性。
  第三章为最短适配体In27的简并序列及结合位点研究。本章使用定点碱基突变的方法,结合结构域划分,筛选评价得到In27序列中对结合产生较大影响的关键碱基。考虑到In27仍然保留了适配体39nt中富含连续鸟嘌呤核苷酸的序列,符合G四聚体(GQ)形成的一般原则,我们在圆二色谱(CD)表征的基础上,将In27上的碱基按-GG(G)-骨架为间隔,划分为D1~D5个结构域,并构建了各定点突变分子群,共6组,分别命名为D1、D2、D3&4、D5、GQ和简并序列定点突变分子群,共32条序列。我们使用表面等离子共振(SPR)方法筛选评价,从该定点突变分子群中最终得到In27的简并序列,从而明晰了最短适配体In27的关键作用碱基。进一步,我们采用亲和竞争作用分析,界定了多种亲和识别分子,如适配体39nt及In27、EPO受体(EPOR)、EPO的单克隆抗体以及麦胚凝集素(WGA),在EPO-α上的结合作用模式。上述研究即为适配体的结构作用特点研究及适配体做为分析传感元件的成功应用奠定了基础。
  第四章为多种光谱技术对于适配体In27的活性高级结构特征研究。适配体的结构具有多样性,其“自适应”式优势构型较易受到包括pH、阳离子类型、稳定保护剂、甚至界面等在内的微环境的影响与调控,这也是大多数适配体和靶分子间相互作用特点尚待厘清和阐明的主要原因之一。本章发展和使用SPR、CD及荧光探针等多种光谱技术,研究和明确了In27的活性与构型间的关系。我们发现阳离子Na+的存在和浓度是影响In27产生特异性亲和识别的关键因素;Na+诱导下In27形成了平行/反平行的混合GQ构型;两种GQ荧光探针硫磺素T(ThT)和 N-甲基间卟啉IX(NMM)在该体系中可用做一对特征性的荧光探针,均可用于表征In27的活性高级构型。EPO-α的加入可与ThT和NMM形成竞争,从而便于利用这两种GQ荧光探针创建活性EPO-α的“光开关”型检测方法。上述研究为阐明新型适配体的活性构型提供了有效的技术组合手段,亦为分析、传感、诊断等应用领域提供了一类作用特点清晰的适配体元件。
  第五章为基于适配体的免标记检测方法研究。生物膜干涉技术(BLI)是一种新型的表面传感技术,具有免标记、灵敏、快速、作用模式多样等特点。本章中将生物素化的适配体39nt或In27固定于链霉亲和素(SA)传感芯片上,优化了用于表面固定的适配体元件的取向、浓度、非特异性作用的克服、再生条件等因素,并利用WGA和适配体作用于EPO-α的不同位点的特征,构建信号放大传感体系,用于溶液中EPO-α蛋白的灵敏检测。同时比较了SPR和BLI技术方法的异同并阐述可能原因。本研究拓宽了适配体做为分析传感元件的应用范围。
  总之,本学位论文立意于创建创新性的小型多方向步进型适配体组合文库,从而高效地筛选优化得到了最短适配体—In27,并在明确其关键碱基位点的贡献基础上构建简并序列。以多种光谱学技术手段,明确和简化得到影响适配体活性构型的关键溶液微环境因素,深入阐明了Na+诱导下的适配体In27的活性高级结构形成特点。最后,基于适配体实现了EPO-α蛋白的免标记、高灵敏检测。在为分析、传感、诊断等应用领域提供了一类作用特点清晰的适配体元件的同时,也为优化适配体结构,阐述适配体与靶蛋白相互作用时结构特征等提供了有效的技术手段。
[硕士论文] 卫莺
药物分析学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  利用光谱法、计算机辅助药物分子设计和药物亲和反应靶标稳定技术研究四种有机锡化合物[二-(2,6)-二氟取代二正丁基锡(DBDFT)、二-(2,4)-二氟取代二苯基锡(DPDFT)、二-(2,4)-二氯取代二苯基锡(DPDCT)和二-4-氯取代二正丁基锡(DBDCT)]与 CYP3A4代谢酶的相互作用,比较不同有机锡化合物与CYP3A4代谢酶相互作用的大小,并研究有机锡化合物对CYP3A4代谢酶构象的影响。
  方法:
  (1)用紫外可见光谱法研究有机锡化合物是否能与CYP3A4代谢酶形成配合物;用荧光光谱法研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白形成配合物的猝灭机制和结合参数,并对四种有机锡化合物与 CYP3A4的作用力大小进行比较;荧光光谱法与紫外可见光谱法相结合研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白是否发生非辐射能量转移。(2)用同步荧光光谱法、三维荧光光谱法、圆二色谱法和计算机辅助药物分子设计中的分子对接模块研究有机锡化合物对CYP3A4蛋白构象的影响,明确有机锡化合物对CYP3A4蛋白中色氨酸和酪氨酸微环境、肽链骨架的微环境、α螺旋含量的影响以及形成氢键的位置。(3)用药物亲和反应靶标稳定技术研究有机锡化合物与CYP3A4蛋白反应后对消化酶的抵抗作用,明确CYP3A4代谢酶和有机锡化合物形成的的配合物能够保护CYP3A4蛋白。
  结果:
  (1)不同结构类型的有机锡化合物与 CYP3A4代谢酶的结合参数、作用力类型和能量转移值不同:1)当四种有机锡化合物(4×10-5 mol·L-1)与CYP3A4蛋白反应后,在280 nm处, DBDFT-CYP3A4、DPDFT-CYP3A4、DPDCT-CYP3A4和蛋白的保护作用比较明显,DPDCT对裂解的CYP3A4蛋白几乎没有保护作用,可能是由于DPDCT与CYP3A4的结合作用比较弱,没有观察到对CYP3A4蛋白的保护作用,这与前述四种有机锡化合物与CYP3A4代谢酶的结合强弱顺序基本一致。
  结论:
  有机锡化合物与CYP3A4代谢酶结合形成了较为稳定的配合物,它们可能结合在CYP3A4的活性区域,二者发生相互作用可使得CYP3A4的肽链和二级结构发生改变。有机锡化合物与CYP3A4的结合作用力强弱不同,会影响其在体内的代谢过程。结合课题组前期实验结果推测它们与CYP3A4代谢酶的结合导致酶活性抑制,从而使得有机锡化合物在体内的抗癌作用时间增加,抗癌活性增强。
[硕士论文] 王彤颖
药物分析学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:石杉碱甲(HupA)是一种高效且可逆的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,是目前治疗老年痴呆症(又称阿尔茨海默病,AD)最有前景的药物。随着世界人口老龄化的加快,阿尔茨海默病患者逐年增加,国内外对其需求量日益增加。当前医学界尚没有发现合适的HupA替代品,人工合成法也局限于实验室使用,目前HupA主要从石杉属和马尾杉属等植物中提取获得,然而该类植物野生资源匮乏,且HupA含量甚微。因此建立高灵敏度的HupA检测方法,对充分利用该类资源具有十分重要的现实意义。
  近年来,纳米技术发展迅速,尤其是纳米金标记技术备受业界关注。该技术具有简便、快速、准确及无毒等优点,为药物的分析测定提供一种新的研究思路。纳米金的表面积大、生物兼容性好,其表面能够通过静电作用与抗体、酶等生物大分子相结合,还可以与巯基或PolyA修饰的DNA相结合,形成探针后后生物分子的活性基本不受影响,且性质较为稳定,这些功能化的纳米金探针用于免疫分析中,可显著提高方法的检测灵敏度。免疫磁珠(磁珠探针)是近年来新兴的一种功能材料,指偶联了抗原或抗体的磁性微球。磁珠具有较强的磁响应性,通过引入磁场,可以实现快速分离、富集目标物,具有操作简便、快速高效和不影响生物活性等优点,在免疫分析领域、细胞分离等方面具有独特的优越性。
  本论文利用纳米金探针和磁珠探针的特性,以竞争免疫分析为基础,研发了检测HupA的新型酶标免疫分析方法,并应用于实际样品的含量测定,为药物中有效成分的微量测定提供新的分析策略。论文共分为三章,主要内容如下:
  第一章:酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  采用柠檬酸三钠还原法合成纳米金,将酶和抗体修饰于纳米金颗粒表面制备纳米金探针,并对探针制备条件进行优化,如标记pH、最适抗体标记量、酶和抗体标记比例等,采用紫外分光光度法和透射电镜对制备好的纳米金探针进行表征。将制备好的纳米金探针引入到免疫分析中,采用竞争免疫分析模式,建立了一种检测HupA的新方法。并对实验条件如包被抗原和纳米金探针稀释比例、最佳竞争反应时间进行了优化,在最佳实验条件下,该方法测定HupA的线性范围为0.5~150ng/mL,线性方程为I=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960),检测限为602.56 pg/mL。将该法应用于蛇足石杉中HupA含量测定,经国标法验证,二者测定结果基本一致,回收率在97.08~106.11%之间,结果较好。该法检测时间短,灵敏度高且重复性好,是一种简便、高效、经济的检测体系,有利于推广应用。
  第二章:磁珠和酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  本研究引入磁性载体-磁珠,代替传统的96孔酶标板,将石杉碱甲完全抗原(HupA-OVA)标记在磁珠上。基于磁性分离,利用纳米金探针,建立了快速、高效、灵敏度高的检测石杉碱甲的酶标免疫新方法。考察并优化了磁珠探针和纳米金探针的稀释比例、最佳竞争反应时间等免疫分析条件,最终确立了检测体系,在优化实验条件下,该方法在HupA浓度为0.075~180ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950),检测限为160.32 pg/mL。将该法应用于石杉碱甲片剂含量测定,检测结果与国标法所测结果基本一致,该方法的灵敏度较前一种方法更高、线性范围更宽且缩短了检测时间。
  第三章:磁珠和DNA-纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  在前两种方法研究的基础上,基于磁珠建立了DNA-纳米金探针检测方法,并对该方法的精密度、重复性、专属性等进行了考察,结果均在允许范围内,该方法在HupA浓度为0.008~16 ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.3006 lgC+0.6142(r=0.9952)检测限为19.41pg/mL。并对蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA进行了检测,加标回收率在99.33~103.73%之间,结果令人满意。DNA的引入进一步提高了方法的灵敏度,此方法较前两种方法灵敏度更高。
[硕士论文] 沈贝莉莎
分析化学 成都理工大学 2017(学位年度)
摘要:紫杉醇是一种强效的抗肿瘤药物,在临床上应用非常广泛,但其极难溶于水,且毒性较大,限制了进一步应用。在目前临床使用的紫杉醇注射剂中,作为溶剂的聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇的混合溶液致敏性很高,毒副作用大。将紫杉醇制成脂质体能有效改善其水溶性、减小细胞毒性、降低溶剂的致敏性。但由于脂质体结构复杂,制剂工艺随品种差异具有多样性,因此,建立一个稳定性高,重复性好的质量分析方法就成为了一个难题。为了建立一套适合紫杉醇脂质体的质量分析方法,本课题首先采用常规方法制备紫杉醇脂质体,通过高效液相色谱法对其药物含量和包封率等重要质量分析指标的测定方法进行了探索,建立了一套基于高效液相色谱法的含量和包封率的测定方法,并考察了此方法对于紫杉醇脂质体含量及包封率测定的可靠性和稳定性。再采用建立的该套方法对经mPEG-姜黄素修饰的紫杉醇脂质体(mPEG-cur/pac/lip)进行含量、包封率、体外释放和体内组织分布进行测定,结果显示,该方法测定的结果稳定性和重复性好,可用于mPEG-cur/pac/lip的质量分析。
  本研究采用薄膜水化法制备紫杉醇脂质体,水化溶剂为含有1%吐温-80的葡萄糖注射液,对紫杉醇脂质体的含量测定方法学进行探索,结果表明:色谱条件:甲醇/水=78/22,流速:1.0mL·min-1,进样量:10μL,检测波长:228 nm,柱温:35℃。紫杉醇浓度在1-160μg·mL-1及20-800 ng·mL-1范围内具有良好的线性关系,R2≥0.999。平均加样回收率为101.1%,精密度和重现性良好,RSD值均小于2,定量限QL为29.86 ng·mL-1,检测限MDL为9.86 ng·mL-1。经筛选确定紫杉醇脂质体包封率的测定方法为鱼精蛋白法,采用的鱼精蛋白浓度为10 mg·mL-1,鱼精蛋白与脂质体体积比为2.5∶10时,鱼精蛋白测定的加样回收率最好,为100.4%,采用该方法测得的紫杉醇脂质体的包封率为97%以上。为验证该方法的适用性,采用薄膜水化法制备了具有长循环,抗多药耐药性的mPEG-cur/pac/lip,处方为:紫杉醇、大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-姜黄素、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺质量比为2∶24∶12∶2∶3,冻干赋形剂选为甘露醇,加入量为8%。使用本研究中建立的质量分析方法对所制得的脂质体含量及包封率进行评价,结果显示,该方法测定条件下,mPEG-cur/pac/lip中紫杉醇分离度良好,其他辅料的保留时间对含量测定无干扰,得到紫杉醇含量为969.66μg·mL-1,载药量4.65%。采用鱼精蛋白法测定冻干前后mPEG-cur/pac/lip的包封率,结果显示,该方法可有效测定冻干前后mPEG-cur/pac/lip的包封率,且重复性好。冻干后脂质体包封率略有降低,但仍可达90%以上。该方法用于mPEG-cur/pac/lip体外释放实验中药物释放量的测定,结果显示,该方法对mPEG-cur/pac/lip体外释放的紫杉醇具有良好的分离度,溶剂及辅料对紫杉醇的保留时间无干扰。体外释放结果显示,mPEG-cur/pac/lip具有一定的缓释作用。用激光粒度仪测得脂质体粒径约为840 nm,脂质体分布较为均匀,Zeta电位绝对值大于30 mV,脂质体稳定性较好。透射电镜观察脂质体形态为圆整度较好的球形,部分能够观察到双分子层结构。将mPEG-cur/pac/lip与普通紫杉醇注射液对健康昆明小鼠进行静脉注射,观察小鼠的状态可知,脂质体毒性及致敏性明显降低。本研究中建立的脂质体含量测定分析方法可用于小鼠组织样品的分析测定,结果显示,在心、肝、脾、肺、肾等组织样品的测定中,组织样品的杂质峰均能与紫杉醇的峰分离良好,对紫杉醇的出峰时间无干扰,相比于普通紫杉醇注射液,mPEG-cur/pac/lip对脾和肺有一定的靶向性。建立了一套基于高效液相色谱法的紫杉醇脂质体质量分析方法,并用于具有抗多药耐药性的新型脂质体mPEG-cur/pac/lip的质量分析。结果证明该方法可用于mPEG-cur/pac/lip的含量,包封率、释放和组织分布的含量测定,方法重复性好,可靠性高;所制得的mPEG-cur/pac/lip包封率高,稳定性好,并具有一定的缓释特性和脾、肺靶向性。建立的脂质体含量测定方法及制备的mPEG-cur/pac/lip为紫杉醇的进一步开发利用奠定了良好的基础。
[硕士论文] 曹云飞
制药工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:一、基本信息
  非洛地平(Felodipine)为一种新型的二氢吡啶类钙拮抗剂,对抑制小动脉平滑肌细胞外钙的内流具有高度选择性,通过对外周血管的松弛作用,降低血压。临床用于各类型高血压、心绞痛的治疗。
  二、调研情况
  非洛地平缓释片为亲水凝胶性骨架型缓释片,非洛地平缓释片(Ⅱ)为采用单层渗透泵技术的缓释片。非洛地平缓释片主要采用湿法制粒的生产工艺,以羟丙甲基纤维素等为骨架材料。非洛地平缓释片(Ⅱ)为采用激光打孔技术生产的渗透泵制剂。
  三、现行标准检验结果分析
  在抽取的83批样品中,合格率为100%,合格率较高。
  四、开展的探索性研究
  1.安全性考察分析-有关物质的研究
  本研究总结了非洛地平及其制剂中降解杂质产生的途径,明确区分了合成工艺杂质、制剂处方引入杂质和降解杂质,并通过HPLC法相对保留时间和UPLC-MS/MS技术获得杂质的相对分子质量信息和碎片信息,对原料和制剂中产生的各杂质进行了定性和明确归属。
  2.有效性考察分析-释放度的探索性研究
  通过对不同释放条件的比较研究,发现了影响非洛地平缓释片的释放行为关键释放参数为释放装置,以具有区分力且方法稳定的桨法—固定篮和往复筒法两种装置对国产制剂与原研制剂进行了释放行为的比较研究。
  3.晶型的探索性研究
  非洛地平具有多种晶型。经PXRD、DSC、IR和NIR等技术分析,各企业提供的原料的晶型基本一致。山西**、常州**、莱阳**和合肥**等四家企业制剂与阿斯利康制剂的PXRD图谱存在明显差异,南京**制剂和阿斯利康制剂的PXRD图谱主要显示为无定型态。
  4.稳定性考察分析-影响因素试验
  在高温光照条件下,非洛地平原料及制剂均不稳定,易产生降解杂质。
  5.近红外光谱一致性模型的建立
  针对生产量大样品量多的3个厂家建立近红外一致性检验模型,各厂家的模型验证结果良好。采用主成分分析法研究片剂工艺的相似程度,结果与一致性模型相对应,并很好的反应了处方工艺的相似程度。
  五、总体评价
  1.部分企业标准限度宽泛,不能有效控制产品质量,因此抽验结果并不能表明非洛地平缓释片剂的质量良好。
  2.有关物质探索性研究表明,国产制剂中有关物质的情况与原研制剂相比具有明显差异,且良莠不齐。
  3.释放度研究表明,国产非洛地平缓释片与原研制剂相比,普遍存在释放偏慢的现象,国产制剂间的释放曲线也存在差异,反映出国产制剂与原研制剂之间,各国产制剂间的工艺存在不同程度的差异。
  4.原料、辅料及生产工艺(1)国产原料存在违规生产和投料的问题(2)存在可能由辅料引入的未知杂质(3)各国产非洛地平缓释片与原研制剂的生产工艺存在一定差异。
[硕士论文] 张晓娜
分析化学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:维生素B作为人体代谢过程中所必需的一种微量有机化合物,主要包括硫胺素(B1)、核黄素(B2)、烟酸(B3)、遍多酸(B5)、吡哆醇和吡哆醛(B6)、叶酸(B9)、生物素(B8)和钴胺素(B12)。它们通常以辅酶的形式参与蛋白质、内糖和脂肪的代谢,当体内缺乏某种维生素B时,其相应的功能将会受阻,严重缺乏时会导致一系列疾病。人体内不能自主合成维生素B,需要从日常饮食和补充类药物中获得,但医药市场监管制度尚不完善,存在一些药品标注值与实际含量严重不符的现象。这就急需建立一种方法检测维生素B补充剂中多种维生素B的含量,来确保人们在服用类似补充剂的同时获得足够的维生素B,保证机体的健康运转。色谱技术由于具有操作简单、重复性好、灵敏高、分析速度快等优点而得到广大分析工作者的青睐,因此我们建立了一种维生素B补充剂中多种维生素同时分析的HPLC方法,该方法具有简单、快速、可靠等优点,能够较好的满足实际样品分析的需求。
  植物激素作为植物体内调控植物生长的一类痕量有机化合物,对植物体内的新陈代谢起着至关重要的作用。按照作用和功能不同,植物激素可分为生长素、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA),多胺、乙烯、茉莉酸、水杨酸和油菜素内酯。与维生素B不同的是植物激素可以在植物体内自主合成,但由于植物激素“量微高效”的特点,单纯利用HPLC很难在植物体内直接检测到植物激素,因此对植物体内植物激素的定性定量分析成为植物研究的瓶颈。基于以上问题,我们建立了一种基于SiO2@GO复合材料的分散固相萃取(dSPE)样品前处理方法,通过对植物激素高效净化和富集,建立了一种基于HPLC技术高效、灵敏、快速、可靠分析植物激素的新方法,实现了对拟南芥等植物中多种植物激素的同时定性和定量分析。本论文具体研究内容如下:
  1.利用维生素B1、B2、B3、B6标准品优化HPLC检测条件,采用ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6mm×100mm,3.5μm)反相色谱柱,流动相为乙酸盐缓冲液(乙酸调节pH=3.22)和甲醇,选择不同比例混合溶液进行梯度淋洗,进样量5μL,检测波长为270nm。四种维生素B在浓度为0.8~400μg/mL的范围内,相关系数r为0.9988~0.9999, 检出限为0.05~0.40μg/mL,加标回收率在85.6%~116.0%之间,相对标准偏差均低于0.33%,该方法实现了对片剂维生素B片中维生素B1、B2、B3和B6的准确测定。
  2.制备SiO2@GO纳米复合材料。本实验采用Hummers法制备GO,并成功的将其包覆在按氨基改性的SiO2表面,材料经过SEM、TEM、UV等一系列大型仪器的表征,结果表明SiO2@GO复合材料已成功合成。将已制备的GO复合材料作为dSPE萃取剂,应用到目标分析物吸附性能的研究,探索最佳料液比、pH值、吸附和解吸时间、解吸温度以及解吸溶剂对吸附性能的影响,实验结果表明本实验建立的dSPE方法具有良好的稳定性和重现性,萃取效率均在80%以上,富集倍数达100多倍,可用于痕量分析物的提取富集。
  3.本实验采用SiO2@GO纳米材料作为固相微萃取填充剂建立了dSPE- HPLC分析方法,对拟南芥、桃子、黄瓜等植物中3-吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、3-吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)四种植物激素进行检测。以Eclipse XDB-C8(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,甲醇∶水(乙酸-乙酸铵缓冲液)=70∶30(pH值3.22)作为流动相,检测波长为280nm的条件下测定四种植物激素含量,并利用HPLC-MS对拟南芥及其培养液中的NAA进行定性分析。试验结果表明:四种植物激素在0.5~50.0μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r≥0.9999,最低检出浓度为0.03~0.05μg/mL,试样在5.0、10.0、20.0μg/mL的3个添加水平下的平均回收率在91.8%~106.9%之间,相对偏差在0.1%~0.7%之间,结果显示:相对于未经SiO2@GO纳米材料富集萃取的样品分析,该检测方法的灵敏度能够提升10-100倍,实现了植物中目标植物激素的痕量分析。
[硕士论文] 郑晶
分析化学 山西师范大学 2017(学位年度)
摘要:科学技术的不停发展,为实际样品的检验检测提供了各种各样的方式。与此同时,寻找一种新颖的检测技术成为了众多科研工作者研究的重中之重。由于传感器的优良特性,比如容易操作、经济、灵敏、便携式和易于制造,因此人们一直致力于通过整合电子元件与识别元件来开发电化学传感器。尤其最近几十年这个领域引起人们的广泛关注。其被普遍应用于检测化学和生物目标分子,如阻抗传感器、电流传感器以及光电化学发光传感器。基于不同聚合物薄膜的电化学传感器发展成果显著,通过放大电化学信号,改善了电化学传感器的生物相容性、灵敏度和选择性,在分析测定中显示了巨大的潜力。本论文主要研制了三种基于聚合物的电化学传感器,建立了一系列快速、灵敏、稳定的定量分析方法,对常见药物的电化学行为进行了研究分析。主要研究内容如下:
  (1)研究了以纳米金/双氢氧化物膜为基础的电极制备,通过电化学方法和扫描电镜对修饰电极进行了表征,详细讨论了电极的性能,找出了制备该修饰电极的实验条件,并将此电极用于生物体系中肾上腺素(adrenaline,AD)的电化学测定。在选定的测定前提下,修饰电极在PBS缓冲溶液(pH=7.00)中进行电化学循环伏安扫描时,电流响应和加入的肾上腺素溶液在浓度9.00×10-8~1.00×10-4 mol/L内呈正相关,相关系数为0.9982,其检出限(S/N=3)可达3.10×10-8 mol/L。并依此建立了一种新的测定肾上腺素的实验方法,用此法测定盐酸多巴胺注射液,效果较为满意。
  (2)构造了分子印迹传感器用于专一地测定巴比妥,在溶液中,以聚叶酸(PFA)为功能单体,巴比妥(BAR)为模板,通过循环伏安法在巯基乙酸自组装金电极表面上聚合制备了BAR印迹敏感膜(MIPs)。应用差分脉冲伏安法在含0.005 mol/L K3[Fe(CN)6]及0.1 mol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS)中,研究了传感器的响应性能,峰电流差与BAR浓度在1.00×10-7~1.00×10-4 mol/L范围内呈线性关系,检出限为4.65×10-8 mol/L(S/N=3)。实验表明,用电化学方法洗脱可以使传感器再生,对BAR的测定具有良好的重现性,并具有良好的稳定性。传感器对于干扰物常见的金属离子和抗坏血酸没有响应,结构相似的戊巴比妥、苯巴比妥有微弱的响应,显示了良好的选择性。所测得的加标回收率为与文献报道的BAR检测方法相比,本传感器具有低的检测限,操作简便,响应快,成本低。
  (3)采用循环伏安法将 CTAB聚合在玻碳电极上,后滴涂氧化铜纳米线,制备氧化铜纳米线-聚 CTAB复合膜电化学传感器(poly(CTAB)/CuONW/GCE)。利用循环伏安法对 poly(CTAB)/CuONW/GCE的制备过程进行了表征,以此为工作电极研究了多巴胺(DA)的电化学行为。研究成果证明,与裸玻碳电极对比,多巴胺在poly(CTAB)/CuONW/GCE上对有较高的电化学活性,发现了一种用检测DA的新手段。在选定的测试前提下研究了多巴胺的电化学行为,检测到其氧化峰电流响应在5.00×10-8~1.00×10-5 mol/L浓度范围呈满意的线性相关,检测限为1.20×10-8 mol/L。样品回收率为96.38~103.92%。该方法灵敏度高,准确性好,设备简便,线性范围宽,检测限低,是一种较好的测定多巴胺的新方法,有望在实际应用中测定多巴胺。
[硕士论文] 杜涓丽
药物分析学 山西师范大学 2017(学位年度)
摘要:随着时间的流逝和经济的迅速发展,药品已经跟随着经济的发展步伐在市场上大批量的上市,人们对药品有了很大的需求量。可随之而来的是人们对药品安全的警醒和担忧。药品的安全在人们心中起着举足轻重的作用,因此具体分析药品是很重要的。由于药品中基质成分比较复杂,且其有化合物的含量又是痕量的,所以在样品分析之前必须要对样品进行前处理。常用的药品富集和分离的方法有固相萃取法,液相萃取法和磁固相萃取法。尽管他们有很多的优点,比如说需要的实验人员少,操作简单,实验费用低,但是他们也有缺点,比如说耗时长,污染环境。本文以混合胶束固相萃取法和磁性纳米材料相结合为研究背景,以混合胶束和磁性纳米材料为萃取剂,以荧光分光光度计为手段,对几种药进行测定,以实现对药品高灵敏度的测定。本论文的研究内容如下:
  1.简单介绍了磁性混合胶束萃取近几年的发展原理及其应用,并且和其他的样品前处理方法进行了比较。评述了新型磁性纳米材料的合成方法,结构及其它的表征而且叙述了本论文的研究意义、目的及主要内容。
  2.采用水热法一步合成新型的磁性纳米材料Fe2-xAlxO3,对其进行表征,结果表明此材料具有很好的表征结果。将此磁性材料作为磁性混合胶束固相萃取的吸附剂,结合荧光分光光度法对加替沙星和普卢利沙星测定。对样品溶液的 pH、磁性材料的种类及其磁性材料的用量、萃取解析时间、解析剂的种类,以及解析体积等实验条件进行了优化。在最佳条件下,加替沙星和普卢利沙星的线性相关系数分别为0.9997和0.9998,线性范围为0.4~120 ng?mL?1和2~240 ng?mL?1,检出限达到0.030和0.070 ng?mL?1,样品的加标回收率的范围是98.72%~106.20%,实验结果表明这个方法可以成功的用于实际样品中加替沙星和普卢利沙星的准确测定。
  3.采用磁性混合胶束固相萃取法结合荧光分光光度计检测对生物样品以及药片中卡维地洛含量进行测定。新型的磁性纳米材料Fe2-xAlxO3和表面活性剂十二烷基硫酸钠结合对卡维地洛具有很好的萃取效果。对影响萃取的主要因素诸如:磁性材料的种类,磁性材料的量,萃取溶液的 pH,表面活性剂的浓度,解吸剂种类及其解吸剂体积,萃取时间和解析时间等进行了优化。在优化的条件下,卡维地洛的荧光强度呈良好的线性关系,其相关系数为0.9998,线性范围为0.02~2.7 ng?mL?1,检出限为0.009 ng?mL?1,样品的加标回收率为101.50%~111.00%。在最佳条件下,该方法成功的应用于测定药片、人体血浆、尿液中卡维地洛的含量,加标回收率在101.50%~111.00%。
  4.采用荧光分光光度计,以新型的Fe2-xAlxO3磁性材料和表面活性剂SDS结合,作为磁性混合胶束固相萃盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的吸附剂,建立了一种测定实际样药物的方法。在优化条件下,盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量与吸光度值呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9997和0.9998,线性范围分别为0.2~110 ng?mL?1和4~260 ng?mL?1,检出限为0.02~0.09 ng mL?1,样品的加标回收率为98.23%~101.06%,这个检测结果表明,该方法可以成功的用于实际样品中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的测定。
[硕士论文] 陈大权
制药工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:药品作为一种特殊商品,其质量与人民群众生命健康息息相关。近年频繁发生的药品安全事故使人们认识到加强药品生产质量管理的重要意义。我国1998年版的药品生产质量管理规范(GMP)距今已近20年,存在严重局限性及不足。国家食品药品监督管理总局(CFDA)在借鉴美国食品药品监督管理局(FDA)、欧盟及世界卫生组织(WHO)GMP基础上,完善和更新了我国药品生产质量管理规范(GMP)。《药品生产质量管理规范(2010年修订)》(以下简称为新版GMP)经过多年修订及征求意见后,于2011年3月1日起实施。新版GMP认证包括两个时间点,药品生产企业的疫苗、血液及注射液等无菌剂型均应在2013年2月31日前完成验证;其他药品则需要在2015年12月31日前符合新版GMP要求,未达到新版GMP标准的企业将不得继续生产。新版GMP提高了药品生产企业的准入门槛,企业若要生存发展,必须投入大量人力物力用于整改及强化药品质量的管理。新版GMP对企业既是机遇也是一种挑战,一方面标准提高将提高药品生产质量并完善药品生产体系,另一方面标准提高将增加企业质量管理成本及资金压力。
  医院制剂是医疗机构为满足临床需要自行配制的医药市场缺乏供应的品种。其与临床结合紧密且配制方便迅速,目前已经成为临床治疗药物中不可或缺的组成部分,此外医院制剂对医疗质量的提高以及医院药学科研能力的提高发挥了重要作用,同时也为医疗机构提供了一定的经济效益及社会效益。然而,随着新版GMP的实施与验证,GMP标准的提高拉大了医院制剂室与药品生产企业的质量管理差距,医院制剂的配制要求与准入标准将大幅提高,同时医疗机构目前很难增加对医院制剂的自己投入。医院制剂如何能在不增加投入前提下,改善药品生产的质量管理水平,提高医院制剂的质量是医疗机构十分关注的问题。为避免特色医院制剂停产及临床医药资源流失,医院制剂需要重新研究其目前质量管理的不足及应对新版GMP的管理措施。
  在目前医药工业迅猛发展及新版GMP大幅提高制剂质量标准前提下,本研究以医疗机构内的医院制剂室为研究对象,分析医疗机构制剂室仍然存在的必要性,同时总结医疗机构制剂室的发展现状及目前存在的问题,并将医疗机构制剂质量管理现状与新版GMP进行对比,探讨新版GMP对医院制剂持续发展带来的不利影响。同时通过回顾并总结质量管理的发展历程及最新理念,探讨将质量管理的最佳方案用于医疗机构制剂室,从而解决医疗机构制剂室目前的发展困境,保证医疗机构制剂室生产的药品质量的持续提高,发挥医疗机构制剂室灵活生产、规模可控的优点。此外,本文还探讨了“以保障人民用药安全为目的的药品质量管理延伸将赋予药品质量管理新内涵"的新论点。
[硕士论文] 刘颖
药物分析学 湖北中医药大学 2017(学位年度)
摘要:人血白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由健康人的血浆经低温乙醇分离提取并经病毒灭活后制成的生物制品,临床上用于出血性、外伤性体克、烧伤、肝硬化伴腹水和水肿、恶性肿瘤、肾病水肿等。
  目前国内企业采用低温乙醇法压滤工艺分离血浆蛋白,该工艺具有蛋白收率高,生产成本低,经济效益好,因而在工业化生产中大规模应用。然而低温乙醇法特异性不高,在生产的过程中不能完全除去杂蛋白成分,各企业的工艺参数也不尽相同,因此在终产品中会存在一定量的杂蛋白。据文献表明,制剂中存在的这些杂蛋白是引起的临床不良反应的主要原因之一[1],不良反应类型主要为全身过敏反应和多器官损坏,包括过敏性休克、热原样反应、肾脏损害等。因此探究血液制品中的未知蛋白可为临床不良反应提供参考,本课题旨在建立杂蛋白分离分析的方法并测定人血白蛋白制剂中的杂蛋白的组成,为各企业的生产工艺优化提供了数据支持,同时为产品的一致性评价奠定基础。
  为了初步了解各企业的杂蛋白含量和种类的差异,对五家企业近两年的批签发数据进行统计分析,共获得323批白蛋白制剂的纯度数据。结果显示,五家企业生产的白蛋白制剂纯度范围在96.2%~98.3%之间,企业间差异较大。其中A企业生产的制剂纯度较为均一,提示生产工艺较为稳定;B企业生产的制剂纯度较其他四所企业低,显示产品中存在一定量的未知蛋白。为了进一步分析各企业制剂的蛋白组成异同,对白蛋白制剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,初步探究其组成成分的异同,结果显示各企业间生产的白蛋白制剂差异较小,各企业制剂的杂蛋白有8~9条带。鉴于醋酸纤维素薄膜电泳与SDS-PAGE方法的局限性,不能特异性地鉴定出杂蛋白成分,本研究尝试建立未知蛋白谱鉴定方法,进而确定各企业生产的人血白蛋白制剂的未知蛋白组成。
  在建立质谱分析方法时,首先对供试品浓度进行选择,再对质谱鉴定参数进行优化。结果显示,白蛋白浓度超过5mg/ml时,超过仪器鉴定阈值,导致白蛋白主成分未能被成功鉴定,提示蛋白浓度不能过高。蛋白浓度在1mg/ml-2mg/ml时,主成分白蛋白肽图较为完整,但未知蛋白检出效率低;对白蛋白肽图中的肽段进行b/y离子连续性分析发现,蛋白鉴定得分大于150分,结果具有较高的可信度。以上结果提示主成分蛋白浓度过高,掩盖未知蛋白的的信号,未知蛋白的鉴定需要对未知蛋白进一步分离。
  结合前期结果,对各企业的白蛋白中未知成分进行分离纯化、酶切方法的优化,确立其分离纯化方法,并分析各企业未知蛋白的种类、数量、分子量、等电点分布及其工艺相关性。采用阴离子交换柱与凝胶过滤层析柱分别对白蛋白进行分离,结果显示,使用阴离子交换层析只能得到主成分单一峰,而使用凝胶过滤层析得三组峰,因此采用凝胶过滤层析对白蛋白中位置组分进行分离。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别对各分离组分进行酶切,结果显示,胃蛋白酶酶切结果重复性较差且蛋白得分较低,而使用胰蛋白酶重现性良好,蛋白鉴定得分较高。对胰蛋白酶酶切效果进行进一步确证,结果发现,三次平行实验,共有11个蛋白被检出,其中共有8个蛋白每次均检出,说明方法稳定性较好。最终采用胰蛋白酶对人血白蛋白中的未知蛋白成分进行鉴定,结果显示五家生产企业产品,除一家企业杂蛋白较少外,另外四家企业所有批次样品均含有载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)、人结合珠蛋白(Haptoglobin)、人血色素结合蛋白(Hempoexin)、α-1B-糖蛋白(Alpha-1B-glycoprotein)、α-2-HS-糖蛋白(Alpha-2HS-glycoprotein),且略有差异。对未知蛋白等电点进行分析发现,未知蛋白等电点与白蛋白较接近,可能在乙醇共沉淀时与白蛋白共同析出,初步可以说明未知蛋白为工艺相关蛋白;对未知蛋白分子量进行分析发现,未知蛋白以多聚体的形式存在于白蛋白中。
  以上结果表明,在临床应用中,应更加关注上述未知蛋白的过敏效应,在工业生产中,应优化生产工艺,尽可能去除无关蛋白,提高产品质量。本课题建立的白蛋白制剂杂蛋白质谱分析方法为探究临床不良反应提供了数据支持,为白蛋白制剂的一致性评价提供了新的方法,为血液制品的质量控制奠定了基础、提供了新思路。
[硕士论文] 王精
药物分析 西南大学 2017(学位年度)
摘要:碳点(Carbon dots,CDs)作为碳纳米材料家族的一名新成员,由于其具有独特的性质及潜在的应用价值,受到越来越多人的关注。相比于传统的有机染料和半导体量子点,碳点不但继承了碳纳米材料原料广泛、成本低的优点,还具有制备简单、易于修饰、发射波长可调谐、光稳定性好、毒性低和生物相容性好等优势,同时在光、电催化等方面也具有特殊的性质。因此,碳点在分析检测、催化、光电器件、生物传感以及生物医疗等领域呈现出广阔的应用前景。碳点的制备方法可以分为:自上而下法和自下而上法。自上而下法主要包括:超声法,激光消融法,电化学法等。自下而上法主要有:模板法,硝酸回流法,微波法,水热法等。本文从碳点的制备及其应用两个方面出发,寻找绿色环保的物质作为合成原料,探索碳点简便快捷的制备方法,并研究其在叶酸和环丙沙星检测中的应用。
  本研究主要内容包括:⑴以乳糖为碳源,在NaOH强碱溶液环境中,通过水热法一步合成具有淡蓝色荧光的碳点。随后,对其进行以下表征:通过高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)观察,碳点的分散性好,平均粒径约为2-3 nm;通过红外光谱表征,碳点表面含有–CH2、–CH3、–OH和–COOH等官能团。由于碳点能与叶酸特异性结合,因此我们以碳点作为荧光探针用于检测叶酸。其机理可能为:碳点表面的水溶性基团(–OH和–COOH)和叶酸的亲水官能团(–OH、–COOH和–NH2)相互作用,形成氢键,促使碳点发生聚集,从而导致荧光猝灭。通过条件优化,叶酸的浓度在6×10-5 mo l/L-8×10-8 mo l/L与碳点的荧光强度猝灭值呈线性相关,检测限为1.2×10-9 mo l/L。此外,该体系用于人体尿液样品中叶酸的检测,回收率在96.7%-103.0%之间,说明本文建立的荧光分析方法能成功用于实际样品中叶酸的检测。叶酸,又称维生素 B9,是一种水溶性维生素,在人体的新生代谢扮演着重要的作用。一些疾病与叶酸的缺乏密切相关,例如:巨幼红细胞性贫血,中风,心脏病发作,精神病,婴儿畸形,癌症等。因此,开发方便快捷的分析方法用于检测叶酸,具有重要意义。⑵以羟丙纤维素(HPMC)作为碳源,通过水热法制备了发蓝色荧光的碳点。通过荧光光谱、高分辨透射电镜、紫外-可见吸收光谱、红外光谱、X射线光电子能谱等手段对其进行表征。碳点的粒径大小约为5.6 nm,荧光量子产率为1.36%;最大激发波长和最大发射波长分别为310 nm和420 nm,同时发现碳点具有发射波长依赖于激发波长的性质;通过结构表征,发现碳点表面富含-OH和-C OO H等水溶性官能团。利用碳点表面基团能与环丙沙星结合,建立了检测环丙沙星的新方法。其线性范围在10 nM-90μM之间,检测限为5.88 nM(3σ),说明其检测范围较宽和灵敏度高,表明本文建立的荧光分析方法可以用于环丙沙星的检测。环丙沙星是第三代喹诺酮类广谱抗菌药,由于其对革兰性阳性菌和革兰性阴性菌都有良好的效果,导致其在生物体残留增多,所以对其痕量残留进行检测是一项很有意义的工作。
[硕士论文] 李志满
药物分析学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  肝纤维化是由多种致病因素引起的肝内结缔组织发育不良的病理过程,肝纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。在肝纤维化过程中,其特征是肝星状细胞和其他细胞外基质细胞的激活。本实验采用二甲基亚硝胺建立慢性肝纤维化体内模型和活化肝星状细胞体外实验,探究垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge,SS)改善肝纤维化进程、脂质沉积、细胞凋亡以及炎症因子的作用,并分析其围绕Sirt1-AMPK-LXR信号通路的调控机制。
  方法:
  体内实验中,取Wistar雄性大鼠随机分为五组,每组六只,即为正常组、DMN组、垂盆草提取物低剂量组(100mg/kg)、垂盆草提取物高剂量组(300mg/kg)和扶正化瘀阳性对照组(2g/kg)。DMN组与各药物治疗组每周连续三次腹腔注射1% DMN(2ml/kg)诱导肝纤维化;造模的同时各治疗组分别灌胃给予垂盆草提取物(100或300mg/kg)或扶正化瘀(2g/kg),每天一次,连续5周。在末次给药6h后,将动物安乐死,收集血液和肝组织。利用试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)的水平。利用H&E,Masson染色和免疫组化染色方法观察垂盆草对大鼠肝组织形态学的影响;通过蛋白印迹方法和PCR法检测肝脏中α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1,SREBP-1,FASN, ACCa, Caspase3, Caspase9, FLIP, Bax, Bcl-2, Bid, Caspase1,TNF-α,Sirt1,AMPKα,p-AMPKα,LXRα,LXRβ蛋白或mRNA的表达。
  体外实验中,将HSC-T6和LX-2细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS),100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的培养基(DMEM)中,在37℃,5%CO2饱和湿度环境的二氧化碳培养箱中培养。将细胞以5×105/孔的密度接种在6孔板中,用TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后,分别给予垂盆草提取物(6.25、12.5、25或50μg/ml)孵育24小时。收集细胞提取总蛋白和核蛋白,分别进行蛋白印迹、PCR和细胞免疫荧光分析,检测了α-SMA,CollagenⅠ,Sirt1,AMPK,p-AMPK,LXRα和LXRβ蛋白表达情况。此外,TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后,再分别给予垂盆草提取物(25或50μg/ml),AICAR(AMPK激动剂)和GW3965(LXR激动剂)处理HSC-T6和LX2细胞6小时后,收集细胞提取总蛋白和核蛋白进行检测。利用蛋白印迹实验和细胞免疫荧光技术检测垂盆草对肝星状细胞中Sirt1,AMPKα, p-AMPKα,LXRα和LXRβ蛋白的表达的影响。
  结果:
  体内实验结果显示垂盆草提取物显著抑制二甲基亚硝胺诱导的肝损伤大鼠血清中ALT,AST活力的升高。H&E染色和Masson染色结果显示,垂盆草提取物可以显著改善二甲基亚硝胺诱导的肝组织病变,且存在剂量依赖性。同时也能够抑制肝组织中α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1蛋白和mRNA表达的升高,与α-SMA免疫组化结果具有一致性。RT-PCR结果显示,垂盆草提取物显著降低了SREBP1,ACCa,FASN mRNA表达。垂盆草提取物能够抑制肝脏中Caspase1,TNFα的表达;并且通过减少FLIPL表达,抑制了Bid,导致cleaved-Bid表达的升高,Bax的表达受到抑制,从而提高Bcl-2的水平。垂盆草给药组显著增加Sirt1,p-AMPKα,LXRα,LXRβ的表达水平。
  体外实验结果显示,垂盆草提取物可以显著降低HSC和LX2细胞中α-SMA,CollagenⅠ两种纤维形成标记物的表达来抑制肝星状细胞的活化,并且免疫荧光结果较为明显看出,垂盆草明显抑制了α-SMA蛋白的表达。此外,垂盆草具有显著促进活化的肝星状细胞中Sirt1,LXRα,LXRβ和AMPK磷酸化表达的作用,具有剂量依赖性。
  结论:
  垂盆草通过抑制纤维化指标,减轻脂肪堆积,抑制炎症和凋亡起到肝保护作用,同时垂盆草激活Sirt1-AMPK-LXR信号通路显著抑制二甲基亚硝胺诱导肝纤维化和活化的肝星状细胞。
[硕士论文] 郑今花
药物分析 延边大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  二氢槲皮素是一种黄酮类化合物,据前期研究发现二氢槲皮素有很强的抗氧化作用,具有很高的潜力。本研究通过狂饮酒精性脂肪肝模型和急性酒精性脂肪肝模型,探讨二氢槲皮素是否对酒精性脂肪肝小鼠有抑制脂肪蓄积的作用。
  方法:
  1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:给药低中高剂量组每天给予不同浓度的二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)共5天,给药第5天时给药4小时候每隔30分钟给予33%酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平,通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响。
  2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:酒精组隔12小时给予33%酒精(5g/kg)共3次,给药低中高剂量组每隔12小时同时给予二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)和酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平,通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响;通过蛋白印迹观察小鼠肝脏LKB1、乙酰辅酶a羧化酶(Acetyl CoACarboxylase,ACC)、AMP依赖的蛋白激酶α(AMP-activated Kinaseα,AMPKα)等脂肪合成与氧化相关因子及炎症小体相关因子表达变化。
  3.急性酒精性脂肪肝体外实验:HepG2细胞给予不同浓度的二氢槲皮素,间隔1小时后给予大剂量酒精诱导肝细胞损伤,24小时后刮蛋白做蛋白印迹实验,检测AMPKα、ACC、IL-1β的表达;HepG2细胞敲除P2x7R,间隔30小时后给予二氢槲皮素和酒精,24小时后通过荧光染色观察SREBP-1的表达;LPS+ATP刺激肝癌细胞株HepG2,并通过Western Blot检测、HepG2胞内P2x7R和pro-IL-1β活化片段。
  结果:
  1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型中,二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量,减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性。
  2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型中,二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量,减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性;二氢槲皮素明显减少了P2x7R、Caspase-1及NLRP3炎症小体的阳性表达,减少了巨噬细胞及中性粒细胞的炎性募集。同时二氢槲皮素能够活化AMPKα、SIRT-1,抑制ACC和SREBP-1的表达。
  3.体外实验中二氢槲皮素明显抑制了酒精诱导的肝细胞中ACC、IL-1β的表达,同时激活了AMPKα、LKB1。
  结论:
  本实验证明二氢槲皮素对狂饮酒精性脂肪肝小鼠和急性酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂肪积蓄有一定的保护作用,同时对脂肪肝伴有的炎症也有一定的抑制作用。
[硕士论文] 龙瑶
药物分析学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:固定相是高效液相色谱(HPLC)的核心,其性能直接影响分离分析效果。固定相基质主要有三类:硅胶(silica, SiO2)基质、聚合物基质和金属氧化物基质。SiO2具有机械强度高、化学性质稳定以及粒径、孔径和表面积可控等特点,成为目前应用最广泛的固定相基质。SiO2表面分布有大量硅羟基,易于经化学修饰而键合各种不同性质的官能团。可以根据分离物质性质的不同,选择合适的化学键合相色谱对物质进行分离分析。
  虽然 SiO2基质固定相具有上述优势,但仍存在一定的局限性,如不支持过酸或过碱的流动相、SiO2上残余的硅羟基易与分析物相互作用而产生拖尾效应。因此,开发稳定性高、表面残余硅羟基活性更低的SiO2基质固定相对HPLC的发展至关重要。
  另外,随着医药卫生、食品卫生、疾病监测、环境监测等领域的不断发展,研究者们需要分离的样品日益复杂,仅具有单一保留机理的色谱模式已经不能完全满足分离分析问题。因此,混合模式色谱(MMC)应运而生。MMC是一种能在分离过程中提供两种或多种保留机理的分离技术,具有选择性好、载样量高、分析成本低等优点,因此其固定相的开发已成为研究热点。
  本论文围绕“SiO2表面的修饰改性”这一主题,分别在MMC固定相的开发以及降低SiO2基质表面酸性方面进行了一定的研究。主要包括以下三部分内容:
  1.通过二硫苏糖醇(DTT)与1-十八烯的“烯-硫醇”点击化学反应,制备出一种新型 MMC固定相 C18-DTT-SiO2。通过对流动相中乙腈比例、pH、缓冲盐浓度、柱温等因素进行系统考察,证实C18-DTT-SiO2具有反相/亲水相互作用保留机制。此外,在不同的色谱模式下,发现其对非甾体类抗炎药、生物碱、碱基核苷、多环芳烃类等不同性质的分析物表现出良好的分离效果。结果表明,C18-DTT-SiO2可以在不同分离模式下分离复杂分析物,具有一定的应用前景。
  2.对SiO2表面硅羟基进行研究,通过三种可行的方法屏蔽了SiO2的酸性硅羟基从而降低了表面酸性,为研究低拖尾或不拖尾(针对碱性样品)色谱固定相奠定了基础。具体如下:在氨水存在条件下,加入(1)正硅酸四乙酯(TEOS)、(2)TEOS与(γ-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPS)、(3)TEOS、GOPS和十六烷基三甲基溴化铵,对分散于乙醇/水溶液中的无定型SiO2进行表面沉积。运用氮气吸附法、化学滴定法分别对沉积后 SiO2孔结构、表面硅羟基含量进行表征。表征结果表明,沉积后 SiO2孔径、孔容及硅羟基含量均减小,证明这三种方法均能够对酸性硅羟基产生屏蔽作用从而降低SiO2表面酸性,并且后两种方法效果更佳。
  3.总结了近年来MMC固定相的表征方法并展望其前景。
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