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[硕士论文] 郭文韬
中医骨伤科学 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题组在前期行体外实验证实了片仔癀可以通过抑制骨肉瘤细胞中ABCB1、ABCG2的表达,有效抑制骨肉瘤的生长并逆转其耐药性的基础上,通过体内实验进一步探讨片仔癀对人骨肉瘤CSCs裸鼠移植瘤的作用及对ABCB1、ABCG2蛋白表达的影响。
  方法:
  1、人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤模型的建立
  对数期MG63/ADM细胞胰酶消化制成单细胞悬液,采用无血清培养基悬浮培养的方式,连续传代3次,富集MG63/ADM细胞中的肿瘤干细胞。48只裸鼠皮下接种肿瘤干细胞建立人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤模型。依照随机数字表法将其分为对照组、阿霉素组、片仔癀组、片仔癀与阿霉素联合组。
  2、测量瘤体体积及称重,计算肿瘤体积及重量抑制率
  末次给药24h后颈椎脱臼处死裸鼠,剥离裸鼠皮下瘤体,测量瘤体体积及称重,计算肿瘤体积、重量抑制率。
  3、HE观察瘤体病理情况
  使用HE染色,在光镜下观察各组瘤体病理情况。
  4、免疫组织组化学法(SP法)及western blot检测瘤体内ABCB1、ABCG2的表达。
  采用免疫组织化学法检测不同组间瘤体中ABCB1、ABCG2阳性积分光密度的表达情况;Western blot法检测不同组间瘤体中ABCB1、ABCG2蛋白的表达。
  结果:
  1、片仔癀对骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤体积及重量的影响:与对照组比较各用药组瘤体体积及重量均有减少(P<0.05),与阿霉素组比较,片仔癀组肿瘤体积抑制率及重量抑制率高(P<0.05),与片仔癀组比较,联合组瘤体体积抑制率及重量抑制率明显增高(P<0.01)。
  2、HE下观察片仔癀对骨肉瘤细胞的影响:HE染色后,在光镜下可见对照组中细胞形态各异,核仁大小不同,存在异形巨核,细胞核浓染,可见处于分裂期的骨肉瘤细胞;片仔癀组肿瘤细胞大小和形状相似,可见少量骨肉瘤细胞凋亡,出现细胞核分解现象;阿霉素组中拥有较多的异形细胞,可见被破坏的组织;联用组中细胞形态较小,可见组织坏死,细胞异型性少,部分核缩小、凝聚,染色质紧贴细胞核,胞浆浓缩色深。
  3、免疫组化检测片仔癀对裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表达的影响:对照组中阳性目标积分光密度大量表达,阿霉素组中阳性目标积分光密度也表达较多,片仔癀组表达较少,联合组最低;阿霉素组中阳性目标积分光密度与对照组比较差异无统计学意义;片仔癀组、联合组与对照组比较,阳性目标积分光密度明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),联合组阳性目标积分光密度最低,与片仔癀组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
  4、Western blot检测片仔癀对裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表达的影响:Western blot结果表明,与对照组比较,阿霉素组ABCB1、ABCG2蛋白表达无显著性差异;片仔癀组和联合组的ABCB1、ABCG2蛋白表达降低,与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。
  结论:
  片仔癀可明显抑制人骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤的生长,且能够逆转阿霉素耐药作用,其作用机制与抑制膜转运蛋白ABCB1、ABCG2的表达相关。
[博士论文] 姜哲
病理学与病理生理学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年,恶性程度甚高的原发性骨肿瘤。该肿瘤易在早期出现远处肺转移,病死率较高,预后极差。探索骨肉瘤的具体发病机制以及新的诊治策略是改善其预后的重要途径。MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物内源性非编码微小RNA,与靶基因mRNA的3'非编码区(3'UTR)的“种子序列”配对结合,从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译。已有文献报道,miRNAs表达失调在骨肉瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程中具有重要作用,本研究旨在探讨miR-208b在骨肉瘤组织和细胞系中的表达及其对骨肉瘤细胞系增殖、侵袭和转移能力的影响。
  方法:首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分别检测miR-208b在骨肉瘤组织、正常骨组织、人正常成骨细胞系NHOst和2种骨肉瘤细胞系(U2OS和Saos-2)中的差异性表达情况,随后建立稳定表达miR-208b的骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2;分别通过CCK8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力;流式细胞术检测骨肉瘤细胞周期;裸鼠皮下成瘤实验在体内观察骨肉瘤细胞形成移植瘤生长能力;划痕愈合和Transwell侵袭实验检测骨肉瘤细胞运动迁移及侵袭能力的情况。进一步利用生物信息学分析预测miR-208b作用的靶基因,然后在骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2中通过荧光报告载体实验验证ROR2是否为miR-208b的直接靶基因;并利用qRT-PCR和蛋白印迹实验检测过表达miR-208b后,ROR2 mRNA和蛋白的表达水平变化。随后设计并合成ROR2-siRNA,并将ROR2-siRNA和siRNA control转染U2OS和Saos-2细胞,然后利用一系列功能实验检测沉默ROR2基因的表达对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响。最后,恢复实验中在骨肉瘤细胞分别转染mimics control、miR-208b mimics、miR-208b mimics+pcDNA3.0和miR-208b mimics+pcDNA3.0/ROR2,利用一系列功能实验检测骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。
  结果:
  1.体内外过表达miR-208b均抑制骨肉瘤细胞生长活性和增殖能力:qRT-PCR实验数据表明,骨肉瘤组织标本中miR-208b的相对表达水平显著低于正常骨组织;且miR-208b在骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2中的相对表达水平均明显低于人正常成骨细胞系NHOst,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2中,与对照组相比,过表达miR-208b后细胞的生长活性和克隆形成率均明显降低(均P<0.05)。构建裸鼠皮下骨肉瘤种植瘤模型,过表达miR-208b的骨肉瘤Saos-2细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的体积和重量均显著低于对照组。
  2.过表达miR-208抑制骨肉瘤细胞的细胞周期进程:流式细胞术检测结果显示在骨肉瘤细胞中,与mimics control组相比,转染miR-208b mimics的细胞G0/G1期所占比例明显增高,而S期所占比例明显降低。
  3.过表达miR-208b抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力:划痕愈合和Transwell侵袭实验结果表明,与mimics control组相比,转染miR-208b mimics的骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞的运动迁移率和侵袭能力均降低。
  4.miR-208b可以直接靶向结合ROR2 mRNA3' UTR:利用生物信息学技术在PicTar和miRanda数据库中,发现miR-208b可以和ROR2mRNA3' UTR的种子序列互补配对。通过荧光素酶报告载体实验检测可知,miR-208b能够识别构建到荧光素报告基因载体的ROR2 mRNA的3'UTR,抑制荧光素酶的活性(P<0.05);而对于突变的ROR2 mRNA的3' UTR则无显著差异性。
  5.miR-208b抑制ROR2的蛋白表达:与对照组相比,在骨肉瘤U2OS细胞和Saos-2细胞中转染miR-208b mimics后,ROR2 mRNA无明显变化,而其蛋白水平明显降低。
  6.沉默ROR2的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖:在骨肉瘤U2OS细胞和Saos-2细胞中,通过小RNA干扰技术使得ROR2蛋白表达水平明显降低。与对照组相比,ROR2-siRNA组骨肉瘤细胞的生长活性明显受到抑制,克隆形成率显著降低(均P<0.05)。
  7.沉默ROR2的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力:划痕愈合和Transwell侵袭实验结果表明,与siRNA control组相比,转染ROR2-siRNA的骨肉瘤U2OS细胞和Saos-2细胞的运动迁移率和侵袭能力均降低。
  8.miR-208b通过ROR2调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程:通过共转染miR-208b mimics和过表达ROR2的质粒pcDNA3/ROR2,western blotting检测证明在过表达miR-208b的基础上成功恢复ROR2的蛋白表达。与miR-208bmimics+pcDNA3.0组相比,miR-208b mimics+pcDNA3.0/ROR2组的骨肉瘤细胞的增殖活性明显升高,克隆形成率显著增高,细胞的运动迁移率明显增加,穿膜细胞数显著增多(均P<0.05),即miR-208b通过ROR2调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程。
  结论:
  1.MiR-208b在骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2中明显低表达,过表达miR-208b可以显著抑制骨肉瘤细胞的生长活性、增殖能力、侵袭及迁移能力,并在裸鼠体内抑制骨肉瘤移植瘤的生长。
  2.生物信息学分析预测并利用荧光报告载体实验验证ROR2是miR-208b的直接靶基因,并在转录后水平上受miR-208b的负调控。
  3.单独沉默ROR2的表达后,骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显受到抑制,这些实验结果与过表达miR-208b是一致的。
  4.在过表达miR-208b的基础上恢复ROR2的蛋白表达水平,骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显恢复。
  综上所述,miR-208b通过负调控ROR2抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。
[博士论文] 王新文
外科学(骨外) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  血管内皮细胞是形成肿瘤新生血管的重要组成部分,与肿瘤的发展及转移密切相关,因此本课题旨在探讨低氧条件下人骨肉瘤MNNG/HOS细胞是否可转分化为血管内皮样细胞,并进一步探讨其分子机制.
  方法:
  1.将人骨肉瘤MNNG/HOS细胞在各组不同条件下培养,观察其是否出现血管内皮细胞所具有典型的"铺路石"外观;应用3D培养技术,观测是否出现网状结构;应用RT-PCR技术,从mRNA水平检测内皮细胞所特有的标记物(CD31、CD34、vWF)的表达情况;采用细胞免疫荧光技术,从蛋白质水平检测CD31、CD34、vWF的表达情况.
  2.将人骨肉瘤MNNG/HOS细胞在各组不同条件下培养96小时后,接种于裸鼠皮下,构建裸鼠人骨肉瘤异种移植瘤模型,接种49天后,取下异种移值瘤并予抗人的CD31抗体进行免疫组织化学染色,检测其异种移植瘤血管内皮细胞是否有来源于人骨肉瘤MNNG/HOS细胞.
  3.将体外各组不同条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞株,应用流式细胞仪进行分析,检测能被CD133抗体染色的细胞的比例,应用qPCR技术检测干细胞基因Oct4和Nanog转录水平;接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力.
  4.应用mTOR通路抑制剂雷帕霉素100nmol/L,30分钟预处理人骨肉瘤MNNG/HOS细胞,然后低氧条件下培养,接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力;接种49天后,取下异种移值瘤予抗人的CD31抗体进行免疫组织化学染色,检测移植瘤血管内皮细胞是否有来源于人骨肉瘤MNNG/HOS细胞.并观察予雷帕霉素预处理的低氧条件下培养的MNNG/HOS细胞是否出现"铺路石"外观;应用3D培养技术,观测是否出现网状结构;应用细胞免疫荧光技术,从蛋白质水平检测CD31、CD34、vWF的表达情况;用流式细胞仪分析能被CD133抗体标记的细胞比例;应用qPCR技术检测干细胞基因Oct4和Nanog转录水平,以及HIF-α转录水平;应用Western blot技术检测HIF-α及mTOR信号通路中的mTOR、p-mTOR、P70S6K及p-P70S6K蛋白表达水平,探讨低氧诱导人骨肉瘤MNNG/HOS细胞转分化为血管内皮样细胞的分子机制.
  结果:
  1.预处理理组和低氧组可观察到血管内皮样细胞所具有典型的"铺路石"外观,三维培养可观测到网状结构形成,mRNA和蛋白质水平均可检测到CD31、CD34、vWF的表达;而常氧组和常氧对照组未能观察到"铺路石"外观及网状结构形成,mRNA和蛋白质水平均未能检测到CD31、CD34、vWF的表达.
  2.预处理理组和低氧组的异种移植瘤,免疫组织化学染色可见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞;常氧组和常氧对照组均未见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞.
  3.低氧组能被CD133抗体染色的细胞的比例较对照组显著增加(P<0.05);干细胞基因Oct4和Nanog转录水平较常氧对照组显著增加(P<0.05);异种移植瘤,体积和重量较对照组显著增大(P<0.05).
  4.雷帕霉素组的皮下异种移植瘤的体积和重量较低氧组均显著减小(P<0.05);未见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞;未能观察到"铺路石"外观,未见网状结构形成;蛋白质水平均未能检测到CD31、CD34、vWF的表达;HIF-α在mRNA转录水平较低氧组无显著差异(P>0.05),但蛋白表达水平显著降低(P<0.05);mTOR信号通路中mTOR及P70S6K蛋白的磷酸化水平较低氧组显著降低(P<0.05).
  结论:
  1.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞可转分化为血管内皮样细胞,并具有典型的"铺路石"外观和形成网状结构,mRNA和蛋白质水平均检测CD31、CD34、vWF的表达显著增加.
  2.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞接种于裸鼠体内可转分化为血管内皮样细胞;
  3.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞可去分化为肿瘤干细胞,其成瘤能力增强.
  4.HIF-1α可能通过mTOR信号通路,参与低氧条件下人骨肉瘤MNNG/HOS细胞转分化为血管内皮细样胞这一过程.
[硕士论文] 曹光庆
外科学(骨外科) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  脊膜瘤为椎管内最常见肿瘤之一,常见于中老年患者,多发于胸椎段。脊膜瘤起源于蛛网膜内皮细胞或者硬脊膜纤维细胞,生长较缓慢,早期常无明显症状。脊膜瘤的保守治疗效果差,尽早手术是治疗脊膜瘤的最佳选择。对肿瘤的分块切除已不符合肿瘤学对肿瘤切除的要求,术后存在较高复发率。脊髓背侧脊膜瘤由于位置浅在,肿瘤整块切除对于脊髓神经功能的影响较小,术后神经功能均恢复良好,且复发率低。脊髓腹侧脊膜瘤临床上并不少见,由于其位置深在,脊髓组织张力较高,手术切除步骤可能对脊髓功能造成影响,所以整块切除实施难度较大,在技术层面上整块切除的可行性有待探讨。
  目的:
  探讨椎管内硬膜下脊髓腹侧脊膜瘤整块切除手术的技术可行性及与脊髓背侧脊膜瘤患者进行临床疗效的对照研究。
  方法:
  通过回顾性分析于2012年4月至2016年12月内在山东省立医院脊柱外二科手术治疗且术后病理确诊为脊膜瘤的椎管内占位性病变患者,分析患者的临床表现、影像学表现以及手术前、末次随访时McCormick神经功能分级改善情况,评估脊髓腹侧肿瘤整块切除手术效果。SPSS22.0软件进行统计学分析,P<0.05表示有统计学意义。
  结果:
  本研究中术后病理显示为脊膜瘤的患者30例。男性患者3名(10.0%),女性患者27名(90.0%);平均年龄为61.9±13.1岁。肿瘤分布于颈椎段者6例(20.0%),胸椎段者23例(76.7%),1例(3.3%)肿瘤双发于胸腰段(T12/L1)及腰椎段(L2/3)。脊髓背侧肿瘤为14例(46.7%),脊髓腹侧为16例(53.3%),其中正腹方7例(23.3%),偏腹方为9例(30.0%)。术前McCormick脊髓功能Ⅰ级4例占13.3%(背侧2例,腹侧2例),Ⅱ级7例占23.3%(背侧4例,腹侧3例),Ⅲ级10例占33.3%(背侧4例,腹侧6例),Ⅳ级9例占30.0%(背侧4例,腹侧5例);术后末次随访时McCormick脊髓功能Ⅰ级14例占46.7%(背侧7例,腹侧7例),Ⅱ级11例占40.0%(背侧3例,腹侧8例),Ⅲ级5例占13.3%(背侧4例,腹侧1例),Ⅳ级0例占0.0%。所有硬膜下脊膜瘤患者行肿瘤整块切除,术后神经功能改善明显,P<0.05,有统计学意义。所有患者至末次随访时所行MRI检查均未发现复发迹象,平均随访时间15.6个月。
  结论:
  脊膜瘤为椎管内良性肿瘤之一,起病隐匿,需结合临床症状、体征及影像学表现争取达到早期诊断;手术彻底切除为首选方案,脊髓腹侧脊膜瘤通过对其手术切除理念和技术层面的深入研究,使整块切除成为可能;临床对照研究中,在术后脊髓神经功能恢复和降低复发率方面取得了和脊髓背侧脊膜瘤相似的疗效,为脊髓腹侧脊膜瘤整块切除技术提供了临床支撑。
[博士论文] 王军
外科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  研究姜黄素对骨肉瘤的作用规律,研究其作用的分子机制,并分析其作用是否为p53途径依赖性,对将来姜黄素的临床应用前景是非常重要的。
  本研究选择p53基因型不同的两种人骨肉瘤细胞系,即p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U2OS细胞系,通过研究不同浓度姜黄素对这两种细胞系的抑制作用,分析姜黄素对U2OS及MG-63的细胞增殖、细胞凋亡及侵袭作用的影响,研究姜黄素的抗骨肉瘤作用随其浓度及作用时间变化的规律,并研究其抗骨肉瘤作用的分子机制;研究这两种细胞系对姜黄素敏感性的差异,探讨姜黄素的抗骨肉瘤作用是否为p53依赖性。
  研究方法:
  第一部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系增殖、凋亡和侵袭的作用规律研究
  1.骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系购自中国科学院上海细胞库。
  2.MG-63细胞系分为4组,A组为空白对照组,加入PBS缓冲液;B组培养液中加入姜黄素,浓度调整为5μmol/L;C组培养液中加入姜黄素,浓度调整为10μmol/L;D组培养液中加入姜黄素,浓度调整为20μmol/L。
  3.细胞增殖能力检测。采用MTT法检测MG-63细胞的增殖能力。细胞增殖试验在96孔板中进行检测(1×104细胞/孔)。在加入不同浓度的姜黄素之后,MG-63细胞在5%二氧化碳,温度为37℃的环境中培养48小时或72小时。将10μl的5mg/ml的MTT溶液分别加入各孔中,继续在37℃的环境中将细胞培养4小时。向各孔中分别加入二甲基亚砜(DMSO),采用酶联免疫检测仪,在490nm波长处分别测量各孔的吸光值。
  第二部分:姜黄素诱导人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系凋亡的分子机制研究
  Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。MG-63细胞系各组分别加入浓度为0-20μmol/L的姜黄素,Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达。一抗分别针对Bcl-2,Bax,cleaved PARP,Caspase-3,和β-actin。12小时后收集处理后的细胞,用预冷的4℃的PBS缓冲液(pH7.4)洗两次,然后加入蛋白裂解液,置于冰上半小时。裂解产物于4℃下12000rpm离心,进行蛋白质浓度测定。SDS-PAGE电泳分离样品。分离后的蛋白被转移到PVDF膜。分别采用一抗和二抗处理。采用odyssey红外成像系统进行探测。
  第三部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系及p53野生型U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭影响的比较分析
  1.骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U2OS细胞系均购自中国科学院上海细胞库。
  2.U2OS细胞系分为4组,A组为空白对照组,加入PBS缓冲液;B组培养液中加入姜黄素,浓度为5μmol/L;C组培养液中加入姜黄素,浓度调整为10μmol/L;D组培养液中加入姜黄素,浓度调整为20μmol/L。MG-63细胞系分组同前。
  3.细胞增殖能力检测。采用MTT法检测MG-63细胞及U2OS细胞的增殖能力。细胞增殖试验在96孔板中进行检测(1×104细胞/孔)。在加入不同浓度的姜黄素之后,MG-63细胞及U2OS细胞在5%二氧化碳,温度为37℃的环境中培养48小时或72小时。将10μl的5mg/ml的MTT溶液分别加入各孔中,继续在37℃的环境中将细胞培养4小时。向各孔中分别加入二甲基亚砜(DMSO),采用酶联免疫检测仪,在490nm波长处分别测量各孔的吸光值。
  研究结果:
  第一部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系增殖、凋亡和侵袭的作用规律研究
  1.MTT法检测不同浓度姜黄素及不同作用时间对人骨肉瘤MG-63细胞系增殖的影响。
  为了探讨姜黄素对人骨肉瘤细胞系MG-63(p53缺失型)增殖的影响,MG-63细胞在不同姜黄素浓度下培养48h和72h。实验结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞的增殖受到明显抑制,其受到抑制的程度与姜黄素浓度呈现依赖关系。
  另外,本实验也研究了骨肉瘤细胞增殖与姜黄素作用时间的关系,结果显示姜黄素作用时间的长短对骨肉瘤细胞受抑制的程度也有明显的相关性。姜黄素作用72小时组,骨肉瘤细胞受抑制的程度显著高于48小时组,其差别有统计学意义。
  由上可见,在0-20μmol/L的范围内,姜黄素的浓度越高,作用的时间越长,骨肉瘤增殖受抑制的程度也越高。
  2.姜黄素能够增强人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡水平
  研究表明,姜黄素不仅能够抑制肿瘤细胞的增殖,而且能够促进肿瘤细胞的凋亡。为了验证姜黄素对骨肉瘤细胞系的促凋亡作用,将浓度为5,10,20μmol/L的姜黄素作用24h后,通过流式细胞术检测p53缺失型MG-63细胞系的凋亡水平。结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞的凋亡率明显增高,增高的程度与姜黄素的浓度呈正比。
  由上可见,在0-20μmol/L的范围内,姜黄素的浓度越高,MG-63细胞系的凋亡率越高。
  第二部分:姜黄素诱导入骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系凋亡的分子机制研究
  为了进一步探讨在p53缺失型MG-63细胞系中,姜黄素促进凋亡的具体分子机制,以Western Blot法检测MG-63细胞中抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax,以及caspase级联反应蛋白Caspase-3、cleaved PARP,在不同浓度的姜黄素作用之后的表达水平。检测发现,Bcl-2蛋白的表达量随着姜黄素浓度的增高而明显降低,呈剂量依赖性,Bax、Caspase-3、cleaved PARP等蛋白的表达量都随着姜黄素浓度的增高而逐渐增高,并呈剂量依赖性。同时,Bax/Bcl-2的比例随着姜黄素浓度的增高而显著增高。
  由上可见,姜黄素对骨肉瘤细胞多种促凋亡蛋白的表达具有上调作用,并对抗凋亡蛋白的表达具有抑制作用。姜黄素通过上调Bax/Bcl-2的比例并激活Caspase-3来促进骨肉瘤细胞的凋亡。这表明,姜黄素促进人骨肉瘤MG-63细胞系的凋亡作用的分子机制与线粒体通路有关。
  第三部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系及p53野生型U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭影响的比较分析
  1.MTT法检测不同浓度姜黄素对人骨肉瘤细胞MG-63和U2OS增殖的影响。
  为了探讨姜黄素对不同p53基因型骨肉瘤细胞系MG-63(P53缺失型)和U2OS(P53野生型)增殖的影响,MG-63、U2OS细胞在不同姜黄素浓度下培养48h和72h。实验结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63和U2OS细胞的增殖都受到明显抑制,其受到抑制的程度与姜黄素浓度都呈现依赖关系。
  另外,在这两种细胞系中,姜黄素作用72小时组,骨肉瘤细胞受抑制的程度都显著高于48小时组。
  p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U2OS细胞系对姜黄素更敏感,在作用时间相同,姜黄素浓度相同的情况下,MG-63细胞系和U2OS细胞系都受到明显的抑制,但是MG-63细胞系受抑制的程度更高。在20μmol/L的姜黄素作用72小时的情况下,MG-63受抑制的程度可达到80%左右。
  根据本实验,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U2OS细胞系对姜黄素更敏感,在相同情况下,其增殖受抑制的程度更高。
  这个结果表明,姜黄素抑制骨肉瘤细胞增殖的作用是p53非依赖性的。
  2.姜黄素能够增强骨肉瘤细胞MG-63和U2OS的凋亡水平
  为了验证姜黄素对骨肉瘤细胞系的促凋亡作用,将浓度为5,10,20μmol/L的姜黄素作用24h后,通过流式细胞术检测p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U2OS细胞系的凋亡水平。结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞和U2OS细胞的凋亡率都明显增高,增高的程度与姜黄素的浓度都呈正比。
  在姜黄素浓度相同的情况下,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U2OS细胞系凋亡率更高,尤其是在姜黄素20μmol/L的情况下,MG-63细胞系的凋亡率大约为84.21%,高于U2OS细胞系的42.81%。
  由上可见,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U2OS细胞系对姜黄素更敏感,相同姜黄素浓度情况下,MG-63细胞系的凋亡率更高。
  这个结果表明,姜黄素诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用是p53非依赖性的。
  3.不同浓度姜黄素对骨肉瘤细胞MG-63和U2OS侵袭能力的影响
  为了进一步验证姜黄素对骨肉瘤侵袭的抑制作用,采用Transwell细胞体外侵袭实验分别对姜黄素抑制MG-63和U2OS侵袭能力进行了研究。结果显示,随着姜黄素浓度的提高,MG-63细胞系与U2OS细胞系的侵袭能力都有了显著的下降。
  与细胞增殖和凋亡的情况类似,在肿瘤侵袭实验中,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U2OS细胞系对姜黄素更敏感。相同姜黄素浓度情况下,MG-63细胞侵袭能力下降的程度更多。
  这个结果表明,姜黄素对骨肉瘤细胞侵袭能力的抑制也是p53非依赖性的。
  研究结论:
  随着姜黄素浓度的升高,入骨肉瘤MG-63和U2OS细胞系的增殖受到明显的抑制,凋亡水平明显增高,侵袭能力逐渐降低;且在一定范围内,骨肉瘤细胞系受到抑制的程度与姜黄素的浓度及作用时间呈现依赖关系。
[博士论文] 韩明明
麻醉学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:内皮素-1(ET-1)是由二十一个氨基酸组成的多肽链,是人体内含量最多的三种内皮素之一。作为神经调质,其广泛表达于中枢神经系统,参与多种疼痛调节。其调节疼痛主要是通过活化内皮素A受体(ETAR)和内皮素B受体(ETBR)实现的,两者皆为其特异性G蛋白偶联受体。ET-1在疼痛调节中发挥重要作用,鞘内注射ET-1可减轻疼痛模型动物的疼痛。相同地,在炎性痛和神经病理性痛模型中,星形胶质细胞过表达ET-1小鼠表现出疼痛减轻,而神经元特异性ET-1敲除小鼠则显示出了相反的结果。在神经病理性痛中,ET-1、ETAR和ETBR表达上调,共同参与疼痛的调节。BCP具有神经病理性痛特征,而ET-1、ETAR和ETBR在BCP中的表达变化,尚不清楚。
  蛋白激酶B(Akt)是介导多种细胞增殖、存活和分化的信号传导通路,广泛表达于脊髓背角Ⅰ-Ⅳ层,调节伤害性刺激。其参与炎性痛和神经病理性痛引发的中枢敏化。除Akt外,细胞外调节激酶(ERK)信号通路在突触和神经元可塑性的调节中也发挥重要作用,它同样调节伤害性刺激诱发的外周和中枢敏化。脊髓Akt和ERK通路存在交叉和联系,共同参与神经病理性痛时机体的病理生理学和神经化学变化。在神经病理性痛中脊髓Akt和ERK表达上调,共同促进疼痛的发展。BCP具有神经病理性痛特征,而脊髓Akt和ERK通路在BCP中的作用,尚不清楚。
  尽管ET-1调节疼痛通过活化ETAR和ETBR实现,但主要是通过ETAR介导的。如当ET-1施加于暴露的坐骨神经外时,大鼠产生患侧后爪退缩,这种作用可被提前腹腔注射吗啡阻断或完全预防,注射ETA拮抗剂可逆转,但ETBR拮抗剂无效。在热痛模型中,中枢给予ET-1的镇痛作用可被ETAR拮抗剂阻断,而ETBR拮抗剂无效,表明ET-1在中枢神经系统的镇痛作用通过ETAR,而非ETBR介导。在脊髓损伤模型中,鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123可减轻神经病理性痛,而ETBR拮抗剂BQ-788无效,此结果表明,ET-1调节疼痛通过ETAR,并不通过ETBR。脊髓Akt和ERK表达上调参与神经病理性痛的而形成和维持,而抑制Akt和ERK或其上游蛋白的表达可减轻疼痛。鞘内注射ETAR受体拮抗剂BQ-123可下调神经病理性痛小鼠脊髓Akt和ERK表达而减轻疼痛。由于BCP具有神经病理性痛特征,鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响及机制,尚不清楚。
  本研究一方面旨在明确脊髓ET-1及其受体在BCP中变化,同时评价脊髓Akt和ERK通路在BCP成形和维持中的作用,为明确BCP机制,发现可能的治疗靶点提供依据;另一方面,通过评价鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响,明确了其减轻BCP的可能分子机制,可为临床BCP治疗方法的研究提供新方向。
  本研究分为两部分,第一部分:脊髓ET-1及其受体、Akt和ERK通路在BCP中的变化;第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻对小鼠BCP。
  目的:
  第一部分:小鼠BCP模型制备成功后,通过检测痛行为学、组织学、脊髓ET-1、ETAR和ETBR基因表达及蛋白表达,Akt和ERK通路蛋白表达,明确ET-1及其受体在BCP中的变化及脊髓Akt和ERK通路在BCP形成和维持中的作用。
  第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123后,通过检测小鼠痛行为学及脊髓Akt和ERK通路蛋白表达,明确鞘内注射BQ-123对小鼠BCP的影响及可能机制。
  方法:
  第一部分:NCTC2472肿瘤细胞系培养于含10%马血清NCTC135培养基,培养箱参数设置为37℃,5%CO2和95%O2,细胞每周传代两次。雄性C3H/HeJ小鼠,4~6周龄,体质量20~25g,采用股骨骨髓腔接种NCTC2472肿瘤细胞的方法制备BCP模型。将小鼠随机分为两组:假手术组(Sham组)和骨癌痛组(BCP组)。每组随机选择8只小鼠固定行痛行为学检测,包括自发抬足次数(NSF)和机械缩足反应阈(PWT)。采用盲法,痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。于肿瘤细胞接种后-1、7、14和21d分别检测NSF和PWT,随后每组随机处死5只小鼠,取脊髓L4-6节段,采用实时定量PCR法检测ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA表达水平。采用Westem blot法检测ET-1、ETAR和ETBR蛋白表达,同时检测磷酸化Akt(p-Akt)、总Akt(t-Akt)、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)和总ERK-1/2(t-ERK-1/2)表达,并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。于肿瘤细胞接种后21d,各组分别取患侧股骨行组织学检测。
  第二部分:将小鼠随机分为7组:Sham+NS组、Sham+BQ-123组、Sham+BQ-788组、BCP组、BCP+NS、BCP+BQ-123和BCP+BQ-788组。每组随机选择8只小鼠固定行NSF检测,另选择8只小鼠固定行PWT检测。选择L5-6椎间孔穿刺行鞘内注射给药。于肿瘤细胞接种后14d(痛行为学检测后)行鞘内注射,Sham+BQ-123组和BCP+BQ-123组小鼠分别鞘内注射BQ-123(30nmol in7μl per dose),Sham+BQ-788组和BCP+BQ-788组小鼠分别鞘内注射BQ-788(10nmol in7μl per dose),Sham+NS组和BCP+NS组注入等量生理盐水,注射速度为1μl/s。痛行为学检测于鞘内注射前即刻及注射后每30min检测一次,至注射后180min。采用盲法,痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。痛行为学检测中,于BCP+BQ-123组痛行为学改善最明显的时点,每组随机选择5只小鼠,处死后取脊髓L4-6节段,采用Westem blot法检测p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2及t-ERK-1/2的表达水平,并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。
  结果:
  第一部分:与-1d时比较,Sham组于肿瘤细胞接种后4、7、10、14和21d时NSF和PWT变化差异无统计学意义(P>0.05),BCP组于肿瘤细胞接种后7、10、14和21d时NSF升高,PWT降低(P<0.01或0.001);与Sham组比较,BCP组小鼠7、10、14和21d时NSF升高,PWT降低(P<0.01或0.001)。组织学结果表明,BCP组小鼠出现肿瘤生长和骨质破坏,肿瘤细胞严重浸润和侵蚀骨皮质,而Sham组小鼠骨质结构基本正常。
  与-1d时比较,Sham组小鼠7d、14d和21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),BCP组小鼠14d和21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达上调(P<0.05、0.01或0.001),7d时差异无统计学意义(P>0.05)。与Sham组比较,BCP组小鼠7、14、21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达上调(P<0.05,0.01或0.001)。
  在观察时点内,Sham组小鼠p-Akt、p-ERK-1/2表达及p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2并未见明显变化,而BCP组小鼠上述指标呈现时间依赖式的表达上调。与Sham组比较,BCP组小鼠7d、14d和21d时p-Akt和p-ERK-1/2表达上调,p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2增加(P<0.05、0.01或0.001)。
  第二部分:与Sham+NS组、Sham+BQ-123组、Sham+BQ-788组比较,BCP组、BCP+NS和BCP+BQ-788组小鼠表现为NSF升高和PWT降低(P<0.001),且痛行为学指标在鞘内注射后180m in的观察时间内基本保持不变。而鞘内注射后,BCP+BQ-123组痛行为学出现了“V”字型变化,表现为NSF在鞘内注射后0~90min内急剧下降,90min时达到最低点,90min后开始急剧上升,180min时基本回复至鞘内注射前水平。PWT的变化趋势与NSF完全相反。因此,于鞘内注射后90min时,每组随机选择5只小鼠,处死后取脊髓L4-6节段,采用Western blot法检测磷酸化p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2和t-ERK-1/2水平,并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。结果显示,与BCP组和BCP+NS组比较,BCP+BQ-123组小鼠脊髓p-Akt、p-ERK-1/2表达下调,p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2降低(P<0.001)。
  结论:
  第一部分:脊髓ET-1及其受体参与BCP的维持,脊髓Akt和ERK通路在BCP的形成和维持中发挥重要作用。
  第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂可能通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻小鼠BCP。
[硕士论文] 庞运国
脊柱骨病外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤是儿童和青少年来源于间叶组织的最常见的恶性肿瘤。由于其发病率较低,对骨肉瘤发病机制的认识仍较少。而且,已经发生肺部转移的骨肉瘤患者的死亡率仍较高。因此,有必要从分子水平研究骨肉瘤发生发展的分子机制,有助于提高骨肉瘤的治疗效果。代谢型谷氨酸受体4(GRM4)已被证明与骨肉瘤的发病机制有关。但是,GRM4在骨肉瘤细胞中的作用和潜在的分子机制仍不清楚。
  目的:
  检测GRM4基因在不同入骨肉瘤细胞株和人成骨细胞中mRNA表达水平;采用RNA-seq技术获得骨肉瘤GRM4高表达细胞株U2OS GRM4敲减前后的差异表达基因;探讨GRM4在骨肉瘤中潜在的分子作用机制。
  方法:
  1、采用实时定量PCR检测4株人骨肉瘤细胞(HOS、MG-63、U2OS和Saos-2)和人成骨细胞hFOB1.19的GRM4mRNA的表达水平。
  2、根据GRM4基因mRNA的序列信息设计合成3条siRNA和1个阴性对照靶点,筛选出干扰效果最好的干扰靶点,构建针对GRM4的干扰慢病毒载体。
  3、用慢病毒介导的小干扰RNA转染GRM4mRNA最高表达的U2OS细胞株。通过嘌呤霉素筛选获得稳定的转染体。
  4、用实时定量PCR和western blot方法检测GRM4的敲减效率。
  5、通过全转录组测序技术筛选得到GRM4沉默前后的差异表达基因并用生物信息学方法进行分析。
  6、此外,通过生物信息学分析方法预测靶向GRM4基因的上游转录因子以及构建下游蛋白质相互作用网络。
  结果:
  1、人骨肉瘤细胞MG-63、U2OS、HOS、Saos-2中GRM4mRNA的表达水平相对高于人成骨细胞hFOB1.19,其中U2OS细胞株的表达水平最高。
  2、所设计的3条干扰靶点序列,其中S1的沉默效果最显著,用作后期实验。
  3、慢病毒介导的GRM4-siRNA在mRNA以及蛋白水平均显著抑制U2OS细胞GRM4的表达。
  4、总共获得51个差异表达基因,其中包括14个表达上调和37个表达下调的差异表达基因。差异表达基因的KEGG通路富集分析表明共获得4条显著富集的信号通路。
  5、总共获得6个可能参与GRM4基因转录调控的转录因子,蛋白质相互作用网络上的182个基因富集在14条信号通路上。其中,趋化因子及趋化因子受体被发现主要富集在3条信号通路上。并且,在GO分类中的分子功能中,趋化因子和趋化因子受体主要显著富集在趋化因子结合、趋化因子活性、趋化因子受体活性、趋化因子结合、C-C趋化因子受体活性、C-C趋化因子结合和细胞因子活性。
  结论:
  1、相对于人成骨细胞,GRM4在人骨肉瘤细胞株中呈高表达。
  2、4条显著富集通路上的差异表达基因可能通过GRM4参与骨肉瘤细胞的发生和进展过程。
  3、EGR1和CTCF可能起肿瘤抑制因子的作用参与GRM4基因的转录调控,并且GRM4通过与下游的趋化因子和趋化因子受体的相互作用参与骨肉瘤的进展。
[硕士论文] 向超
外科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨经后路减压钉棒系统内固定联合椎体成形术治疗合并神经症状的胸腰椎转移瘤的近期临床疗效分析。
  方法:2015年1月至2017年6月收治合并神经症状的胸腰椎脊柱转移瘤患者24例,男16例,女8例;年龄38~84岁,平均57岁;18例累及单节椎体,3例累及2节椎体,2例累及3节椎体,1例累及4节椎体;11例累及胸椎椎体,15例累及腰椎椎体(2例累及胸腰椎)。记录手术时间、术中出血量和术后住院天数,采用VAS评分、ECOG评分及ASIA分级分别对疼痛、功能状况及脊髓功能进行评价。采用X线测量病椎体前柱高度和中柱高度变化情况评估脊柱稳定性。使用Kaplan-Meier法评估生存率。随访观察肿瘤复发情况及并发症发生情况。
  结果:所有患者均获得随访,平均随访11月,手术时间平均2.15h,术中出血量平均727.08ml,术后住院天数平均5.46天。X线病椎椎体前柱、中柱高度术后较术前提高,差异具有统计学意义(p<0.05)。术后VAS评分和ECOG评分均较术前明显降低,患者的疼痛缓解和功能状况改善情况明显,比较差异具有统计学意义(p<0.05)。术后按ASIA脊髓功能分级,24例患者均得到一定的改善,术前术后比较差异具有统计学意义(p<0.05)。术后未见明显严重并发症。术后放化疗的患者生存时间比未行放化疗的长。
  结论:经后路减压钉棒系统内固定联合椎体成形术治疗合并神经症状的胸腰椎转移瘤手术相对简单,并发症少,能够安全、有效的改善患者的生活质量。
[博士论文] 陆荣斌
骨外科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:建立并评估MNNG/HOS人骨肉瘤细胞系在BALB/c裸鼠臀部背侧成瘤的动物模型,了解MNNG/HOS人骨肉瘤成瘤过程中对宿主血糖的影响及其影像学表现,揭示糖代谢相关的PI3K/AKT通路在这一过程中的基因和蛋白表达的差异,探讨这一细胞信号通路在成瘤过程中发挥的作用和受到的影响,从影像学、血清学、组织细胞学及分子生物学的角度阐述骨肉瘤生长与糖代谢相关的关系,为研究观察骨肉瘤病情发展的血清学指标提供基础支持。
  方法:选取90只4周龄雄性BALB/c裸鼠以1周、2周、3周、4周不同时间点分4个实验组每组10只及对应4个空白组每组10只,另有10只测定起始体重和血糖等,作为0w空白对照。将体外培养的MNNG/HOS人骨肉瘤细胞接种到SPF级环境饲养的裸鼠体内,分别到1周、2周、3周、4周取材,实验组每组随机抽取在一个时间点2只活鼠(4侧肿瘤)总共有8只裸鼠(16例肿瘤)进行影像学分析。测量每组裸鼠体重、实验组肿瘤重量、MRI检测实验组肿瘤体积。将植入MNNG/HOS人骨肉瘤细胞的BALB/c裸鼠,分别于0、1、2、3、4周检测宿主BALB/c裸鼠血清apelin、血糖、ALP、LDH,分别使用ELISA、微量酶法进行检测,分析不同时间点肿瘤进展过程中这些血清学指标的变化关系。验证PI3K/AKT通路激动是否对成骨细胞提高生存和代谢能力有影响。啮齿类SD大鼠乳鼠成骨细胞培养至第三代后,分入6个实验组,分别是空白对照、500ug/ml克林霉素磷酸酯,13nmol/mL IGF-1,20%FBS,13nmol/mL IGF-1+500ug/ml克林霉素磷酸酯,以及20%FBS+500ug/ml克林霉素磷酸酯,取三个时间点3天、5天和7天。细胞增殖和凋亡通过光学显微镜、HE染色来观察,荧光染色观察细胞活性,免疫组织化学检测细胞中ALP、BMP-2、OCN蛋白质的水平。IGF-1,IGF-1R,IRS1,COL I,BMP2,RRAS2,BGLAP,IBSP和PI3K/AKT通路相关的mRNA使用RT-PCR检测。Western blotting检测PI3K通路上关键的几个亚基的蛋白p-110(Pik3ca),p-85(Pik3r1),AKT及作为参照的GAPDH。MNNG/HOS人骨肉瘤细胞系分别与人hFOB成骨细胞系和BALB/c裸鼠成骨细胞的细胞培养与共培养,Western-blot,RT-PCR等测定PI3K/AKT细胞信号转导通路上与糖代谢相关的mRNA和蛋白质表达的分析,从分子、组织细胞、生物体水平上,探讨MNNG/HOS人骨肉瘤细胞成瘤过程中,宿主裸鼠糖代谢变化及Apelin-13在这一过程中的变化和影响。
  结果:所有实验组裸鼠接种区均成瘤。90只裸鼠中12只因不同原因退出实验,但减少的裸鼠均予以补做,以保证每组数据的统计学意义。实验组裸鼠体重与空白对照组相比,1周肿瘤组大于对照组(p<0.05)、2周无差异(p>0.05)、3周小于空白对照组(p<0.05)、4周小于空白对照组(p<0.01)。实验组肿瘤重量随时间改变的趋势与MRI计算的肿瘤体积变化的趋势呈正相关,与血糖水平、宿主体重呈负相关。MNNG/HOS入骨肉瘤宿主BALB/c裸鼠血清apelin水平在早期阶段上升不明显,在骨肉瘤生长的后期明显增高;血清ALP水平成在骨肉瘤形成早期有增高表现,在3周后则表现为降低;血清LDH水平表现与血清ALP相似,在肿瘤发展的前2周表现增高,3周以后则表现为降低,但趋势变化不如ALP明显;血清葡萄糖水平随时间增加而逐渐降低的表现。细胞形态上,在同一时间点上,被激活PI3K/AKT通路的成骨细胞的数量要多于空白对照组和所有含有克林霉素磷酸酯的组,同时细胞的形态也更好。IGF-1、Pi3kca、Pi3kr1、Akt、Irs1、Bmp2、Rras2、的基因水平在PI3K/AKT通路单纯激活的组表达量情况及通路关键调控蛋白磷酸化的情况显示,激动此通路有利于加强成骨细胞的生存能力和增强代谢,同时加入激动剂和抑制剂的组也较只含有抑制剂的组在细胞形态、活力、基因和蛋白表达方面提示有着更好的细胞存活情况。
  结论:MNNG/HOS人骨肉瘤细胞系在BALB/c裸鼠宿主皮下成瘤的动物模型稳定可靠,适合用于骨肉瘤生长中能量代谢相关的研究。影像学评估的肿瘤体积、血糖变化与直接称量得到的肿瘤重量随时间变化的趋势分别呈正相关和负相关,可以作为评估肿瘤进展的有效方法。MNNG/HOS人骨肉瘤宿主BALB/c裸鼠血清Apelin血清学检查可以与ALP、LDH、微量血糖等血清学指标联合作为观察骨肉瘤生长的指标。Apelin-13通过激活PI3K/AKT细胞信号通路可以改善细胞对葡萄糖的摄入,提高细胞生存率和生存质量。血清Apelin-13和血糖联合作为判断骨肉瘤生长的血清学标志有潜在的临床应用价值。
[硕士论文] 汪奇
外科学(小儿外科学) 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤,其发病率居于原发性骨肿瘤之首,它们大多发生于四肢的长管状骨,尤其是股骨远端和胫骨近端,由于肿瘤组织生长迅速、侵袭能力强、早期转移等特点,周围正常的骨组织常常被肿瘤所侵蚀,给病人的生活带来巨大影响。近几十年以来,由于提出了新辅助化疗理念、术后放化疗治疗水平的提高再加上外科手术技术提升,过去传统的截肢术逐渐被新辅助化疗联合保肢手术所取代,骨肉瘤患者的五年生存率显著提高至60~70%,但由于骨肉瘤的高度侵袭性和早期转移以及对化疗药物耐药,加上目前暂无敏感性和特异性较高的肿瘤标志物,骨肉瘤患者在前来就诊时大多数已进入癌症晚期阶段,所以患者的肿瘤复发率和死亡率仍无明显改善。因此,迫切需要探索涉及骨肉瘤发展的潜在分子机制,以对骨肉瘤进行早期诊断及探寻新的治疗方式来改善骨肉瘤患者的预后及其生活质量。
  树突状细胞(dendritic cell,DC)是作为一类特定的抗原呈递细胞被大家熟知,它们在人体中分布广泛,普遍分布于血液,组织和淋巴器官中。它们被认为是免疫系统的中心,功能是桥接特异性免疫系统和非特异性免疫系统,可以产生强大的免疫应答。近十年以来,基于DC的癌症免疫疗法围绕着DC的这些功能来开展,旨在通过疫苗接种开发针对癌症的免疫治疗策略。为此,必须更好地了解DC免疫生物学,调节先天免疫系统和适应性免疫系统以及肿瘤微环境,以及应用科学的最新进展,以提高其巨大的抗肿瘤免疫治疗潜力。
  微小RNA是一类长度约为19~25个核苷酸片段具有调节功能的非编码RNA分子。miRNA通过与靶mRNAs的3'非翻译区(UTR)碱基互补配对诱导信使RNA(mRNA)降解或通过与种子序列不完全碱基配对抑制mRNA翻译来调节靶基因的表达。在人类癌症中观察到miRNA的异常表达,并且已经显示其参与多种关键的细胞过程,包括细胞分化,增殖和代谢。
  DC由发育和功能不同的亚群组成,已经发现不同DC族的发育受不同细胞因子和转录因子的网络调节。此外,DC的反应受到严格调控以维持免疫系统的稳态。在免疫系统中,miRNA在造血发育和细胞亚群分化过程中在检查点起作用,它们调节效应细胞功能,并牵涉维持动态平衡。DCs受miRNA的调控,在过去的十年中,miRNA在调节DC发育和功能中的作用已经取得了很大进展。基于骨肉瘤的治疗现状,以树突状细胞为基础的免疫治疗可以作为一种非常有前景的治疗方式来开展。
  目的:
  本研究通过比较miRNA-200a在骨肉瘤组织与癌旁组织、骨肉瘤患者及健康体检者外周血、骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中的表达水平差异,并分析其与临床病例参数的关系,为以树突状细胞为基础的骨肉瘤的免疫治疗提供一定的理论基础。
  方法:
  选取郑州大学第一附属医院骨科及小儿外科2015年10月至2017年10月收治行骨肉瘤切除手术、病理诊断明确的40例骨肉瘤患者,征得骨肉瘤患者及家属同意,所有纳入研究的骨肉瘤患者均需排除骨肉瘤以外其他系统肿瘤。收集这些患者手术当日的外周静脉血5ml、术中收集癌组织、癌旁组织及癌旁未被侵犯的组织,其中男20例,女20例,年龄介于10~48岁之间,新鲜手术标本切除后用生理盐水冲洗干净并迅速保存于-80℃低温冰箱中待用。另外收集患者临床资料,如肿瘤大小、肿瘤浸润情况、淋巴结有无转移以及其他脏器有无转移等,同时收集本院至门诊体检的40例健康人血液标本5ml放置于-80℃低温冰箱中保存待用。培养人U2OS骨肉瘤细胞系和人hFOB1.19成骨细胞系,通过qRT-PCR检测miRNA-200a在标本和细胞中的表达水平的不同,并分析它们与患者临床资料的关系。
  结果:
  1.检测miRNA-200a在骨肉瘤患者癌组织及骨肉瘤细胞系中的表达水平
  运用qRT-PCR实验方法检测骨肉瘤患者癌组织及癌旁组织、人骨肉瘤细胞系U2OS与人成骨细胞系hFOB1.19中miRNA-200a的表达水平,结果显示癌组织中miRNA-200a表达量低于癌旁组织,两组差异比较具有统计学意义(P<0.05),骨肉瘤细胞中miRNA-200a表达量低于人成骨细胞,两组差异比较具有统计学意义(P<0.05),这意味着miRNA-200a在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中低表达。另外通过对比不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤生长位置、病理类型、有无转移及不同生存情况等组间骨肉瘤组织miRNA-200a表达水平的差异,结果显示死亡组和转移组miRNA-200a表达水平高于存活组和非转移组(P<0.05),提示miRNA-200a可能在骨肉瘤发生、发展、转移和患者生存中发挥重要的作用。
  2.检测miRNA-200a在骨肉瘤患者外周血中的表达水平
  运用qRT-PCR实验方法比较40例骨肉瘤患者与40例门诊体检的健康人血清当中miRNA-200a表达水平。结果显示相对于门诊体检的健康人,骨肉瘤患者血清中miRNA-200a表达量升高,两组数据对比结果显示差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  miRNA-200a在骨肉瘤患者癌组织表达下调,在其血清中表达上调,表明它可能在骨肉瘤发生、发展、转移和患者生存中发挥重要的作用,可为以树突状细胞为基础的骨肉瘤的免疫治疗提供一定的理论基础。
[硕士论文] 王文剑
外科学(骨科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于间叶细胞恶性增殖产生骨样和骨基质所构成的原发恶性骨肿瘤,是最常见的原发性骨恶性肿瘤,多发生于骨骼快速生长发育的青少年或者儿童。由于骨肉瘤起病隐匿、恶性程度高、发展较快,给临床早期诊断与及时治疗带来困难。40年前,其生存率不足20%,近年来,随着新辅助化疗的出现,骨肉瘤患者的5年总生存率逐步提高。近20年来,中国新辅助化疗及辅助化疗应用日渐广泛,但骨肉瘤生存率未见继续提高,术后复发及转移率亦未下降。由于缺乏更为有效的化疗药物,多学科协作亦未形成标准,骨肉瘤综合治疗疗效未见提升。为了解中国骨肉瘤近年来发病情况,2017年本人前往国内7家骨肿瘤治疗中心,收集整理了1593例行手术治疗的骨肉瘤患者资料。试图从患者性别、发病年龄及发病部位、新辅助化疗和辅助化疗、化疗后肿瘤坏死情况、手术方式等相关问题等诸多指标揭示中国近年骨肉瘤发病情况及治疗现状。并在国内外数据库中检索有关骨肉瘤的大样本文献,与本组资料进行比较,对比流行病学特征及治疗情况,调查其特征是否有区别,并分析产生区别的原因。
  目的:
  了解中国目前骨肉瘤的临床流行病学特点,分析国内骨肉瘤的发病情况及临床治疗现状,并在国内外数据库中检索有关骨肉瘤的大样本文献,与本组资料进行比较,对比流行病学特征及治疗情况。
  方法:
  1、收集原始资料:
  前往国内七家骨肿瘤治疗中心的病案室调阅病历资料,所有病例均查阅原始病历,5家医院为2000年1月至2017年2月资料,2家医院为2008年1月至2017年2月资料,骨肉瘤患者共1593例。
  2、提取相关数据:
  整理1593例骨肉瘤患者的一般情况(性别、发病年龄、首发部位、初诊时肺转移),诊断方式(术前穿刺活检、术前切开活检、未活检),及治疗情况(手术方式、术前化疗、化疗后肿瘤坏死率、术后化疗)。
  3、各数据库中检索文献:
  在Pubmed数据库、Embase数据库、SpringerLink全文数据库、Elseviver Science Direct全文数据库、John Wiley Interscience全文数据库、ProQuestHealth&Medical Complete全文数据库、EBSCO MEDLINE Complete全文数据库检索上检索“osteosarcoma”,在重庆维普科技期刊数据库、同方期刊全文数据库、中华医学会&中国医师协会全文期刊库检索“骨肉瘤”,纳入骨肉瘤病例数大于100的有相关数据对比的回顾性研究。最终共检索英文文献22篇,中文文献18篇,骨肉瘤共18534例,用作与本组病例发病及治疗情况的对比。
  4、统计学分析:
  采用SPSS13.0统计软件包(SPSS公司,美国)进行统计学分析。对比各组间流行病学特征及治疗情况进行比较,检验水准α值取0.05。
  结果:
  1、本组数据结果:一般情况:本组1593例患者中,男984例,女609例;男女比:1.62∶1。平均年龄:23.2岁(范围3-80岁)。发病高峰11-20岁(52.4%);高龄(>40岁)患者217例(13.6%)。病变发生于四肢骨1524例,中轴骨69例。发病部位最常见为股骨远端(706例)、胫骨近端(375例)、肱骨远端(117例),其他395例。膝关节周围1154例(71.0%);中轴骨包括脊柱18例,骨盆49例,肋骨2例。初诊时伴有转移的病例79例,占5.0%。诊断方式:术前穿刺活检1111例,切开活检280例。术前可以明确诊断1345例(占所有病人的比例84.4%,占活检病人的比例96.7%)。治疗方式:术前化疗1185例(74.4%)。术前化疗以DIA方案(271例)、DIA+MTX方案(251例)、AP方案(149例)为主;描述术后肿瘤细胞坏死率的220例,依据Huvos分级,Ⅰ级78例,Ⅱ级105例,Ⅲ35例,Ⅳ级2例;术后化疗1299例(81.5%);1306例患者行保肢手术(82.0%),具体术式以人工假体置换术最为常见(911例,69.8%);术后化疗以DIA+MTX方案(471例)、DIA方案(266例)、AP方案(98例)为主;手术前后化疗方案相同379例,更改化疗方案666例。
  2、国内外大样本文献检索结果及对比情况:国内共检索出18篇大样本文献5684例病例,男女比、年龄范围、发病高峰、发病部位与本研究相似,平均年龄低1-2岁,初诊转移率较高,术前术后化疗与与保肢率较低,化疗后肿瘤坏死率较好。国外共检索22篇大样本文献12850例病例,其男女比较低,平均年龄高1-2岁;膝关节周围比例较低,初诊转移率较高,术前术后化疗率与本研究类似,化疗后肿瘤坏死率较好。
  结论:
  此次调查骨肉瘤发病一般情况(性别、年龄、发病部位)与之前国内外报道均无明显差别;治疗方面术前、术后化疗率及保肢手术率较以往有明显提高,化疗方案上从各种方案并存逐渐向以DIA+MTX与DIA方案为主流方案。
[硕士论文] 覃川
外科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:提高对骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿的临床诊断和复发相关因素的认识。
  材料和方法:回顾分析2012年4月份至2016年4月份手术的23例骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿和58例单纯型骨巨细胞瘤病例的复发率、年龄、性别、病程、发病部位、碱性磷酸酶、血沉、超敏C反应蛋白及肿瘤冠状面面积、有无病理性骨折、手术方式。探讨骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿复发相关因素以及影像学(X-ray、CT、MRI)对其诊断的特异性。
  结果:两组术后复发率、超敏C反应蛋白阳性率、肿瘤冠状面面积小于14.40cm2例数占比差异有统计学意义,P<0.05;年龄、性别、病程、发病部位、碱性磷酸酶阳性率、血沉阳性率、病理性骨折、手术方式无统计学无意义,P>0.05;Campanacci's影像学分级Ⅰ级9例,Ⅱ级6例,Ⅲ级8例,其中Ⅰ级复发0例,Ⅱ级复发2例,Ⅲ级复发5例,影像等级越高,肿瘤越易于复发,P<0.05;23例骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿术前均行X-ray检查,11例行CT检查,6例行MRI检查,其中有0例X-ray、2例CT以及3例MRI可观察到重要影像学征象(液-液平面),三种影像学检查液-液平面观察率差异有统计学意义,p<0.01。
  结论:骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿较单纯型骨巨细胞瘤可能更易复发,Campanacci's影像分级越高则复发可能性越大;由于骨巨细胞瘤继发动脉瘤样骨囊肿的高复发率,临床医生应对超敏C反应蛋白水平不高、发病部位血运丰富,病灶面积较大的骨巨细胞瘤病例高度警惕,尽可能使用X-ray结合MRI或CT鉴别骨巨细胞瘤是否继发动脉瘤样骨囊肿。
[博士论文] 李博
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 二甲双胍抑制骨肉瘤生长的分子机制研究
  目的:
  骨肉瘤是最为常见的原发恶性骨肿瘤,虽然手术和化疗等治疗手段在过去的30年中进步明显,但该病的总体生存率未见明显提高。二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线药物,目前很多证据表明其可以抑制多种恶性肿瘤的进展,但详细分子机制仍未研究透彻。本研究主要目的是探索二甲双胍在骨肉瘤中的抗肿瘤效应以及寻找潜在的信号通路,为进一步探索二甲双胍的抗肿瘤作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点提供新思路。
  方法:
  在本研究中,首先通过CCK-8细胞计数实验、平板克隆实验和流式分析技术探索不同浓度和作用时间条件下的二甲双胍对骨肉瘤增殖能力的影响,确定最适合的干预条件;然后通过流式分析技术、线粒体膜JC-1标记、WB等实验探索二甲双胍在骨肉瘤细胞凋亡方面的作用。随后对骨肉瘤细胞进行GFP-LC3慢病毒感染,并通过透射电镜技术和WB实验探索二甲双胍是否可以引起骨肉瘤细胞发生自噬现象;进一步通过免疫荧光、流式细胞标记和WB等实验技术对下游信号通路进行分析;最后,通过构建裸鼠骨肉瘤胫骨平台荷瘤模型,在动物实验水平探讨二甲双胍对骨肉瘤的影响。
  结果:
  证明二甲双胍通过诱导细胞周期G2/M时相阻滞进而抑制骨肉瘤细胞的生长,并且可以促进骨肉瘤细胞发生凋亡和自噬现象。通过进一步分析,发现抑制二甲双胍诱导的自噬现象可以促进骨肉瘤的凋亡。二甲双胍引起骨肉瘤细胞的线粒体膜电位发生变化,产生过量的ROS,进而激活下游的JNK/c-Jun信号通路进而诱导骨肉瘤细胞产生凋亡和自噬现象。最后,在动物体内水平证明安全剂量的二甲双胍可以显著抑制骨肉瘤的增殖。
  结论:
  在本项研究中,首次从体外和体内水平证明二甲双胍可以通过ROS依赖的JNK/c-Jun信号途径诱导骨肉瘤发生细胞周期障碍、凋亡和自噬现象。该研究为进一步探索二甲双胍在肿瘤领域的作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点奠定了基础。
  第二部分 唑来膦酸抑制骨肉瘤生长的代谢组学研究
  目的:
  唑来膦酸作为双膦酸盐家族中最有代表性的一员,近年来越来越多的证据表明其可以对多种肿瘤具有直接的抗增殖和促凋亡作用。本研究主要通过运用代谢组学技术探讨唑来膦酸抑制骨肿瘤生长的作用机制。
  方法:
  在本研究中,我们首先通过CCK-8细胞计数毒性实验和流式细胞周期检测技术探索不同浓度和作用时间下唑来膦酸对骨肉瘤增殖能力的影响,确定最适合的作用条件。之后采用液相质谱技术分析唑来膦酸干预骨肉瘤细胞后细胞内部代谢产物的差异性变化,随后通过对发生显著变化的代谢物进行聚类分析和KEGG通路的富集分析。
  结果:
  首先CCK-8的结果显示唑来膦酸对骨肉瘤细胞的增殖生长有抑制的作用,并且这种作用存在时间和浓度的依赖性,流式细胞周期检测提示该药物可以诱导骨肉瘤细胞周期发生G1时相停滞。随后通过液相质谱分析在正离子模式下分别发现15种显著差异代谢物和8种差异代谢物,而在负离子模式下发现了21种显著差异代谢物和11种差异代谢物。上述代谢物主要参与体内核酸代谢,氨基酸代谢和TCA循环等重要的生物过程。最后将得到的显著差异代谢产物进行聚类分析和KEGG通路富集分析后发现,上述代谢物涉及在细胞内部包括central carbon metabolism in cancer,pyrimidine metabolism和ABC transporters等多条重要的代谢通路。
  结论:
  在该项研究中,我们首次运用液相质谱分析唑来膦酸在骨肉瘤中的代谢组学水平的变化,为进一步探索唑来膦酸在肿瘤领域的作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点提供新的思路。
[硕士论文] 刘永刚
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)属于起源于间充质的一种恶性骨肿瘤,是儿童与青少年罹患原发性恶性骨肿瘤疾病谱中最常见的。骨肉瘤患者的年龄分布呈现双峰状态,分别为青春期人群与老年人群。青春期高峰集中在大约15岁。0~24岁组的骨肉瘤发病率为4.4/百万。第二个峰值集中在75岁左右,主要由与佩吉特病或其他骨性病变相关的继发性骨肉瘤组成。男性与女性的发病率之比为1.22∶1。转移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并发症,约有80%的骨肉瘤患者在确诊时发现已存在转移性或微小转移性病灶。由于治疗原则和化学疗法的进展,患者的5年生存率从不到30%提高到70%以上。尽管有了上述进展,但骨肉瘤发生发展的生物学机制研究仍任重而道远,如何从根源上治愈骨肉瘤是当今医学界面临的难题之一。
  整合素连接激酶相关磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一种丝氨酸/苏氨酸(S/T)磷酸化酶,与细胞的生存和凋亡有关。ILKAP同时也是一种具有调控肿瘤发生发展功能的抑癌基因表达产物。ILKAP广泛表达于人体组织中,主要在肾脏、骨骼肌、肝脏等脏器中表达水平较高。介导细胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。ILKAP与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。
  低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是肿瘤微环境与肿瘤病因学研究中的重点。作为一种转录因子,HIF-1有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失调,细胞将具备多种恶性能力并演变成肿瘤。早期研究认为,细胞在正常微环境下,HIF-1主要受羟化酶的调节而进入泛素降解途径,而仅当细胞处于低氧条件时HIF-1不能被降解,进而发挥功能。近年来随着对HIF-1调节方式的深入研究,人们发现羟化反应并不是HIF-1转录活性调节的唯一途径,磷酸化调节也是调控HIF-1的一种重要方式,尤其是在非低氧条件下。
  研究目的:
  证实低氧可导致细胞发生凋亡;研究低氧条件下ILKAP通过与HIF-1α相互作用,对骨肉瘤细胞凋亡产生的相关影响。
  研究方法:
  1、细胞低氧模型的构建与监测:使用Billups Rothenberg公司生产的二氧化碳培养箱将骨肉瘤细胞进行培养。连续从0h至96h将气罐中充入了混合的O2(1%)与N2(94%)和CO2(5%)。调节二氧化碳培养箱的温度(37℃)、湿度(95%)。每24h更换细胞培养液。通过YSI模型55溶氧测定仪来监测培养箱内溶氧量,从而监测低氧环境。
  2、骨肉瘤细胞活力测定:台盼蓝染色试验测定细胞存活率。将单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合混匀。每0.1mL单细胞悬液中加入一滴台盼蓝染液,室温下染色3~5min,记录活细胞和死细胞数。将处理过的骨肿瘤细胞材料在高倍镜下观察。分别计数1000个细胞内的活细胞和死细胞数,统计未染色细胞,用公式计算细胞存活率。
  3、骨肉瘤细胞凋亡检测:本实验采用激光共聚焦显微镜技术通过观察骨肉瘤细胞内DAPI与TUNEL的共定位,判断骨肉瘤细胞是否经历凋亡。
  4、检测HIF-1α、细胞凋亡标记物:采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)—底物化学发光ECL法。
  5、研究ILKAP在导细胞凋亡过程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒转染与Ad-ILKAP过表达的研究方法。
  6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之间的相互作用:对细胞进行了72h低氧处理,而后进行免疫共沉淀实验。
  研究结果:
  1、细胞活力随着时间延长而下降,细胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α随低氧处理时间延长逐步被诱导,磷酸化HIF-1α逐渐减少。通过400U ILKAP处理HIF-1α,PBS作为阴性对照,400Uλ磷酸酶作为阳性对照,发现ILKAP和λ磷酸酶对于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐渐增多。
  2、低氧条件下细胞存活由ILKAP shRNA维持。低氧条件下细胞凋亡与ILKAP有关。相同低氧时间下,ILKAP shRNA组的细胞凋亡数明显少于对照组(P<0.05)。Western blot条带显示HIF-1α在ILKAP shRNA组与对照组比较,大部分没有转为去磷酸化形式。
  3、通过免疫共沉淀实验发现,磷酸化形式的HIF-1α优先与抗ILKAP抗体免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α优先与p53抗体免疫共沉淀,ILKAP与p53之间没有相互作用。
  4、相比于对照组,Ad-ILKAP组的细胞存活率显著减少,呈时间依赖性(P<0.05)。细胞凋亡标记物和TUNEL法在Ad-ILKAP组相比于对照组,反映出显著增加的细胞凋亡现象。常氧条件无法诱导HIF-1α表达,但在Ad-ILKAP组可检测。
  研究结论:
  1、细胞凋亡数量会随着低氧处理时间延长而显著增加。ILKAP可以起到类似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化状态在持续的低氧诱导细胞凋亡过程中发生改变,ILKAP可使HIF-1α从磷酸化状态转为去磷酸化状态。
  2、长时间低氧诱导情况下,下调细胞内ILKAP表达,则细胞凋亡减少。由此可见,ILKAP在长时间低氧诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。
  3、ILKAP结合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后与去磷酸化形式的HIF-1α分离,去磷酸化的HIF-1α则与p53结合。ILKAP不与p53直接作用。
  4、常氧无法诱导HIF-1α表达。在常氧情况下,上调细胞内ILKAP表达可诱导细胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。
  综上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且对后续p53依赖的细胞凋亡发挥重要作用。考虑到其与p53及p53本身的复杂作用,现阶段的实验结果为进一步研究不同HIF-1α类型在多种疾病中的作用基因奠定了基础。
[硕士论文] 黄文星
外科学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨神经外科与脊柱外科在手术治疗椎管内肿瘤的不同的临床疗效及优缺点。
  方法:回顾性分析青岛市市立医院神经外科手术治疗椎管内肿瘤的25例患者,神经外科手术均在显微镜下完成肿瘤切除,并以手术方式分为神经外科全椎板组和神经外科半椎板组;青岛市立医院脊柱外科手术治疗椎管内肿瘤20例,均在肉眼下操作完成,且手术方式均为全椎板切除的手术方式,并行钉棒系统固定;通过神经外科全椎板组、神经外科半椎板组分别与脊柱外科组进行对比,比较三组间患者的术后住院时间、手术时间、术中出血量、肿瘤切除率、住院费用、术后神经功能评分改善率、术后并发症等情况。
  结果:神经外科全椎板组与脊柱外科组对比,在住院时间、术中出血量、住院费用方面,两组无明显统计学上差异。在手术时间方面,神经外科全椎板组明显比脊柱外科组时间长,并且有统计学上差异。但肿瘤全切除率明显高于脊柱外科组,术后神经功能恢复情况也明显优于脊柱外科组;神经外科半椎板组与脊柱外科组对比,手术时间、术后住院时间、术中出血量、住院费用也明显低于脊柱外科组,肿瘤全切除率也明显高于脊柱外科组,术后神经功能恢复情况明显优于脊柱外科。在并发症的发生方面,神经外科全椎板组中无并发症的发生,脊柱外科有2例发生。在脊柱稳定性方面,神经外科全椎板组患者1例出现脊柱失稳情况,神经外科半椎板组无脊柱失稳,脊柱外科组有1例患者出现脊柱失稳情况。
  结论:在手术治疗椎管内肿瘤方面,神经外利组采用半椎板与全椎板的手术方式,脊柱外科采用全椎板的手术方式,通过相关组别间的术后住院时间、术中出血量、肿瘤切除率、住院总费用等方面的对比,同种手术方式下脊柱外科组的手术时间少于神经外科组,与脊柱外科更多进行脊柱固定方面手术有关。而在神经功能恢复、出血量、肿瘤全切率等方面,神经外科更有优势。不同手术方式时,在手术方式选择上以半椎板的手术方式的优势更为明显,值得在临床中进一步推广及使用。
[博士论文] 乔苏迟
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨骼系统最常见的的原发恶性肿瘤,年发病率约(1-3)/1000,000,可于任何年龄发病,但高级别骨肉瘤(High-grade osteosarcoma,HGOS)主要发生于10-20岁的青少年和儿童。OS多累及长骨末端,尤其是生长快速的骨骼,如股骨远端、胫骨近端、肱骨近端等。
  得益于新辅助化疗的发展、假体以及材料学技术的进步,目前OS的保肢率和生存率都得到了较大的提升。但复发及远处转移的患者预后仍然较差,新型药物的研发也迟滞不前,OS的治疗已经进入到瓶颈。阐明OS发生发展的分子机制,研发新型药物是目前迫切需要解决的问题。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)的是一类重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。已有大量研究报道,LncRNA出现异常表达或是突变,与恶性肿瘤增殖、侵袭、转移、耐药等机制密切相关。而在OS中,LncRNA的相关研究尚处于起步阶段,是否可以利用下调或上调异常表达的LncRNA方式治疗OS,或是逆转OS耐药,有待深入探索。此外,LncRNA能否作为OS患者临床诊断的重要参考,以及判断化疗敏感性和预后的分子标志物,有待临床实践检验。
  LINC00511是一个较为全新的LncRNA,在非小细胞肺癌、舌鳞癌以及胰腺导管腺癌中,已证实LINC00511呈现高表达,并在其中作为癌基因发挥作用,促进相应恶性肿瘤增殖、迁移,与患者预后不良密切相关。
  通过芯片筛选等前期预实验,发现,相对于癌旁正常组织,LINC00511在OS组织中呈现低表达。本研究旨在进一步探索LINC00511在OS中的表达情况,并分析其表达与患者临床特征及预后的相关性,此外,分别从体外和体内层面对LINC00511的功能展开研究并初步揭示LINC00511在OS中的调控机制。
  第一部分:LINC00511在骨肉瘤组织、细胞株中的表达及其意义
  第一部分研究中,通过定量PCR检测LINC00511在OS组织标本和癌旁正常组织标本的表达情况,并结合临床资料分析LINC00511的表达水平与OS患者年龄、性别、肿瘤分期、化疗敏感性、预后等临床特征之间的相关性。此外,同时采用定量PCR检测LINC00511在不同OS细胞株及正常成骨细胞细胞株中的表达水平差异。结果显示,LINC00511在OS组织及细胞株中呈现低表达;LINC00511的表达与患者肿瘤坏死率显著相关,高表达患者呈现出更好的化疗敏感性;LINC00511的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、肿瘤体积变化、手术方式等无关;LINC00511表达水平与骨肉瘤患者预后明显相关,高表达患者三年生存率更高,预后更好。上述结果提示,LINC00511可能是骨肉瘤疾病发生发展中的重要抑癌基因,其表达升高预示更好的化疗敏感性及预后,有望成为骨肉瘤诊断以及预后判断中的重要分子标志物。
  第二部分:LINC00511对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用
  第二部分研究中,构建了OS细胞株MG-63及Saos-2的LINC00511的过表达稳定株,并检测比较肿瘤生物学行为的变化。在体外细胞层面上,LINC00511表达上调后,进行CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞划痕实验、细胞transwell实验等观察LINC00511对OS细胞增殖、凋亡以及迁移的影响。在体内层面上,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证LINC00511对OS发生发展的作用。结果显示,MG-63及Saos-2中过表达LINC00511能够显著抑制OS细胞增殖、迁移,但不影响细胞凋亡;裸鼠成瘤实验中LINC00511过表达的裸鼠肿瘤生长更慢,相同时间内肿瘤体积更小,肿瘤质量更轻。上述结果提示,LINC00511在OS中能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移,是其发病机制中重要的抑癌基因。
  第三部分:LINC00511对骨肉瘤疾病进展的调控机制的初步研究
  第三部分研究中,对LINC00511调控OS的分子机制进行初步的研究。从OS上皮间质转化及PI3K/Akt信号通路的调控两方面进行观察。在Saos-2各组细胞中,利用Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimemin和α-SMA的表达,以及PI3K/Akt信号通路中PI3K和p-Akt的蛋白表达量,初步探讨LINC00511抑制OS增殖、迁移的分子调控机制。结果显示,Saos-2中过表达LINC00511后OS中的E-cadherin蛋白表达显著升高,而Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,OS的EMT受到显著抑制。此外,PI3K和p-Akt(308)蛋白表达显著降低,而p-Akt(473)蛋白表达并无明显变化,PI3K/Akt信号通路受到明显抑制。上述结果提示,LINC00511可能通过抑制OS的EMT以及PI3K/Akt信号通路,对OS细胞增殖、迁移产生调控作用,其中,PI3K/Akt信号通路产生作用的Akt的磷酸化位点是苏氨酸308(Thr308)。
[硕士论文] 思治广
影像医学与核医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.研究脊柱骨母细胞瘤的CT、MRI和PET-CT表现。
  2.研究脊柱骨母细胞瘤的影像学表现与肿瘤外科分期之间的关系。以提高对脊柱骨母细胞瘤的认识,为术前诊断和评估提供重要参考。
  方法:
  1.回顾性分析16例经手术和病理证实的脊柱骨母细胞瘤的影像及临床资料。
  2.所有病例按临床、影像学及病理进行外科分期,分析各期肿瘤与影像学表现之间的关系。
  结果:
  11例发病年龄在10~29岁,5例在30~51岁;男性11例,女性5例;胸椎8例,颈椎4例,腰椎4例;13例起源于脊柱附件,3例起源于椎体,1例单纯椎体发病;6例呈膨胀性骨质破坏,10例呈溶骨性骨质破坏;13例为良性,3例为侵袭性;1例继发动脉瘤样骨囊肿,1例继发病理性骨折;16例病灶平均直径约38mm,1例小于20mm,15例大于20mm。CT示:16例病灶内见钙化或骨化影;15例伴有软组织肿块;13例椎管受累。6例呈膨胀性骨质破坏,骨硬化边连续;10例呈溶骨性骨质破坏,无明确骨硬化边,3例见骨性分隔。3例侵袭性病灶累及椎旁软组织和肋骨。MRI示:13例T1WI上呈等、低信号,T2WI上呈等、高信号,部分见厚薄不均低信号环;13例均伴有软组织肿块并椎管受累,7例见多发囊变,7例脊髓明显受压。13例增强扫描肿瘤不均匀强化,周围软组织强化更明显,病灶内钙化、骨化及囊变未见强化。PET-CT示:5例肿瘤呈结节状、分叶状放射性浓聚影,标准摄取值(SUV)增高。
  13例良性肿瘤Enneking分期为Ⅱ期6例,Ⅲ期7例;3例侵袭性肿瘤均为Ⅲ期。CT示:6例Ⅱ期肿瘤呈膨胀性骨质破坏,骨皮质连续,肿块局限于间室内;10例Ⅲ期肿瘤呈溶骨性骨质破坏,骨皮质中断,肿块侵袭至间室外。MRI示:4例Ⅱ期肿瘤边界清,信号尚均匀,周边见线状低信号环,增强扫描肿块均匀强化;9例Ⅲ期肿瘤较大,信号不均,肿块向椎旁及硬膜外延伸,增强扫描肿块不均匀强化。PET-CT示:2例Ⅱ期肿瘤呈结节状放射性浓聚影,SUV值增高;3例Ⅲ期肿瘤呈分叶状放射性浓聚影,SUV值增高。
  结论:
  1.脊柱骨母细胞瘤好发于青少年及青年患者,男性多于女性,肿瘤直径多大于2cm,部分有侵袭性,影像学表现比较典型,为脊柱附件区膨胀性、溶骨性骨质破坏并伴有软组织肿块,内见斑点状、结节状钙化或骨化影;T1WI上呈等低信号,T2WI上呈等高信号,部分周边见厚薄不均低信号环;增强扫描肿瘤不均匀强化;PET-CT示肿瘤呈结节状、分叶状放射性浓聚影,标准摄取值增高。
  2.脊柱骨母细胞瘤影像学表现与肿瘤外科分期关系密切,Ⅱ期肿瘤表现为膨胀性骨质破坏,骨硬化边连续,肿瘤局限于间室内;Ⅲ期肿瘤表现为溶骨性骨质破坏,肿瘤侵袭至间室外。
  3.综合运用CT、MRI和PET-CT检查,对脊柱骨母细胞瘤的早期诊断、肿瘤外科分期、手术治疗及愈后复发均有重要意义。
[硕士论文] 彭东宇
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:尤文肉瘤(Ewing's sarcoma,ES)是儿童和青少年中第二大常见骨肿瘤,是一种侵袭性骨和软组织肉瘤,其年发病率是2.93/1000000,常发生于骨骼,特别是下肢(41%),骨盆(26%),胸壁(16%),椎骨(6%)和颅骨(2%)。约四分之一的尤因肉瘤出现在软组织中而不是骨,大约四分之一的患者有诊断时可检测到转移。肺是最常见的转移部位(50%),其次是骨(25%)和骨髓(20%)。临床早期症状不明显,故极易漏诊。尤文肉瘤患者对放疗极为敏感,通过小剂量照射后,肿瘤可迅速减小,局部的疼痛感显著减轻。但值得注意的是,放疗对起源于椎体的尤文肉瘤同时容易造成脊髓及神经的损伤甚至导致神经功能不可逆性损害而致患者瘫痪。而且尤文肉瘤又容易早期转移,单纯放疗对于此类病人远期疗效差。但其具体的发病机制尚不明确。
  蛋白酶体系统是最重要的系统之一,蛋白质降解系统在真核生物中具有调节细胞过程如细胞周期,转录,细胞信号传导,细胞死亡和免疫反应的能力。REGγ(也被称为PA28γ、11Sγ或Proteasome activator complex subunit3,PSME3)蛋白是20S蛋白酶体激活因子家族中的一员,主要定位在细胞核中,可以形成同源七聚体,作为细胞内一种重要的蛋白酶体激活因子,参与到许多与疾病相关的通路调节中。以非泛素和非ATP依赖的方式促进一些靶蛋白的降解,如SRC-3、P21、P53、P16、CK-1δ、SirT1等。已有研究证实REGγ在许多癌症组织中高表达及恶性生物学行为中发挥着重要作用,如结肠癌、肺癌、胃癌、脊索瘤等。但它在尤文肉瘤中的作用尚未有报道,此研究REGγ在尤文肉瘤中的功能,为了解和阐明尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究目的:通过检测REGγ在尤文肉瘤组织中的表达水平及预后相关性,初步探究REGγ在尤文肉瘤发生发展中的作用及相互关系。为深入探索尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究方法:1.通过免疫组化染色评估REGγ在尤文肉瘤组织中的表达情况,并结合临床随访资料行相关性分析;2.在尤文肉瘤细胞系中干扰REGγ的表达,肿瘤细胞生物学行为的改变;3.在尤文肉瘤细胞系中过表达REGγ基因,检测肿瘤细胞生物学行为的改变。
  研究结果:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,瘤旁正常组织中REGγ表达水平相对较低;2.REGγ在尤文肉瘤组织中的高表达与患者的不良预后存在显著的相关性;3.在尤文肉瘤细胞系中,REGγ敲减干扰后均出现凋亡敏感性的增加而使其增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降的肿瘤细胞生物学行为的改变;4.在尤文肉瘤细胞系中,过表达REGγ基因,尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强。
  研究结论:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,这表明REGy可能有促进肿瘤细胞生长的作用;2.REGγ的表达与尤文肉瘤患者的无瘤生存时间呈负相关;3.在尤文肉瘤中,蛋白酶体REGγ敲减干扰后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显下降,而其凋亡增加。REGγ过表达后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强,而其凋亡敏感性降低。提示REGγ与尤文肉瘤的发生及预后密切相关,这将为提高尤文肉瘤的治愈率提供非常重要的思路。
[硕士论文] 洪超
外科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:回顾性研究股骨远端和胫骨近端骨肉瘤患者行肿瘤型关节假体置换术后的生存率、肢体功能和假体生存情况。
  方法:随访2007年至2017年在广西医科大学第一附属医院和肿瘤医院确诊并进行新辅助化疗和肿瘤假体置换手术的48例膝关节周围骨肉瘤患者。根据肿瘤部位分为两组:股骨远端组和胫骨近端组,其中股骨远端组30例,胫骨近端组18例。随访平均时间32.5个月(6-106个月),随访内容包括:患者生存情况,术后肢体功能和人工假体情况。利用MSTS评分系统和患者术后6个月的膝关节屈曲范围进行膝关节功能评定。采用Kaplan-Meier生存曲线评估患者术后2年生存率和2年假体生存率,并分析术后假体并发症的发生率。
  结果:利用Kaplan-Meier方法分别对股骨远端组和胫骨近端组患者的术后生存时间制作生存曲线,两组患者的2年生存率分别为75.0%和66.7%(P=0.737),两组患者术后2年生存率差异不具有统计学显著性。对获得完整随访的29例存活患者进行MSTS功能评分(术后6个月),股骨远端组为25.3±2.4,胫骨近端组为23.3±3.4(P=0.091),表明股骨远端组术后膝关节功能好于胫骨近端组,但差异不具有统计学显著性。术后6个月膝关节活动度,股骨远端组93.5°±6.3°,胫骨近端组87.9°±10.8°(P=0.088),表明股骨远端组术后膝关节屈曲范围好于胫骨近端组,但差异不具有统计学显著性。利用Kaplan-Meier方法对股骨远端组和胫骨近端组患者的术后假体生存时间制作生存曲线,两组患者的2年假体生存率分别为70.0%和58.3%(P=0.620),两组患者术后2年假体生存率差异不具有统计学显著性。对可能影响患者2年假体生存率的相关因素进行单因素分析发现,患者BMI、肿瘤大小和病理性骨折是影响假体生存的危险因素,而患者的性别、首诊年龄、肿瘤部位、Enneking分期不是影响患者假体生存的相关因素。术后各类假体并发症发生率为10.4%(5/48),股骨远端组中1例出现假体松动,1例假体周围感染;胫骨近端组中,2例出现假体周围感染,1例假体周围骨折。
  结论:于本研究接受肿瘤型关节假体置换术的膝关节周围骨肉瘤患者短期内具有较好的肿瘤学预后和令人满意的术后肢体功能。股骨远端组术后膝关节功能和屈曲范围好于胫骨近端组,差异不具有统计学显著性。人工肿瘤型假体置换术后存在一定比例的并发症,其中病理性骨折、肿瘤大小、患者BMI是影响假体生存的危险因素,而肿瘤部位、性别、首诊年龄、Enneking分期等对假体生存无显著影响。
[博士论文] 王锦阳
人体解剖与组织胚胎学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤,最常见于儿童和青少年,其5年生存率仍不尽人意。众所周知,表皮生长因子受体(EGFR)与骨肉瘤TNM分期呈正相关关系,这表明EGFR在骨肉瘤进展中发挥重要作用。本研究的目的是探讨这种相关性的潜在机制。为此,我们发现EGF促进MG63细胞迁移和侵袭以及通过Rho A活化细胞应力纤维形成,并且可以通过抑制Rho A表达来逆转这些作用。此外,在RhoA下游的分子,包括ROCK,LIMK2和Cofilin,也在EGF诱导的MG63细胞中被激活,导致肌动蛋白应力纤维形成和细胞迁移。使用已知的抑制剂或shRNA抑制MG63细胞中的RhoA,ROCK,LIMK2或Cofilin可抑制肌动蛋白应力纤维形成和细胞迁移。因此,我们得出结论:信号通路RhoA/ROCK/LIMK2/Cofilin在EGFR活化后介导MG63细胞中的肌动蛋白微丝形成和细胞迁移。此信号通路为预防骨肉瘤进展和治疗骨肉瘤提供了有希望的靶点。
  1.EGF通过激活EGFR促进MG63细胞迁移
  (1)背景:
  受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)位于调节细胞增殖,存活,粘附,迁移和分化的复杂信号转导级联的头部。虽然生长因子诱导的EGFR信号传导对许多正常形态发生发展过程是必不可少的,并涉及许多额外的细胞反应,但该受体家族的成员的异常活化已显示在肿瘤细胞的发育和生长中起关键作用。
  (2)目的:
  本节的目的是探讨EGF是否可以激活MG63细胞中EGFR的表达,以及EGF对肌动蛋白应力纤维形成的影响。
  (3)材料方法和结果:
  用EGF处理MG63细胞2h后EGFR磷酸化显著增加,并且达到峰值,4h时开始减弱。与对照组相比,10ng/mL EGF诱导显著增加细胞侵袭(p<0.05)。此外,划痕实验显示,与对照组相比,10ng/mL EGF处理组在12,24,36和48h时MG63细胞的迁移显著增加(p<0.05)。肌动蛋白应力纤维在几种重要的细胞过程中(如迁移,胞质分裂和形态发生)提供力方面的基本作用。因此,观察用EGF处理后MG63细胞中肌动蛋白应力纤维的形成和分布,从6h开始,肌动蛋白应力纤维的分布和形成在MG63细胞的核周围达到峰值。
  (4)结论:
  EGF激活MG63细胞中的EGFR表达,并且其能够通过增加肌动蛋白应力纤维形成来促进细胞迁移。
  2.Rho A参与EGF诱导的MG63细胞迁移
  (1)背景:
  RhoA是Rho GTPase家族中研究最为广泛的成员,属于小G蛋白Ras超家族。它在信号转导中发挥重要作用,并且报道显示调节许多生物学活性,包括应力纤维基因转录、膜转运和粘着斑以及肿瘤发展的过程。
  (2)目的:
  本节的目的是确认RhoA是否参与EGF诱导的MG63细胞迁移。
  (3)材料方法和结果:
  为了确定RhoA在MG63细胞迁移中的作用,进行了pull-down实验。我们发现GTP-结合的Rho A在用EGF处理后6~12h显著增加。为了进一步探索RhoA在EGF诱导的MG63细胞迁移中的作用,观察RhoA shRNA干扰作用。实验结果显示在RhoA shRNA处理后的MG63细胞中RhoA及其下游ROCK的蛋白表达与mCherry对照组相比显著降低。Transwell实验结果显示Rho A shRNA与mCherry对照组相比MG63细胞迁移显著减慢。此外,在Rho A shRNA处理组中,肌动蛋白应力纤维的重组也受到抑制。Rho抑制剂C3转移酶以浓度依赖性方式抑制Rho A和ROCK的磷酸化,同时C3转移酶处理则可减少应力纤维的形成。在24,36和48h时,与EGF-单独处理组相比,用EGF与C3转移酶处理的MG63细胞显示迁移减少。
  (4)结论:
  RhoA参与EGF诱导的MG63细胞迁移,并且抑制RhoA的能够抑制应激纤维的形成和MG63细胞的迁移。
  3.RhoA激活ROCK信号介导MG63细胞迁移
  (1)背景:
  Rho相关蛋白激酶(ROCK)是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。它主要通过作用于细胞骨架来调节细胞的形状和运动。ROCK在广泛在不同细胞中发挥作用,ROCK是小GTP酶Rho的下游效应蛋白,是细胞骨架的主要调节剂之一。
  (2)目的:
  本节的目的是确定ROCK是否作为RhoA下游参与EGF诱导的MG63细胞迁移及其应力纤维重组。
  (3)材料方法和结果:
  ROCK是Rho A的主要下游效应器,其主要作用是通过作用于细胞骨架来调节细胞的形状和运动。因此,检测Rho A是否通过ROCK促进了EGF诱导MG63细胞中的应力纤维形成和细胞迁移。利用ROCK抑制剂Y27632预处理MG63细胞2h,然后用EGF处理,结果显示ROCK磷酸化从2h开始增加,并在6h达到最大值,12h后ROCK磷酸化恢复至基线水平。与没有Y27632预处理的组相比,Y27632预处理组中的应力纤维的重组明显受到抑制。此外,划痕实验显示对照组和Y27632处理组之间MG63细胞迁移没有显著差异。然而,EGF+Y27632组迁移的MG63细胞数量与单用EGF组相比下降(p<0.05)。
  (4)结论:
  ROCK是Rho A的主要下游效应子,能够促进MG63细胞迁移并参与应力纤维重组,抑制ROCK表达,导致EGF诱导的MG63细胞迁移减少和应力纤维表达降低。
  4.ROCK激活LIMK2/Cofilin信号介导MG63细胞迁移
  (1)背景:
  Cofilin是一种广泛分布的细胞内肌动蛋白调节蛋白,可以结合和解聚丝状F-肌动蛋白并以pH依赖性方式抑制单体G-肌动蛋白的聚合。它参与肌动蛋白-丝切蛋白复合物从细胞质向细胞核的转位。
  (2)目的:
  确定ROCK是否通过激活下游LIMK2/Cofilin信号传导介导MG63细胞迁移。
  (3)材料方法和结果:
  试图确定ROCK是否通过激活的LIMK2/Cofilin信号传导介导MG63细胞迁移。实验结果显示LIMK2磷酸化显著增加并且在6h达到峰值,然后在EGF刺激后12h下降。Cofilin磷酸化表现出类似的趋势,2h后增加并且在6h达到峰值。此外,EGF诱导的LIMK2和Cofilin1的磷酸化被ROCK抑制剂Y27632抑制,表明EGF通过ROCK诱导LIMK2和Cofilin激活。利用LIMK2和Cofilin1的siRNA转染细胞,结果发现LIMK2和Cofilin1在MG63细胞中的表达被其各自的siRNA明显地抑制,同时siLIMK2和siCofilin1抑制应力纤维形成。
  (4)结论:
  LIMK2和Cofilin1作用于Rho A/ROCK的下游,以调节MG63细胞中EGF诱导的应激纤维形成。
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