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[硕士论文] 徐晨阳
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:桑树(Morus alba L.)作为我国重要的经济树种,在桑蚕饲养上有很大价值,但也长期遭受桑天牛的危害。本研究通过定性和定量分析桑树在机械损伤和不同昆虫啃食下诱导产生的挥发性有机化合物释放,探究桑树对机械损伤和生物逆境的防御机制,为桑天牛植物源引诱剂生物防治和清洁高效的桑蚕饲料生产提供基础理论知识。本实验采用动态顶空气体采样和在线测量相结合,应用TD-GC-MS和PTR-MS两种不同原理的质谱技术,对桑树叶片在三种处理下的挥发性化合物进行定性和定量分析,得出如下结果:
  (1)机械损伤后的桑树叶片会立即释放大量的绿叶挥发物(GLVs),其中包括(E)-己-3-烯基碳酸乙酯、1-甲基环戊烯、环己烯、(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛、3-己烯醇、壬醛等主要物质,其中TD-GC-MS的检测结果显示(E)-己-3-烯基碳酸乙酯释放量最大,但所有挥发物释放的种类和浓度会在短时间内恢复到正常状态。
  (2)桑蚕啃食诱导的叶片也会释放GLVs,但叶释放量相对较少,且没有检测到(E)-己-3-烯基碳酸乙酯。但在诱导后6小时,可以检测到单萜类物质,相比于机械损伤,桑蚕啃食诱导的叶片释放挥发物种类更多,但即时释放量小,且叶片恢复较慢。
  (3)天牛啃食诱导的叶片也会释放绿叶挥发物,同样是释放量相对较少,但依然释放(E)-己-3-烯基碳酸乙酯。与桑蚕啃食诱导的叶片相同的是,诱导后6小时,可以检测到单萜类物质。相比起前两种诱导,天牛啃食的叶片释放挥发物种类最多,恢复最慢。
  结论:三种损伤后均以GLVs为主,这与三种损伤均导致生物膜的破裂和脂膜氧化有关。相比机械损伤和天牛啃食,桑蚕的啃食并没产生(E)-己-3-烯基碳酸乙酯,我们推测(E)-己-3-烯基碳酸乙酯很可能是一种对桑蚕极为不利的化合物,在桑蚕和桑树的协同进化中存在一种调控机制而不产生(E)-己-3-烯基碳酸乙酯。相比纯粹的机械损伤,数小时后才诱导产生的单萜类物质,很可能是来自昆虫啃食唾液物质的驱动。详细的调控和诱导机制,还需要更加深入的研究。
[硕士论文] 郑俊明
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:干旱和土壤盐渍化是制约农林业发展的重要因素,探究桑树在干旱和盐两种非生物逆境下的生理生化响应和适应能力,为桑树的品种选育、栽培管理和推广种植提供理论依据。以农桑14号、农桑12号和强桑1号三种盆栽苗为实验材料,采用盆栽控水模拟干旱胁迫(CK和30%FC);向盆栽土壤倒入氯化钠溶液模拟盐胁迫(CK,T0.1和T0.3),对盆栽桑树苗的形态变化和生理和生化响应等进行了研究,主要结果如下:
  (1)干旱导致三种桑树苗的相对高度生长速率(RHG)、净光合速率(Pn)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)显著下降,气孔限制值(Ls)和水分利用效率(WUE)显著上升。农桑14号和农桑12号的根干重(RDM)、茎干重(SDM)、叶干重(LDM)和总干物质量(TDM)均显著下降,而强桑1号对照与处理组之间无显著差异。农桑14号的超氧化物歧化酶(SOD)显著下降,过氧化物酶(POD)活性显著上升,强桑1号的丙二醛(MDA)含量显著上升。气孔关闭显著限制了三种桑树的Pn,而农桑14号和农桑12号同时存在非气孔因素的限制。农桑14号和农桑12号通过形态调节(基部脱叶)和气孔调节来适应干旱胁迫,其水分利用方式更适合在湿润地区种植;强桑1号严格控制着各部分生物量的分配,与农桑14号和农桑12号相比,强桑1号更适合在干旱地区种植。
  (2)盐胁迫下农桑12号和强桑1号各光合色素含量在T0.1处理下上升,而T0.3处理下三种桑树叶片光合色素含量均下降,其中农桑14号光合色素分解显著。三种桑树在盐胁迫下Pn、Gs和Tr下降,且T0.3处理使叶片气体交换抑制程度加深,气孔因素显著限制了Pn,而T0.3处理第7天和T0.1处理第14天,农桑14号Ci上升,表明其Pn的限制还存在非气孔因素。T0.3处理中初始荧光(Fo)显著上升,最大荧光(Fm)、PSⅡ的潜在光化学效率(Fv/Fo)、PSⅡ原初最大光能利用效率(Fv/Fm)、光化学淬灭系数(qP)和PSⅡ实际量子产额(YⅡ)下降,反映了光合电子传递链中PSⅡ反应中心电子库容减小,光化学转化效率降低,PSⅡ氧化侧和原初电子受体受损,电子传递受抑制。农桑14号和农桑12号在T0.1处理中非光化学淬灭系数(NPQ)上升,而T0.3处理第7天其NPQ均下降,非调节性能量耗散的量子产额(YNO)显著上升,意味着存在大量过剩光能。强桑1号在T0.3处理下NPQ上升,表明桑树叶片PSⅡ中激发能分配发生改变,且强桑1号有更好的热耗散能力。盐胁迫下桑树叶片中SOD、POD、可溶性糖(SS)和MDA均上升,且T0.3处理下POD和SS积累显著;盐胁迫下桑树叶片中MDA均有上升,且农桑12号在盐胁迫第7天MDA含量显著上升,意味着其膜脂过氧化程度较高。
  (3)桑树在盐胁迫的第7天就产生响应,盐胁迫下桑树能积累可溶性糖来抵抗渗透胁迫,通过提高热耗散来保护光合机构,POD在活性氧(ROS)的清除中起到重要作用,其中农桑14号对土壤盐分十分敏感,表现为光合色素降解严重,PSⅡ能量传递效率受抑,存在光合机构损伤的非气孔限制,同时叶片严重脱落。农桑12号存在一定的抗盐能力,轻度盐处理下(T0.1)其通过提高光合色素含量来适应盐环境,但MDA的数值反映其膜脂过氧化程度过高。强桑1号具有较强的抗盐能力,从光合色素含量,光化学效率和热耗散能力均反映了强桑1号具有更强的抗盐能力。
  综合分析后认为这三种桑树的抗旱和抗盐性均为:强桑1号>农桑12号>农桑14号。与此同时农桑14号和农桑12号更快的生长速率,在水肥良好的环境下能更好的生长,即具有更大的生长潜能,建议在立地条件良好的地区种植以发挥其最大的经济效益。而强桑1号具有相对更强的抗逆能力,可以将其作为生态修复树种推广至内陆的干旱和盐渍地区种植,以发挥其防沙治沙、水土涵养等生态功能。
[硕士论文] 陈慧珠
蚕学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)可引发家蚕血液型脓病,给蚕业带来严重损失。同时,BmNPV也作为良好的外源基因表达材料应用于现代医学研究和生物技术等方面。BmNPV同源重复区hrs可以作为该病毒基因组复制的起点,并且能够作为增强子增强基因的表达效率,对BmNPV的增殖有着密切的关联。囊膜糖蛋白GP64可识别细胞膜表面的受体,是病毒入侵宿主细胞所需的重要结构,对病毒在宿主体内的传播具有关键性作用。
  本研究通过对采集自广西各蚕区的家蚕血液型脓病样本,进行BmNPV多角体的纯化,提取其BmNPV病毒株的全基因组,并对基因组的同源重复区hr5和囊膜糖蛋白gp64基因进行克隆,经过测序和序列分析,结果显示:
  1.本试验通过对19株广西BmNPV病毒株hr5进行克隆分析,结果发现广西BmNPV病毒株的hr5核苷酸序列出现不同程度的变异,表现在由大片段的缺失和插入造成序列长度差别较大。这种差别不仅出现在不同毒株之间,而且同一毒株两个目的序列也不尽相同。19个供试毒株的hr5大小在165-999bp之间,其中,有10个毒株分别扩增出两个不同长度的hr5,有2个毒株出现了整个同源重复序列的缺失,其他毒株也存在不同程度的回文片段缺失或增加。以此认定hr5并非病毒复制的必需因子,但hrs不同的回文序列之间存在功能补偿或相互替代作用,使病毒不仅能保持其基因的稳定性,更能维持其对新环境适应性能,这就是病毒在新老环境下皆能得以为继与不断适应与生存的意义所在。
  2.通过对供试的18个BmNPV病毒株gp64基因的克隆。结果发现,其中有2个毒株与T3株gp64基因ORF的长度一致,有2个毒株的gp64基因ORF在94-96位有3个核苷酸的缺失,有10个毒株的gp64基因ORF在97-102位上有6个核苷酸的插入。该突变位点位于GP64蛋白的N端信号肽序列,所缺失和插入的氨基酸均为疏水性氨基酸,该突变对相应区域结构或功能是否有影响还有待进一步深入研究。
  3.依据与BmNPV病毒株gp64ORF构建的遗传进化树比较,结果显示区内各分离毒株与国外的毒株不在同一亚群,说明gp64基因的遗传具有地域特点。
  4.通过对供试BmNPV病毒株的gp64基因和hr5序列核苷酸序列同源性对比,发现gp64基因序列间的同源性在97.5%以上,而hr5序列的核苷酸同源性仅在66%以上。从此可以认定结构蛋白基因gp64更具保守性,而基因间区序列hr5则不然。
[硕士论文] 代欣
植物营养学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:桑树(Morus alba L.)对干旱、盐碱等非生物逆境胁迫具有较强的适应能力,同时桑树也可产生较高的经济效益,近年来桑树在黑龙江盐碱土地区推广种植,用于植被恢复和发展农村经济。植物冠层可消纳部分氮沉降,为了初探桑树(Morus alba L.)幼苗生长发育、生理特征对氮沉降的响应机制,本试验以1年生桑树幼苗品种“秋雨桑”为试验材料,以NH4NO3溶液模拟氮沉降,设置3个模拟氮沉降水平:低氮(LN,4mg·L-1)、中氮(MN,8mg·L-1)和高氮(HN,16mg·L-1),以蒸馏水处理为对照(CK),研究了模拟氮沉降对桑树幼苗生长、光合特性、氮代谢以及叶片结构等方面的影响。主要研究结果如下:
  模拟氮沉降水平的变化可明显影响桑树幼苗生长和生理生化特性,其中,低氮处理下桑树幼苗生长和生理状况与对照相比差异较小,中氮处理下桑树幼苗非光化学猝灭系数(NPQ)显著低于对照,桑树幼苗总叶绿素含量、叶绿体数目及大小、栅栏组织厚度、总生物量、株高、叶面积、比叶重、根系活力、最大净光合速率(Pnmax)、气孔导度(Gs)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、表观电子传递速率(ETR)、硝酸还原酶(NR)活性、谷氨酰胺合成酶(GS)活性、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性均显著高于对照及低氮、高氮处理。而高氮处理下桑树幼苗非光化学猝灭系数(NPQ)显著高于对照,桑树幼苗叶片总叶绿素含量、根系活力、最大净光合速率(Pnmax)、总生物量、光合氮素利用效率(PNUE)、硝酸还原酶(NR)活性、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性、栅栏组织厚度显著低于对照,细胞膜透性增大,叶绿体中淀粉粒数目增多,叶绿体基粒片层结构垛叠疏松,基粒数目减少,被膜结构不清晰。以上结果表明,适当浓度的氮沉降处理(中氮)有利于增强桑树幼苗的光合能力,促进其氮代谢,有利于生物量的积累;而高氮处理影响桑树生理代谢稳定,导致桑树幼苗叶绿体结构破坏,影响叶绿体正常的光合作用,对桑树幼苗生长产生不利影响。
[硕士论文] 陶程
蚕学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:广西地处亚热带湿润季风气候的南部,是中国种桑养蚕最大的省区,桑园种植面积在20万公顷以上,桑树年冬夏两次采伐,年产桑枝条高达600万吨以上,这是一宗可利用的宝贵资源。据《中国药典》记载,桑枝有祛风湿、利关节、行水之功效,可以治疗风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。现代药理学研究也表明,桑枝中含有多糖、黄酮、生物碱等物质,具有降血糖、降血压、抗癌等药理活性。有关桑树活性成分研究成为了近年来的桑树领域的研究热点。但是,关于桑树活性物质的研究仍大多针对桑叶来进行,而以桑枝为材料的研究则甚少,桑树作为蚕桑产业的物质基础,其主要是利用叶片,而桑枝条往往被作为产业废弃物。因此,本研究以广西主推桑树品种为材料,通过采用雷氏盐比色法、芴甲氧酰氯柱前衍生化反向-高效液相色谱紫外检测法、硫酸-蒽酮法、分光光度法分别测定23个桑树品种的夏伐、冬伐、不同月龄剪伐等方式下生长的枝条中总生物碱、DNJ、多糖、总黄酮的含量,以探究枝条中总生物碱、DNJ、多糖、总黄酮含量随品种、生长时间季节、采伐时期的动态变迁。并通过采用spss23进行因子分析优选出高品质桑枝原料品种。研究结果如下:
  (1)夏伐桑枝的干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖、总黄酮含量的范围分别为:55.21%-69.64%、2.942-6.511mg/g、0.44-1.077mg/g、7.558-9.875mg/g、1.081-1.743mg/g。桑枝干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖含量虽高的品种分别为:桂桑6号、桑特优2号、粤椹大10、强桑1号。桂桑6号和桑特优2号是广西主推的桑树品种,其他广西主推的桑树品种夏伐桑枝干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖含量均在较高水平。
  (2)冬伐桑枝的干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖、总黄酮含量的范围分别为:44.87%-65.33%、3.599-6.511mg/g、0.43-1.35mg/g、8.109-14.069mg/g、0.810-1.472mg/g。桑枝干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖含量最高的品种分别为:沙2×伦109、桑特优1号、桑特优1号、桂桑优62。桑特优1号和桂桑优62是广西主推的桑树品种,其他广西主推的桑树品种冬伐桑枝干物率和桑枝中总生物碱、DNJ、多糖、总黄酮含量均在较高水平。
  (3)依桑树生长时期、季节、枝条老嫩等因素,桑枝中干物率与总生物碱、DNJ、多糖的含量有如下趋势:生长3月龄及其以上的桑树枝条较1~2月龄的嫩枝要高;半年生枝条比1年生枝条高,下半年生长的枝条比上半年生长的枝条高。
  (4)通过对桑树各品种的枝条中总生物碱、DNJ含量的相关性分析,结果表明不论是夏伐枝条,还是冬伐桑枝,其DNJ含量与总生物碱含量有显著的正相关关系。
  (5)广西主推品种已有较大种植面积的桂桑优12、桂桑优62、桑特优2号、桑特优1号、桂桑5号、桂桑6号等桑树品种枝条中以上所测定的总生物碱、多糖、DNJ含量均在较高水平,是桑枝条利用难以多得的宝贵资源。
[硕士论文] 彭梦媛
蚕学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:中国是种桑养蚕的发源地,也是世界茧丝绸生产、加工与贸易的第一大国,在国际市场上占据主导地位。现今广西已经是中国最大的蚕桑生产基地,蚕茧与茧丝年产量均占全国第一,分别占总产量的52%和36%。因此,研究了解广西现行家蚕品种茧丝结构及性能,找出广西家蚕品种与高档丝绸所要求的丝质优良的家蚕品种之间的差异,对广西桑蚕品种选育以及茧丝绸品质的提高具有现实指导意义。
  本论文以广西壮族自治区蚕业技术推广总站育成并仍然在推广应用的“两广二号”、“桂蚕2号”和“桂蚕N2”3个家蚕品种与中国蚕业研究所育成的多丝量家蚕品种“菁松×皓月”和抗NPV能力较强的家蚕品种“华康2号”2个品种为对比研究材料,应用现代分析技术手段对其茧质及其丝质成绩、茧层及茧丝的横截面、蚕茧及茧丝的表面、茧丝蛋白的结构、热性能、茧丝及生丝的力学性能进行了分析研究,并比较研究了家蚕在不同环境湿度(RH60%,RH90%)下营茧时,其茧丝性能之间的区别与联系,旨在为广西家蚕品种的选育与茧丝绸加工等提供一些新的思路和方法。研究的主要结果如下:
  (1)家蚕在高湿度环境条件下(RH90%)吐丝营茧,其蔟中死蚕率和死笼率增加,虫蛹生命力明显降低,含抗NPV基因的品种也没有明显提高的趋势;解舒丝长和解舒率明显降低;但对吐丝量无影响。
  (2)通过对茧层与茧丝电镜观察发现,家蚕在高湿度环境(RH90%)下营的茧茧层致密性较高,茧丝间交错接触点也更大,增强茧丝间的胶着力,导致家蚕茧丝的解舒率下降。
  (3)“菁松×皓月”茧丝蛋白的β-转角构象所占比例高于其他几个家蚕品种;家蚕营茧时的环境湿度对茧丝蛋白的β-折叠构象有或多或少的影响,当营茧环境湿度较高时往往会诱导部分家蚕品种茧丝蛋白的α-螺旋和β-转角向β-折叠构象转变。
  (4)所供试的家蚕品种中抗NPV家蚕品种茧丝的热稳定性普遍低于普通家蚕品种,但是家蚕营茧环境的湿度对其茧丝的热稳定性能影响则较小。
  (5)营茧环境中的湿度对家蚕茧丝和生丝力学性能均产生较大的影响。高湿的营茧湿度能提高茧丝和生丝的断裂伸长率,但对强力、强度等性能指标的影响则不明显。家蚕在高湿环境(RH90%)下营茧,既可以提高生丝的刚度,诸如“菁松×皓月”、“桂蚕2号”、“华康2号”以及“桂蚕N2”家蚕品种的生丝,又能改善其生丝的韧性,如“菁松×皓月”、“两广二号”、“桂蚕2号”、“桂蚕N2”以及“华康2号”等所有供试家蚕品种生丝的韧性。此外,当家蚕营茧环境的湿度为90%时,“华康2号”以及“桂蚕2号”反交家蚕品种生丝的力学性能得到了全面的提升,即断裂伸长率、断裂强度、刚度以及韧性均有不同程度的提高。
[硕士论文] 胡冬冰
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕是一种鳞翅目模式昆虫,杆状病毒是专一性侵染鳞翅目昆虫的病毒,家蚕与杆状病毒之间相互作用的研究具有多方面的应用价值,二者之间相互作用机制的阐明对害虫的生物控制、外源蛋白的真核表达以及宿主对病毒免疫抗性机制的揭示等方面都具有十分重要的意义。
  血液-神经表达蛋白1样蛋白(hematalogical and neurological expressed1protein-like,hn1l)广泛表达于多种动物组织中,该蛋白被抑制表达后会出现细胞周期阻滞现象,是一种重要的功能蛋白,但其在家蚕细胞中的生物学功能尚未可知。前期的杆状病毒感染前后的家蚕细胞蛋白质表达差异组学分析结果显示,家蚕HN1L蛋白在病毒侵染的家蚕细胞中表达水平显著下调。为了深入了解该蛋白的生物学功能,主要研究了以下内容:①通过对HN1L蛋白序列(基因序列号)进行生物学信息分析,发现家蚕HN1L与人类和小鼠同源性达到59%,并具有相同的保守结构域。因此,推测家蚕HN1L蛋白可能也具有相似的生物学功能;②构建重组原核表达载体pET32a-hn1l并在大肠杆菌中进行表达、纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,用于后续研究;③构建了重组瞬时表达载体pIEX-1-hn1l用于在家蚕细胞中过表达目的蛋白,Western blot检测发现重组质粒在转染BmN细胞36h后hn1l开始表达水平,48h后达到峰值,之后趋于稳定,由此确定了最佳表达时间为48h;④细胞活力检测发现HN1L蛋白过表达可以显著增强细胞活力(p<0.01),促进细胞增殖;⑤DNA片段化检测结果表明,HN1L蛋白表达上调对DNA片段化水平有一定程度的抑制作用(p<0.05)。此外,Western bolt检测结果也显示,与正常细胞相比,HN1L蛋白的过表达对于病毒感染诱导的caspase-9酶原活化和Bax表达水平上调均显著下降,而Bcl-2的表达水平增加。流式细胞术检测结果也进一步证实,过表达HN1L可显著抑制BmNPV感染诱导的细胞凋亡。因此,推测HN1L对细胞凋亡也具有一定的抑制作用;⑥检测HN1L蛋白过表达对细胞周期的影响,Western blot检测结果显示HN1L过表达的细胞中周期蛋白Cyclin D较正常细胞减少,同时流式细胞术检测结果也表明G1期细胞减少而S期细胞增加(p<0.05),说明家蚕HN1L蛋白对细胞的G1/S期转换有一定的促进作用;⑦通过荧光定量PCR技术检测了病毒在过表达HN1L蛋白的BmN细胞中的复制能力,结果显示病毒的复制能力显著低于正常BmN细胞(p<0.05),说明HN1L蛋白对杆状病毒的复制具有一定的抑制作用。综上所述,可知家蚕HN1L蛋白具有增强细胞活性、促进细胞增殖、抑制病毒感染诱导的细胞凋亡、促进细胞G1/S期的转换、抑制病毒复制等多种生物学活性,是一种家蚕重要的功能蛋白。
[硕士论文] 刘晓颖
林业 河南农业大学 2018(学位年度)
摘要:桑树在我国有着悠久的栽培历史,传统上对桑树的利用只以植桑养蚕为主,对桑树的综合利用较少。随着现代林木育种技术的逐步发展,培育出了很多相对于传统桑葚产量更多、果形更大的桑树新品种——果桑。本文以洛阳市伊川县吕店乡温沟村50亩果桑园为研究对象,通过对其种植的三种果桑的生物学性状、产量性状与综合利用产生的经济效益的研究,主要结论如下:
  (1)在伊川县温沟村的果桑园种植的三个果桑品种(大十、白玉王、红果2号)中,其树形、枝条、叶片以及果实的颜色、大小和形状均各有特点,大十和红果2号的果色均为紫黑色,白玉王成熟的果实为白色带微紫。白玉王的果径最大,为1.6cm,红果2号的果径最小,为1.35cm。但大十的果最长,平均4.5cm,白玉王的最短,平均2.8cm。
  (2)三种果桑的产量性状也有较大差异。单芽坐果数方面,大十和红果2号相同,都是5-7个,而白玉王只有3--6个;而鲜果单果的重量,白玉王>大十>红果2号;每亩果桑园所产的桑葚量依次为大十、红果2号、白玉王。由于三种果桑的亩产量以及市场价格不同,因此作为水果所获取的经济效益也就截然不同,大十每亩的经济效益为10225.6元,红果2号为9873.6元,白玉王为7522.2元。大十和红果2号在市场上销售的价格都是30元/Kg,而白玉王为40元/Kg。
  (3)2017年在采摘园的经营模式下,游客量达到了6000余人,平均每人消费为130元,因此获得了78万元的收益,并对2018年-2021年这几年的预估效益进行了分析,25亩果桑园产生的观光效益分别是112.32万元,161.74万元,233.63万元,336.96万元。在三个品种中,只有大十和红果2号比较适合加工成果汁饮料,因大十无籽,其出汁率比红果2号高,但红果2号加工成果汁的市场价为120元/箱,大十为100元/箱,因此每亩大十加工成果汁后,可获得的收益为9536元,而红果2号的收益为9880元,二者还是有一定差别的。
  (4)2016年每亩果桑园可采摘的桑叶量为1000Kg,制成的桑叶茶产量为142.85Kg,市场价为200元/Kg,所以2016年桑叶茶的经济效益为28570元/亩。而2017年果桑园桑叶的产量为1250Kg/亩,市场价上涨为250元/Kg,因此2017年桑叶茶获得的收益为35714元/亩。除了制作桑叶茶以外,在2016年每亩果桑园可采摘的桑叶菜产量为120Kg,2017年为150Kg,但2017年桑叶莱的市场销售价格为60元/Kg,2016年市场销售价仅为50元/Kg,所以2017年平均每亩果桑园加工桑叶菜的收益为9000元,而2016年的为6000元。
  (5)2017年每亩果桑园修剪的桑枝量为500Kg,2016年每亩的桑枝产量为400Kg,利用桑枝屑培养食用菌所获得的经济效益,2016年的收益为2800元/亩,而2017年已经增长到4000元/亩。
  (6)将2016年和2017年的总收益进行了分析,由于2016年无桑葚观光采摘的经济效益,所以2016年50亩果桑园全年的总收入为235.35万元,而2017年的总收益达到了377.8万元。
[博士论文] 沈运旺
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:杆状病毒科包含一大类专一性感染昆虫的有囊膜病毒,它们的基因组是环状、超螺旋的双链DNA分子。目前已经在600多种昆虫中分离到杆状病毒,主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫。杆状病毒在其生活周期中,产生两种遗传物质相同,但是形态和功能完全不同的病毒粒子,即出芽型病毒(budded virus,BV)和包埋型病毒(occlusion-derived virus,ODV)。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)只感染家蚕(Bombyx mori),是目前研究最广泛的杆状病毒之一。本研究以BmNPV四个功能未知的ODV相关蛋白ORF40、ORF133/134和ORF92a为研究对象,通过构建基因敲除突变体,发现它们在ODV的形成过程中发挥不同的功能。主要结果如下。
  1.BmNPV ORF40的功能研究
  BmNPV的ORF40(bm40)位于病毒基因组的38,254-39,213nt,在已测序的α杆状病毒基因组中高度保守。bm40的开放阅读框(open reading frame,ORF)全长960bp,编码319个氨基酸残基,预测分子量为37.8kDa。生物信息学分析显示Bm40的N端和C端分别含有一个Dna J结构域和一段RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm40是一个晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了敲除bm40的重组病毒。结果表明,敲除型病毒只能感染单个细胞,无法产生具有感染力的子代BV病毒粒子,但是病毒DNA的复制没有受到影响。电镜结果表明,敲除bm40影响了核衣壳从细胞核转运到细胞质、核衣壳包膜形成ODV病毒粒子,以及随后ODV包埋的过程。共聚焦显微镜分析发现,从感染后48小时,Bm40主要位于细胞核内,并在感染晚期聚集在核膜和多角体上。敲除Bm40的RRM不影响BV的产生和Bm40的细胞内定位。以上结果表明,在BmNPV感染周期中,Bm40在BV的产生和ODV的包膜过程中发挥重要作用。
  2.BmNPV ORF133/134的功能研究
  BmNPV的ORF133(bm133)和ORF134(bm134)分别位于病毒基因组的126,858-127,313nt和127,342-127,671nt。这两个开放阅读框相邻,并且转录方向相反。这两个基因在所有已测序的groupⅠNPV中高度保守,分别编码两种小分子蛋白(Bm133,17.7kDa;Bm134,12.4kDa)。RT-PCR结果表明bm133和bm134均是晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了bm133和bm134同时缺失的重组病毒。结果表明,同时敲除两个基因不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜结果表明,双敲除不影响核衣壳的组装、核内微泡的形成,以及ODV病毒粒子的产生,但是被包埋进多角体的ODV病毒粒子数量显著减少。进一步研究显示单独修复某个基因并不能恢复ODV包埋的能力,表明这两个基因在ODV包埋过程中缺一不可。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm133和Bm134同时位于细胞质和细胞核。在裂解的细胞中,Bm134主要聚集在多角体上。这些结果表明,Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在ODV包埋与多角体形态发生过程中发挥重要作用。
  3.BmNPV ORF92a的功能研究
  BmNPV的ORF92a(bm92a)位于病毒基因组的88,983-89,162nt,在已测序的杆状病毒基因组中高度保守。bm92a的开放阅读框全长180bp,编码59个氨基酸残基,预测分子量为7.1kDa。Bm92a是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的经口感染因子AC110的同源物,在其N端存在一段高度疏水的跨膜结构域(transmembrane,TM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm92a是一个晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了敲除bm92a的重组病毒。结果表明,bm92a敲除型病毒和修复型病毒具有类似的增长曲线。电镜结果表明,bm92a敲除不影响核衣壳的组装、ODV的包膜和多角体的形态。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm92a主要位于细胞核内的环形区域,并在感染晚期聚集在多角体上。并且,Bm92a的细胞内转运和定位模式与经口感染因子PIF1和PIF2的类似。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Bm92a与PIF1具有强烈的互作关系。这些结果表明,Bm92a不是BV和ODV产生必需的,它可能通过与PIF1的互作参与经口感染因子复合体的形成。
[博士论文] 冯敏
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)属于杆状病毒家族的α-杆状病毒属,是引起家蚕病害的主要病原。BmNPV在感染宿主细胞的过程中会产生两种遗传物质相同但形态结构各异的病毒粒子,即出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV)。ODV经口感染昆虫中肠引发原发性感染后,产生的BV随后感染其他细胞引起水平传播,最终导致宿主的全身性感染。GP64是BV的一种主要囊膜融合蛋白,在介导病毒感染和水平传播过程中发挥了关键作用。本研究旨在探究BV入侵宿主的分子机制,鉴定与BV结合的细胞表面蛋白,以及筛选宿主细胞中的GP64互作蛋白,从分子水平阐述杆状病毒出芽型病毒粒子BV入侵宿主细胞以及病毒主要囊膜蛋白GP64与宿主互作的分子机制。主要结论如下:
  1、BV病毒粒子入侵宿主细胞的机制
  利用内吞体酸化抑制剂在BV感染前处理家蚕BmN细胞,发现病毒增殖受到显著抑制,表明BV通过低pH介导的内吞作用途径进入BmN细胞。利用网格蛋白依赖的内吞作用途径抑制剂处理以及siRNA干扰网格蛋白重链CHC表达,结果表明网格蛋白介导的内吞作用途径参与了BV入侵宿主细胞过程。此外,动力蛋白抑制剂处理实验证明了动力蛋白参与了BV对宿主细胞的有效入侵。进一步通过siRNA干扰胞内囊泡运输和融合调控因子Rab蛋白,结果显示BV感染过程受到Rab5和Rab7调控,而Rab11不参与其中,表明早期和晚期内体的运输在BV病毒粒子入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。
  2、与BV结合的宿主表面蛋白筛选
  利用病毒覆盖蛋白结合实验,分离并纯化BV病毒粒子以及BmN细胞表面蛋白,并进行孵育。利用GP64抗体检测到3个明显蛋白条带,表明细胞表面存在与病毒相互作用的蛋白。进一步通过质谱分析,从3个阳性分离胶条中共鉴定到158种蛋白。GO分析表明这些蛋白涉及细胞组分、分子功能和生物过程。蛋白分子功能聚类结果显示,在这些鉴定到的蛋白中结合活性蛋白占比45%,转运活性蛋白占比4%,催化活性蛋白占比32%。以上数据为进一步鉴定与BV结合的宿主细胞膜蛋白受体打下了基础。
  3、BV关键囊膜融合蛋白GP64与宿主互作蛋白鉴定
  构建了家蚕BmN细胞酵母文库,以GP64作为诱饵蛋白进行酵母文库杂交分析,共筛选到8个与GP64结合的候选蛋白,分别为E3泛素连接酶SINA-like10(E3ubiquitin-protein ligase SINA-like10)、RAN结合蛋白9(ran-binding protein9)、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase)、卵裂和多腺苷化特异性因子5(cleavage and polyadenylation specific factor5)、Abrupt-like蛋白(protein abrupt-like)、NADH泛醌氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),以及两个未知蛋白uncharacterized protein LOC101738779和scaf492190774-2191531(-)。
  4、GP64互作蛋白SINAL10对病毒感染的影响
  对上述酵母双杂交鉴定的8个候选蛋白作进一步免疫共沉淀验证,发现E3泛素连接酶SINA-like10(SINAL10)与GP64存在体外相互作用且在细胞内存在共定位。过表达和siRNA抑制实验表明SINAL10能够促进病毒在细胞内增殖,并在病毒的感染周期中发挥重要作用。
  本论文研究结果初步揭示了家蚕BmNPV BV入侵宿主细胞的途径,明确了该过程涉及网格蛋白介导的内吞作用,依赖于动力蛋白功能,并受到Rab5和Rab7蛋白调控,从分子水平上初步揭示了BV入侵宿主的机制。初步筛选了与病毒结合的细胞表面蛋白,并对其功能进行了注释分析。进一步利用酵母双杂交技术筛选到8个与病毒关键囊膜融合蛋白GP64相互作用的宿主靶标蛋白,并鉴定了其中一个蛋白SINAL10与GP64的互作关系,证明该蛋白对BV增殖具有促进作用。
[硕士论文] 朱兵
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:Apolipophorin-Ⅲ(ApoLp-Ⅲ)是存在于昆虫血淋巴中的一种转运脂肪的营养储藏类蛋白,其属于载脂蛋白家族,在脂肪体中合成,主要用于脂质的储藏和转运,在免疫反应、炎症的发生及抵抗外部细菌的侵染等方面也起着重要的作用。乙酰化修饰是一种重要的可逆蛋白翻译后修饰,可以调控蛋白与DNA的互作、基因转录、应激反应、新陈代谢和蛋白稳定性等,与糖尿病、癌症和心血管病等多种重大疾病有关联。前期研究发现,家蚕血淋巴中包括ApoLp-Ⅲ(BmApoLp-Ⅲ)的多种营养储藏类蛋白存在大量乙酰化修饰位点,其中乙酰化修饰可以调控其中的SP2和30K-3蛋白的稳定性。基于前期研究,本课题同样开展乙酰化修饰调控家蚕BmApoLp-Ⅲ稳定性的功能研究,为进一步深入研究乙酰化调控家蚕营养储藏和利用的机制打下基础。
  首先利用RT-PCR的方法从家蚕卵巢细胞总RNA中获得了BmApoLp-Ⅲ基因的编码区片段(ORF),将其克隆至改造后的真核表达载体pIEX-1-si-GFP中,获得了重组真核表达载体pIEX-1-si-GFP-ApoLp-Ⅲ。转染家蚕BmN细胞,成功表达出HIS融合的BmApoLp-Ⅲ重组蛋白。利用HIS单抗免疫共沉淀获得纯化的BmApoLp-Ⅲ蛋白,乙酰化单抗进行Western blotting检测,结果表明BmApoLp-Ⅲ存在高度的乙酰化修饰,和前期质谱鉴定结果一致。其次,采用去乙酰化酶抑制剂LBH589和乙酰化酶抑制剂C646分别上调和下调蛋白的乙酰化水平,结果显示,LBH589和C646处理后,BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达量分别呈现为上调和下调的趋势,并且在转录水平上并无影响,这一结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平影响BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达和细胞含量。利用CHX和MG132处理细胞,研究乙酰化修饰对蛋白的降解和积累的影响,结果表明,CHX阻断蛋白合成途径后,与对照组相比,乙酰化水平上调可以明显减缓BmApoLp-Ⅲ蛋白的降解,反之,MG132阻断蛋白降解途径后,乙酰化水平的上调可进一步提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的细胞含量,上述结果表明乙酰化水平的上调可以提高BmApoLp-Ⅲ的稳定性。最后开展BmApoLp-Ⅲ蛋白乙酰化与泛素化竞争实验,结果表明,当BmApoLp-Ⅲ乙酰化水平提高后,其泛素化水平降低,反之亦然,乙酰化和泛素化水平呈负相关结果,推测BmApoLp-Ⅲ的乙酰化与泛素化存在竞争关系。综合上述结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平上调BmApoLp-Ⅲ的蛋白表达和稳定性,其分子机制可能是通过竞争其泛素化修饰,阻滞泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高蛋白的稳定性和细胞含量。上述结果有望发现家蚕中一种新的调控载脂蛋白稳定性和水解的新机制。
  另外,利用H2O2诱导BmN细胞凋亡,证实BmApoLp-Ⅲ蛋白具有剂量依赖的抗细胞调亡能力,同时LBH589处理细胞后可以进一步显著提高细胞的成活率,而C646却使细胞的成活率显著下降,表明乙酰化修饰可以提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞调亡能力。综合前面的研究结果,推测其机制可能是乙酰化水平的上调提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的稳定性和细胞内该蛋白的含量,从而提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞凋亡能力。
[硕士论文] Jauharotus Shobahah
Biochemistry and Molecular Biology 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:Bombyx mori has become an important model organism for many fundamental studies.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)is a significant pathogen to Bombyx mori,yet also an efficient vector for recombinant protein production.A previous study indicated that acetylation plays many vital roles in several cellular processes of Bombyx mori while global phosphorylation pattern upon BmNPV infection remains elusive.Employing tandem mass tag(TMT)labeling and phosphorylation affinity enrichment followed by high-resolution LC-MS/MS analysis and intensive bioinformatics analysis,the quantitative phosphoproteome in Bombyx mori cells infected by BmNPV at24hpi with an MOI of 10was extensively examined.Totally,6480phosphorylation sites in2112protein groups were identified,among which4764sites in1717proteins were quantified.Among the quantified proteins,81up-regulated and 25down-regulated sites were identified with significant criteria(the quantitative ratio above1.3was considered as up-regulation and below0.77was considered as down-regulation)and with significant p-value(p<0.05).Some proteins of BmNPV were also hyperphosphorylated during infection,such as P6.9,39K,LEF-6,Ac58-1ike protein,Ac82-1ike protein and BRO-D.The phosphorylated proteins were primary involved in several specific functions,out of which,we focused on the binding activity,protein synthesis,viral replication and apoptosis through kinase activity.
  During infection,BmNPV39K has4phosphorylated sites which one of them has a great phosphorylation ratio(16.683).Interestingly,the homolog of39k,AcMNPV orf36also called pp31has been reported to be phosphorylated as well.On this basis,we then aimed to further investigate the function of phosphorylation on BmNPV39K in the viral replication and transcription.In order to investigate the biological function of phosphorylation in BmNPV39K,we constructed the mutant of the highest phosphorylated site of39K(136th amino acid)to be the positive and negative mutant.We then inserted these two mutants and wild type39K to the knocked out39K Bacmid by Lambda-red mediated repair gene technique.These three kinds of repaired Bacmid along with wild type and knocked out bacmid were then transfected to BmN cells and further investigated by qPCR analysis.
  The result of qPCR showed that the BmNPV39K phosphorylation does not have significant effect on the viral replication.The viral transcriptional level investigation by qPCR showed that each type of viral gene;early gene(lef-3),late gene(vp39),and very late gene(p10)transcription were likely to be lessened in the cells that were transfeeted with39K positive mutant repaired Bacmid and vice versa in the cells transfected with39K negative mutant repaired Bacmid.The positive mutation that was done to mimic the phosphorylation could reduce the viral transcription while the negative mutation to induce de-phosphorylation has ability to elevate it suggesting that phosphorylation on BmNPV39K tends to alleviate the viral transcription in each phase.
  In conclusion,BmNPV39K is an early gene in which the phosphorylation of this protein will not be an essential mechanism for DNA viral replication.Interestingly,the phosphorylation of BmNPV39K apparently plays an important role in the viral transcription.However,from this result we could yield an assumption that BmNPV39K phosphorylation which diminishes the viral transcription is a mechanism required by the virus to prolong the life of cells in order to harness the cellular material for the production of their viral progeny.Moreover,there is also a possibility that BmNPV39K phosphorylation is an important pathway regulated by the cellular enzyme to protect themselves from the onset of virus.This study will lay the groundwork for further investigation in the function of BmNPV39K phosphorylation on the viral genome replication and transcription.
[博士论文] 张健家
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,其基因组大小为80-180kb,在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个显著特征是病毒生活史中产生两种不同的病毒粒子形态:一种为包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV),在病毒经口感染过程中,ODV在宿主中肠强碱性环境下从包涵体内释放,感染中肠上皮细胞实现原发感染;另一种为出芽型病毒粒子(budded virus,BV),主要介导细胞与细胞之间的感染。两种类型病毒粒子都由多种结构蛋白组成,其中BV囊膜的结构较ODV简单,病毒结构蛋白通过相互之间的作用共同形成完整的病毒粒子,并且这些相互作用还具有除结构支撑以外的其他功能。本研究以家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)为研究对象,利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术对其BV病毒结构蛋白间的相互作用进行了分析和验证。为进一步探讨病毒囊膜与核衣壳等结构在病毒入侵细胞过程中的作用,构建了能够同时标记BV病毒囊膜和衣壳的重组双荧光病毒。利用序列截短突变的方式对BV最重要的囊膜融合蛋白GP64与相关蛋白间的互作进行了深入分析,阐明了其参与互作的关键结构域。主要结论如下:
  1、探明了BV病毒粒子结构蛋白间的相互作用网络
  通过对27个主要BV结构蛋白进行酵母双杂交一对一筛选,发现了57对蛋白相互作用,其中6对为自相互作用。进一步用免疫共沉淀技术验证了其中的10对相互作用。根据迄今为止关于杆状病毒蛋白互作的研究,发现VP39、FP和38K是杆状病毒蛋白互作网络中参与蛋白互作最多的三个关键蛋白,由此推测它们可能是病毒结构的主要骨架;还发现每种囊膜蛋白都与至少一个衣壳蛋白发生互作。根据这些蛋白互作信息,最终确立了5组BV结构蛋白间的互作网络。这些结果对于深入理解杆状病毒的结构具有重要参考意义。
  2、成功构建了同时标记病毒囊膜和衣壳的双荧光重组病毒
  为进一步探究BV结构蛋白中病毒囊膜和衣壳蛋白间的互作以期揭示病毒囊膜及衣壳这两个结构在病毒感染细胞过程中的作用,构建了能够同时标记病毒囊膜及衣壳的双荧光病毒。利用“λ-red同源重组系统”将BmNPV病毒本身的vp39和gp64基因双敲除,并在此基础上利用该重组系统将融合有3个红色荧光mCherry膜,这与GP64和VP39的共定位相似,暗示GP64可能参与将PKIP转运入细胞核。
[硕士论文] 廖金旭
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕是一种经济价值很高的鳞翅类昆虫,养蚕业是世界上发展中国家农业经济的主要来源。但是,由家蚕核型多角体病毒(BmNPV:Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)引发的蚕脓病严重危害养蚕业,该病传染性强、难以控制,全球由BmNPV引起的蚕茧损失占总损失的50%以上,需迫切寻找新的有效的抗BmNPV病毒的药物以控制蚕浓病。家蚕胸腺素(BmTHY:Bombyx mori Thymosin superfamily protein)是一种重要的免疫因子,前期研究发现BmTHY分布于家蚕细胞的细胞质和细胞核,在5龄幼虫多个组织都有表达,且在家蚕的不同发育阶段存在差异表达,体外实验证明其为胸腺素THY超家族蛋白之一,而且是actin-sequestering(肌动蛋白螯合)蛋白,说明BmTHY参与家蚕细胞基本的生命活动,具有多种生理功能。还发现BmNPV病毒感染BmN细胞及5龄幼虫时,BmTHY可以提高细胞及幼虫的存活率,具有一定的抗病毒作用,但其对病毒侵染及增殖影响的具体环节和内在机制不清楚。
  本课题先构建了BmTHY的过表达和抑制表达体系,以研究过表达和抑制表达BmTHY后对BmNPV增值和复制的影响。首先,用野生型病毒分别感染过表达和抑制表达BmTHY的BmN细胞,感染48h后,取细胞上清,用TCID50终端稀释法分析各组细胞的病毒滴度,结果显示:随着感染时间的延长,过表达BmTHY组的滴度值明显比对照组滴度值低:在感染168h,过表达BmTHY组的滴度值是对照组滴度值的42%;但是,抑制表达BmTHY组的滴度值明显比对照组滴度值高:在感染168h抑制表达BmTHY组的滴度值是对照组滴度值的2.37倍。结果说明过表达BmTHY对BmNPV病毒的增殖起到了抑制作用。
  其次,在过表达和抑制表达BmTHY48h后,用BmNPV-RFP感染各组细胞,在感染48h后,荧光显微镜下观察,相对于对照组细胞,过表达组发红色荧光明显减少,而抑制表达组发红色荧光明显增多。qRT-PCR分析结果表明:过表达BmTHY时gp41的基因拷贝数降低,而在抑制BmTHY表达时则升高。这些结果进一步说明了在BmN细胞内,BmTHY可以抑制BmNPV的复制和病毒蛋白的表达。
  最后,为了更进一步探究BmTHY的抗病毒机制,通过提取BmN细胞总蛋白,以BmTHY抗体为诱饵,IgG兔抗为对照,采用免疫共沉淀的方法,即内源性Co-IP(Co-immunoprecipitation)证明:在细胞内BmTHY蛋白与actin蛋白有相互作用。这个结果证明了BmTHY与actin的互作可能影响细胞骨架,是BmTHY抗病毒的机制之一。由于BmNPV杆状病毒侵染宿主细胞时,其病毒粒子的复制需要借助于微管蛋白。随后用BmNPV分别感染过/抑制表达BmTHY的BmN细胞后,采用不同缓冲溶液分别提取F-actin(Fibrous actin)和G-actin(Globular actin)蛋白,然后各取等量蛋白Western blotting分析检测过/抑制表达BmTHY的BmN细胞中F-actin和G-actin蛋白量的变化情况,分析各组F/G-actin比值。结果表明:相对于对照组,过表达组F-actin/G-actin升高了20.4%。相反,与对照组相比,抑制表达组的F-actin/G-actin降低了39.8%。上述实验结果表明:在BmNPV侵染BmN细胞时,BmTHY对actin的聚合产生影响,进而影响微管蛋白的结构和功能,从而进一步影响BmNPV侵染能力。
  综上所述,BmTHY是家蚕重要的免疫因子,能够抑制BmNPV病毒的增殖和复制,并且是通过与actin的互作抑制病毒的增殖和复制。
[硕士论文] 呼思瑞
养殖 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:家蚕微粒子病是蚕业生产中具有毁灭性的传染病,其发生流行严重威胁蚕种的安全生产。科学合理的微粒子病检疫方法,可切断造成该病胚种传染的途径,有效提高蚕种生产经济效益。因此,如何优化和发展检疫相关技术对养蚕业具有重要意义。本文以家蚕一代杂交种中散卵为研究对象,以蚕种均匀性评价为切入点,对成品卵家蚕微粒子病检验技术进行初步研究并取得一定进展。
  本文对浙江省内家蚕一代杂交种的生产过程和整理流程(冷藏浸酸种和越年种)进行实地调查,发现装盒蚕种存在品质不均匀的问题,提出在蚕种原有整理流程上额外增加混匀操作,并将混匀操作后的蚕种(混匀批)与原有整理流程的蚕种(常规批)的良卵率、克卵粒数和微粒子病检出率进行比较研究。
  研究结果显示:混匀操作后,试验调查的23批蚕种中有22批蚕种各样本间的良卵率未见显著差异;克卵粒数指标下的混匀批的蚕种均匀性较之常规批蚕种可得到明显提高,但发现克卵粒数的均匀性与蚕种的并批方式等有关。另外,构建了基于磨碎管的催青方法,蚕种孵化率达98%以上;对磨碎方法进行了初步的探索,发现珠式磨碎法对蚕种数量少于1000粒的样本具有良好的破碎效果;在已有技术基础上,对不同蚕卵数量样本和蚕卵不同发育阶段的14批次蚕种84个样本的散卵进行调查,发现蚕种孵化后绝食5~7日微孢子虫检出率较高,同时样本蚕卵数量在600粒~1000粒时有利于微孢子虫的检出,其稳定性有待进一步试验研究补充验证。
[硕士论文] 刘云财
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:高温胁迫是影响昆虫生长和分布的最主要的非生物胁迫之一。桑螟,(Glyphodes pyloalis Walker)螟蛾科(Pyralidae)昆虫,广泛分布于广东、广西、浙江、江苏、云南、四川等蚕业养殖大省,因其对环境适应性强、世代多、繁殖率高的特点,是蚕丝业生产上最为严重的经济害虫之一。本论文运用行为学、转录组学、分子生物学、微生物多样性分析等方法,研究了高温环境下桑螟的躲避行为、高温胁迫后虫体耐热物质代谢变化、耐热相关关键基因的变化以及桑螟肠道的微生物变化等。目的是揭示桑螟适应夏季高温的机制,从而为其科学预警和防控提供理论参考。主要结果如下:
  (1)为了明确桑螟在高温逆境下的生存状况,以桑螟为对象,研究了其在寄主植物桑树上栖息、爬行和取食时的躲避临界高温。将桑螟放在人工气候箱中并经过梯度温度处理(22-37℃),结果显示,在高温环境下桑螟将桑叶折叠的角度减小并且温度越高桑螟将桑叶折叠的时间越短,观察桑螟在桑叶上所处的位置,结果显示在一定温度范围内(20-38℃)桑螟一直处于较高位置的桑叶上,当温度超过38℃时,桑螟会出现在较低位置的叶片上。
  (2)为了研究桑螟应对高温胁迫的分子机制,分别对25℃和40℃处理4h后的桑螟后进行转录组测序分析,拼接共得到34034个基因,其中,在热处理后,1275个基因表达量上调,1222个基因表达量下调。通过表达分析,找到了一些可能参与或介导桑螟耐高温胁迫相关生物途径的主要基因。比如热激蛋白和代谢相关基因,同时,维他命消化吸收通路和14个细胞色素P450相关基因等可能参与桑螟的耐热机制,而免疫和磷脂酰肌醇相关通路也可能与其耐热性有紧密的联系。
  (3)为了从分子水平上探明高温胁迫对抗高温伤害的机制,在从转录组获得桑螟ecCu/ZnSOD核苷酸序列的基础上,克隆了桑螟ecCu/ZnSOD基因,该序列cDNA长725bp序列,编码241个氨基酸。表达模式分析发现,桑螟ecCu/ZnSOD在高温及低温条件下表达量高,属于极端温度表达基因。在大肠艾希菌中表达并纯化了桑螟ecCu/ZnSOD重组蛋白,酶学性质分析表明桑螟ecCu/ZnSOD在40℃时活性最高,采用牛津杯法,研究桑螟ecCu/ZnSOD的抗氧化能力,结果显示表达桑螟ecCu/ZnSOD的大肠艾希菌抗氧化能力显著增强。
  (4)为了从肠道微生物分析桑螟耐高温的原因,通过采用16SrDNA高通量测序技术,对桑螟在不同温度下的细菌群落结构、丰度及演替规律进行深入研究。结果表明:在细菌群落结构的门水平上,变形菌门、放线菌门、绿细菌门是优势种群。在属水平上,正常温度(25℃)条件下,节细菌属、多形杆状菌、沃尔巴克氏菌为主要的优势菌属,其中沃尔巴克氏菌占最大的比例,最高达51.15%;在高温(37℃)条件下,普雷沃菌属迅速增加,成为桑螟肠道内第二大优势菌属。
[硕士论文] 苏航
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:桑螟(Glyphodes pyloalis Walker)目前已成为桑园最主要的害虫之一,桑螟大暴发会给桑园造成严重的灾难,给桑农带来巨大的经济损失。由于近年来桑园对杀虫剂严重的依赖性,桑螟对化学农药的抗性发展十分迅速,应引起我们的足够重视。与其他著名害虫如小菜蛾(Plutella xylostella)等相比,关于桑螟杀虫剂抗性相关的研究十分匮乏。代谢抗性是杀虫剂抗性中最主要的分子机制之一,三大解毒酶家族:细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶在昆虫对外来有毒物质代谢过程中起非常重要的作用。本研究中我们以桑螟为主要研究对象,通过比较转录组分析,筛选了抗性相关基因,并对其进化关系进行了系统研究。本论文的主要内容包括以下几个部分:
  1、本研究在Illumina4000平台上对敏感品系桑螟和抗性品系桑螟的中肠进行了转录组测序,最终分别获得27703和27684个Unigene,共获得32229个Unigene。通过差异基因分析,我们获得1740个差异基因,其中643个上调,1097个下调。基因功能注释结果显示261个差异基因显著注释到56个GO terms中。KEGG代谢通路分析结果表明含差异基因数最多的pathway是代谢通路(metabolic pathways)。
  2、在桑螟中肠中鉴定了杀虫剂抗性有关的Unigene,包括33个细胞色素P450,27个谷胱甘肽S-转移酶基因,23个羧酸酯酶基因,1个乙酰胆碱酯酶基因,2个钠离子通道基因和5个鱼尼丁受体基因。对差异基因的筛选,得到19个差异表达的解毒酶基因,其中有9个P450(6个上调,3个下调),5个GST(2个上调,3个下调),5个CCE(3个上调,2个下调)。对差异基因进行定量PCR验证,结果与转录组数据一致。定量分析结果显示4种代谢酶基因在残杀威诱导后显著上调,而CYP324A19基因在辛硫磷诱导后表达极显著上调。此外我们在3个P450基因中发现21个SNP,只有CYP9A20基因的SNP导致了4个氨基酸的替换。
  3、鉴定并比较了两种桑螟细胞色素P450基因:CYP324A19和CYP9A20,通过生物信息学分析和表达分析比较了两者的差异。发现CYP324A19基因可能通过上调参与桑螟抗药性。
  4、初步构建了CYP9A20-pFastbac真核表达载体,并在转染Sf9细胞中得到了重组CYP9A20蛋白。为进一步研究该基因体外表达和蛋白的酶学特性等功能提供基础。
[硕士论文] 黄扬玉
农业推广 广西大学 2017(学位年度)
摘要:种桑养蚕是中华民族的一项伟大发明,至今已有5000多年的历史。中国仍然是当今世界上最大蚕丝生产国,广西更是我国乃至世界亚热带蚕丝产业最大生产基地,时至2015年桑蚕茧和生丝产品的产量分别占全国总量的50.6%和33%。蚕种是蚕业生产的最重要物质基础,蚕种繁育是蚕业生产一项重要的工作。桑蚕现行繁育制度是原原蚕、原蚕和普种蚕的三级饲养以及原原母种、原原种、原种和普通种的四级制种技术。本文通过对以广西为代表的亚热带蚕区的现行当家桑蚕品种“两广二号”和“桂蚕2号”的母种、原原种、原种等桑蚕品种的长年繁育与研究观察,并通过3种不同催青方法进行催青以及不同温度种茧保护、蚕蛹与雌蛾冷藏冷藏调节发蛾的制种技术试验,得出以下结论。
  1.首次系统总结并描述亚热带桑蚕当家品种“两广二号”和“桂蚕2号”的母种、原原种的“932”、“7532”、“湘晖”、“芙蓉”、“8810”和“8711”及其原种的品种特性及繁育技术。
  2.明确了含有多化性血统的桑蚕品种更适用于两段催青法。尤其是“932”、“7532”母种和原原种采用两段催青法,利用偏高的催青温度与长光照等条件就更能保持品种原有特征特性,否则在制种时容易产生不越年卵和不良卵。
  3.在对交品种发蛾调节的蚕蛹冷藏与雌蛾冷藏的试验结果表明,所有供试桑蚕品种均表现出蚕蛹比蚕蛾更适合冷藏,尤其是“932”品种的母蛾对低温更为敏感,在生产上对交品种的发蛾调节时应尽量避免雌蛾冷藏,否则所生产蚕种往往容易出现叠卵多、产附不整齐,产卵量减少等现象发生。
  4.亚热带桑蚕原种繁育中微粒子病的防控尤其重要,在严格原蚕饲养和制种环节的消毒防病技术、防止野外昆虫交叉感染措施外,原蚕饲养中桑叶全程浸泡消毒技术及蚕沙无害化处理技术对微粒子病的防治起到十分明显的效果,但在多雨等潮湿季节要谨慎使用。
[博士论文] 张强
遗传学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:家蚕的卵子发生是一个复杂的生理过程,通常可以分为卵黄生成前期、卵黄生成期和卵壳生成期。卵泡作为卵子发生的主要功能单位,在卵子发生过程中发生了巨大的形态与生理变化。尽管在家蚕卵子发生的结构和激素调控方面已经进行了一些研究,但在全基因组层面对家蚕卵子发生过程中基因表达调控模式及机制的研究还未见报道。
  本文应用时间序列转录组以及MeRIP-seq的方法分析了家蚕卵子发生在转录水平以及转录后水平的基因调控机制,得到的主要结果如下:
  ①家蚕的卵子发生过程涉及了生殖细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖等众多细胞活动,在卵子发生早期和后期存在明显的蜕皮激素滴度变化。通过相邻时间点基因表达差异比较分析,共鉴定得到1932个差异表达基因,其中主要的差异变化出现在卵黄生成后期向卵壳生成期早期的发育转变过程中,主要富集在生殖、细胞分化、形态发生以及跨膜转运等功能分类。通过权重共表达网络分析,共鉴定得到6个主要的时期特异表达基因模块,对应了大部分的卵子发生发育时期。对每个模块进行功能富集及通路富集分析表明,在免疫、自噬调节、细胞通讯、信号转导以及背腹轴形成、不饱和脂肪酸合成代谢、蜕皮激素合成代谢等通路富集。进一步对蜕皮激素合成与代谢相关基因分析表明,蜕皮激素关键合成基因CYP314A1主要在卵黄生成前期和卵黄生成早期表达,而蜕皮激素代谢基因CYP18A1主要在卵黄生成后期表达,两者的动态变化是卵子发生过程中蜕皮激素动态变化的主要原因。此外,注射胰岛素信号通路抑制剂实验,初步证实了胰岛素可能是卵子发生的必要因素。
  ②尽管家蚕与果蝇分属不同的昆虫目,但都是多滋养型卵巢的主要代表。通过对两种昆虫的共表达网络比较,共鉴定得到4个一致性网络,涉及了蜕皮激素合成、信号调控以及RNA修饰相关的关键基因,为多滋养型卵巢发育的分子调控机制研究提供了新的依据。
  ③本研究共鉴定了9种类型的可变剪接形式,剪接供受体位点改变和外显子改变是造成可变剪接的主要原因。研究发现组蛋白和RNA修饰基因在家蚕的卵子发生过程中表现出类似分子开关的作用,通过MeRIP-seq分析在卵黄生成期与卵壳生成期转变前后的RNA修饰的动态变化,研究表明,m6A修饰位点主要分布在基因组编码区域(约85%),且主要集中在5'UTR、CDS和3'UTR区域,5'UTR区较多。在卵子发生早期和后期,m6A修饰位点存在较为明显的差异,修饰基因涉及的功能也各异,但在Hippo、Wnt以及Notch等信号通路均有明显的富集,表明这些通路可能是m6 A修饰的主要靶通路。此外,研究还在多个不同类型的转座子转录本中找到了m6 A修饰的证据,表明这些类型的转座子在卵子发育中活跃转录,并且m6 A修饰可能是转座子转座所必须的。本研究进一步加深了对家蚕卵子发生RNA转录后调控的认识。
  上述的结果表明家蚕卵子发生过程中存在复杂的转录水平和转录后水平调控,发育中的卵泡是研究昆虫卵子发生分子机制的优秀模型,有利于我们更好地理解昆虫配子发生及生殖的分子机制。
[硕士论文] 郑煜
发育生物学 江苏科技大学 2017(学位年度)
摘要:桑螟是桑树的主要虫害,每年都给桑蚕业的发展带来巨大损失。作为目前防治桑螟的主要手段,化学防治引起的环境污染、桑螟抗药性等问题日益凸显,而且化学农药的施用极易对家蚕造成药害。因此,急需找到一种绿色防治手段。混腔室茧蜂是桑螟的优势寄生蜂,幼虫发育期具有特殊的啮后继续取食寄主的寄生模式。通过的选择性和非选择性实验,测定混腔室茧蜂对不同龄期桑螟的寄生率,确定对桑螟的最适寄生龄期。通过动态追踪寄生蜂幼虫的啮后取食行为,对这一特殊的寄生方式进行定量描述。通过测定桑螟被寄生前后血淋巴中糖类、蛋白质和体重变化,研究寄生对桑螟生长发育的影响。通过对桑螟被寄生前后转录组分析,确定其被寄生后相关免疫基因的表达差异。
  桑螟龄期对混腔室茧蜂性比及发育时间有显著影响,对寄生蜂子代后足胫节大小无影响,对低龄寄主对寄生后出茧数无显著影响。通过寄主桑螟龄期非选择性实验,统计啮出的寄生蜂茧数量,2龄、3龄、4龄桑螟寄生后出茧率均在60%以上,出茧数均显著大于5龄桑螟出茧数。不同龄期寄主被寄生后,由3龄寄主啮出的茧重最大35.5 mg±5.8 mg,寄生4龄寄主的子代蜂发育时间最短,分别为11.2 d±2.05,比寄生2龄和3龄寄主获得的子代蜂发育时间比4龄和5龄寄主长较长,分别为13.9d±3.11d和12.4d±2.02d;寄生各龄期桑螟获得的子代蜂后足胫节大小均无显著差异;寄生2龄和3龄寄主获得的子代蜂性比明显偏向雌性。
  未完成取食的处理一不利于混腔室茧蜂结茧、茧重、寿命。完成取食并提供人工蛹室的处理二和对照组处理三均完成取食后结茧率为100%和95%,未取食的寄生蜂结茧数为80%,处理组二和处理三分别是处理一的1.25倍和1.125倍;处理组二为32.0 mg±9.59 mg,对照组结茧重为31.0 mg±5.2 mg,前两者显著重于处理一茧重(15.7 mg±3.89 mg),完成取食的两组处理寄生蜂茧重分别是未完成取食的2.04倍和1.97倍;处理二和处理三寄生蜂寿命分别比处理一寄生蜂寿命提高了4天和2.8天,因此,混腔室茧蜂幼虫啮后寄主后的继续取食行为对其成功发育至关重要。
  具有啮后取食行为的混腔室茧蜂寄生桑螟后对后者血淋巴中营养物质含量及体重影响不显著。混腔室茧蜂寄生桑螟后,寄主血淋巴中的总糖、海藻糖及蛋白质含量均无显著变化。混腔室茧蜂对桑螟生长发育无显著影响。
  混腔室茧蜂寄生桑螟后,引起寄主免疫相关基因及调控生长发育基因表达的改变。通过桑螟转录组分析,基因功能注释,鉴定出寄生引起的调控桑螟生长发育免疫的相关基因190个;寄生和未寄生寄主的转录本比较,结果统计出总的表达差异性基因有2327个,其中上调基因有1771个,下调基因有556个;这些基因主要参与细胞组分、分子功能和生理过程。寄生对寄主生理反应相关基因具有显著影响。
  本研究结果对揭示混腔室茧蜂基础寄生规律和生物学特性具有重要意义,能够丰富和完善经典的寄生蜂寄主选择和发育的模型或假说。同时也能为充分发挥混腔室茧蜂生物防治桑螟的控害潜能、构建桑叶害虫绿色防控体系提供重要的参考和依据。
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