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[博士论文] 曹艳丽
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上含量最为丰富的碳水化合物之一,丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物类别,而里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的典型代表。在纤维素等底物存在的条件下,里氏木霉能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解,因此成为纤维素酶工业的主要生产菌株。
  目前对里氏木霉纤维素酶表达合成的研究主要集中在两个方面:一方面集中在纤维素酶基因的表达调控方面,以期从理论上阐释产酶调控机制,从而为通过菌株的遗传改造提升纤维素酶的表达水平提供理论支持;另一方面,通过对里氏木霉现有酶系组分的性能改善或合理复配以提高其酶解效率。在纤维素酶基因表达调控方面,目前已经鉴定到了多个直接参与酶基因表达的转录因子包括正调控因子及负调控因子。研究发现,不同的转录因子在启动子上具有各自特定的结合位点及生物学功能,这意味着纤维素酶基因的诱导转录是一个多转录因子参与,从而响应不同环境信号的复杂过程。为了更为深入地了解这一复杂过程,有必要筛选鉴定纤维素酶基因表达过程中涉及的其他未知转录因子及辅功能因子,从而解析里氏木霉纤维素酶基因的转录调控网络。
  此外,作为真菌的里氏木霉,其染色质结构的变化包括重构和核小体共价修饰可能也是纤维素酶基因诱导表达过程中的重要影响因素,系统阐述此种变化在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用对全面理解相关调控机制也极为重要。因此,论文工作主要从上述几个方面展开,取得相应结果如下:
  一、鉴定了一个新的纤维素酶基因转录抑制因子Rce1,其通过与Xyr1在纤维素酶基因启动子上竞争性结合参与纤维素酶基因的表达调控
  以里氏木霉主要的纤维素酶基因启动子(Pcbh1)为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中筛选获得了真菌典型转录因子Ga14类型的转录因子Rce1。细胞定位分析发现Rce1主要位于细胞核。对rce1的缺失及过表达分析表明,Rce1在纤维素酶表达过程中发挥抑制作用。通过体外的凝胶泳动迁移(EMSA)及DNA足迹保护(DNAse Ifootprinting)实验鉴定了Rce1在cbh1启动子上的结合位点,发现其与纤维素酶基因的关键转录激活因子Xyr1具有相似的结合位点。进一步通过体外竞争及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析发现,Rce1在纤维素诱导表达过程中与Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子,进而实现对纤维素酶表达的抑制作用,而xyr1过表达可以解除rce1对纤维素酶的表达抑制。综上所述,我们通过酵母单杂交筛选到一个转录抑制因子Rce1,通过与转录激活因子Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子来调控纤维素酶的表达。
  二、发现泛素结合酶TrUbc4在里氏木霉纤维素酶表达过程中发挥重要作用
  以纤维素酶基因启动子cbh1为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中还筛选获得了一个属于UBC超家族的泛素结合酶TrUbc4。细胞定位分析发现TrUbc4定位于细胞核。TrUbc4编码基因的敲除显著降低了里氏木霉纤维素酶基因的诱导转录和表达。突变体回补实验发现,TrUbc4的活性位点C85在纤维素酶表达过程中发挥着重要作用。在Xyr1过表达菌株中缺失Trubc4并分析表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Trubc4缺失对纤维素酶表达造成的的下调。进一步的ChIP分析发现,Trubc4缺失导致Xyr1在纤维素酶基因启动子区的占据水平显著降低,这种降低即使在Xyr1过表达的情况下仍然存在。以TrUbc4为“诱饵”进行酵母双杂交文库筛选,获得了具有SWIB/MDM结构域的蛋白TrSnf12。该基因的缺失表型及蛋白细胞定位与TrUbc4类似,但是我们并没有检测到TrSnf12的泛素连接酶活性。综合上述结果,我们发现Trubc4在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥着重要作用,此种作用是特异性的,并且依赖于其泛素结合酶活性。
  三、泛素修饰组学初步分析TrUbc4可能参与里氏木霉多种生理调控过程
  对TU6以及Trubc4缺失菌进行了泛素化蛋白质组学定量研究,鉴定到位于1385个蛋白上的2563个泛素化位点,其中941个蛋白的1623个位点包含定量信息。以1.5倍为变化阈值,在具有定量信息的泛素化位点中,△Trubc4/TU6比较组中有396个位点的修饰水平发生上调,298个位点的修饰水平发生下调,△Trubc4缺失导致里氏木霉整体的泛素化水平升高。进一步分析发现与TU6相比,有295个位点,258个蛋白在△Trubc4缺失菌中未检测到,这些蛋白涉及了转录因子、泛素结合酶、蛋白激酶、转运蛋白以及SAGA复合物,这说明Trubc4可能参与里氏木霉多种调控过程。
  四、Xyr1招募SWI/SNF复合物参与纤维素酶基因的表达调控
  酵母双杂交及体外GST-pull down实验发现,所鉴定的里氏木霉潜在的SWI/SNF复合物同源亚基TrSnf12与Xyr1的转录激活结构域(activation domain,AD)区存在相互作用,并且TrSnf12与同源核心亚基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一个同源核心亚基编码基因Trsnf5的缺失对里氏木霉的生长及生孢均具有严重的影响,并且使得纤维素酶的表达性能丧失。ChIP实验结果表明,在纤维素诱导条件下,TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件下,TrSwi1也能被招募至纤维素酶基因启动子区,这说明Xyr1可能通过与TrSnf12之间的相互作用,通过靶向募集TrSwi1来介导纤维素酶基因启动子区的染色质结构变化,进而调控纤维素酶基因的表达。然而,对OExyr1Δswi1/snf5的表型分析发现,在xyr1过表达的条件下,无论是诱导条件还是非诱导条件,Trswi1及Trsnf5的缺失对纤维素酶表达的影响程度都很小,这说明在xyr1过表达的条件下,纤维素酶基因的表达可能摆脱了对Trswi1及Trsnf5的绝对依赖。综上,在里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达过程中,染色质重塑复合物SWI/SNF发挥着重要的调控的作用。Xyr1可通过与TrSnf12亚基的相互作用招募TrSwi1/TrSnf5亚基到纤维素酶基因启动子区,从而调控纤维素酶的表达。
[硕士论文] 张建波
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:在蛋白质工程中,通过在蛋白质的特定位点进行拆分或插入新的结构域可构造出不同的调控元件,但如何发现蛋白质中特定的改造位点限制着这些调控元件的构建。因此,找到一种合适的方法来筛选目的蛋白中的改造位点就显得尤为重要。
  在我们的研究中,我们构建了基于转座子的体外转座反应体系,经优化后能够快速、高效地构建转座子随机插入文库,且构建的随机插入文库满足多样性和均一性的要求。在目的蛋白的选择上,我们将激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)蛋白作为研究对象,AID蛋白的脱氨作用能够实现碱基C→T的特异性突变,利用AID蛋白及其同家族成员的脱氨特性构建的单碱基基因编辑工具能够实现单碱基的精确编辑,由此了解AID蛋白中的插入突变耐受位点对其后续利用有着重要的意义。
  为此,我们构建了转座子随机插入到AID蛋白中的文库,通过后续的酶切连接分别将(GGGGS)2片段和(EAAAK)2片段插入到AID蛋白中,最终通过基于利福平抗性的鉴定方法筛选出AID蛋白中的两个耐受插入区域:loop7和C端,并在此基础上结合易错PCR和循环富集筛选的策略筛选出了一系列活性较野生型AID蛋白不同程度提高的、带有插入突变的易错PCR突变体,这为后续改造和利用AID蛋白提供了实验基础。
[硕士论文] 刘玉姣
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素在自然界中广泛存在,而且含量丰富,是一种可再生资源,对解决能源短缺和资源枯竭具有重要意义。但是,我国的纤维素利用率很低,造成大量的浪费。在纤维素的分解过程中,纤维素酶发挥非常大的作用,将纤维素最终分解为葡萄糖,使得纤维素能够得到充分的利用。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生热稳定性酶,是纤维素的分解者之一。
  本研究对来自嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk进行克隆,并在毕赤酵母中进行表达,得到CBHK和BGK重组酶。对重组酶进行分离纯化, SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量,外切葡聚糖酶CBHK的表观分子量为72kDa,大于理论分子量50kDa,可能是糖基化造成的;β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小为55kDa与理论的分子量大小基本一致。
  改善酶活性对提高纤维素的降解具有十分重要的作用。基于嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶HiBG的结构,本研究对嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶活性位点进口端的12个氨基酸残基进行定点突变。通过同源建模,对来源于嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因进行四个位点的定点突变。并将它们在毕赤酵母中进行了突变基因的高效表达。与野生型外切葡聚糖酶相比,突变体的酶活性都有所降低,其中W163H酶活性降低最多,降低了50%;E429D和Q459T分别降低了40%和35%;突变后W397H活性完全丧失。与野生型β-葡萄糖苷酶相比,所有突变体的酶活力都降低了,其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低较少,分别降低了20%、20%、30%和30%;D237S、L173Q酶活性分别降低了55%和60%;而突变W168H、N335F和W349G的酶活性完全丧失。
  在纤维素的分解过程中,β-葡萄糖苷酶起着关键作用,酶的催化存在产物抑制现象,大多数酶都存在产物抑制现象,但是一些酶对葡萄糖具有耐受性。嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有耐受性,但是具体的作用机制尚不清楚。本研究,通过对嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12个进口端位点进行定点突变,研究这些位点对于嗜热革节孢第一家族β-葡萄糖苷酶酶活性及葡萄糖耐受性的影响。突变L173Q丧失葡萄糖耐受性,突变Y179F在高浓度葡萄糖时丧失葡萄糖耐受性。初步证明进口端位点对于酶活性及葡萄糖耐受性都具有一定的影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 开思琪
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:本实验通过构建模型生物膜体系,并利用和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)等多种表征手段,在形态学、反应动力学和分子结构等方面全面探究磷脂酶A2与生物膜的作用,从现象到分子层面对磷脂酶A2的水解作用提供一个深入、一致的系统性解释,为磷脂酶的生物学研究提供一个较为完整的模型。
  本文通过三种光学技术——和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)和衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR),研究了平面磷脂双分子层在钙离子依赖性蜂毒磷脂酶A2(bvPLA2)作用下的水解过程。研究采用荧光共定位的方法,通过LSCM观测,追踪水解的动态过程和形态学变化,半定量以及定性地阐释了水解产物的空间分布情况。结果表明,水解产物之一的脂肪酸大部分从界面上脱离并游离到溶液介质当中,而另一个水解产物溶血磷脂则在界面上形成了稳定的自组装微管结构。ATR-FTIR实验的观测结果同样佐证了这一动态过程。SFG实验明确地揭示了钙离子在水解过程中发挥的作用,即通过连接磷脂膜和吸附在其表面的磷脂酶,诱导磷脂酶分子取向发生变化,从而有效激发界面上磷脂的水解反应。本研究以界面磷脂水解反应为例,建立了一个基于现代光学技术、能够在分子和微观层面上表征界面信息的实验体系,对于探究和理解磷脂水解的这一重要的生物物理化学过程有很大的帮助。
  此外,为了优化和扩展实验体系,本文在其他荧光标记手段上和多种模型双层膜制备上有所尝试,制备出可用于荧光标记且不易淬灭的新型硅量子点,并制备了软基底的磷脂分子双分子层和二氧化硅微球支撑双分子层,使本文研究方法在将来能够继续拓展,以在基础研究方面开发出更大的价值。
[硕士论文] 邓文凤
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:1,2,3-三氯丙烷(TCP)作为表氯醇工业生产中的主要副产物,已经成为一种持久性的地下水污染物,对人体具有潜在致癌性,急需建立一种廉价高效的技术将TCP从污染源中清除。相比传统的手段,生物降解环境污染物的方法更加环保高效,同时也能节约成本带来更多的效益。卤醇脱卤酶(HHDHs)是一种能够催化卤代醇的碳-卤键断裂的裂解酶,因此可以降解环境中的TCP。同时,它们也可以在亲核试剂存在的情况下催化逆向的环氧化物开环反应,可以用来制备多种具有重要应用价值的手性卤代醇、环氧化物和β-取代醇。改造卤醇脱卤酶的脱卤活性和立体选择性是本论文研究的两个重要方面。
  最新研究显示,在生物降解1,2,3-三氯丙烷(TCP)的多酶体系中,HheC酶催化中间产物2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)发生脱卤反应的活性极低,严重制约了TCP的生物转化。为此,本论文借助组合式改造策略来提高HheC酶对2,3-DCP的催化活性。首先运用分子动力学模拟获得HheC在对2,3-DCP进行脱卤时相关的氨基酸残基信息,预测筛选出得到可能发挥作用的10个关键位点;然后借助半理性设计的策略,将这10个位点进行合理组合构建了6个饱和突变文库;筛选约8200个克隆子后,最终获得了30个针对底物2,3-DCP脱卤活性提高的突变体,其中突变体P84A活性提高了21.8倍,F86I提高16.7倍,F12Q/F186L和W249P分别提高17.4倍和16.9倍。筛选得到对映体选择性提高的突变体F86S/L142Y(由ER=7.6提高到ER=200),W139A(由野生态的ER=7.6提高到ER=184),P84A也从ER=7.6提高到ER=72。
  通过分子对接和MD分析进一步探究上述突变体催化特性大幅改进的结构基础。结果表明:P84、F86、F12、F186和W249这些位点对提高HheC降解2,3-DCP的活性至关重要,且这些位点突变为小侧链氨基酸时活性更高;氨基酸P84,F86, L142,T134,N176和W139在调控HheC酶对底物的立体选择性方面也起着关键作用,P84,F86和W139突变成小侧链氨基酸时,卤醇脱卤酶HheC对(R)-2,3-DCP有很强的偏好性,而当T134和N176发生突变时,HheC酶对(R)-2,3-DCP的偏好性全部丧失,有逆转HheC偏好性的趋势。综上所述,卤醇脱卤酶HheC的脱卤活性和立体选择性的调控是由多个氨基酸共同完成的。因此,组合式改造策略对HheC相关催化特性的改造具有很大的优势。
[硕士论文] 周洁
营养与食品卫生学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素B6(VitaminB6,VB6)是六种可以相互转化的吡啶衍生物的总称。维生素B6是多种酶的辅酶,在多种物质代谢反应中起重要的作用。磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)是维生素B6的主要辅酶活性形式。PLP以辅酶形式参与多种氨基酸代谢转化。PLP的化学结构中存在活泼醛基,在活泼醛基的作用下生物体内的游离PLP会与含有胺基的化合物相结合生成醛亚胺等物质,且这种结合反应极易发生,这就可能影响生物体内含有胺基的化合物或其他物质的正常生理水平。PLP的动态平衡对哺乳动物的正常生理功能的维持有着重要的意义。
  PLP代谢在哺乳动物体内研究较多,但是对其如何保持动态平衡机制尚不明确。生物体内的PLP水平受到PLP磷酸酶、PL激酶和PNP氧化酶等因素的调控。生物体内游离PLP的浓度需要一定机制进行调控,而PLP的水解是其重要的调控机制。对PLP水解相关酶的基因克隆和分析等方面的研究是明确PLP的水解机制的基础。本研究将大豆作为实验材料,由于大豆种子中含有丰富的植物蛋白,在相应生理过程中氨基酸代谢非常活跃,因此维持体内PLP浓度的动态平衡对大豆有非常重要的意义。
  本实验以大豆为实验材料,根据在NCBI中查找得到已被命名但未被验证的大豆磷酸吡哆醛磷酸酶(GmPLPP)(Gene ID:100806718)基因,设计引物并克隆,在表达菌株中进行原核表达获得目的蛋白,对目的蛋白进行纯化并研究相关的酶学性质,同时构建GmPLPP的RNAi载体。
  本研究克隆的大豆GmPLPP基因cDNA长948bp,编码315个氨基酸,对应的分子量约为36.91kDa。核苷酸序列分析结果显示,GmPLPP与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的一致性都达到36%。氨基酸序列分析结果显示,GmPLPP的氨基酸序列与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的氨基酸序列在与活性位点有关的氨基酸相对保守,同时它们之间含有多个同源的蛋白质翻译后修饰位点(包括1个N-糖基化位点、3个磷酸化位点和3个N-豆蔻酰化位点)。将大豆预测的PLPP基因与已验证的人和小鼠的PLPP基因以及多个物种预测的PLPP基因对比。氨基酸序列的一致性结果显示,多个物种的PLPP基因存在一个与活性位点有关的保守的氨基酸——-天冬氨酸;并且发现动物体内PLPP的氨基酸序列之间的一致性较高,植物体内的PLPP氨基酸序列之间的一致性也较高,但是动物之间的PLPP氨基酸序列一致性不高,这可能与植物和动物之间的物种差异性有关。
  酶学性质分析结果显示,该酶的最适pH约为7.5,最适温度45℃;通过不同二价金属阳离子对酶活性影响研究发现,Mg2+对该酶的酶促反应有促进作用,并且能够解除低浓度EDTA对酶促反应的抑制作用;Ca2+、Zn2+对酶促反应有弱抑制作用;Mn2+和Cu2+对酶促反应有强抑制作用,这种作用会随其浓度增加而增强。
  在最适酶促反应条件下,以4-硝基苯磷酸二钠(pNPP)、磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)为底物的Km值分别为0.608mmol/L、0.452mmol/L和0.637mmol/L,Vmax分别为0.703umol/min/μg protein、0.814umol/mir/μg protein和0.967umol/min/μgprotein。由于PLP的Km值比pNPP和PMP小,说明该酶对PLP的亲和力相对较高。以多种磷酸酯型化合物为底物进行酶活性测定发现,该酶对其他底物也有一定活性,但是对PLP活性是最大的。根据不同化合物对以PLP为底物的酶促反应的影响结果可知,发现咪唑对酶促反应存在竞争抑制作用。并且,pNPP、PMP、Na3PO4、Na2MoO4、Na4P2O7和KF对酶促反应有抑制作用,并且随浓度升高抑制性增强。本研究已成功构建出GmPLPP的RNAi载体,以便后续研究的进行。
[硕士论文] 许婷婷
制药工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:羰基还原酶即醇脱氢酶,可以催化醇和酮或醛之间的相互转化。(3R,5S)-6-氯-二羟基己酸叔丁酯是合成他汀类药物中的一种重要的手性中间体,例如瑞舒伐他汀和阿托伐他汀。因此,本研究通过基因组挖掘的方法从产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca中发现了一种新型的羰基还原酶KleADH,并对其进行了克隆表达和性质测定。将羰基还原酶KleADH克隆到pet-28载体质粒上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其表达出了大小为30KDa左右的目的蛋白。重组后的全细胞用于催化S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯生成(3R,5S)-6-氯-二羟基己酸叔丁酯。反应24h后,其非对映体选择性(d.e)和转化率都达到了99%以上,且反应无需添加昂贵的辅因子。
  使用Discovery Studio2.5对KleADH进行同源建模,完成酶与底物对接实验,得到了KleADH与底物复合物的三维结构。为了确定KleADH的催化中心,我们对Asp44、Tyr49、Lys74和His107这几个氨基酸残基进行了“丙氨酸扫描”实验,突变体转化到大肠杆菌Transetta感受态细胞中,诱导目的蛋白的表达。实验结果符合预期,突变体全部失去了原有的活性,证明Asp44、Tyr49、Lys74和His107组成了KleADH的活性中心。
  对影响全细胞催化活性的因素进行了研究,包括温度、pH、金属离子和有机溶剂对酶活的影响。实验表明在30℃,pH7.0的条件下酶的活性最高。终浓度为0.1mM的Mg2+能使酶活性提高至1.45倍,金属离子对酶活的影响与浓度有很大的关系。两相系统正己烷/水和正庚烷/水能显著提高羰基还原酶KleADH催化不对称还原反应的速率。底物特异性的研究显示该羰基还原酶KleADH对几种芳香酮类化合物也具有显著的活性和较高的立体选择性。这种新型羰基还原酶KleADH的发现为制备手性醇类化合物提供了新的方法,对于手性醇类药物的制备具有潜在的意义及应用价值。
[硕士论文] 陈欣欣
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:由于抗生素的滥用,病原菌的耐药性已经变得越来越强。因此,迫切地需要发展一个更加有效且合理的方式来解决细菌强耐药性的问题。在寻找更加有效的治疗方式时,许多精力都放在了细胞壁裂解酶的研究中。细胞壁裂解酶能够破坏细菌的细胞结构,进而杀死被侵染的细菌,得益于该酶对耐药菌株具有高效能活性,而且导致新型耐药表型细菌出现的概率较低,因此细胞壁裂解酶成为抗菌药物研究的合适候选者。
  面对海量的蛋白数据,提供一个计算方式来准确且有效地预测细胞壁裂解酶是很有必要的。本工作致力于开发一个预测器来识别细胞壁裂解酶。为了这个目的,在本工作中,首先通过搜寻 UniProt数据库收集了一系列客观且严格的蛋白序列。最终,68条细胞壁裂解酶蛋白和307条非裂解酶蛋白序列被选中并构成基准数据集。随后,我们使用改进的伪氨基酸组分来表征蛋白样本序列,不仅包括序列的 g-间隔二肽组分,还包括两个残基之间理化性质的相关性。一种基于方差分析的特征筛选技术被用来获取含有63个特征的最优特征子集,最终支持向量机算法被用来执行预测。Jackknife交叉验证获得了84.82%的最优的平均精度,且此时全局精度为90.13%、auROC为0.926。为了便利其他研究者,我们开发了一个免费的预测器 Lypred,其网址为 http://lin.uestc.edu.cn/server/Lypred。我们确信 Lypred将成为裂解酶研究和抗菌药物研发的有力工具。
  根据物种来源的不同,细胞壁裂解酶又可分为内溶素和自溶素两种。我们将Lypred中的68条细胞壁裂解酶作为数据集构建模型来进一步辨识它们,其中的27条内溶素蛋白作为正样本,余下的41条自溶素蛋白序列组成为负样本集。我们用三肽特征来提取蛋白序列的信息,为了剔除冗余的、嘈杂的特征,使用二项分布来进行特征筛选。最终通过使用对分类最有贡献力的44个特征,支持向量机被用来训练了预测模型。所构建模型的全局精度高达94.12%,auROC也达到了0.986,这证明了所构建模型的强健。
[硕士论文] 梁跃斌
微生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase EC3.2.1.40)属于糖苷水解酶类,能够专一、高效水解许多天然糖苷化合物如橙皮苷、芦丁、柚皮苷和槲皮苷等末端的α-L-鼠李糖基。据报道该酶可从细菌,酵母,真菌,植物和动物组织中分离获得,其应用价值在于能将果汁类饮品脱苦,去除饮品中的浑浊,增加酒的香气,可水解许多天然化合物的鼠李糖苷,作为药物前体来改善药物特性等等。
  本研究通过检索CAZy数据库,获得193条细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列,经氨基酸一级序列同源性多重比对后,根据α-L-鼠李糖苷酶催化中心残基广义酸氨基酸的差异以及广义酸碱对处保守氨基酸基序特点,将其分为三个亚家族,对其中两个亚家族的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列分别再进行多重序列比对,在各自广义酸碱对处分别获得两段保守氨基酸基序。
  利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,以提取的健康人体粪便宏基因组DNA为模板,基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段。对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,将其编码的氨基酸序列在GenBank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余九条在94%以上。与GenBank数据库中序列一致性高(>94%)的片段,根据其对应全长基因序列设计上下游引物,对于氨基酸序列一致性为52%的基因片段,通过对样品进行全基因组de novo测序,得其全长基因序列。将获得的四条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,克隆于载体pET-28a,转化至E.coli BL21(DE3)进行异源表达。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析表明,目的蛋白在上清和沉淀中均有表达。
  以对硝基苯酚α-L-鼠李糖苷(pNPR)为底物对获得的粗酶液活性进行初步检测,仅在RhaC目的蛋白的可溶性上清中检测到活性。随即利用镍柱亲和层析的方法,对其纯化条件进行摸索和优化,进而纯化得到高纯度的目的蛋白。
  综上所述,人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因的挖掘提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。
[博士论文] 郭丽敏
分析化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:核酸适配体是一种能和靶分子特异性结合的人工体外合成的单链寡核苷酸,其靶分子可以是离子、小分子、蛋白质甚至整个细胞。近年来,适配体作为分子识别探针已经在医疗诊断、化学分析、环境检测、食品安全等方面发挥了重要作用。在基于适配体的分析研究中,凝血酶的两种适配体是短链,合成成本低,而且它们可与凝血酶的不同位点结合,形成三明治结构,同时不影响凝血酶的催化活性,因此凝血酶与其适配体是最常见的研究对象。但是这些研究大多数都集中在对凝血酶的检测上。
  利用适配体对凝血酶的亲和力以及凝血酶的催化活性等特点,本文发展了新型的凝血酶联适配体法(TLAA)检测其他蛋白质,拓展了凝血酶及其适配体的分析应用。构建了一条由蛋白质目标分子适配体序列和凝血酶的适配序列体组成的DNA探针,DNA探针既可与蛋白质目标分子结合,也可与凝血酶结合,通过凝血酶和适配体的直接结合将凝血酶分子标记在蛋白质上,从而将蛋白质的检测转化为凝血酶的检测。凝血酶催化底物产生光学信号,实现对蛋白质的定量测定。以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的检测为例,分别建立了几种不同模式的TLAA检测方法,包括三明治夹心模式的TLAA,滚环扩增偶联的TLAA和竞争模式的TLAA。整个论文包括如下6个章节:
  第一章:简要介绍了适配体的筛选和特点,综述了基于适配体的蛋白质检测方法,阐述了论文的立题背景、主要研究内容和创新点。
  第二章:发展了一种以磁球为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。DNA探针(由PDGF-BB的适配体、凝血酶的适配体和连接臂三部分组成)和包被在磁球上的抗体分别与PDGF-BB的两个位点结合,形成三明治结构,凝血酶与DNA探针中凝血酶适配体部分结合从而标记在三明治复合物上,凝血酶催化荧光底物或生色底物,产生可检测信号的产物,实现定量测定PDGF-BB。磁球的预富集作用和凝血酶的催化放大使该方法有较高的灵敏度,使用荧光底物时,检出限为16pM。使用生色底物可以进行简单常见的吸光度分析,同时由于产物有颜色,可以利用反应前后溶液颜色的变化进行目测,实现对PDGF-BB的半定量检测。
  第三章:发展了一种以微孔板为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。在上一章工作的基础上,本论文以微孔板为固体基质,利用其快速高通量检测的优点,将抗体修饰在微孔板上,随后依次在微孔板中加入PDGF-BB和DNA探针,形成三明治结构。然后凝血酶被DNA探针捕获,标记在复合物上。凝血酶催化荧光多肽底物产生荧光信号,信号的强度与PDGF-BB的浓度在一定范围内呈线性相关。该方法也可用于复杂样品中PDGF-BB的检测。
  第四章:发展了滚环扩增偶联的凝血酶联适配体检测方法(RCA-coupled TLAA)。方法利用RCA反应产生具有重复凝血酶适配体序列的寡核苷酸,从而实现多重的凝血酶标记,而凝血酶的催化功能则将检测信号放大,实现了RCA和凝血酶催化的双重放大效应,进一步提高了检测灵敏度。修饰在微孔板上的抗体、PDGF-BB和连有引物的适配体形成三明治结构,引物与编码有凝血酶适配体互补序列的模板杂交,RCA反应将引物序列延伸,产生一条含有多重凝血酶适配体的长DNA链,RCA产物可以捕获许多凝血酶分子,在三明治复合物中实现多重的凝血酶标记。凝血酶催化其生色底物或荧光底物产生可检测的产物,实现对目标蛋白质的定量测定。由于RCA和凝血酶催化的双重放大效应,检测的灵敏度得到提高,在使用荧光底物的情况下,方法的检出限可低至3.1pM,与单个凝血酶分子标记相比,检出限降低了62倍。
  第五章:构建了竞争模式的TLAA检测体系。首先PDGF-BB吸附在微孔板表面,然后溶液中的PDGF-BB和固定在微孔板上的PDGF-BB竞争性地与一条包含PDGF-BB适配体和凝血酶适配体的DNA探针结合,与固定的PDGF-BB结合的DNA探针捕获凝血酶分子,最后捕获的凝血酶催化底物产生荧光信号,进而完成对溶液中PDGF-BB的定量检测。溶液中的PDGF-BB越多,与固定的PDGF-BB结合的凝血酶就越少,从而引起荧光信号的下降。方法可以检测0.125nM的PDGF-BB,同时实现在1%人血清的检测。与三明治检测模式相比,竞争模式的TLAA只需要一个亲和探针,缩短了实验时间。通过简单改变DNA探针中适配体序列,该方法可以凝血酶为标记用于其它物质的检测,扩大了检测物范围。
  第六章:总结了本文的主要工作和创新点,提出了下一步的工作计划。
[硕士论文] 周文娟
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白酶体在细胞内代谢调控扮演着重要作用,诸多报道显示蛋白酶体功能异常和人类衰老等相关疾病的发生有关。虽然蛋白酶体结构与功能已被深入研究,但是由于人们对蛋白酶体的代谢调控的了解很少,对于蛋白酶体在疾病代谢调控的通路中的具体作用机制并不是很完整清晰的了解。糖原合成激酶是糖原代谢过程中的限速酶,在调控血糖方面起着重要作用,大量研究表明,在老年痴呆症发病初期,糖原合成激酶表达显著提高。而蛋白酶体活性和糖代谢有着密切关系,因此我们将研究糖原合成激酶在蛋白酶体代谢调控中扮演的作用。
  本文从细胞内和体外的实验验证糖原合成激酶对蛋白酶体活性起抑制作用,并寻找可以在体外逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。发掘更多蛋白酶体活性调控代谢因子,为蛋白酶体活性调控在老年痴呆、糖尿病及其他血管病的发生机理代谢机制提供新的视角和见解。从细胞内和体外的实验证明糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性,但是糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性并不直接作用于26S蛋白酶体。PP1A在体外可以提高核提取物和26S蛋白酶体的肽酶活性,并且可以逆转糖原合成激酶抑制核提取物蛋白酶体活性,证明PP1A是可以逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。因此得出结论糖原合成激酶抑制蛋白酶体的活性。
[硕士论文] 谢买胜
海洋生物学 国家海洋局第一海洋研究所 2017(学位年度)
摘要:地球在形成后的初期是一个高温缺氧的极端环境,与现在发现的一些热泉环境极为相似。由于地球形成后,出现最原始、最丰富的生命体是微生物,因此很多科学家认为对热泉环境中的微生物的研究有助于揭示地球上生命的起源,同时还能开发出更适应用于工业生产和科学研究的热稳定酶。其中,最为成功的例子就是广泛应用于PCR的DNA聚合酶。本研究以产κ-卡拉胶酶的热泉微生物为研究对象,对其分泌的κ-卡拉胶酶进行了一系列研究,从而为生物酶法制各卡拉胶寡糖及卡拉胶寡糖的应用提供科学依据。
  本文以κ-卡拉胶作为唯一碳源,从印尼热泉样品中分离出16株具有κ-卡拉胶酶活性的菌株,经16S rRNA基因鉴定表明,其中11株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),2株属于芽孢杆菌属(Bacillus),其余3株分别属于科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、希瓦氏菌属(Shewanella)和海单胞菌属(Marinomonas)。以其中1株酶活性最高的Bacillus sp.Carl9为研究对象,对其发酵条件进行了优化。发酵条件优化结果显示,9个因子影响Bacillus sp.Car19的产酶量;其中,3个主要影响因素分别为培养温度、培养基中Cu2+、NaCl浓度。综合次要因素对Bacillus sp.Car19产酶影响,Bacillus sp.Car19最佳产酶发酵条件为:培养温度52℃、Cu2+浓度6.93 mmol/L、NaCl浓度37.03 g/L,培养基pH为6,接种量1%,培养时间36 h,半乳糖浓度0.3 g/L,硝酸铵浓度7g/L,卡拉胶浓度0.5 g/L;优化后发酵上清液酶活力达到15.21 U/mL,与优化前相比提高了1.5倍。
  以优化的培养基培养Bacillus sp.Car19,对其分泌的卡拉胶酶进行分离纯化结果表明,该卡拉胶酶相对分子质量在40~50 KDa之间;酶最适反应温度为60℃,具有良好的热稳定性,最适反应pH约为7;金属离子Sr2+、Fe2+、Cd2+、Fe3+对该酶活性有抑制作用,其中Sr2+的抑制作用最为明显,酶活下降约50%;Cu2+、Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用,其中Cu2+作用最显著,能使酶活提高80%左右,而Ni2+、Mn2+等金属离子对酶活性无显著影响;底物特异性表明,该酶仅对κ-卡拉胶具有显著的降解活性,而对ι-卡拉胶、λ卡拉胶以及琼胶和褐藻酸钠等底物无降解活性。酶解产物经薄层层析(TLC)分析表明,该卡拉胶酶降解卡拉胶的最终产物为卡拉二糖。
  利用卡拉胶酶与卡拉胶反应得到的卡拉胶二糖进行植物促生抗病实验结果表明,1%和1‰卡拉寡糖水溶液处理的小麦种子,其根系较空白对照组增长效果分别达到29.48%和27.17%,且根较空白对照的粗壮;在防治黄瓜病毒病方面,2%卡拉寡糖稀释100倍和200倍的水剂对黄瓜白粉病的防治效率分别达到55.27%和45.36%,防治效果比市面上常用的氨基寡糖稍低;同时,在防治黄瓜白粉病实验表明,1%和2%卡拉寡糖水溶液防治效果分别为48.99%和37.82%。有关卡拉寡糖的活性作用机理以及该酶编码基因的克隆和异源表达等工作还需进一步研究。
[硕士论文] 李彩霞
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:目前微波杀菌技术由于其安全环保高效的优点而在食品工业中得到了广泛的应用,其杀菌所需要的时间和温度都低于其他常规方法,并且对食物的营养成份影响较小甚至无影响。近年来,有研究表明紫外协同微波作用的杀菌优势比单独的微波杀菌更强,但是关于紫外协同微波作用在大米灭菌及呼吸作用方面的研究却鲜有报道。对大米进行灭菌的目的是延长其保质时间,而延长大米保质时间的另一个方法便是抑制大米的呼吸作用,目前有很多这方面的研究和应用,但是尚未见到通过降低辅酶Q含量来抑制大米呼吸作用的报道。所以本课题以未处理的样品为空白对照,以水浴处理和单独的微波处理为对比,研究紫外协同微波处理对大米灭菌及辅酶Q的影响,欲通过此研究为延长大米的储存期提供一个新的理论方法。主要研究内容和结果如下:
  1.通过研究水浴加热、单独的微波加热和紫外协同微波加热的升温曲线,我们发现无论是否有紫外辐射的存在,微波使用功率300 W时的升温曲线都与水浴升温曲线最接近。
  2.用以上三种不同的处理方式分别处理大米1 min,3 min,5 min和7 min之后,提取大米蛋白质,进行SDS-PAGE电泳,发现所有条带的分布和颜色都基本一致,说明紫外协同300 W微波功率处理不会影响大米中蛋白谷的分子量和含量。
  3.用以上同样的方式处理大米表面的霉菌,随着处理时间的延长,三种处理方式处理之后细菌的残余菌数都逐渐减少;当处理时间为3 min的时候,紫外协同300 W微波功率处理后的杀菌效率是单独的微波功率处理之后的2.1倍,这说明紫外协同300 W微波功率处理能够在相对短的时间内具有更高的杀菌效率。
  4.用以上同样的方式处理大米,测定大米中辅酶Q的含量,结果显示紫外协同300 W微波功率处理之后,大米中辅酶Q含量降低的幅度最大,说明紫外协同300 W微波功率处理能更有效地降低大米中辅酶Q的含量。因辅酶Q在电子传递链中作用重大,所以通过降低辅酶Q的含量,可以抑制大米细胞的呼吸作用,从而延长大米的保质时间。同时用傅立叶变换红外光谱分析仪和紫外分光光度计分别测定用以上处理方式以及不同处理时间之后的辅酶Q10的结构,结果显示紫外协同微波作用能够改变辅酶Q10的化学结构。
[硕士论文] 王晶
应用化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在本论文中,运用酶活力的分析方法、DLS法及界面性质研究的张力及扩张流变法等研究了碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加其界面性质的变化情况;并用多个界面吸附模型将碱性蛋白酶的平衡界面张力(空气/水、正己烷/水界面)进行了拟合,比较了碱性蛋白酶在两个不同界面上的吸附。
  本论文首先研究了不同质量分数的碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加,其酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变的变化。
  本实验测定了不同质量分数的碱性蛋白酶酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变随放置时间的变化。随碱性蛋白酶溶液放置时间的增加和质量分数的增大,溶液中蛋白酶分子的粒径增大、Zeta电位下降,碱性蛋白酶溶液体系不稳定,溶液内蛋白酶分子趋向于发生聚集。在体相溶液中,碱性蛋白酶分子发生聚集首先导致了碱性蛋白酶的活力下降甚至失活,其次还改变了蛋白酶分子从体相扩散到界面的动力学。碱性蛋白酶溶液在水气界面的平衡张力值增大且随着时间的增加,界面吸附趋于平衡,由此引起了界面膜的弹性和机械强度全部下降的改变。
  本论文其次主要研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况。
  本实验主要运用界面张力、界面扩张流变及用不同吸附模型对空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力拟合,研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况进行了比较研究。首先,分别测定了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的动态界面张力随时间的变化关系;其次,用不同的吸附模型对不同浓度碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力进行了拟合;此外,在一定的频率范围内,对不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的总模量随碱性蛋白酶浓度的变化情况进行测定,进一步研究碱性蛋白酶在空气/水界面和正己烷/水界面的的界面性能并进行比较。
[硕士论文] 马振桥
食品科学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素B6(Vitamin B6,VB6)是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称,包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamin,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)以及它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5'-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5'-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoal-5'-phos phate,PLP)。其中PLP是细胞内140多种酶的辅酶。动物自身不能合成VB6,其需要从食物中获取各种形式的VB6通过代谢转换途径完成PLP的合成。在自然界中存在两条从头合成途径,一条是DXP依赖途径,另一条是DXP非依赖途径。植物通过DXP非依赖途径合成PLP,PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB6。在这个过程中VB6磷酸酶、PL还原酶、PM-丙酮酸转氨酶、吡哆醛激酶(PLK,Pyridoxal kinase)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO,Pyridoxine5'-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。PLK可以将PN、PM和PL磷酸化生成PNP、PMP和PLP,PNPO可以将PNP和PMP氧化生成PLP。
  植物作为动物的主要食物来源,也是VB6的主要来源。植物体内VB6的代谢转换途径的研究对人体营养素VB6的供给问题具有重要的意义,PLK和PNPO两个关键代谢转换作用酶的研究也尤为必要。在植物拟南芥中已经克隆鉴定出PLK和PNPO并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上研究对其他VB6合成代谢转换酶基因表达的影响,但其还缺乏在不同物种和不同方法上的验证。本实验采用模式植物烟草为材料进行PLK和PNPO相关研究,对植物体内营养素VB6的合成和代谢转换具有参考作用。
  本研究,利用拟南芥PLK和PNPO cDNA序列在烟草EST库中检索,寻找到预测编码烟草NtPLK和NtPNPO的eDNA序列,在Genbank上的登录号分别为XM_009804516.1和XM_009801441.1。以提取的烟草叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计引物对NtPLK和NtPNPO的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段,产物测序结果显示NtPLK的编码框长为1020bp,编码的蛋白含有339个氨基酸,分子量大小为37.4kDa,等电点为6.96。氨基酸序列比对发现相对哺乳动物、昆虫和细菌存在N端延长,酶活性位点处的氨基酸残基和其他物种一样保守。该基因在染色体上跨度1.2kb DNA,含有13个外显子和12个内含子。NtPNPO的编码框长为1620bp,编码的蛋白质含有539个氨基酸,分子量大小为60kDa,等电点为8.03。氨基酸序列比对发现与哺乳动物、昆虫和细菌相比在N端大幅度延长约280个氨基酸残基,该区域主要是YJeF_N功能域,该功能域功能目前尚不清楚。该基因在染色体上跨度0.7kb DNA,含有14个外显子和13个内含子。NtPLK在烟草的叶片中转录表达水平最高,根和茎中转录表达水平较低且比较接近。NtPNPO在烟草的叶片中转录表达水平最高,茎中次之,根中最低。
  将克隆得到的NtPLK和NtPNPO的编码框序列导入到pET32a(+)表达载体中在Rosetta大肠杆菌中表达出预期蛋白。NtPLK的粗酶液相对于底物PL,显示的吡哆醛激酶的活性为29.7nmolPLP/mg/min。NtPNPO的粗酶液相对于底物PMP,显示的磷酸吡哆醛氧化酶的活性为21.4nmolPLP/mg/min。酶活证实了克隆的序列所编码的蛋白为烟草PLK和PNPO。
  选取NtPLK的编码框内490bp的特异性的序列和NtPNPO的编码框内497bp的特异性的序列,将其各自的正反向序列分别插入pHANNIBAL中内含子的两端,构建发卡结构的RNAi载体。利用农杆菌EHA105介导侵染烟草叶片,通过qRT-PCR检测显示NtPLK RNAi在烟草叶片中下调NtPLK转录水平表达效果的最佳时间是72h,NtPNPO RNAi在烟草叶片中下调NtPNPO转录水平表达效果的最佳时间是48h。NtPLK RNAi处理后72h,烟草叶片中NtPLK、NtPNPO和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了50.9%、51.1%和26.3%,而NtPLR上升了27.7%;NtPNPO RNAi处理后48h,烟草叶片中NtPNPO、NtPLK、NtPLR和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了68%、22.1%、29.5%和33.9%。证实了构建的RNAi载体成功的下调了目的基因的表达。
[硕士论文] 刘薇
生物工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:L-酪氨酸羟化酶(HDP)在生物学上担任着非常重要的角色,它催化L-酪氨酸转变为L-多巴,酪氨酸羟化酶的缺乏会导致多巴胺以及肾上腺素和去甲肾上腺素的合成受损。类弹性蛋白(ELP)特殊的性质使其溶解度可根据环境温度而变化,且这一特性在它与其他蛋白连接之后仍然有效,因此被本课题用它来提高蛋白的溶解度、稳定性,并且成为了一种纯化的手段。本课题中的L-酪氨酸羟化酶是一类依赖于血红素的过氧化物酶,来源于菌种Streptomyces refuineus subsp.中的orf基因。
  1、本文利用本实验室构建的pET28a-HDP载体和pET28a-HDP-ELP载体转化大肠杆菌BL21得到表达菌,在25℃,0.4mM IPTG,200rpm,诱导10h的条件下实现高效表达。运用Ni-NTA层析柱成功纯化出HDP蛋白,运用ELP的ITC循环纯化得到HDP-ELP。经过探究得知,HDP-ELP和HDP在90min后的溶解度分别为初始溶解度的93%和63%;圆二光谱结果显示加入ELP标签并没有对HDP的二级结构产生影响,并且使其对过氧化氢的耐受性有所提高;HDP-ELP和HDP催化90min后L-Tyr的转化率分别为70.3%和21.1%;在不同温度和pH的环境中,HDP-ELP都表现出十分稳定的酶活。
  2、由于HDP催化的必须底物除了L-Tyr之外还有过氧化氢,因此本文引入了D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化D-丙氨酸产生过氧化氢这一过程为HDP的催化提供H2O2,这样就形成一个促进催化平衡向正向反应的结果。本课题还利用了基因工程的手段成功构建了pETDuet-HDP-IN-IC-DAAO载体,转化大肠杆菌BL21后在25℃,0.6mM IPTG,190rpm,诱导20h的条件下实现HDP-DAAO蛋白的高效表达。利用Ni-NTA层析柱成功纯化出HDP-DAAO蛋白。比较了H2O2与D-Ala作为底物的HDP-DAAO的酶活,L-Tyr的转化率分别为52.8%和66.3%;HDP-DAAO中DAAO的比活也比单酶要高;圆二光谱的结果显示HDP-DAAO融合蛋白的构建并没有对HDP的结构产生影响;经过荧光淬灭实验得知HDP-DAAO融合蛋白的稳定性要比HDP单酶要好。
[硕士论文] 李文
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素类生物质的高效转化利用是解决资源错置、环境污染与能源缺乏的重大课题,具有重要的现实意义。大部分天然纤维素降解酶都具有催化模块(CDs)、碳水化合物结合模块(CBMs)。CBMs具有识别和结合底物的功能,辅助CDs对底物的催化水解。设计获得高效纤维素降解酶有两大策略,第一提高纤维素酶蛋白对纤维素类底物的结合力,可以通过增加CBMs模块的数量和提高CBMs和CDs对底物的结合力来实现;其次,设计提高酶蛋白整体结构的热稳定性。生物炼制产业采用高温生产环境,能够加快反应速度并减少杂菌污染,因此需要高热稳定性的酶蛋白提高降解效率并降低生产成本。
  GH12家族的TrCel12A是只有一个CD模块的嗜中温内切纤维素酶,只有234个氨基酸,结构简单,具有很大的改造空间。鉴于定向筛选的不确定性以及长时耗,本文综合生物信息学分析手段与分子动力学模拟研究策略,对不同结合模式的CBMs家族进行了功能架构分析,来筛选适合与TrCel12A重组的CBMs模块;运用分子动力学模拟探宄该酶的热稳定性机制,定位潜在的突变靶点,并设计了四个突变期望提高该糖菅水解酶的热稳定性。计算方法和实验方法的结合大大减少了实验测定的工作量。本文主要内容及研究结果如下:
  (1) CBMs能够自主折叠并发挥功能,在CAZy数据库中,序列相似度30%以上的CBMs被归于同一CBMs家族,具有相似的结构特征。对三种不同结合模式的7个CBMs家族进行功能架构分析,对研究CBMs的功能混杂性和理性设计提高CBMs结合力都具有重要理论价值。本文研究发现,CBMs功能架构处偏好芳香族氨基酸(W、Y)和极性氨基酸(Q、R、N),结合模式不同的CBMs对酸碱氨基酸的偏好不同,这是CBMs识别底物的分子基础;不同家族在功能架构处采用增加亚位点数量或增加亚位点上的氨基酸数量来保障对底物的结合能力;功能架构序列谱表明不同CBMs家族具有不同数量的底物结合亚位点,而且与CDs相比,保守氨基酸数量相对较少,通常为芳香族氨基酸(W、Y)和弱极性氨基酸(N、Q),大部分分布在A型CBMs中;不同CBMs家族功能架构上的绝对保守氨基酸、相对保守氨基酸和可变氨基酸识别碳水化合物底物糖环上各羟基氧原子的模式各不相同,从而不同CBMs家族可对结构相近的碳水化合物底物进行部分识别,这可能是不同CBMs家族产生功能混杂性的分子基础。
  (2)应用分子动力学模拟分析TrCel1A的热稳定性的影响因素。本文使用Gromacs软件模拟溶剂环境,并设置了四个温度梯度(300K、350K、400K、500K)对TrCel1A进行分子动力学模拟。分析RMSF值发现蛋白的柔性分布是不均匀的,蛋白的N末端和活性中心是高柔性位点;四个位于不同二级结构上的N末端突变的分子动力学模拟结果表明,引入大的疏水基团(G41F)以及引入带电基团(Q6K)等方式能够增强N末端内部的相互作用,从而提高酶蛋白整体的结构稳定性;S25P通过引入内酰胺环的方式降低了α-螺旋的柔性,但是降低单个二级结构的柔性没有提高整体蛋白的热稳定性。
  (3)N末端突变对TrCel1A热稳定性的影响的实验验证。使用大肠杆菌表达体系表达出四个突变体蛋白,在50℃、55℃、60℃进行热稳定性检验,G41F和Q6K在55℃和60℃下的酶活性高于野生型。DSC测定出的Q6K和G41F的Tm值比野生型高,证明G41F和Q6K提高了蛋白的热稳定性。这说明稳定N末端结构是提高纤维素酶热稳定性的有效方式以及分子动力学模拟方法的高效与可靠。
[博士论文] 王美美
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:由于草浆等纸浆存在滤水性差、强度低等缺点,使其应用受到限制,一般生产过程中需要对其进行改性以改善滤水和强度性能。与化学法改性相比,采用纤维素酶(主要是内切酶EG)处理对纸浆改性是一种环境友好的技术,且已被证明在改善纸浆滤水性,提高成纸强度等方面具有良好效果。由于制浆造纸工艺往往在中、碱性条件下进行,这就要求使用的酶能够在高pH条件下维持酶活性,保证其催化作用有效进行。但市场上已有的商品纤维素酶大多为酸性酶,在碱性条件下酶活很低。虽然国内外对碱性纤维素酶的研究正逐渐深入,但目前仍存在很多问题,例如,已有产碱性纤维素酶菌株的产量低、酶系不合理、酶改性机理尚未完全清楚等。因此,设法提高碱性纤维素酶产量,合理优化酶系,以降低纤维素酶生产成本和提高对纸浆的改性效果,同时深入研究酶法改性机制等,对促进酶在造纸工业中的应用,降低生产成本等具有重要意义。基于以上背景,本论文在实验室前期研究基础上,通过构建耐碱性纤维素酶菌株,以希望提高纤维素酶产量;同时通过构建耐碱性纤维素酶与木聚糖酶共表达菌株,以达到优化改性酶系、提高酶法改性效果的目的;同时从不同角度研究了纸浆酶法改性的机制。本论文主要研究内容和结果如下:
  1.耐碱性纤维素酶的表达及其对纸浆改性效果研究
  为获得适合纸浆改性用的耐碱性纤维素酶,在实验室前期研究基础上,扩增来源于特异腐质霉的三个耐碱性内切纤维素酶H.EGI,H.EGII,H.EGV的基因,并在毕赤酵母GS115中成功异源表达;同时在大肠杆菌BL21中成功异源表达了来源于不同芽孢杆菌的三个内切纤维素酶Y106-EG,z-16-EG及A30-EG。测定纯化后重组耐碱性纤维素酶的性质,发现这六种内切纤维素酶的最适pH在6.5-7.5左右,最适温度在50℃-60℃之间,各酶在pH6.0-8.0条件下放置1h能够维持60%以上酶活性,其中Y106-EG、z-16-EG和H.EGV在pH9.0条件下放置1h可以维持60%以上酶活性。将六种耐碱性内切酶应用于麦草浆改性,发现Y106-EG在酶用量仅为0.2 IU/g条件下,与对照相比,能够降低12.5%的打浆度,抗张强度指数,耐破指数,撕裂指数分别提升14.6%、14.3%和10.7%。对纸浆的改性效果明显优于其它五种耐碱性内切葡聚糖酶,显示出良好的潜在应用前景。
  2.重组菌Y106OE-EG粗酶液对不同纸浆改性时的酶处理条件优化及与其它酶的协同作用研究
  为提高耐碱性纤维素酶Y106-EG的产量,利用基因工程方法,实现Y106-eg基因的同源过表达,经实验室前期优化的发酵培养基发酵,所得发酵液的CMCase酶活达到8.45 IU/ml,是出发菌株的8.28倍。利用工程菌Y106OE-EG粗酶液对杨木CMP(杨术化学机械浆),松木CMP(松木化学机械浆),麦草CP(麦草化学浆)进行改性研究发现,改性效果依次为麦草CP>杨木CMP>松木CMP。对酶法改性时的酶处理条件(处理温度、时间和pH等)进行了优化,发现当酶用量仅为0.2 IU/g浆,pH7.0,温度55℃条件下对麦草浆处理2h,与未用酶处理的对照相比,纸浆的抗张指数,耐破指数,撕裂指数分别增加了15.4%、16.9%和11.8%。
  研究了工程菌Y106OE-EG粗酶液与其它酶的协同改性效果,发现Y106OE-EG的内切纤维素酶与纤维素膨胀因子SWO4的联合处理,与单独使用内切酶或SWO4相比,反而降低了纸浆的强度和纤维素结晶度,而当与β-葡萄糖苷酶(1.2 IU/g)或木聚糖酶(5 IU/g)联合处理时,对纸浆的强度性质(抗张指数,撕裂指数,耐破指数)均有明显改善,在温度55℃、pH7.0条件下处理2h,当Y106OE-EG粗酶液用量为0.2 IU/g,β-葡萄糖苷酶1.2 IU/g时,与对照相比,麦草浆的抗张指数、撕裂指数、耐破指数分别提升23.68%、34.10%、20.82%。当木聚糖酶加量为5 IU/g时,与对照相比,麦草浆的抗张指数、撕裂指数、耐破指数分别提升32.65%、42.44%、25.00%。此外,木聚糖酶与SWO4或木糖苷酶的联合处理,对麦草浆的改性也具有良好的协同作用效果。综合而言,Y106OE-EG生产的内切纤维素酶与短小芽孢杆菌生产的木聚糖酶Xyn30的协同处理对纸浆的改性效果最佳,为后续的共表达菌株构建提供了理论依据。
  3.产耐碱性纤维素酶与木聚糖酶共表达菌株构建及产酶条件优化
  为实现耐碱性纤维素酶(Y106-EG)及木聚糖酶(Xyn30)在Y106-WT中的共表达,采用顺反子共表达,融合酶表达,串联共表达三种方式,意在提高枯草芽孢杆菌Y106-WT的产酶能力,结果表明,以串联共表达的方式能够实现两酶的共表达,对构建的共表达工程菌Y106OE-EG-Xyl进行液体发酵,发现该菌株在培养56 h后,CMCase酶活可达最高(8.20 IU/ml),木聚糖酶在菌株培养64 h时酶活达到最高(60.40 IU/ml),分析该菌株产粗酶液的酶系发现,其滤纸酶活(0.12 IU/ml),外切纤维素酶活性(0.02 IU/ml),β-葡萄糖苷酶(未测到)均较低,说明对应用于纸浆改性而言,共表达菌所产纤维素酶的酶系比较合理,在对纸浆进行改性的同时不损害纸浆纤维。
  利用工程菌Y106OE-EG-Xyl粗酶液在最佳处理pH7.0,最佳处理温度55℃,浆浓度10%(w/v)条件下处理麦草化学浆2h,当酶用量为纤维素酶0.2IU/g木聚糖酶活1.5IU/g时,与对照及单独添加纤维素酶(0.2IU/g)及木聚糖酶(1.5 IU/g)相比,纸浆白度和强度性能都有改善,其中与不加酶的对照浆处理相比,纸浆白度增加2.0% ISO,抗张指数、耐破指数、撕裂指数分别增加8.7%、16.6%和9.3%,而打浆度降低了15%。
  利用混料设计优化了工程菌Y106OE-EG-Xyl发酵时培养基中的碳源及诱导剂比例,发现当麸皮,玉米芯,乳糖配比为3.33%、0.83%、0.83%时,液体发酵72 h,纤维素酶活可达7.9 IU/ml,木聚糖酶活可达74.5 IU/ml,木聚糖酶活比优化前提升了14.1个酶活单位,且木聚糖酶与内切纤维素酶的比由原来的7.5提升至9.4。
  4.纸浆的酶法改性机制研究
  通过对Y106OE-EG粗酶液处理前后纤维质量变化,纤维结晶度(XRD)及红外光谱(FITR-ATR)等的变化分析发现,经重组菌Y106OE-EG粗酶液处理后,杨木CMP和麦草CP的纤维质量得到明显改善,且改善效果好于松木CMP。Y106OE-EG粗酶液处理后,杨木CMP及麦草化学浆的结晶度与对照相比明显提高,但松木CMP结晶度则提高不明显,三种浆经酶处理后纸浆中的氢键强度均有所提升。分别提取了麦草CP、松木CMP和杨木CMP中的木质素组分,研究了木质素对Y106OE-EG的酶蛋白吸附特征,发现松木CMP和杨木CMP的木质素对纤维素酶蛋白的吸附能力明显高于麦草浆中的木质素,木质素对蛋白的不可逆吸附将影响酶对纤维底物的作用,因此相对而言,Y106OE-EG酶液更适合用于麦草浆的改性。
  分别利用Y106OE-EG和Y106OE-Xyl及共表达菌株Y106OE-EG-Xyl的粗酶液(EG0.2 IU/g、 Xylanase1.5 IU/g、EG0.2 IU/g-Xylanase1.5 IU/g)处理纸浆,发现与对照或只添加EG或木聚糖酶的样品相比,共表达菌株的粗酶液处理后纸浆纤维的平均长度增加,宽度几乎不变,长宽比变大,细小纤维含量减少,卷曲指数及扭结指数均有所降低,且共表达菌株的粗酶液处理效果优于单独酶的处理效果。利用红外谱图对共表达菌株Y106OE-EG-Xyl粗酶液处理前后草浆的吸收峰相对强度进行分析,发现经共表达菌株粗酶液处理后,氢键强度明显提升。利用SEM观察了重组菌Y106OE-EG及共表达菌株Y106OE-EG-Xyl的粗酶液处理前后草浆纤维表面形态变化,发现经两菌株的粗酶液处理后,与对照相比,纸浆中的细小纤维含量明显减少,纤维变得平整。酶处理后纸浆在纤维质量、纤维素结晶度、氢键强度、表面形态等方面发生的上述变化,是酶处理改善纸浆强度和滤水性能的内在原因。
  分别从酶的结构和性质、蛋白表面电荷、蛋白的疏水性、蛋白在纸浆纤维上的吸附等角度,探讨了Y106-EG所产粗酶液与来源于特异腐质霉的三个耐碱性内切纤维素酶H.EGI、H.EGII和H.EGV以及来源于其它芽孢杆菌的两个耐碱性内切纤维素酶z-16-EG和A30-EG对麦草浆的改性差异及内在原因。研究发现,与其它五种耐碱性内切纤维素酶相比,Y106-EG由于酶蛋白对底物的亲和力相对较大,且在pH7.0时,pH值低于其自身等电点使其氨基酸易被带上正电荷,另外,蛋白表面的Zeta电位与其它几种耐碱性内切酶相比负值较小,且蛋白的疏水性小,这些都使得Y106-EG酶蛋白更易于与带负电荷的细小纤维发生亲水性结合,从而有利于酶降解细小纤维。此外,Y106-EG酶蛋白是典型的(β/α)8桶状结构特征,结构稳定性较好且开口宽阔的活性中心使其可以容纳更多类型不同的多糖支链,在催化降解复杂底物时有较大优势,该酶的CBM属于A型CBM,易于结合于结晶型纤维素多糖上。这些特征使得Y106-EG在用于纸浆改性时表现出较好的优势。
[硕士论文] 高飞
化学工程与技术 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:在手性药物合成过程中,脂肪酶作为一种高效的生物催化剂,能够催化拆分酯类药物中间体,得到手性药物中间体,用于后续的化学合成步骤。脂肪酶催化拆分酯类药物中间体的反应具有高效、简便、纯度高、产率高等特点,能够降低药物的生产成本。洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶(BCL)是目前研究比较清楚,底物谱较为广泛的脂肪酶,具有很大的应用价值。本课题主要是应用实验室现有的洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A(BCLA)催化硫酸沃拉帕沙药物中间体拆分反应,并且用基因挖掘的方法找到一个新的脂肪酶片段BCLC,对其进行了底物特异性研究。
  洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A(BCLA)和折叠酶B(BCLB)基因工程菌,分别诱导表达,在BCLB的辅助下,对BCLA进行复性,获得可溶性蛋白。用可溶性BCLA催化拆分硫酸沃拉帕沙药物中间体4-乙酰氧基-N,N-二苯基-2-戊炔酰胺,并进行了条件优化,最终结果如下:温度60℃,pH7.0,反应时间4h,底物浓度1g/L,酶浓度0.028g/L,拆分后的底物ee值达94.5%,回收率42.86%。
  用BCLA的氨基酸序列在洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia ATCC25416)全基因组中进行比对,找到一个相似序列,命名为BCLC。通过构建大肠杆菌基因工程菌,诱导其表达蛋白,研究其催化酯类底物的特异性。研究发现,此片段对硫酸沃拉帕沙药物关键中间体4-乙酰氧基-N,N-二苯基-2-戊炔酰胺及衣折麦布药物关键中间体6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮、5-(4-氟苯基)-5-羟基-戊酸甲酯有拆分活性,ee值分别为78.49%、44.28%、60.86%。
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